JP2011524745A - 修飾オリゴヌクレオチドを使用するhrp−3の阻害 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はPWWPドメインを有するタンパク質の活性を調節するための剤に関する。
その際、それぞれのY及びZは互いと一緒に塩基対、特にワトソン−クリック塩基対を形成し、X1及びX2は独立してポリ(アルキレングリコール)単位を含む基から選択される、
n及びmは独立して0又は1を示し、その際n及びmの少なくとも1つは1である、
sは1〜20、有利には5〜18の整数である、
Bは架橋基である]
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子である。
X1及びX2は独立してポリ(アルキレングリコール)単位を含む基から選択される、
n及びmは独立して0又は1を示し、その際n及びmの少なくとも1つは1である、かつ
Bは架橋基を示す]
を含む単鎖オリゴヌクレオチド分子に関する。
図1は、HDGFファミリーの6部分のアラインメント及びPWWPドメインの構造的保存を示し、これは常に全てのファミリーメンバーのN末端に存在する。
図2は、HRP−3によるNIH−3T3移動に対する阻害作用を示す。
図3及び4は、刺激24時間後のHRP−3により誘発される用量依存性HUVEC発芽を示す。
図5及び6は、HUVEC細胞株中でのHRP−3刺激あり及びなしでのVEGFR−2 mRNA発現及びVEGF mRNA発現をそれぞれ示す。
図7は、HUVEC細胞株中でのVEGF刺激あり及びなしでのHRP−3 mRNA発現を示す。
図8は、抗VEGF抗体Avastin及びHRP−3ありでのHUVEC細胞の発芽試験を示す。
図9は、増加する量のHRP−3タンパク質の存在下でのHUVEC細胞移動アッセイを示す。
図10は、様々な正常及び腫瘍性のヒト細胞株中でのHRP−3発現レベルを示す。RNAを細胞から抽出し、DNアーゼ処理、レトロ転写及びリアルタイムPCR分析した。18S RNAレベルを試料標準化のために使用した。HRP−3タンパク質がヒト神経芽腫細胞株により高度にかつ選択的に発現されていることが見出された。
図11はウェスタンブロットアッセイを示し、この場合にHRP−3タンパク質がSHSY条件培地中で見出された。
図12は、設計された二重鎖DNAの配列を示し、二重鎖2、3及び4には赤で下線を引いた塩基があり、Lukasik et al.の二重鎖で導入した変化を強調する(二重鎖1)。
図13は、図12のDNA二重鎖1(DNA1)を用いた3T3移動in vitroアッセイを示す。
図14−A)は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞株のHRP−3転写産物レベルを示す。RNAを細胞から抽出し、DNアーゼ処理、レトロ転写及びリアルタイムPCR分析した。18S RNAレベルを試料標準化のために使用した。平均発現値に応じて細胞株を上から下に配置した。神経芽腫細胞株は灰色で印をしてある。
図14−B)は、神経芽腫及び非神経芽腫細胞によるHRP−3の発現及び分泌を示す。タンパク質を細胞ライセートから抽出するか又は濃縮し、この条件培地から沈殿させ、SDS−PAGEゲルで分画し、HRP−3についてイムノブロットした。GADPHレベルを試料標準について測定した。このバンドの相対強度をImageJ softwareを用いて計算した。
図14−C)は、SH−SH5Y、Gl−Ll−N及びHTLA230神経芽腫異種移植片のHRP−3タンパク質レベルを示す。異種移植片腫瘍組織又は正常マウス組織から抽出したタンパク質をSDS−PAGEにより分離し、HRP−3についてイムノブロットした。精製したHRP−3タンパク質をポジティブコントロールとして使用した。GAPDHのタンパク質レベルを試料標準化のために使用した。バンドの定量化をImageJ softwareを用いて実施した。
図15は、37℃で0〜25時間のマウス血清中でのインキュベーション後の配列番号4、5、6及び7の本発明によるオリゴヌクレオチド分子(それぞれ化合物BN203、BN204、BN205及びBN206として示す)のゲル電気泳動分析を示す。
図16は、配列 配列番号11(化合物BN210として示す)のオリゴヌクレオチド分子の細胞毒性アッセイを示す。MTT試験を、BN210又はコントロール試験物質を用いた24、48及び72時間のインキュべーション後のHepG2及び神経芽腫細胞株Gl−L−lN、SH−SY及びIMR32に対して実施した。ポジティブ及びネガティブコントロールを、それぞれ10%又は0%のウシ血清を含有する細胞培地を用いて実施した。
図17は、ビンクリスチン(VIN)単独又は配列 配列番号11(BN210)のオリゴヌクレオチド分子と組み合わせた場合のin vitro細胞毒性を示す。GI−L−IN神経芽腫細胞を0.15〜5nMの範囲の濃度でのビンクリスチンで、単独で用いて又は250nMのBN210と組み合わせて処理した。48時間後にMTT試験を実施した。
図18は、甲状腺刺激性の神経芽腫異種移植片に対する、化学療法剤ビンクリスチン(VCR)と組み合わせた配列 配列番号11(BN210)の本発明によるオリゴヌクレオチド分子のin vivo活性の結果を示す。
図19は、配列番号1のオリゴヌクレオチドがHRP−3誘発したHUVECの発芽を遮断できることを示す。
材料と方法
HRP−3タンパク質供給源
このタンパク質をGSTコンジュゲートとして市販の供給源から最初に獲得した。同時に、このcDNAをRT−PCRによりヒト細胞から獲得した。このHRP−3コード領域を、制限部位としてEcoRI及びNdelを使用してpET30ベクター中にクローニングした。この組み換えタンパク質を大腸菌(E. CoIi)TOPF10及び12中で生産しポジティブクローンを獲得した。2つのポジティブクローンを配列決定して、その正確さを確かめ、両者ともに正確である。したがって、このタンパク質発現工程のために我々のポジティブクローンを大腸菌BL21中に形質転換した。異なる条件の温度及び時間における我々のクローンのいくつかの発現アッセイ後に、HRP−3を第1の工程のためにHPLCを用いてカチオン交換により、そして第2の工程のために疎水性精製を用いて精製した。組み換えタンパク質が完全に精製した後に、LAL試験を実施し、エンドトキシンの非存在を確かめ、次いでこれを定量化した。
NIH 3T3繊維芽細胞のための抗移動剤としてのHRP−3
NIH 3T3繊維芽細胞に対する報告されたHDGF活性と類似して、PWWPドメインに結合できるリガンドによるいかなる干渉活性も報告できる試験を開発すべく、これら細胞に対するHRP−3活性を試験することに決めた。増加する量のタンパク質の存在下での3T3細胞の移動及び増殖アッセイを実施した。これらアッセイは、HRP−3タンパク質の強力な抗移動作用の定義を可能にし、これは30ng/mLで5%のFBSにより24時間で誘発される3T3移動の50%を妨げることができる。この試験はバリデーションされ、今や良好に再現可能である、図2。
HUVEC細胞のための血管形成剤としてのHRP−3
HDGFが、様々な種類の腫瘍において血管形成に関連することが見出され、この理由のために、我々はBAEC及びHUVECとしての内皮初代細胞株に対するHRP−3の活性を試験した。BAEC及びHUVEC細胞に対する増殖に対する作用が見出されなかった一方で、HRP−3は、24時間の刺激後にHUVEC発芽を誘発できる。図3及び4に示されるとおり、HRP−3は、用量依存的にHUVEC細胞において発芽を誘発できる。図4には、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールを60ng/mLでVEGFを用いて示している。このデータからは、100ng/mlを超える濃度でHUVEC細胞に対する発芽をHRP−3が刺激することを実証した。我々の結果を確かめるために、実験を盲目的にも実施している。
神経腫瘍中でのHRP−3発現レベル
以前の刊行物から、HDGF発現が様々なヒトの癌中でメラノーマ、結腸直腸、膵臓、胃、肝細胞及び肺の癌腫として増加することを我々は知っている。このため、ヒトの腫瘍細胞株中のHDGFタンパク質の特異的過剰発現をリアルタイムPCRによりスクリーニングすることが決定され、そして、我々はこの基本のmRNAレベルが全ての細胞株に対してHRP−3よりも高いことを認め、そして、これまでにはHDGFが乳癌、神経芽腫、骨肉腫、リンパ腫、膵臓及び子宮のアデノカルシノーマ中で過剰発現することが見出されているが、しかしこの最大の過剰発現はヒトの肝臓細胞であるChang細胞株中で見出された。
オリゴヌクレオチドによるHRP−3ターゲッティング
二重鎖DNAとの複合体にあるPWWPドメインの利用可能な構造を基礎として、短い(15bp)二重鎖DNA及び3つの派生DNA二重鎖をHRP3をターゲッティングするために設計した(図12)。この設計したDNAの配列は図面中で左側に示され、Lukasik et alの二重鎖(二重鎖1)で導入された変化を強調して赤及び下線を引いた塩基を有する。この二重鎖は様々な分子形状を試験するために(二重鎖3)、そして、この結合のためにいかにこの配列が重要であるかを理解するために設計されている(二重鎖2及び4)。
細胞毒性試験
結合(ref. Lukasik et al., 2006)、及び、in vitroでの溶解性HRP−3の血管形成促進性作用の遮断(データ示さず)のためのこれら配列の能力から出発して、我々は、図16で示されるように、様々な細胞株中での配列番号11(化合物名BN210で同定)の細胞毒性、及びin vivoでのその急性毒性を試験することを決定した。
in vivoモデル
以前の実験において、BN210は、in vitroで抗血管形成作用を有することが示されている(データ示さず)。したがって、腫瘍血管形成のモデルにおいてin vivoでBN210の効力を試験した。神経芽腫を腫瘍モデルとして選択し、というのもHRP−3は原則的にマウス中の神経系で発現するからであり、そして以前の実験はHRP−3が、様々なヒトの神経芽腫細胞株の条件培地中に存在し、かつ、過剰発現することを示している。HRP−3は試験した細胞株のいずれの増殖にも作用しないので、細胞毒性剤、ビンクリスチンと組み合わせてBN210を使用することが適当であることが見出された。
VCR単独投与と比較して、BN210がNB異種移植片中でVCRの治療作用を改善するために使用できるかどうかを決定するために、Gl−Ll−N細胞をヌードマウスの左の副腎中に注入し、約200mm3mpサイズに達するまで成長させた(22日)。NB腫瘍を有するマウスを次いで、上で報告されているとおり、週毎の間隔で薬剤で処理した。図18に示されているとおり、VCR単独で処理した(1mg/kg i.v.、この実験において治療量以下の用量)NBを有するマウスは、ネガティブコントロールマウスに比較してその寿命のいかなる増加も示さなかった。対照的に、VCR+BN210の組み合わせで処理したマウスは、ネガティブコントロール及びVCR処理群に比較してその寿命の統計学的に有意な増加を有した(p=0.0058)(図18)。
Claims (20)
- ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが、デオキシリボヌクレオチド構成ブロック、修飾したデオキシリボヌクレオチド構成ブロック、リボヌクレオチド構成ブロック、修飾したリボヌクレオチド構成ブロック、ヌクレオチドアナログ構成ブロック、特にPNA、LNA、O−メチルRNA、又はモルホリノ構成ブロック又はこの組み合わせから選択される請求項1又は2記載のオリゴヌクレオチド分子。
- X1及びX2が、200〜100000Daの範囲内にある分子量を有する線状又は分枝鎖状のポリ(エチレングリコール)単位を含む基から選択される請求項1から3までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。
- Bが、相補ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックを連結でき、かつ、塩基対の形成を支持できる20つまでの構成ブロックのスペーサー配列である請求項1から4までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。
- Bが、
(i)少なくとも3つの対となっていないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ構成ブロックのヌクレオチド性スペーサー配列、又は
(ii)非ヌクレオチド性スペーサー配列、例えば少なくとも5つのエチレングリコール単位のポリ(エチレングリコール)スペーサー配列
を含む結合基である請求項1から5までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。 - PWWPドメインタンパク質、例えばHDGF、HRP−1、HRP−2、HRP−3、HRP−4及び/又はLEDGF、特にHRP−3及び/又はHDGFを阻害するための請求項1から6までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。
- PWWPドメインタンパク質に少なくとも10μM、有利には少なくとも100μM、特に有利には少なくとも1000μMの親和性で結合する請求項1から7までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。
- 医薬における使用のための、例えば診断及び/又は治療適用のための請求項1から8までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。
- PWWPドメインタンパク質機能障害と関連、付随する、かつ/又はこれにより引き起こされる状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項9記載のオリゴヌクレオチド分子。
- 血管形成に関連した疾病、例えば癌、例えば神経芽腫、メラノーマ、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌及び肺癌の診断及び治療における使用のための請求項9又は10記載のオリゴヌクレオチド。
- 更なる療法、例えば放射線、手術及び/又は更なる医薬の投与と組み合わせた使用のための請求項9から11までのいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド分子。
- 薬剤スクリーニングにおける使用のための請求項1から8までのいずれか1記載のオリゴヌクレオチド。
- 医薬における使用のための、例えば診断及び/又は治療適用のためのHRP−3ポリペプチド、特に哺乳類のHRP−3、又は、これをコードする核酸分子。
- 細胞の移動、増殖及び/又は足場形成独立成長の阻害のための剤としての請求項13又は14記載の化合物。
- 過剰増殖状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項14又は15記載の化合物。
- 医薬における使用のための、例えば診断及び/又は治療適用のためのHRP−3アンタゴニスト。
- 抗体、抗体断片、アンチセンス分子、リボザイム、RNAi剤又はアプタマーである請求項17記載の化合物。
- 血管形成の阻害のための剤としての請求項17又は18記載の化合物。
- 血管形成に関連した状態又は疾病の診断及び治療における使用のための請求項17から19までのいずれか1項記載の化合物。
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