JP2012012334A - 固定化タンパク質および固定化タンパク質作製用活性化担体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、無機系多孔質連続体からなる担体上(1)に、介在タンパク質(2)を介して配向が制御された形態で共有結合により固定化された固定化タンパク質であって、介在タンパク質(2)がリジン及びシステインを含まず、該介在タンパク質(2)のカルボキシ末端が前記担体(1)の表面にアミド結合(5)を介して共有結合により固定化され、該担体上(1)に固定化された介在タンパク質(2)中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基と目的タンパク質(3)中のリジン残基の側鎖のアミノ基とがアミド結合(5)を介して結合している。
【選択図】図1
Description
このように、タンパク質の固定化技術は非常に多岐にわたるが、作製された固定化タンパク質の機能・性能・安定性など品質の観点で評価すると、理想的な固定化の形態としては、共有結合による配向が制御された形態での固定化タンパク質が望ましいことは、自明である。
ちなみに、抗体分子を共有結合で固定化した場合、担体の表面上での抗体分子の結合様式を整えることは原理的に不可能であり、極端な場合は、抗体分子の物質認識能に必須な部位が利用できない形での固定化が生じたり、物質認識能に大きく影響する形での結合が生じることが多くの文献で示されている。すなわち、共有結合による固定化された抗体の配向性は、分子としてまったく不均質な形での固定化抗体であり、このような不均質な固定化により抗体分子の機能、すなわち、抗原との結合能力が、抗体分子の変性、無秩序な配向や化学修飾などにより、低下することが報告されている。(非特許文献4:M.Nisnevitch, M.A.Firer, The solid phase in affinity chromatography: strategies for antibody attachment, J.Biochem.Biophys.Methods, vol. 49, pp.467-480(2001); 非特許文献5:R.Danczyk, B.Krieder, A,North, T.Webster, H.HogenEsch, A.Rundell, Comparison of antibody functionality using different immobilization methods, Biotechnol. Bioeng. Vol.84, pp.215-223(2003); 非特許文献6:Yongwong Jung, Hyo Jin Kang, Jeong Min Lee, Sun Ok Jung, Wan Soo Yun, Sang J, Chung, BVong Hyun Chung, Controlled antibody immobilization onto immunoanalytical platforms by synthetic peptide, Analytical Biochemistry, vol. 374, pp99-105(2008))。
本発明者らは、タンパク質配列の末端一か所での結合を確実なものにするために、シアノシステインを介したタンパク質の固定化反応を開発すると共に、その反応だけでなく官能基のマスク反応にも非感受性であるタンパク質の一般的形態を開発している(特許文献1:特開2008-115151;特許文献2:特開2008-115152;特許文献3:特開2008-115153;特許文献4:特開2008-266219;特許文献5:特開2008-266221;特許文献6:特開2008-280259)。配向を制御して共有結合で固定化するためには、固定化の対象となるタンパク質の配列もしくは構成するアミノ酸の種類が大きく制限されることになる。
このことを、より一般化して表現すると、配向制御固定化を目的とするタンパク質の固定化において、目的タンパク質と特異的に結合する小タンパク質(リガンドタンパク質)を介在タンパク質として、あらかじめ担体表面上に配向制御固定化しておき、介在タンパク質に目的タンパク質を結合させると、介在タンパク質自身は配向が制御されており、且つ、介在タンパク質と目的タンパク質の結合は、定まった構造で結合することから、配向が定まったタンパク質に定まった結合をすることで、配向が定まるという帰結になる。このとき、介在タンパク質が結合する部位が、固定化を目的とするタンパク質の機能発現を損なわない部位であれば、このような形での目的タンパク質の固定化は、目的タンパク質の配向が整った上で機能的にも均質な機能が保証できる形態での固定化が実現できることになる。
しかしながら、架橋反応で結合したイムノグロブリンGの機能が保持されたままであったかの記載はなく、また、今日に至るまでに、このような架橋により作製された固定化抗体が実用的であるとの報告も見当たらない。このことは、架橋反応に用いられる試薬が、主にタンパク質のリジン残基の側鎖のアミノ基と反応すること、また、架橋は、プロテインAとイムノグロブリンGの側鎖間で反応が生じた場合にだけ成立し、分子内での架橋、もしくは、片方だけの反応(いわゆる、単なる化学修飾)が生じ、固定化した抗体そのものの機能が大きく失われ、プロテインAを介した抗体分子の固定化そのものに成功したとしても、固定化抗体として利用できる形態に反応を制御することが困難であることによるものであると考えられる。これを模式的に表したのが図2である。
(非特許文献:R. Polzius, T. Schneider, F.F. Biert, U. Bilitewski and W. Koschinski , Optimization of biosensing using grating couplers: immobilization on tantalum oxide waveguides. Biosens. Bioelectron. 11 (1996), pp. 503-514. )
しかしながら、プロテインAもしくはプロテインGなどの介在タンパク質を共有結合により配向を制御して固定化したとしても、介在タンパク質と目的タンパク質との結合を非共有結合として場合、類似タンパク質の存在や、溶液のpH変化、塩濃度変化などにより、目的タンパク質が、固定化基板から遊離するため、その利用が大幅に制限を受ける。例えば、プロテインAを配向制御した担体に蛍光ラベルしたイムノグロブリンGを中性条件で結合した固定化抗体においては、高濃度の蛍光非標識イムノグロブリンGを共存させることにより、徐々に蛍光ラベルしたイムノグロブリンGが遊離すること、また、pHを3から2の酸性にするだけで、ほぼすべてのイムノグロブリンGが遊離する。
すなわち、本発明者らは、リジンおよびシステインを全く含まないタンパク質をアミノもしくはカルボキシ末端側のいずれか一か所で共有結合により固定化基板に配向制御して固定化した固定化タンパク質(これを介在タンパク質と称する)に着目し、この介在タンパク質が固定化の対象となるタンパク質が機能発現部位以外の部位で特異的にタンパク質−タンパク質相互作用により強く結合できる場合において、介在タンパク質中のアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基をカルボジイミド法などによりアミノ基と特異的に縮合反応をするように活性化し、活性化した状態で目的タンパク質と結合させるとタンパク質構造の揺らぎとの兼ね合いで、両タンパク質の結合部位もしくはその近傍のリジン残基のアミノ基だけがアミド結合を優先的に結合できること、このことにより、目的タンパク質において、結合に関与したアミノ酸残基以外のアミノ酸は、全く変化しないことから、介在タンパク質と目的タンパク質との共有結合の形成において、目的タンパク質の機能を保持したまま共有結合(アミド結合)により結合できることを示し、且つ、すでに本発明者らが発明しているイムノグロブリンGタンパク質のFcドメインに特異的に結合するプロテインAもしくはプロテインGタンパク質のアミノ酸配列を改変し、リジンおよびシステイン残基を全く含まない形で、共有結合で且つ配向制御固定化した固定化タンパク質を、介在タンパク質として利用することにより、イムノグロブリンGタンパク質を配向制御固定化できることを明らかにした。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル-ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のpHを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液10gに対し、0.05〜0.8g、好ましくは0.1〜0.7gである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には40〜200℃で、加熱後の溶媒のpH値は、6.0〜12.0が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
本発明の固定化タンパク質の用途として幅広い用途が考えられるものとして、固定化イムノグロブリンGその中でもモノクローナル抗体があげられる。
以下に、固定化抗体および固定化モノクローナル抗体に関して、より詳細に本発明の内容、その利用法及び効果を説明する。
抗体は、免疫系を有する生物が作り出すタンパク質であり、抗原に対して特異的に結合する機能を有することから、抗体の物質認識機能を人工的に利用することが幅広く行われている。また、一つの抗原を認識結合できる抗体としては、各種生物由来もしくは同一の生物種由来でも数多くのタンパク質分子が分離されている。それらのうちでも、利用価値の高い抗体は、市販されており、ある抗原に対して特異的に結合できる抗体については、多くは、市販品として入手できる。入手できない場合でも、免疫動物に対して目的抗原を免疫することにより、当業者であれば目的抗体を作製することができる。従って、固定化抗体を作製する際に、抗体の入手には、ほぼ制限がなく、入手できることから、抗体タンパク質の入手により本発明は制限を受けないことは自明である。
モノクローナル抗体は、免疫動物が作る抗体タンパク質が、複数の抗体産生細胞由来であることから、エピトープなどの抗原認識においてヘテロであることと大きく異なり、単一の抗体産生細胞由来であるから、それを暗号化する遺伝子配列が一種類であり、したがって、タンパク質配列も均一な抗体であるこという特徴を有する。モノクローナル抗体も、市販品としての入手、もしくは、当業者による作製が可能である。
本発明は、市販品として入手可能な抗体タンパク質を、特別の処理を施すことなく、共有結合により配向を制御して担体に固定化して、利用できることを可能とする技術を提供する。また、本発明によって作製される固定化抗体においては、固定化反応に関与したリジン残基の側鎖のアミノ基もしくはアミノ末端のアミノ基以外のアミノ酸残基は、固定化処理によっても化学的に全く変化を受けていない、ということに、特徴を有する。従って、固定化に関与する残基が該抗体タンパク質の機能発現に関与しない場合においては、固定化により該抗体タンパク質の機能が完全に保たれることも保証されることになる。
本発明において介在タンパク質として抗体の共有結合による配向制御固定化に利用される固定化タンパク質としては、すでに、本発明者らが発明している、リジンおよびシステイン残基を全く含まず且つアミノ末端もしくはカルボキシ末端1箇所で担体と共有結合により結合した固定化タンパク質を用いることができる(特許文献1乃至6)。
抗体分子に結合能を有するタンパク質としては、Staphylococcus aureus由来のプロテインA(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)、Streptococus sp. Group C/G由来のプロテインG (EP0131142A2(1983)に記載)、Preptostreptococcus magnus由来のプロテインL(US5965390(1992)に記載)、group A Streptococcus由来のプロテインH(US5180810(1993)に記載)、Haemophilus influenzae由来のプロテインD(US6025484(1990)に記載)、Streptococcus AP4由来のプロテインArp (Protein Arp 4)(US5210183(1987)に記載)、group C Streptococcus 由来のStreptococcal FcRc(US4900660(1985)に記載)、group A streptococcus, Type II strain 由来のタンパク質(US5556944(1991)に記載)、Human Colonic Mucosal Epithelial Cell由来のタンパク質(US6271362(1994)に記載)、Staphylococcus aureu , strain 8325-4由来のタンパク質(US6548639(1997)に記載)、Pseudomonas maltophilia由来のタンパク質(US5245016(1991)に記載)等が知られている。また、これらのタンパク質に関しては、多くの場合繰り返し配列を持ち、断片化したタンパク質においても抗体分子との結合能を有することが明らかにされているが、これらのタンパク質の抗体結合能を有する断片もしくはすべての配列を基にして、抗体結合能を保ったままで、該結合タンパク質配列中に存在するすべてのリジン残基およびシステイン残基をほかの18種類のアミノ酸残基に置換することにより、本発明に供する介在タンパク質を作製することができることは、すでに、本発明者らによる発明で公知である(特許文献1乃至6)。
上記の、抗体結合タンパク質のうち、プロテインAおよびプロテインGは、抗体タンパク質イムノグロブリンGのFcドメインと呼ばれる、抗原認識結合部位とは全く異なるドメインを認識し、非共有結合で結合する。また、Fcドメインには、リジン残基が複数含まれ、それらがタンパク質構造において、タンパク質表面に露出しており、リジン残基の側鎖のアミノ基を結合反応に利用できる構造をしている。
本発明の実施例においては、介在タンパク質として、リジン残基およびシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメインもしくは改変プロテインGドメインをカルボキシ末端をグリシンリンカーを介して結合した固体化タンパク質を担体として用いた例を示しているが、本発明は、介在タンパク質が改変プロテインAドメインもしくは改変プロテインGドメインに限定されないことは自明である。
リジン残基およびシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメインもしくは改変プロテインGドメインのカルボキシ末端側1箇所で固定化したのち、マスク反応を施した固定化タンパク質を用い、これをカルボジイミドとスクシイミドで処理することにより、固定化された改変プロテインAドメインもしくは改変プロテインGドメインのアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基をスクシイミド化することができる。スクシイミド化されたカルボキシル基は、アミノ基と強い反応性を有し、反応によりアミド結合を形成する。従って、スクシイミド化した固定化担体を抗体タンパク質と混合することにより、抗体分子中のリジン残基のアミノ基もしくはアミノ末端のアミノ基は、改変プロテインAドメインもしくは改変プロテインGドメインのアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の側鎖のスクシイミド化したカルボキシル基と反応して、アミド結合を形成することにより、共有結合で結合する。
この反応は、改変プロテインAドメインもしくは改変プロテインGドメインが、抗体分子のFcドメインと特異的に結合することから、非常に限定されたアミノ酸側鎖間で優先的に形成される。このことは、実施例において顕著に示され、抗体結合能を失った改変プロテインAドメインを用いた場合、抗体との結合反応がほとんど起こらないこと、さらに、介在タンパク質を固定化した担体と抗体タンパク質と混合した後、できるだけ速やかに、洗浄することにより、非特異的結合を避けることにより達成できる。固定化反応後、介在タンパク質中のスクシイミド化したカルボキシル基は、エタノールアミンなどで処理することによりマスクすることができる。
この反応により、固定化された抗体タンパク質は、介在タンパク質である改変プロテインAドメインと抗体のFcドメインとアミド結合で共有結合、すなわち、配向が制御された形態で、固定化されており、抗体タンパク質そのものの抗原認識結合機能は完全に保たれている。また、介在タンパク質そのものも、共有結合で且つ配向が制御された形で固定化されていることから、抗体タンパク質が共有結合で且つ配向が制御された形で固定化した固定化タンパク質が形成されたことになる。このような、形態での固定化タンパク質が、全く新規な物質であることは、従来の方法を駆使しても、固定化反応を制御することが困難であり、本発明以前には作製が不可能であったことなどを考慮すると明白である。
従って、本発明は、共有結合で配向が制御された形で固定化されたタンパク質の製造方法を提供するだけでなく、物質としても全く新規な物質を提供するものである。
本発明に用いられる担体として、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル-ゲル転移を起こさせることにより得られる無機系多孔質連続体を用いる。
従来の固定化担体としては、多孔質粒子状の担体、多孔質膜状の担体、繊維状の担体が用いられてきた。その中でも多孔質粒子が最も一般的に用いられており、多孔質であるのは表面積を大きくし固定化できるタンパク質の量を多くするためであり、球状であるのは粒子間隙を液が流れるので、通液性を安定させるためである。
本発明の目的は固定化したタンパク質と特異的に相互作用するタンパク質、例えば抗体と抗原との相互作用を利用して機能を発揮するものであり、粒子中の細孔表面に固定化されたタンパク質と相互作用をするためには細孔内を拡散で移動しなければならない。拡散時間は拡散距離の2乗に比例するため、効率よく相互作用を起こさせるためには拡散距離すなわち粒子径を小さくしなければならない。しかしながら、粒子径を小さくすると通液性が悪くなってしまい、粒子間隙を通液するためには大きな圧力をかけなければならず、使用上大きな制約となる。繊維状の担体、膜状の担体はいずれも通液可能な間隙あるいは細孔は存在するが、それだけでは表面積が小さく固定できるタンパク質の量は多孔質粒子と比較すると1/10以下となる。
使用可能な無機系多孔質連続体のマクロ孔の細孔径が1.2μm〜6μmの範囲である。細孔径が1.2μm以下であれば通液性が悪く、タンパク質を含む溶液を無機系多孔質連続体中に通益するための圧が高くなってしまい、実用上使用が困難になる。また、細孔径が6μm以上になると、シリカ骨格径が最小でも3μm程度となり、多孔質連続体としての拡散距離が小さいと言う優位性が小さくなってしまう。
使用可能な無機系多孔質連続体のメソ孔の細孔径が30nm〜100nmの範囲である。30nm以下であれば、分子量の大きなタンパク質が出入りするための十分な大きさではなく、細孔表面を利用できない。また。100nm以上になると表面積が小さくなってしまい、機能が低下してしまう。
例えば、目的タンパク質として、Affibody(R) Moleculeなる一群の小タンパク質が開発、販売されており、各々の小タンパク質はそれぞれ特異的にある目的タンパク質だけと結合することが公知である。Affibody(R) Moleculeは、Staphylococcus aureus由来のプロテインAのBドメイン由来のタンパク質の配列を改変する事により創製されているが、その配列中には、リジン残基が含まれているが、元の機能を保ったままリジン残基部分を他のアミノ酸に変換することは、本発明者らがStaphylococcus aureus由来のプロテインAのAドメインを用いてすでに示しているように、当事者であれば達成できる(特許文献1乃至6)。従って、本発明の技術は、対象とするタンパク質によって制限を受けないことは明らかであり、一般性が保たれる。
ヒトポリクローナル抗体は、市販品を用いた。抗IL8ヒト型モノクローナル抗体は、CHO細胞としてATCCCRL-12445株を培養し、培養上清から精製したものを用いた。ヒトモノクローナル抗体、アバスチン、ハーセプチン、リツキサンは、医薬品として販売されているものを用いた。
リガンドタンパク質としては、改変プロテインA用としては、配列表1に示すタンパク質を、改変プロテインGとしては、配列表2に示すタンパク質を用い、これを、シアノシステインを介して配向制御固定化反応により固定化して得られたものを用いた。なお、このリガンド固定化反応による固定化により、介在配列としては、リジン残基およびシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメイン(配列表3)もしくはリジン残基およびシステイン残基を全く含まない改変プロテインGドメイン(配列表4)がC末端側を介して担体基材と固定化された形で介在タンパク質の役割を果たす。
固化した試料をさらに数時間熟成させ、密閉条件下で140℃に1時間保った。この処理の後、ゲルを40℃で3日間乾燥し、100℃/hの昇温速度で800℃まで加熱し、直径4.5mmの棒状の無機系多孔質体を得た。
得られた多孔質体中には中心孔径3.5μm(=3500nm)程度の揃った貫通孔が3次元網目状に絡み合った構造で存在していることが確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径40nm程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。この棒状の無機系多孔質体を厚さ1.5mmに切断することにより円盤状の無機系多孔質体を得た。
続いて、2 mlの10 mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0) 中に10 mgのリジン残基およびシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメイン(リガンドタンパク質)を溶解させた(リガンド溶液)。リガンド溶液に、10 mM ホウ酸緩衝液 (pH8.5) で調製した45 mMの2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTCB)を加えてリガンド溶液のNTCB濃度を5 mMに調整し、リガンドタンパク質のスルフヒドリル基を活性化させた(固定化反応溶液)。50個のポリ‐L‐リジンを固定化させた円盤状の無機系多孔質体を上記調製の固定化反応溶液20 ml中に浸漬し15時間振盪混和させ、担体機材表面にリジン残基およびシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメインを固定化した。固定化反応後担体表面上の余分なアミノ基を1%無水酢酸溶液20mlに浸漬することで、マスク反応を行った。このようにして得られたものを、介在タンパク質を導入した担体として用いた。
モノリス担体に改変プロテインAもしくは改変プロテインGを導入した担体を用いた場合の詳細に示す。
固定化対象となる抗体として、抗ヒトIL8ヒト型抗体を用いた。
抗体濃度:0.34mg/mL
アプライした抗体タンパク質総量 (これを、Aとする。):
0.34mg×0.8mL=0.272mg
非吸着タンパク質総量:
改変プロテインA担体: 0mg
改変プロテインG担体: 0mg
洗浄工程1溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0.008mg
改変プロテインG担体: 0.068mg
洗浄工程2溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0.072mg
改変プロテインG担体: 0.024mg
ブロッキング工程溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0mg
改変プロテインG担体: 0mg
非固定化タンパク質総量 (これを、Uとする。)
改変プロテインA担体: 0.080mg
改変プロテインG担体: 0.092mg
固定化タンパク質総量 (これを、Bとする。)
改変プロテインA担体: 0.192mg
改変プロテインG担体: 0.180mg
この結果、固定化効率は、
固定化効率=100×(固定化タンパク質総量(B))/(アプライした抗体タンパク質総量(A)−非吸着タンパク質総量(U))
で計算されることから、
固定化効率 (E=100×B/(A−U)の計算式)
改変プロテインA担体: 約71%
改変プロテインG担体: 約66%
という結果であった。
上記3で得られたヒト抗IL8ヒト型抗体を固定化した円盤状の無機系多孔質体をスピンカラム内に固定化したスピンカラム型の分離カラムを用いて、市販品として売られているヒトIL8ペプチドを用いて、結合溶出実験を行った。
ヒトIL8ペプチドを0.1Mのリン酸緩衝液、pH7.4に溶かし、最終濃度、0.1mg/mlになるようにした。タンパク質濃度は、BCA法により測定し、牛血清アルブミン換算として求めた。
ペプチド溶液0.4mLを添加し、添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(吸着工程と称する)。この操作を2回行った。分離した溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した(非吸着ペプチド量と称する)。
遠心分離後の担体に、0.5MのNaClを含む0.1Mのリン酸緩衝液、pH7.4、0.4mLを添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(この操作を、洗浄工程と称する)。洗浄工程を3回行った。分離した溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した。
その結果
アプライしたペプチド総量:
0.1mg/ml×0.8mL=0.08mg
非吸着ペプチド総量: 0.002
洗浄工程溶出ペプチド総量:0mg
溶出工程タンパク質総量:0.074mg
吸着効率=100×(アプライしたペプチド総量−非吸着IL8ペプチド総量)/アプライしたIL8ペプチド総量=約98%
溶出回収効率=100×溶出工程タンパク質総量/アプライしたペプチド総量=約93%
という結果であった。
(2) 介在タンパク質
(3) 目的タンパク質
(4) 前述した介在タンパク質(2)のカルボキシ末端
(5) アミド結合
(6) 目的タンパク質の固定化部位(ドメイン)
(7) 目的タンパク質の機能発現部位(ドメイン)
Claims (7)
- 反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体からなる担体上に、介在タンパク質を介して配向が制御された形態で共有結合により固定化された固定化タンパク質であって、介在タンパク質がリジン及びシステインを含まず、該介在タンパク質のカルボキシ末端が前記担体の表面にアミド結合を介して共有結合により固定化され、該担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基と目的タンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とがアミド結合を介して、該目的タンパク質が少なくとも1か所で結合している固定化タンパク質。
- 反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体からなる担体上に、介在タンパク質を介して配向が制御された形態で、共有結合により固定化された固定化タンパク質であって、介在タンパク質がリジン及びシステインを含まず、該介在タンパク質のカルボキシ末端が担体の表面にアミノ末端のαアミノ基を介して共有結合により固定化され、該担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基又はカルボキシ末端のカルボキシル基と目的タンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とがアミド結合を介して、該目的タンパク質が少なくとも1か所で結合している固定化タンパク質。
- 介在タンパク質が、抗体結合機能を有するタンパク質であり、目的タンパク質がイムノグロブリンである、請求項1又は2に記載の固定化タンパク質。
- 介在タンパク質が、プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択されるタンパク質由来の抗体結合ドメインの改変タンパク質であり、リジン残基及びシステイン残基を含まない改変タンパク質である、請求項3記載の固定化タンパク質。
- 無機系多孔質連続体のマクロ孔の細孔径が1.2μm〜6μmの範囲であり、メソ孔の細孔径が30nm〜100nmの範囲であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の固定化タンパク質。
- 介在タンパク質を介して目的のタンパク質を固定化するための、介在タンパク質と担体を含む固定化タンパク質作製用活性化担体であって、担体が反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体であり、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が該タンパク質のカルボキシ末端を介して担体と共有結合により結合しており、該タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている、固定化タンパク質作製用活性化担体。
- 介在タンパク質を介して目的のタンパク質を固定化するための、介在タンパク質と担体を含む固定化タンパク質作成用活性化担体であって、担体が反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体であり、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が該タンパク質のアミノ末端を介して担体と共有結合により結合しており、該タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている、固定化タンパク質作製用活性化担体。
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Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014148456A (ja) * | 2013-01-13 | 2014-08-21 | Kyoto Univ | マクロ多孔性モノリスとその製造方法およびその応用 |
JP2016190204A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-10 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | クロマトグラフィー用充填剤 |
JPWO2014083729A1 (ja) * | 2012-11-30 | 2017-01-05 | 国立大学法人京都大学 | マクロ多孔性モノリスとその製造方法 |
JP2017047365A (ja) * | 2015-09-01 | 2017-03-09 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | タンパク質固定化用担体及びその製造方法 |
EP3578571A1 (en) * | 2015-04-13 | 2019-12-11 | Fujifilm Corporation | Method for producing short-chain peptide-immobilized carrier, and short-chain peptide-immobilized carrier |
US10695744B2 (en) | 2015-06-05 | 2020-06-30 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbent biprocessing clarification agents and methods of making and using the same |
US11229896B2 (en) | 2014-01-16 | 2022-01-25 | W.R. Grace & Co.—Conn. | Affinity chromatography media and chromatography devices |
US11389783B2 (en) | 2014-05-02 | 2022-07-19 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material |
US11628381B2 (en) | 2012-09-17 | 2023-04-18 | W.R. Grace & Co. Conn. | Chromatography media and devices |
CN116286731A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-06-23 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 蛋白基固定化酶及其制备方法及高效制备甘油二酯的方法 |
WO2023190099A1 (ja) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 株式会社ビー・エム・エル | 対象物質の測定方法、捕捉担体、測定キット、および測定試薬の製造方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008115151A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-05-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質 |
JP2008266221A (ja) * | 2007-04-20 | 2008-11-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | アミノ末端1箇所で配向制御固定化された固定化タンパク質 |
-
2010
- 2010-06-30 JP JP2010150314A patent/JP5769124B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008115151A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-05-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質 |
JP2008266221A (ja) * | 2007-04-20 | 2008-11-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | アミノ末端1箇所で配向制御固定化された固定化タンパク質 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6013014198; J Chromatogr B Biomed Sci Appl. Vol.722, 19990205, p.11-31 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11628381B2 (en) | 2012-09-17 | 2023-04-18 | W.R. Grace & Co. Conn. | Chromatography media and devices |
JPWO2014083729A1 (ja) * | 2012-11-30 | 2017-01-05 | 国立大学法人京都大学 | マクロ多孔性モノリスとその製造方法 |
JP2014148456A (ja) * | 2013-01-13 | 2014-08-21 | Kyoto Univ | マクロ多孔性モノリスとその製造方法およびその応用 |
US11229896B2 (en) | 2014-01-16 | 2022-01-25 | W.R. Grace & Co.—Conn. | Affinity chromatography media and chromatography devices |
US11389783B2 (en) | 2014-05-02 | 2022-07-19 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Functionalized support material and methods of making and using functionalized support material |
JP2016190204A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-10 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | クロマトグラフィー用充填剤 |
EP3578571A1 (en) * | 2015-04-13 | 2019-12-11 | Fujifilm Corporation | Method for producing short-chain peptide-immobilized carrier, and short-chain peptide-immobilized carrier |
US10927188B2 (en) | 2015-04-13 | 2021-02-23 | Fujifilm Corporation | Method for producing short-chain peptide-immobilized carrier, and short-chain peptide-immobilized carrier |
US10695744B2 (en) | 2015-06-05 | 2020-06-30 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbent biprocessing clarification agents and methods of making and using the same |
JP2017047365A (ja) * | 2015-09-01 | 2017-03-09 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | タンパク質固定化用担体及びその製造方法 |
WO2023190099A1 (ja) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 株式会社ビー・エム・エル | 対象物質の測定方法、捕捉担体、測定キット、および測定試薬の製造方法 |
CN116286731A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-06-23 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 蛋白基固定化酶及其制备方法及高效制备甘油二酯的方法 |
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