JP2011513380A - フェニルアミノピリミジン誘導体の結晶型 - Google Patents

フェニルアミノピリミジン誘導体の結晶型 Download PDF

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ラチャコンダ，スリーニバス
アディバトラ・カリ・サトゥヤ，ブジャンガ・ラオ
ベンカイア・チョウダーリ，ナンナパネニ
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ナトコ ファーマ リミテッド
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Abstract

本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）の特別な結晶型、その調製方法、この結晶型を含む医薬組成物、およびヒトに対する抗癌剤としてのそれらの使用に関する。ＡＮ−０１９としても公知である式Ｉの化合物は、式Ｉ（Ｉ）で表される。

Description

この出願は、２００９年３月２日に、米国を除くすべての国の指定に対する出願人は、インド国籍企業であるナトコ ファーマ リミテッド（Natco Pharma Limited）の名の下に、米国のみの指定に対する出願人は、インド国民である、アマラ・キシャン・コムペラ（Amala kishan Kompella）、ブジャンガ・ラオ・アディバトラ・カリ・サトゥヤ（Bhujanga rao Adibhatla Kali Satya）、スリーニバス・ラチャコンダ（Sreenivas Rachakonda）、およびナンナパネニ・ベンカイア・チョウダーリ（Nannapaneni Venkaiah Chowdary）の名の下に、ＰＣＴ国際特許出願として出願され、２００８年３月４日に出願された米国特許出願第１２／０４２，２４０号および２００８年３月４日に出願された米国特許出願第１２／０４２，２３５号に対する優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）の特別な結晶型、その調製方法、この結晶型を含む医薬組成物、およびヒトに対する抗癌剤としてのそれらの使用に関する。ＡＮ−０１９としても公知である式Ｉの化合物は以下のとおりである。
式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドの調製、および、特に抗癌剤としてのその使用が、２００６年３月１６日に公開されたＷＯ２００６／０２７７９５（２００５年７月１９日出願のＰＣＴ／ＩＮ０５／００２４３）の実施例３および実施例４、ならびに、米国（公開番号：ＵＳ２００７／０２３２６３３）を含む他の多数の国での対応出願に記載されている。これらの公報においては、多形は論じられていない。
驚くべきことに、ある条件下では、式Ｉの化合物の新しい多形が形成されることが発見された。これは、以下にＩＩＩ型結晶として記載され、有利な特性を有する。
本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）の特別な結晶型、その調製方法、この結晶型を含む医薬組成物、およびヒトに対する抗癌剤としてのそれらの使用に関する。ＡＮ−０１９としても公知である式Ｉの化合物は以下のとおりである。
一実施形態においては、本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶に関し、ＩＩＩ型結晶は、後に示す表３に列挙されたＸＲＰＤの特徴を有する。この結晶型は、２４０°Ｃ以上の融点を有し得る。結晶型は本質的に純粋であり得る。
一実施形態においては、本発明は、増殖抑制治療を必要とする対象の治療方法に関する。当該方法のこの実施形態は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶を対象に投与することを含み得る。この場合、ＩＩＩ型結晶は、後に示す表３に列挙されたＸＲＰＤの特徴を有する。
本発明はまた、医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学上許容される賦形剤と、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶とを含有する。ここで、ＩＩＩ型結晶は、後に示す表３に列挙されたＸＲＰＤの特徴を有する。
本発明はまた、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶の使用に関する。ここで、ＩＩＩ型結晶は、腫瘍疾患の治療用の抗増殖性医薬を製造するための、表１に列挙されるＸＲＰＤの特徴を有する。
本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶の調製方法に関する。ここで、ＩＩＩ型結晶は、後に示す表３に列挙されたＸＲＰＤの特徴を有する。この方法は、酢酸、または、ジメチルホルムアミドとアセトン、ヘキサンもしくはトルエンとの混合物でＩ型またはＩＩ型の結晶を有する式Ｉの化合物を処理するステップを含む。この方法はまた、酢酸、アセトン、ヘキサンまたはトルエンで一旦処理された化合物を引き続き処理するステップを含み得る。
別の局面においては、本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩ型結晶に関する。ここで、Ｉ型結晶は、後に示す表１に列挙されたＸＲＰＤの特徴を有する。
別の局面においては、本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩ型結晶に関する。ここで、ＩＩ型結晶は、後に示す表２に列挙されたＸＲＰＤの特徴を有する。
式Ｉの化合物のＩ型結晶のＸ線回折（ＸＲＤ）図を示す。２θ値および強度が表１に示される。 式Ｉの化合物のＩＩ型結晶のＸ線回折（ＸＲＤ）図を示す。２θ値および強度が表２に示される。 式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶のＸ線回折（ＸＲＤ）図を示す。２θ値および強度が表３に示される。 式Ｉの化合物のＩ型結晶の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す図である。 式Ｉの化合物のＩＩ型結晶の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す図である。 式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す図である。 式Ｉの化合物のＩ型結晶の形態を示す図である。 式Ｉの化合物のＩＩ型結晶の形態を示す図である。 式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶の形態を示す図である。 式Ｉの化合物の腹腔内注射（実施例１）によってヌードマウスの白血病が軽減された。尾静脈から得られた血液塗抹標本により、対照群におけるＬＧＩの増加と、イマチニブおよびＡＮ０１９で処置されたマウスにおけるＬＧＩの段階的な減少とが明らかにされた（図１０Ａ）。 式Ｉの化合物の腹腔内注射（実施例１）によってヌードマウスの白血病が軽減された。４８日目に、イマチニブで処置されたマウスのＬＧＩが２０±５であると判断されたのに対して、ＡＮ０１９で処置されたマウスのＬＧＩが、ほぼ標準的な細胞数である１０±２であることが発見された（図１０Ｂ）。 ＡＮ０１９で処置された細胞が脾臓肥大を呈さず、イマチニブで処置されたマウスが脾臓肥大を呈した（実施例２）。 １ｍｇ／ｋｇのＡＮ０１９濃度ではルシフェラーゼ発現の低下が生じなかったのに対して、５ｍｇ／ｋｇでは一定の発現レベルで白血病細胞の固着がもたらされ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ濃度ではルシフェラーゼ発現の低下がもたらされた。 Ｋ５６２ｌｕｃヒト白血病細胞が移植されたヌードマウスにイマチニブ（１、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した結果、より高濃度で白血病が軽減した。ｌｍｇ／ｋｇ濃度のイマチニブの投与ではルシフェラーゼ発現が低下しなかったのに対して、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでは、ルシフェラーゼ発現の遅延が見られた。 対照薬としてダサチニブを使用した、図１２および図１３に示されたのと類似の研究の結果である（実施例１６）。 図１２および図１３に示されたのと類似の研究の結果である（実施例１６）。 図１２および図１３に示されたのと類似の研究の結果である（実施例１６）。 放射線照射有りおよび無しでの、特定濃度のＡＮ−０１９、ＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞についてのｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイ。 放射線照射有りおよび無しでの、特定濃度のＡＮ−０１９、ＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞についてのｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイ。 放射線照射有りおよび無しでの、特定濃度のＡＮ−０１９、ＡＮ−０２４の存在下での４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ。 放射線照射有りおよび無しでの、特定濃度のＡＮ−０１９、ＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞についてのウエスタンブロット解析。 ＡＮ０２４、ＡＮ０１９またはイマチニブでの処置後の、Ｋ５６２ １ｕｃが移植されたマウスのルシフェラーゼ発現。 ５８日目のＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後に治癒した動物の数。薬物治療を４２日目に中止し、動物が、薬物治療の中止後にＡＮ０２４およびＡＮ０１９で処置した後に治療効果を示し続けた（発光に基づいたデータ）。 示された日において動物から得られた血液塗抹標本からの芽細胞数。薬物治療は４２日目で中止した。ＡＮ０２４およびＡＮ０１９は、薬物治療の中止後において、有効性を示した。イマチニブは効果がないことが分かった。 放射線照射（５Ｇｙ）有りまたは無しで、ＴＭＺ、ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後のヌードマウスにおける頭蓋内腫瘍の半定量分析。 放射線処置無しでの、ＡＮ０１９、ＡＮ−０２４での薬物治療後において頭蓋内腫瘍が無いことを示すヌードマウスのグラフ図。
発明の詳細な説明
表１は、図１のＸ線回折（ＸＲＤ）図からの式Ｉの化合物のＩ型結晶の２θ値および強度を示す。
表２は、図２のＸ線回折（ＸＲＤ）図からの式Ｉの化合物のＩＩ型結晶の２θ値および強度を示す。
表３は、図３のＸ線回折（ＸＲＤ）図からの式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶の２θ値および強度を示す。
式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶は、針状晶によって特徴付けられる。式Ｉの化合物のＩ型およびＩＩ型の結晶は、非針状の結晶によって特徴付けられる。
式Ｉの化合物のＩ型およびＩＩ型の結晶は、室温で準安定である。しかしながら、式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶は、室温では熱力学的に安定な結晶型である。これは、ＩＩＩ型結晶のより高い安定性を示している。
従って、一実施形態においては、本発明によって提供される式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶は、室温や、さらにより高温（たとえば１２０°Ｃ）で、かつ高い応力条件では安定であり、表３（上述）に記載される特徴を備える。
一実施形態においては、本発明は、表３に記載される特徴を備え、安定な式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶の調製方法を提供する。
表４は、１１０〜１４０°Ｃの温度でのＩＩＩ型結晶の熱安定性を示す。ＩＩＩ型は、６時間、１３０°Ｃで加熱された場合に準安定ではなく、安定であることが示された。
この方法によって調製された純粋なＩＩＩ型結晶（１ｇ）を沸騰管に配置し、油浴中で徐々に加熱した。次いで、ＸＲＰＤによって物質を検査した。結果を表４に示す。
このデータは、ＩＩＩ型結晶が準安定ではなかったことを実証している。ＩＩＩ型結晶は、６時間にわたる１３０°Ｃへの加熱に対しても安定であった。
表５は、バルクおよびカプセル製剤における高い応力条件（４５±２°Ｃ、７５±５％ ＲＨ、６か月）下でのＩＩＩ型結晶の安定性を示す。
このデータは、ＩＩＩ型が、ある期間にわたって他の結晶型に転化されないことを実証している。バルクおよび製剤カプセル中のＩＩＩ型の安定性がこうして確立された。
一実施形態においては、本発明は、式Ｉの化合物の安定なＩＩＩ型結晶を含有する、腫瘍治療に有用な医薬組成物を提供する。
本発明の方法で調製できる安定なＩＩＩ型結晶を含有する製剤の剤形は、たとえば経口投薬形態であり、組成物、たとえば粉末状または粒状の固形組成物を硬質または軟質の外皮内に含有するカプセルであってもよい。外皮は、グリセリンもしくはソルビトールなどの可塑剤、および乳白剤または着色剤を任意に含むゼラチンから作成されてもよい。
カプセルの中にＩＩＩ型結晶を含有する医薬組成物を調製するために、当該技術において公知の方法を使用してもよい。使用され得る賦形剤は、微結晶性セルロース、ポロキサマー４０７、クロスポビドンＸＬ、アエロジル、ＳＬＳ、ステアリン酸マグネシウムまたはその混合物を含む。
表６は、本医薬製剤のための活性成分および賦形剤の好適な量（重量％）を示す。
一実施形態においては、本発明は、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）の特別で、本質的に純粋なＩＩＩ型結晶に関する。「本質的に純粋」という語は、本発明の文脈においては、本発明の結晶型、たとえばＩＩＩ型結晶の中に、式Ｉのその結晶が約９０〜１００ｗｔ％、約９５〜１００ｗｔ％、または、たとえば約９９〜１００ｗｔ％、存在していることを意味していると理解される。
式ＩのＩＩＩ型結晶が本質的に図３と同様のＸ線回折図を呈することを述べる文脈においては、「本質的に」という語は、図３に示される図の少なくとも主要な線、すなわち、当該図における最も強い線に対して１０％、特に２０％を上回る相対的な線強度を有するもの、が存在していることを意味している。
結晶型は以下の特性を備える。
ＩＩＩ型結晶のＤＳＣサーモグラムにおける融点は、２４６．７°Ｃである。Ｉ型結晶のＤＳＣサーモグラムにおける融点は、２３４°Ｃであり、ＩＩ型結晶は２４０．４７°Ｃ、２４９．２°Ｃ（ピーク）である。
Ｘ線回折図はまた、他の顕著な違いを示す。一実施形態においては、式Ｉの化合物の本質的に純粋なＩＩＩ型結晶は、図３に示されるＸ線回折図を示す。
一実施形態においては、本発明は、図９に示される結晶型を表す結晶の存在によって特徴付けられる式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶、たとえば本質的に純粋なＩＩＩ型結晶、に関する。
一実施形態においては、式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶は、２４０°Ｃよりも高い、たとえば２４５°Ｃ〜２５０°Ｃの融点を有する。
（たとえば、本質的に純粋な）ＩＩＩ型結晶は以下の方法：
式Ｉの化合物の別の結晶型、たとえばＩ型またはＩＩ型の結晶、を適切な極性溶媒、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドもしくはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどのＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−低級アルカンカルボキサミド、または、たとえば、酢酸などの脂肪族カルボン酸、またはこれらとアセトンなどのケトンとの混合物、または、疎水性炭化水素、たとえばトルエンもしくはヘキサン、またはそれらの混合物を用いて、適切な温度で処理する方法によって入手可能である。
一実施形態においては、式Ｉの化合物は、ジメチルホルムアミドとアセトンとの混合物で処理された後、アセトン中で処理される。一実施形態においては、式Ｉの化合物は、ジメチルホルムアミドとヘキサンとの混合物で処理された後、ヘキサン中で処理される。一実施形態においては、式Ｉの化合物は、ジメチルホルムアミドとトルエンとの混合物で処理された後、トルエン中で処理される。一実施形態においては、式Ｉの化合物は、酢酸で１回以上処理される。この文脈においては、処理（treating、treatment）とは、溶媒または溶媒の混合物中での加熱、冷却、還流、洗浄、懸濁などを指している。これらの実施形態の各々では、式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶が産出される。
いくつかの実施形態においては、ＩＩＩ型結晶を生成する当該方法は、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、エーテル（たとえばジエチルエーテル）、水、酢酸エチルまたはそれらの混合物で式Ｉの化合物の別の結晶型を処理することは含んでいない。いくつかの実施形態においては、ＩＩＩ型結晶は、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、エーテル（たとえばジエチルエーテル）、水、酢酸エチルまたはそれらの混合物で式Ｉの化合物の別の結晶型を処置することによっては生成されなかった。
式Ｉの化合物のＩＩＩ型結晶および他の型も、有用な薬理学的特性を有しており、たとえば抗腫瘍剤として使用されてもよい。
本発明はまた、式Ｉの化合物の調製方法を含む。この方法は以下のステップを含み得る。
式ＶＩの化合物である３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを準備するステップ、または公知の方法によってこの化合物を供給するステップ；
４−メチル−３−ニトロ−アニリンと、式（ＩＶ）の化合物を、塩基性化合物が加えられた塩化炭化水素溶媒中で、約０°Ｃ〜約−１０°Ｃで縮合させて、式ＩＩＩの化合物である（（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（４−メチル−３−ニトロフェニル）−）−ベンズアミドを得るステップ；
式（ＩＩＩ）の化合物を還流温度で、約０．５〜約１時間、塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、式ＩＶの化合物である（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−アミノ−４−メチルフェニル）−）−ベンズアミドを得るステップ；
式ＩＶの化合物とシアナミド水溶液を、還流温度で、ｎ−ブタノール溶媒中、縮合させて、式Ｖの化合物である（３，５−ビス−トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−グアニジノ−４−メチルフェニル）−ベンズアミドを得るステップ；および
式（Ｖ）の化合物と３−ジメチルアミノ−ｌ−ピリジン−３イル−プロペノンを、塩基の存在下、還流温度で縮合させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップ。
一実施形態においては、当該方法は実施例１０に記載のとおりに実現される。
２００７年３月５日に出願された米国特許出願第１１／７１４，５６５号（２００７年１０月４日に公開された米国公報ＵＳ２００７／０２３２６３３）の開示、および、２００５年７月１９日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＮ２００５／０００２４３（２００６年３月１６日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２７７９５）の開示は、それら全体が引用によってこの明細書中に組込まれる。
本発明の実施形態は、以下に述べられた実施例に記載されている。これらの実施例は、本発明を例示するためだけに提示されたものであり、このため、発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
一般的注釈
（開発コードＡＮ−０１９によって示される）式Ｉのこの発明の主要な化合物は、このクラスの既存の承認薬のうちのいくつかより優れた有用な抗腫瘍活性を呈することが判明した。この化合物は、上述のとおり３つの異なる多形Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型を示すことが判明した。これらの結晶型はすべて、有用な薬理学的特性を呈しており、抗腫瘍剤として使用され得るが、ＩＩＩ型は、その熱力学的安定性に基づいて生物学活性の評価のために選択された。開発コードＡＮ−０２４は、発明者によって別記された同じクラスの別の化合物を指す。この発明の化合物の生物有効性および活性は、この研究の陽性対照群としてイマチニブメシラートおよびダサチニブのような承認薬と比較された。「イマチニブメシラート」は、この研究においては「イマチニブ」として短縮されて称された。
実施例１−ｋ５６２細胞が移植されたがヌードマウスでのＡＮ−０１９の抗ＣＭＬ活性の確立（図１０Ａおよび図１０Ｂ）
この発明の化合物の抗ＣＭＬ活性を測定するために、ＡＴＣＣからＫ５６２細胞を得て、ヌードマウスにこれらの細胞を移植した。対照群として、イマチニブは、比較用に、ｋｇ体重毎に同じ濃度で使用された。薬物処置を移植後１５日で開始し、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉｐ）注射を毎日、４８日間続けた。血液を、６日おきに尾静脈から得て、百分率Ｋ５６２細胞を決定し、百分率白血病成長指数（percent leukemia growth index：ＬＧＩ）を計算した。
ＡＮ０１９で処置されたマウスは、薬物処置の開始後にＬＧＩの安定した低下を呈した。イマチニブで処置されたマウスのＬＧＩも低下を示したが、ＡＮ０１９で処置されたマウスよりも著しく遅れていた。連続的な腹腔内注射後４８日目に、ＡＮ０１９で処置されたマウスは正常対照群マウスと類似しており、イマチニブで処置されたマウスは、対照群と比較すると、２０±５のＬＧＩを示した。Ｃｒｋタンパク質用の脾臓の免疫組織化学により、対照群マウスの脾臓にＫ５６２細胞の局在化が示された。ＡＮ０１９で処置されたマウスはＣｒｋ発現の基礎レベルを示したのに対して、イマチニブで処置されたマウスではＣｒｋの検出不可能な発現レベルほどに低いコロニーはほんのわずかであった。
方法
Ｋ５６２移植
ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に尾静脈を介してＫ５６２細胞（１ｘ１０6）を移植した。１群当たり４匹のマウスを用い、４つの群に分けた。３つの群にＫ５６２細胞を移植し、１つの群を正常対照群として使用した。群２にはＫ５６２細胞を接種させて、未処置の陽性対照群として機能させた。Ｋ５６２細胞を移植した他の２つの群をイマチニブまたはＡＮ０１９で処置した。
ＡＮ０１９およびイマチニブの腹腔内注射
Ｋ５６２が移植されたマウスは、腹腔内注射によってイマチニブまたはＡＮ０１９で処置された（１０ｍｇ／体重ｋｇ）。イマチニブおよびＡＮ０１９の貯蔵液はＤＭＳＯにおいて１００μｇ／μｌの濃度で作製した。マウスには上述の投与量で腹腔内経路を介して注射した。ヌードマウスの平均重量は３０±３ｇであると判断され、マウス当たりの投与量は３００±３０μｇ／匹と計算された。３μｌの貯蔵液を、腹腔内注射に先立って滅菌水で１００μｌに希釈した。移植後１５日目から４８日目まで毎日、合計３３回、腹腔内注射を行なった。
白血病成長指数（ＬＧＩ）の決定
白血病成長指数を、式ＬＧＩ（％）＝（ＶC−Ｖt）／ＶC´１００％を用いて決定した。ＶCは、特定の測定の時間での対照群動物の血液１ｍｌ当たりの平均芽細胞数（Ｋ５６２）である。また、Ｖtは、特定の測定の時間での試験動物中の血液１ｍｌ当たりの平均芽細胞数である。Ｋ５６２細胞移植後、６日目にマウス（処置済みおよび未処置）から血液を採取し、その後、４８日間、６日間隔毎に採取した。血液は尾静脈を介して採取した。ＬＧＩの定量分析をグラフで表わした。
免疫細胞化学
二次性白血病の症状、たとえば、腹部の膨満や、皮膚表面下の赤色斑を伴い指の損失を引起こす抹消部位での循環不足などが観察された場合、４２日目に対照群マウスを犠牲にした。脾臓および如何なる二次性腫瘍も、標準試験計画書に従って、摘出し、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片を得て、免疫細胞化学的に処理した。再水和された切片を０．３％のＨ2Ｏ2で処置して、免疫プローブの前に天然のペルオキシダーゼを不活性化した。切片を、室温で、１時間、フィルタ殺菌された（０．２２μｍ）１％のＢＳＡ−ＰＢＳでブロックした。ブロック後、ヒトＣｒｋＬタンパク質（Ａｂｃａｍ（米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ））のＮ末端付近のＳＨ２領域の一部に対応する合成ペプチドに対してウサギ中に生成されたヒト特有の抗Ｃｒｋのモノクローナル一次抗体で、切片を、一晩、１％のＢＳＡ−ＰＢＳ中で、免疫プローブした。ＨＲＰに接合された二次抗体（抗ウサギ）を用いて、一次抗体の存在を検出した。二次抗体での免疫プローブ後、切片をＰＢＳ溶液中で簡単に３回すすぎ、製造業者（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ（米国、ミズーリ州）の指示書に従って、ＤＡＢ ＨＲＰ基質を加えた。陽性対照群と陰性対照群との顕著な差が観察されるまで、反応を進めさせた。陰性対照群については、一次抗体を除去した。白血病マウスの脾臓は陽性対照群としての役割を果たした。
結果
ＡＮ０１９の腹腔内注射により、ヌードマウスの白血病が軽減した。移植後６日毎に採取された血液塗抹標本では、未処置のマウスに比べて対照群にＬＧＩの増加が見られた。尾静脈から得られた血液塗抹標本は、対照群でのＬＧＩの増加と、イマチニブおよびＡＮ０１９で処置されたマウスのＬＧＩの段階的な低下とを示した（図１０Ａ）。移植後１５日目から、マウスに、１０ｍｇ／体重ｋｇの投与量でＡＮ０１９またはイマチニブを腹腔内注射で投与した。イマチニブで処置されたマウスは、ＡＮ０１９で処置されたマウスよりもすべてのデータポイントで遅れていた。４８日目に、イマチニブで処置されたマウスのＬＧＩが２０±５であると判断されたのに対して、ＡＮ０１９で処置されたマウスのＬＧＩが、ほぼ標準的な細胞数である１０±２であることが判明した（図１０Ｂ）。
実施例２−Ｋ５６２細胞を移植したヌードマウスのＡＮ０１９注射では脾臓肥大を示さず、Ｃｒｋ発現もなかった（図１１）
Ｋ５６２細胞が移植されたヌードマウスを、腹腔内注射剤によってイマチニブまたはＡＮ０１９で処置した。ＬＧＩの低下が観察された後、マウスを犠牲にして、脾臓を採取した。全体観察により脾臓肥大を観察した。また、対照群マウスがＫ５６２細胞の局在化を示す肥大化した脾臓を呈したと判断された。ＡＮ０１９で処置された細胞は脾臓肥大を呈さなかったのに対して、イマチニブで処置されたマウスでは脾臓がわずかに肥大していた（図１１）。Ｃｒｋタンパク質の存在について免疫プローブされた脾臓のパラフィン切片が、対照群マウスにおけるＫ５６２局在化を示す細胞密度の増大に伴うＣｒｋ発現の強い局在化を示した。ＡＮ０１９で処置されたマウスは、陰性対照群に類似するＣｒｋ発現の基礎レベル発現しか示さなかった。イマチニブで処置されたマウスは、脾臓中のＫ５６２細胞を示す、Ｃｒｋ発現のある局所的な発現領域を呈した。対照群マウスには、また、Ｋ５６２細胞の存在を示す、Ｃｒｋ発現を示すランダムな皮下腫瘍が生じていた。
これらの結果から、ＡＮ０１９での処置がヌードマウスのＬＧＩの低下を引き起こしたことは明らかである。イマチニブで処置されたマウスはまた、ＬＧＩの著しい低下を示したが、ＡＮ０１９で処置されたマウスよりも遅れていた。ＡＮ０１９およびイマチニブの両方で処置されたマウスは異常な生理学、表現型または行動の異常を示さなかった。対照群マウスは、腹部のわずかな膨満や皮膚下の赤みがかった斑点を伴って、指の損失を伴うランダムな皮下腫瘍の存在を示した。これらの結果から、ＡＮ０１９が白血病の処置に有望な治療薬剤を提供することは明らかである。
実施例３−Ｂａｆ３イマチニブ耐性ネズミＣＭＬ細胞株を用いるｉｎ ｖｉｖｏ研究
ＡＮ０ｌ９およびＡＮ０２４のｉｎ ｖｉｖｏ抗白血病活性を判断するために、ヌードマウスに、Ｂａｆ３ネズミ白血病細胞（Ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２２５Ｋ）を腹腔内移植し、移植の１５日後に、マウスを、強制経口投与または腹腔内注射によって、イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。血液塗抹標本を尾静脈または大腿静脈から６日おきに得て、芽細胞を数えて、グラフに表わした。
イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＢａｆ３Ｗｔ移植マウスの血液塗抹標本は、４２日後において、正常な対照群と同様であった。
イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）またはＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＢａｆ３Ｔ３１５Ｉ移植マウスの血液塗抹標本は、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９で処置されたマウスにおいて芽細胞数の有意な減少を示した。イマチニブの経口投与で処置されたマウスは、芽細胞数の減少を示さず、処置していない対照群およびＢａｆ３Ｍ３５１Ｔ移植マウスと同様であった。
Ｂａｆ３Ｅ２５５Ｋを移植されたマウスも、Ｂａｆ３Ｍ３５１ＴおよびＢａｆ３Ｔ３１５Ｉ移植マウスと同様に振舞った。
Ｂａｆ３突然変異細胞Ｗｔ、Ｅ２５５Ｋ、Ｔ３１５ＩおよびＭ３５１Ｔを移植されたヌードマウスを、イマチニブ、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４で（経口および腹腔内で）処置した。簡潔に言うと、マウスは、移植後１５日で、強制経口投与または腹腔内注射によって、イマチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＮ０１９（２０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＮ０２４（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置された。腹部膨満および活動の減少を毎日監視し、血液塗抹標本を６日おきに尾静脈または大腿静脈から得て、標準試験計画書に従ってＨ＆Ｅ染色した。移植の４２日後に、マウスを犠牲にして、脾臓を摘出した。脾臓肥大が判断され、血液塗抹標本芽細胞数と関連付けられた。
結果
芽細胞数の顕微鏡測定
尾静脈または大腿静脈からの血液を、Ｂａｆ３細胞移植マウスから６日おきに４２日目まで得た。移植後１５日目に、マウスを、先に述べたように（経口および腹腔内で）イマチニブ、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４で処置した。Ｂａｆ３Ｗｔ移植マウスでは、芽細胞数の漸進的な減少がすべての処置条件において観察されたことが観察された。Ｂａｆ３Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋは、イマチニブ処置に十分に反応しなかった。イマチニブの経口投与は、Ｂａｆ３Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋ移植マウスにおいて有意な効果はなかった。全体的な腹腔内処置ＡＮ０２４およびＡＮ０１９は、すべてのＢａｆ３移植マウスにおいて芽細胞数を減少させることにおいて、有意に、より優れていた。
Ｂａｆ３Ｗｔ移植マウスにおけるＡＮ０１９処置は、白血病芽細胞の完全な退行を引き起こし、処置していない対照群と類似した。腹腔内処置は経口処置より優れていた。Ｂａｆ３ Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋ移植マウスにおけるＡＮ０１９処置は、芽細胞数の有意な減少を示し、４２日目において腹腔内処置されたマウスにおける移植後１２日目と類似した。また、腹腔内処置されたマウスは、経口処置されたマウスより芽細胞の大きな退行を示した。Ｂａｆ３ Ｍ３５１Ｔ、Ｔ３１５ＩおよびＥ２２５Ｋ移植マウスにおけるＡＮ０２４処置は、芽細胞数の有意な減少を示し、４２日目においてＡＮ０１９処置より優れていた。また、腹腔内処置されたマウスは、経口処置されたマウスより芽細胞の大きな退行を示した。
実施例４−Ｋ５６２正常／Ｌｕｃヒト白血病細胞を移植されたヌードマウスの、低用量のＡＮ０２４、ＡＮ０１９およびイマチニブでの、反応（図１２および図１３）
ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、Ｋ５６２細胞（１ｘ１０６）正常／ｌｕｃを、尾静脈を介して移植した。１つの群につき５匹のマウスを使用し、２４の群と２つの対照群とに分けた。すべての群にＫ５６２正常／ｌｕｃ細胞を移植した。２４の群のうち、１２の群をルシフェラーゼ研究に用い、他の１２の群は血液塗抹標本数研究に用いられた。
ＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびイマチニブの経口投与
薬剤は、強制経口投与によって投与された（水性懸濁液における２％アラビアゴムおよび２％ＳＬＳ）。
結果
Ｋ５６２ｌｕｃヒト白血病細胞を移植されたヌードマウスにおけるＡＮ０１９（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、より高い濃度において、白血病退行をもたらす結果となった。１ｍｇ／ｋｇのＡＮ０１９濃度は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こさなかったが、５ｍｇ／ｋｇでは、一定の発現レベルで白血病細胞の固着を引き起こし、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの濃度では、ルシフェラーゼ発現の低下を引き起こした（図１２）。Ｋ５６２ ｌｕｃのヒト白血病細胞が移植されたヌードマウスに対するイマチニブ（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、結果として、より高い濃度で白血病の退行をもたらした。ｌｍｇ／ｋｇ濃度でのイマチニブの投与は、ルシフェラーゼ発現の低下を引き起こさなかったのに対して、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇではルシフェラーゼ発現の遅延を示した（図１３）。
研究においては、特に２４日間の処置後、イマチニブよりもＡＮ−０１９の方が白血病を退行させるのに優位性を示していた。
実施例５−薬物有効性（Ｄ e ）および一時の薬物浸透度（drug temporal penetrance）の測定
薬物有効性（Ｄ e ）の測定
薬物有効性は、以下の等式Ｄe＝
を用いて測定した。ここで、Σａｌｉｖｅは、濃度毎の、実験の終わりでの生存するマウスの総数×光子数である。Σｌｕｃは、濃度毎の、実験の終わりでルシフェラーゼ発現を示した生存するマウスの総数（ｃは対照群未処置動物である）×光子数である。Σc-initialは、実験の開始時における対照群の動物の最初の数×光子数である。結果を、グラフで、百分率薬物有効性として表わした（表７）。
結果
表７は、ｉｎ ｖｉｖｏ研究から測定される、さまざまな濃度のイマチニブ、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４での薬物有効性を示す。表７から、ＡＮ０１９は用量依存的態様でふるまい、イマチニブおよびＡＮ０２４はそうではなく、低い濃度で有効であった。
一時の薬物浸透度（Ｔ p ）の測定
一時の浸透度は、以下の等式Ｔp＝
を適用して計算した。ここで、Ｐは、日「ａ」、日「ｔｅｒ」または日「ｂ」における光子数である（ここで、「ａ」は薬物処置を中止した日であり、「ｔｅｒ」は実験を終了した日であり、「ｂ」は日「ａ」の後かつ日「ｔｅｒ」前においてＰが最小であった日である）。ｎは、Ｐが測定されたときに生存していた動物の数である。
値が大きいほど、薬物処置を中止した後の薬物の有効性、つまり経時的な薬物の透過度がより大きいことを示す。
結果
ＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびイマチニブの一時の浸透度を測定するために、ヌードマウスにＫ５６２ｌｕｃ細胞を移植した。移植後、動物を６日間隔で撮影した。薬物処置（ＡＮ０１９を２０ｍｇ／ｋｇ、ＡＮ０２４を２０ｍｇ／ｋｇおよびイマチニブを１０ｍｇ／ｋｇ）を移植後１５日で開始して、腹腔内注射を毎日行なった。薬物処置を３５日目に中止し、動物を４５日目まで撮影し、方法において記載されるように計算した。
一時の浸透度に対する等式を適用することにより、Ｔp値を以下のように判断した：
ＡＮ０１９＝２．０
ＡＮ０２４＝２．４
イマチニブ＝０．８
これらのＴpの値は、ＡＮ０２４が、未処置の対照群よりも活性を有し、薬物処置の中止後の経時的な活性に関してＡＮ０１９よりも良いことを示している。
実施例６−ＡＮ０２４、ＡＮ０１９およびイマチニブと比較した際の、Ｂａｆ３移植ヌードマウスにおけるダサチニブの効果（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ）
実施例３は、Ｂａｆ３（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴおよびＥ２５５Ｋ）突然変異細胞株を用いて、イマチニブと比較して、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９が白血病治療に有効であることを示した。ここで、我々は、ダサチニブを対照薬として用いて、ＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびイマチニブと比較して、Ｂａｆ３突然変異細胞の処置に対する反応を測定した。
方法
実験の概要を以下に表の形式で示す：
ヌードマウスにＢａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴまたはＥ２５５Ｋ）を腹腔内移植した。移植後１５日で、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇダサチニブで、２７日間、経口または腹腔内処置した。血液を大腿静脈または尾静脈から６日毎に採取し、芽細胞数を測定し、グラフで表わした。
結果
６日目において、Ｂａｆ３突然変異細胞（ｗｔ、Ｔ３１５Ｉ、Ｍ３５１ＴまたはＥ２５５Ｋ）を移植されたヌードマウスの血液塗抹標本は正常な芽細胞数を示し、芽細胞数は１２日目に観察した通り、漸進的に増大した。ダサチニブ処置を移植後１５日目に開始した。ダサチニブ処置はイマチニブより良いことはなかった。４２日目に、実験を終了し、ｗｔ細胞を移植されたマウスはダサチニブに対して有意な反応を示し、腹腔内処置は経口処置よりも優れていることを示した。Ｔ３１５Ｉ細胞およびＭ３５１Ｔ細胞を移植されたマウスは対照群と同様にふるまい、芽細胞数における有意な減少はなかった。Ｅ２５５Ｋを移植されたマウスは、ダサチニブ処置に対する反応に関して、Ｔ３１５Ｉ移植細胞よりもほんの僅かに良好であるだけであった。全体的なダサチニブ処置は、白血病の進行における遅延を引き起こしたのみであり、どのような有意な治療効果もなかった。芽細胞数は、ＡＮ０１９で処置された群においては著しく少なかった。これらの結果を図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃに示す。
実施例７−神経膠腫細胞株および乳癌細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究（図１５〜図１８）
材料および方法
放射線照射有り、または放射線照射無しでの、神経膠腫細胞および乳癌細胞に対するＡＮ０１９、ＡＮ０２４およびテモゾロマイドの効果を測定するために、細胞を指定された用量で処理し、浸潤、血管新生および特定のシグナル伝達分子の変化を測定した。
マトリゲル浸潤アッセイ
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤性を、修正されたボイデンチャンバー法を用いて評価した。細胞はこれらの化合物で４８時間処置された。１ｘ１０6個の細胞を、０．２％ＢＳＡを補われた６００μｌの無血清培地において懸濁し、マトリゲル（０．７ｍｇ／ｍｌ）で被覆されたトランスウェルチャンバー（Corning Costar Fischer Scientific Cat #07-200-158, Pittsburgh PA）の上部区画に配置した。このチャンバーの下部区画は２００μｌの血清培地で満たされ、細胞を２４時間、遊走させた。インキュベーションの後、細胞を固定し、Ｈｅｍａ−３で染色し、先に記載の通り、定量した（モハナムら（Mohanam et al.）１９９３年）。遊走した細胞を顕微鏡下で撮影し、この発明の化合物によって引き起こされる浸潤性の低減を測定した。
血管新生アッセイ
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生を以下のように測定した。細胞（２ｘ１０４／ウェル）を８ウェルチャンバスライドに接種し、さまざまな濃度の試験化合物で処理した。２４時間のインキュベーション期間の後、馴化培地を除去し、４ｘ１０４のヒトの皮膚内皮細胞（８ウェルチャンバースライドにおいて単層）に加え、ヒトの皮膚内皮細胞を７２時間成長させた。次いで、細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈ＆Ｅで染色し、撮影した。
ウェスタンブロット解析
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウェスタンブロット解析を、標準試験計画書に基づいて評価した。細胞は、所定濃度のＡＮ０１９、ＡＮ０２４またはテモゾロマイドで処理された。処理の２４時間後、細胞を集め、細胞溶解物を抽出した。等しい量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。分画されたタンパク質を、ナイロンメンブレン上にブロットし、ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＰｉ３ｋに関して免疫プローブした。乳癌細胞の単離タンパク質を、さらに、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３に対して免疫プローブした。
結果
マトリゲル浸潤アッセイ
所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を、修正されたボイデンチャンバー法を用いて評価した。細胞はこれらの化合物で４８時間処理された。表２は、放射線照射有り、および放射線照射無しでの、所定濃度の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイの研究からの結果を示す。
さまざまな細胞株の浸潤性における変化を表８に示す。この浸潤アッセイから、ＡＮ０１９およびＡＮ０２４は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、細胞の大半において浸潤を阻害することに最も効果的であったことは明らかである。
図１５および図１６は、所定の濃度のＡＮ０１９の存在下における、放射線照射有り、および放射線照射無しでの、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。
血管新生アッセイ
血管新生アッセイ実験から、ＡＮ０１９が、血管新生を阻害することにおいて最も効果的であったことが観察される。
テモゾロマイド処置はＺＲ−７１細胞において完全な血管新生阻害を引き起こし、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照条件において、放射線照射後における阻害の増加を伴う形で、ほんの僅かな阻害が観察されたのみであった。神経膠腫異種移植片細胞４９１０は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、血管新生の有意な阻害を示した。５３１０細胞の場合、血管新生阻害は対照条件において見られ、一方、血管新生は、放射線照射処置の後、促進された。Ｕ８７神経膠腫細胞は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、同様の阻害パターンを示した。
ＡＮ０２４処置はＺＲ−７１細胞において完全な血管新生阻害を引き起こしたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照および放射線照射処置においてほんの僅かな阻害が観察されたのみであった。神経膠腫異種移植片細胞４９１０は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、有意な血管新生阻害を示した。５３１０細胞の場合では、血管新生阻害は対照条件において見られ、一方、血管新生は、放射線照射処置の後、さらに阻害された。Ｕ８７神経膠腫細胞は、放射線照射後に阻害の増加があり、血管新生において有意な遅延を示した。
ＡＮ０１９処置はＺＲ−７１細胞において完全な血管新生阻害を引き起こしたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照および放射線照射処置の両方において、僅かな阻害が観察された。神経膠腫異種移植片細胞４９１０は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と同様の血管新生阻害を示し、放射線照射後に血管新生阻害の増加があった。５３１０細胞の場合、血管新生阻害は、対照条件においては、放射線照射処置後よりも大きかった。Ｕ８７神経膠腫細胞は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、血管新生における同様の有意な遅延を示した。
図１７は、放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０１９の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイから得られた結果を示す。
ウェスタンブロット解析
所定濃度のこの発明の化合物の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウェスタンブロット解析により、以下のことが示された。Ｕ８７細胞は、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、ＡＫＴレベルまたはＰＩ３ｋレベルにおいて有意な変化を示さなかったが、ＡＮ０２４で処置された細胞においてはＥＲＫレベルの僅かな減少が観察され、減少は、放射線照射後、さらに進んだ。４９１０細胞は、Ｕ８７細胞と同様にふるまい、ＡＫＴレベルの減少がＡＮ０２４処置の後に見られ、そのＡＫＴレベルの減少は、放射線照射後、さらに進んだ。５３１０細胞の場合、ＥＲＫ発現には有意な観察可能な差異は見られなかったが、ＡＮ０１９処置ではＡＫＴ発現レベルの低下が生じた。ＰＩ３ｋのレベルは、ＡＮ０１９で処置された細胞においては、放射線照射無しの状態では殆ど検出不可であったが、放射線照射処置の後、再び現れた。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合は、ＡＫＴ、ＥＲＫまたはＰＩ３ｋにおける有意な変動は見られなかったが、ＺＲ７１の場合には、ＡＮ０１９処置によって、ＡＫＴレベルの低下が生じ、それは放射線照射後、さらに進んだ。ＡＮ０２４処置は放射線非照射条件下においてどのような有意な変動も示さなかったが、放射線照射後、ＡＮ０２４で処置された細胞はＡＫＴ発現の減少を示した。ＰＩ３ｋレベルは、ＡＮ０１９処置においては、放射線照射有り、および放射線照射無しの両方において、存在しなかった。ＡＮ０２４処置では、放射線照射後、ＰＩ３ｋレベルの低下を引き起こした。ｐＡＫＴのレベルは、放射線照射があってもなくても、どの処置においても有意な変動はなかったが、ｐＥＲＫのレベルは、特に、ＡＮ０１９で処置された細胞において、放射線照射有りおよび放射線照射無しの両方において有意に減少し、ＡＮ０２４も、ｐＥＲＫレベルの低下を示したが、その程度はＡＮ０１９よりも少ないものであった。テモゾロマイド処置は、放射線照射有りおよび放射線照射無しの両方において、活発なレベルのｐＡＫＴにおいて有意な変化を全く示さなかった。
図１８は、放射線照射有りおよび無しでの、所定濃度のＡＮ−０２４の存在下での、４９１０、５３１０およびＵ８７神経膠腫細胞ならびにＭＤＡＭＢ２３１およびＺＲ７１乳癌細胞のウエスタンブロット解析の結果を示す。
実施例８−白血病生存研究（図１９〜図２１）
Ｋ５６２ルシフェラーゼ発現細胞をヌードマウスに腹腔内移植した。ルシフェリンの腹腔内注射投与の後、ｘｅｎｏｇｅｎｙ ＩＶＩＳ撮影ステーションを用いてマウスを走査することにより、移植を判断した。薬物処置を、先の研究の通り、移植後１５日目に開始した。動物に対し、４２日目まで処置を施し、その後、薬物処置を中止し、動物の生存を動物健康管理規定に従って判断した。対照群動物は白血病を発症し、死亡が３４日目および３５日目に生じたことが観察され、規定に従い、我々は、残りの８匹の動物を３５日目で犠牲にするよう勧告された。薬物処置を移植後４２日目で中止し、動物の生存を判断した。
ＡＮ０２４で処置された動物は３８日目で死亡を示し、死亡した動物に対するさらなる調査では、脾臓肥大は示されず、死因は白血病以外のものであると判断され、血液塗抹標本は死亡した動物から採取することができなかった。用いられた１０匹の動物のうち、８匹は、５５日目において、白血病の兆候を全く示さなかった。
ＡＮ０１９で処置された動物は全く死亡せず、１０匹のうちの７匹は、白血病の症状が完全に無いことを示した。
イマチニブで処置された動物は、薬物処置中止後において再び白血病の症状が生じたことを示し、５５日目、５６日目、５７日目、５８日目に死亡した。生存している動物は白血病の症状があることを示した。
図１９は、ＡＮ０２４、ＡＮ０１９またはイマチニブでの処置後、移植されたマウスから得られるＫ５６２ｌｕｃのルシフェラーゼ発現の量を示す。
図２０は、ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後、５８日目において治癒した動物の数を示す。薬物処置を４２日目で中止した。動物は、ＡＮ０２４およびＡＮ０１９の処置後、薬物処置の中止後において、治癒効果を示し続けた。
図２１は、示された日において動物から得られた血液塗抹標本からの芽細胞数を示す。薬物処置を４２日目で中止した。ＡＮ０２４およびＡＮ０１９は薬物処置の中止後において効果を示した。
実施例８Ａ−ＥＤ 50 、ＬＤ 50 、ＭＴＤおよび治療指数に関する研究
以下の表は、イマチニブと比較した、この発明の化合物のＥＤ50、ＬＤ50、先に引用したＭＴＤ（最大許容用量）および治療指数をまとめたものである。方法は、J, Pharmacol. Exp. Ther., （1949）, 96: 96-113に従って用いられた。
実施例９−神経膠腫放射線照射研究（図２２および図２３）
ヌードマウスに、４９１０ヒト神経膠腫異種移植片細胞（１ｘ１０6個の細胞）を頭蓋内移植した。移植後１０日で、マウスを、ＡＮ０１９、ＡＮ０２４またはテモゾロマイドを用いて、放射線照射（５Ｇｙ／週）有りまたは無しで処置した。実験は移植後４０日目で終了した。
その結果から、対照群の動物の１００％が頭蓋内腫瘍を生じ、放射線照射のみでは腫瘍のサイズの低減には殆ど効果はなかったことが観察された。ＴＭＺ単独で処置された動物は頭蓋内腫瘍の低減を示し、１０匹のうち３匹には腫瘍が完全に見られなかった。放射線照射処置をＴＭＺ投与と組合せたものは、腫瘍のサイズにおいてさらなる退行を生じさせ、動物は、頭蓋内圧の症状（arched back）がより少なくなり、この場合においては、１０匹のうち２匹が観察可能な頭蓋内腫瘍を示さなかった。
放射線照射無しで、ＡＮ０２４で処置された動物は、頭蓋内腫瘍の存在を示したが、それらの腫瘍は十分に輪郭がはっきりとし、対照群またはＴＭＺ処置に見られるような拡散エッジ（diffuse edge）を示さず、１０匹のうち３匹が治癒した。放射線照射処置の後、１０匹のうち７匹が治癒し、腫瘍の存在を示した動物は、十分に輪郭がはっきりとして、外科的に見て礼儀正しい腫瘍を示した。
ＡＮ０１９単独で処置された動物はＡＮ０２４で処置された動物と同様の腫瘍を示し、この場合においては、放射線照射有りおよび無しの両方において、１０匹のうち６匹が治癒した。放射線照射後、腫瘍のサイズは有意に低減したことが観察された。
図２２は、放射線照射（５Ｇｌｙ）有りまたは無しでの、ＴＭＺ、ＡＮ０２４またはＡＮ０１９での処置後のヌードマウスにおける頭蓋内腫瘍の半定量分析から得られた結果を示す。
図２３は、放射線処置無しでの、ＡＮ−０１９、ＡＮ−０２４での投薬治療後において、頭蓋内腫瘍が無いことを示すヌードマウスのグラフ表示を示す。
この発明の化合物の調製合成および他の局面を以下の実施例において示した。
実施例１０−Ｉ型の調製
式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを、以下のとおり、ＷＯ２００６／０２７７９５（ＵＳ２００７／０２３２６３３）における実施例３のステップＩＶの方法に従って調製した。
（３，５−ビストリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（Ｉ）の調製
ステップ（Ｉ）：新規な（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（４−メチル−３−ニトロフェニル）−）−ベンズアミドの調製
第一に、出発物質のうちの１つとして使用された３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを以下のように調製した。
塩化チオニル（５７６．０ｇ、４．８モル）を、１５分間をかけて、室温で、クロロホルム（２．５Ｌ）の３，５−ビス トリフルオロメチル安息香酸（ランカスター）（２５０．０ｇ、０．９７モル）の溶液に加えた。反応混合物を、１時間、還流温度に加熱した。塩化チオニルの過剰分を減圧下で、クロロホルムとの共沸によって除去した。蒸留の終了後、得られた３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを室温に冷却し、４００ｍｌのクロロホルムに溶解させた。クロロホルム（１．２Ｌ）中の４−メチル−３−ニトロアニリン（９２．０ｇ、０．６０モル）の溶液を−５°Ｃに冷却し、トリエチルアミン（３０４．８ｇ、３．０モル）を加えた。クロロホルム中の３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを、６０〜７５分間をかけて、−５°Ｃで滴下した。得られた懸濁液を−５°Ｃで、１時間、攪拌した。懸濁液を残留量８００ｍｌとなるまで蒸留してさらにろ過し、冷却されたクロロホルム（２００ｍｌ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、１６０．０ｇの新規な（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（４−メチル−３−ニトロフェニル）−）−ベンズアミド（６８％）を淡黄色の結晶として得た（ＨＰＬＣによる純度９８．２％）ＭＲ−１２３−１３０°Ｃ。
ステップ（ＩＩ）：（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−アミノ−４−メチルフェニル）−）−ベンズアミドの調製
無水エタノール（８５０ｍｌ）中の新規な（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（４−メチル−３−ニトロフェニル）−ベンズアミド（１６０ｇ、０．４１モル）および塩化第一スズ（４６０．８ｇ、２．０モル）の懸濁液を、４０分間、還流温度に加熱した。次いで、得られた懸濁液を室温に冷却し、５Ｌの氷水の中に加えた。反応混合物のｐＨを４．３Ｌの５％水酸化ナトリウム溶液で８．０に調節し、２×２Ｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水およびブラインで続けて洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを完全に蒸留し、５００ｍｌのヘキサンを残留物に加えて、ろ過した。ろ過されたケーキを６０°Ｃで高真空で乾燥させて、９６．０ｇの新規な（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−アミノ−４−メチルフェニル）−）−ベンズアミド（６５％）を黄色結晶として得た（ＨＰＬＣによる純度９８．５％）ＭＲ−１５３−１５６°Ｃ。
ステップ（ＩＩＩ）：（３，５−ビス−トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−グアニジノ−４−メチルフェニル）−ベンズアミドの調製：
ｎ−ブタノール（５００ｍｌ）中の（３，５−ビス−トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−アミノ−４−メチルフェニル）−ベンズアミド（９０ｇ、０．２０モル）の懸濁液を、ｐＨが２．５に達するまで濃硝酸（１５．９ｇ）および水（１５ｍｌ）中のシアナミド（１５．７ｇ、０．３７モル）溶液で続けて３０分間、処理した。得られた反応混合物を、６時間、還流温度で撹拌した。次いで、反応混合物を真空下で完全に蒸留し、残留物を、室温まで放冷した。１８０ｍｌのメタノールと１８０ｍｌのＩＰＥとの混合物を、反応塊に追加し、室温で、１時間、撹拌した。生成物を吸引してろ過し、メタノールとＩＰＥとの混合物（３×５０ｍｌ）で洗浄し、６０°Ｃで真空下で乾燥させて、当該式の新規な（３，５−ビス−トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−グアニジノ−４−メチルフェニル）−ベンズアミドの硝酸塩７２ｇを得た（ＨＰＬＣによる９９．２％の純度）理論値の６２％、ＭＲ−２８５−２８７°Ｃ。
ステップ（ＩＶ）：（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（Ｉ）の調製：
窒素雰囲気下、ｎ−ブタノール（４７０ｍｌ）中の（３，５−ビス−トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−グアニジノ−４−メチルフェニル）−ベンズアミド硝酸塩（７０ｇ、０．１５モル）の懸濁液を、水酸化ナトリウムフレーク（７．０ｇ、０．１８モル）と、３−ジメチルアミノ−ｌ−ピリジン−３イル−プロペノン（２８．０ｇ、０．１６モル）とで続けて処理した。得られた懸濁液を、２時間、還流温度に加熱した。反応混合物は均質な深いオレンジ色の溶液になり、ジメチルアミンをｎ−ブタノールの蒸留によって除去した。反応塊を室温にまで冷却し、水とクロロホルム（３００ｍｌ＋３００ｍｌ）との混合物を加えて、クロロホルム層を分離した。クロロホルム層を水で洗浄し、残留量が７０ｍｌになるまで蒸留した。酢酸エチル（３５０ｍｌ）を反応塊に加えて、吸引してろ過して、単離された固体を、酢酸エチル（２×５０ｍｌ）および水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、真空下で６０°Ｃで乾燥させた。
収量：式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド４８．０ｇ。
ステップＩＶの方法によって得られた式Ｉの化合物を４８０ｍｌのクロロホルムに懸濁させ、５０°Ｃ〜５５°Ｃに加熱した。反応塊を室温に冷却し、次いで、−５°Ｃ〜０°Ｃにさらに冷却した。生成物をろ過して、クロロホルム（２５０ｍｌ）で洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量は４０ｇだった。融点範囲−２３０°Ｃ−２３７°Ｃ（ＤＳＣ）。
この明細書に添付の図面の図１は、この実施例において開示されている方法に従って調製されたＩ型の典型的には純粋なサンプルを実質的に図示する粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す。２θ値および強度を表１に示す。
図４は、この実施例に記載される方法によって調製されたＩ型結晶の変形例のＤＳＣサーモグラムを示す（４０．０°Ｃ〜３２５°Ｃ、１０．００°Ｃ／分；Ｎ2 ８０ｍｌ／分で実行）。
図７は、式（Ｉ）の化合物のＩ型結晶の変形例の結晶を示す。
実施例１１−ＩＩ型の調製
ＷＯ２００６／０２７７９５（ＵＳ２００７／０２３２６３３）における実施例４の方法に従って、式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドを以下のとおり調製した。
（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドの代替調製方法
第一に、出発物質のうちの１つとして使用された３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを以下のとおり調製した。
塩化チオニル（２．０４ｋｇ、１７．２モル）を、１５分間をかけて、室温で、クロロホルム（９Ｌ）中の３，５−ビス トリフルオロメチル安息香酸（８５５．０ｇ、３．３モル）およびＤ．Ｍ．Ｆ．（９ｍｌ）の溶液に加えた。反応混合物を、１時間、還流温度に加熱した。塩化チオニルの過剰分を、４０°Ｃで、減圧下で、クロロホルムで共沸することによって除去した。蒸留の終了後、得られた３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを、室温に冷却し、７００ｍｌのクロロホルムに溶解した。
クロロホルム（９Ｌ）のＮ−（５−アミノ−２−メチルフェニル）−（３−ピリジル）−２−ピリミジンアミン（０．７３ｋｇ、２．６４モル）の溶液を−５°Ｃに冷却し、トリエチルアミン（１．０３ｋｇ、１０．２モル）を加えた。クロロホルム中の３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを６０〜７５分間をかけて、−５°Ｃで滴下した。得られた懸濁液を−５°Ｃで、１時間、攪拌した。懸濁液をろ過し、Ｄ．Ｍ．水およびメタノールで真空下で洗浄して、１．３ｋｇの湿った未精製の掲題化合物を得た。これは、メタノールから再結晶化させることで、０．８２ｋｇ（６０％）の（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（Ｉ）を得た。
上述の方法によって得られた式Ｉの化合物を５Ｌのメタノール中に懸濁させ、還流温度に加熱した。反応塊を、３０〜４０分間、同じ温度に維持し、４０〜４５°Ｃにゆっくりと冷却して、６０分間、この温度で維持した。生成物をろ過し、４０〜４５°Ｃで０．５Ｌのメタノールで洗浄した。湿ったケーキを、６時間、６０°Ｃで乾燥させた。収量：６５０ｇ。
この明細書に添付の図面の図２は、この実施例において開示されている方法に従って調製されたＩＩ型の典型的に純粋なサンプルを実質的に図示する粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す。２θ値および強度を表２に示す。
図５は、この実施例に記載される方法によって調製されたＩＩ型結晶の変形例のＤＳＣサーモグラムを示す（３０．０〜３５０°Ｃ、１０．００°Ｃ／分；Ｎ2 ８０ｍｌ／分で実行）。
図８は、式（Ｉ）の化合物のＩＩ型結晶の変形例の結晶を示す。
実施例１２−ＩＩＩ型の調製
上述の実施例１１において言及されるＷＯ２００６／０２７７９５の実施例４の方法に従って、式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを調製した。
上述の方法によって得られる式Ｉの化合物を、２．５Ｌのジメチルホルムアミドと４．１Ｌのアセトンとの混合物中に懸濁させ、５０°Ｃに加熱した。反応塊を３０〜４０分間、同じ温度で維持し、次いでゆっくりと２５〜３０°Ｃに冷却して、同じ温度で、６０分間、保温した。生成物スラリーを、−５°Ｃまでさらに冷却し、ろ過し、０．８Ｌのアセトンで洗浄した。湿ったケーキを０．４Ｌのアセトン中に懸濁させ、還流温度に加熱した。冷却したスラリーをろ過し、０．４Ｌのアセトンで洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量：５００ｇ。
この明細書に添付の図面の図３は、この実施例において開示されている方法に従って調製されたＩＩＩ型の典型的に純粋なサンプルを実質的に図示する粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンを示す。２θ値および強度を表３に示す。
図６は、この実施例に記載される方法によって調製されたＩＩＩ型結晶の変形例のＤＳＣサーモグラムを示す（４０．０〜３２５°Ｃ、１０．００°Ｃ／分；Ｎ2 ８０ｍｌ／分で実行）。
図９は、式（Ｉ）の化合物のＩＩＩ型結晶の変形例の結晶を示す。
実施例１３−ＩＩＩ型の調製
上述の実施例１１において言及されるＷＯ２００６／０２７７９５の実施例４の方法に従って、式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを調製した。
上述の方法によって得られた式Ｉの化合物を、２．５Ｌのジメチルホルムアミドと４．１Ｌのヘキサンとの混合物中に懸濁させ、５０°Ｃに加熱した。反応塊を、３０〜４０分間、同じ温度で維持し、２５〜３０°Ｃにゆっくりと冷却して、１２時間、同じ温度で保温した。生成物スラリーをさらに−５°Ｃに冷却し、ろ過し、０．８Ｌのヘキサンで洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量：４００ｇ；ＤＳＣ：２４８．２（ピーク）。
実施例１４−ＩＩＩ型の調製
上述の実施例１１において言及されるＷＯ２００６／０２７７９５の実施例４の方法に従って、式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを調製した。
上述の方法によって得られた式Ｉの化合物は、２．５Ｌのジメチルホルムアミドと４．１Ｌのトルエンとの混合物中で懸濁させ、５０°Ｃに加熱した。反応塊を、３０〜４０分間、同じ温度で維持し、２５〜３０°Ｃにゆっくりと冷却して、１２時間、同じ温度で保温した。スラリーをさらに−５°Ｃまで冷却し、ろ過して、０．８Ｌのトルエンで洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量：４５０ｇ；ＤＳＣ：２４６．７（ピーク）。
実施例１５−ＩＩＩ型の調製
上述の実施例１１において言及されるＷＯ２００６／０２７７９５の実施例４の方法に従って、式Ｉの（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを調製した。
上述の方法によって得られた式Ｉの化合物を２．５Ｌの酢酸の混合物中で懸濁させ、５０°Ｃに加熱した。反応塊を、３０〜４０分間、同じ温度で維持し、２５〜３０°Ｃにゆっくりと冷却して、９６時間、同じ温度で保温した。生成物をろ過し、０．４Ｌの冷却した酢酸で洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量：６５０ｇ；ＤＳＣ：２４６．３（ピーク）。
実施例１６−ＩＩＩ型の調製
実施例１０によって調製されたＩ型（４０ｇ）を１２０ｍｌのジメチルホルムアミドと２００ｍｌのアセトンとの混合物中で懸濁させ、５０°Ｃに加熱した。反応塊を、３０〜４０分間、同じ温度で維持し、２５〜３０°Ｃにゆっくりと冷却して、６０分間、同じ温度で保温した。スラリーを−５°Ｃに冷却し、ろ過し、４０ｍｌのアセトンで洗浄した。湿ったケーキを２００ｍｌのアセトン中で懸濁させ、還流温度に加熱し、還流温度で、６０分間、維持した。スラリーを２５°Ｃに冷却し、ろ過し、４０ｍｌのアセトンで洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量：２５ｇ；ＤＳＣ：２４７．０°Ｃ（ピーク）。
実施例１７−ＩＩＩ型の調製
実施例−１１によって調製されたＩＩ型（６５０ｇ）を、１．９５Ｌのジメチルホルムアミドと３．２５Ｌのアセトンとの混合物中で懸濁させ、５０°Ｃに加熱した。反応塊を、３０〜４０分間、同じ温度で維持した。反応塊を、２５〜３０°Ｃにゆっくりと冷却し、６０分間、同じ温度で維持した。生成物をろ過し、０．７Ｌのアセトンで洗浄した。湿ったケーキを３．５Ｌのアセトン中で懸濁させ、還流温度に加熱した。スラリーを２５°Ｃに冷却し、ろ過し、０．７Ｌのアセトンで洗浄した。湿ったケーキを６０°Ｃで、６時間、乾燥させた。収量：３９５ｇ；ＤＳＣ：２４６．５°Ｃ（ピーク）。
ここで用いられる通り、「約」という語は、有機化学分野において通常の量または範囲における変動、たとえば、有機化学実験室、スケールアップ、もしくは製造設備における現実世界の状況、または抗増殖薬剤を評価する際において測定される温度または時間において生ずるような典型的な変動を指す。本発明の記載において用いられる、「約」という語によって修飾される範囲または量は、「約」という語によって修飾されなくても、この発明の一部である。たとえば、「約１０〜約２０」という記載は、「１０〜２０」という記載も含む。
この明細書および特許請求の範囲において用いられる通り、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに他の態様を示す場合を除き、複数形を含むことに注意されたい。したがって、たとえば、「ある１つの化合物（a compound）」を含む組成物に対する言及は、２つ以上の化合物の混合物を含む。さらに、「または」という語は、内容が明らかに他の態様を示すのでなければ、一般に、その、「および／または」を含む意味において用いられることに注意されたい。
この明細書に記載のすべての刊行物および特許出願は、この発明が関係する当該技術分野の通常の技術レベルを示す。
この発明を、さまざまな具体的な、および好ましい実施例および技術を参照して記載した。しかしながら、この発明の精神および範囲に存在する限り、数多くの変更および修正を、行ってもよいことが理解されるべきである。

Claims (20)

  1. （３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶。
  2. ＩＩＩ型結晶が以下のＸＲＰＤの特徴を有する、請求項１に記載のＩＩＩ型結晶。
  3. 結晶型が２４０°Ｃ以上の融点を有する、請求項１に記載のＩＩＩ型結晶。
  4. 結晶型が本質的に純粋である、請求項１に記載のＩＩＩ型結晶。
  5. 抗増殖治療を必要とする対象の治療方法であって、
    （３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶を当該対象に投与することを含む、方法。
  6. ＩＩＩ型結晶が以下のＸＲＰＤの特徴を有する、請求項５に記載の方法。
  7. 薬学的に許容可能な賦形剤、および（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶を含有する、医薬組成物。
  8. ＩＩＩ型結晶が以下のＸＲＰＤの特徴を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 腫瘍疾患の処置のための抗増殖性医薬を製造するための、（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶の使用（ここで、ＩＩＩ型結晶は以下のＸＲＰＤの特徴を有する）。
  10. （３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩＩ型結晶の調製方法であって、
    Ｉ型またはＩＩ型の結晶の式Ｉの化合物を、酢酸またはジメチルホルムアミドとアセトン、ヘキサンもしくはトルエンとの混合物で処理するステップ；および
    一旦処理された化合物を酢酸、アセトン、ヘキサンまたはトルエンで引き続き処理するステップ
    を含む、方法。
  11. Ｉ型またはＩＩ型の結晶の式Ｉの化合物を、酢酸で処理するステップ；および
    一旦処理された化合物を酢酸で引き続き処理するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. Ｉ型またはＩＩ型の結晶の式Ｉの化合物を、ジメチルホルムアミドおよびアセトンの混合物で処理するステップ；および
    一旦処理された化合物をアセトンで引き続き処理するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
  13. Ｉ型またはＩＩ型の結晶の式Ｉの化合物を、ジメチルホルムアミドおよびヘキサンの混合物で処理するステップ；および
    一旦処理された化合物をヘキサンで引き続き処理するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
  14. Ｉ型またはＩＩ型の結晶の式Ｉの化合物を、ジメチルホルムアミドおよびトルエンの混合物で処理するステップ；および
    一旦処理された化合物をトルエンで引き続き処理するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
  15. ＩＩＩ型結晶が以下のＸＲＰＤの特徴を有する、請求項１０に記載の方法。
  16. （３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩ型結晶。
  17. Ｉ型結晶が以下のＸＲＰＤの特徴を有する、請求項１６に記載のＩ型結晶。
  18. （３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３イル−ピリミジン−２イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミド（式Ｉ）のＩＩ型結晶。
  19. ＩＩ型結晶が以下のＸＲＰＤの特徴を有する、請求項１８に記載のＩＩ型結晶。
  20. 式Ｉの化合物の調製方法であって、
    前記方法は、
    式ＶＩの化合物である３，５−ビス トリフルオロメチルベンゾイルクロリドを供給するステップ；
    塩基性化合物を加えた塩化炭化水素溶媒中、約０°Ｃ〜約−１０°Ｃで、４−メチル−３−ニトロ−アニリンと式（ＩＶ）の化合物を縮合させて、式ＩＩＩの化合物である（（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（４−メチル−３−ニトロフェニル）−）−ベンズアミドを得るステップ；
    還流温度で、約０．５〜約１時間、式（ＩＩＩ）の化合物を塩化第一スズ／濃塩酸で還元して、式ＩＶの化合物である（３，５−ビス トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−アミノ−４−メチルフェニル）−）−ベンズアミドを得るステップ；
    式ＩＶの化合物とシアナミド水溶液を、還流温度で、ｎ−ブタノール溶媒中、縮合させて、式Ｖの化合物である（３，５−ビス−トリフルオロメチル）−Ｎ−（３−グアニジノ−４−メチルフェニル）−ベンズアミドを得るステップ；および
    式（Ｖ）の化合物と３−ジメチルアミノ−ｌ−ピリジン−３イル−プロペノンを、塩基の存在下、還流温度で縮合させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップ、を含む、方法。
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