JP2011512390A - 可溶性担体上での合成によりヌクレオチドおよびアナログを調製する方法、ならびにこうして調製された生物学的ツール - Google Patents

Abstract

本発明は、ヌクレオチドまたはモノマーヌクレオチドアナログを調製する方法であって、(1)少なくとも1つの二酸またはエーテル-酸結合手およびヌクレオシドまたはモノマーヌクレオシドアナログを含む可溶性ポリエチレングリコール基質を、結合剤を使用してヌクレオシドのアミノ基またはヒドロキシル基に結合させるステップと、(2)前記基質に結合させた前記ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの、リン酸化剤を使用した少なくとも1つのリン酸化ステップと、(3)前記基質を切断し、少なくとも1つのヌクレオチドまたはモノマーヌクレオチドアナログを回収するステップとを含む方法に関する。本発明はまた、前記ヌクレオチドにも関する。

Description

本発明は、ヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドアナログのモノマーを可溶性担体上で調製する方法、さらに正確にはヌクレオチド、すなわちモノリン酸、ジリン酸、およびトリリン酸ヌクレオシドを調製する方法に関する。

ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの化学合成は、1980年代の開始以来、熱心な研究の主題であった。1983年、オリゴヌクレオチドを固体担体上で合成する方法が、McBrideおよびCaruthersによって開発された。「ホスホラミダイト法」と称されるその方法では、固体担体を使用して、それにヌクレオシドを結合させた。その方法において使用される固体担体は、多孔度を制御したガラスビーズであった。第1のヌクレオシドが、3'位のヒドロキシルを介して固体担体に結合し、核酸鎖の3'末端から5'末端に合成は進行した。さらに正確には、5'位の不安定な酸保護基が外されることによって、ヒドロキシル官能基が遊離された。次いで、この末端の求核基を、活性化剤の存在下で、5'位が保護されている3'-O-ホスホラミダイトモノマーおよび場合によってはヘテロ環にカップリングさせた。次いで、3',5'-ホスフィットトリエステル結合が酸化されて、ホスホトリエステル結合が生成した。その合成方法では、脱保護、カップリング、キャッピング、および酸化のステップが連続して実施され、所望の長さのオリゴマーが得られるまで繰り返された。

それ以来、他の合成方法でも固体担体が使用された。これらの方法は、Gallopら、J. Med. Chem.、37、1233頁(1994)、Goldら、Annu Rev. Biochem.、64、763頁(1995)、およびThompsonら、Chem Rev、96、555頁(1996)によって記載されている。

申し分ない結果が得られたが、固体担体方法には、いくつかの欠点、例えば速度論の点から非線形挙動、担体上のまたは担体が原因の不規則分布、溶媒和の問題、不十分なカップリング度、または反応条件、およびさらに正確には反応媒体の不均一性による合成の問題がある。さらに、固体担体は非常に高価であり、これによって大スケールの合成が非常にコスト高になる。さらに、通常の固相における合成収率は、特に生成物の精製および切断配列からの生成物の分離が困難であるためいつも申し分ないというわけではない。最後に、固体担体方法では、反応を追跡することが困難である可能性がある。

したがって、より均一な反応条件を使用する他の代替方法が検討され、可溶性ポリマー担体の使用が提案された。その方法体系は「液相合成」と呼ばれ、固体担体で遭遇するいくつかの問題を克服する。これらの方法は、Mutterら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、10、811頁(1971)およびBayerら、Nature (London)、237、512頁(1972)で理解しうるように、ポリエチレングリコール(PEG)を可溶性担体として使用する。

PEGとは別に、他の担体、特に架橋ポリスチレンにグラフト化されたPEGが当技術分野で知られている(Bayer, E.、Angew. Chem. Int. Ed. Engl、30、113頁(1991))。ペプチドのポリエチレンイミン上での合成も知られており、この担体は30000から40000の範囲の分子量を有する(Pfaenderら、Peptides;Proc. Eight Eur. Pep. Symp;Ann Arbor Science;North Holland、137頁(1967)、およびBlecherら、Liebigs. Ann Chem、1263頁(1973))。ポリビニルアルコールコポリマー(Bayerら、Liebigs An Chem、1671頁(1974))およびポリビニルアルコール-ポリ(1-ビニル-2-ピロリドン)コポリマー(Geckelerら、Makromol. Chem、175、1995頁(1974))もペプチド合成用の可溶性担体として使用された。

これら可溶性担体上での第1のペプチド合成の重大な欠点の1つは、期待されるペプチドについて得られる収率にあり、収率は、不完全な切断および/または優勢な副反応のため低い。

次いで、不安定な酸または塩基結合、不安定なチオール結合、および合成後のペプチドの光分解による塩析によって誘導される切断など、他の切断方法が使用された。

液相合成を使用したオリゴペプチド、オリゴ糖、およびオリゴヌクレオチドを合成する最近の一方法が国際公開第2006/096963号に記載されている。液体担体として使用されるイオン性液体は、オニウム型有機塩、例えばヘテロ環式第四級アンモニウムカチオン、およびアニオン、例えばCl^-、Br^-、BF₄ ^-、PF₆ ^-、SbF₆ ^-、CuCl₂ ^-、またはAlCl₄ ^-である。カチオンの例として、置換ピリジンおよび1,3-二置換イミダゾールも挙げられる。

Dongaら、J. Org. Chem.、71、7907〜7910頁(2006)には、可溶性イオン性液体型担体(ILSS)上で、オリゴヌクレオチドを高収率でかつ担体を切断する前にクロマトグラフィーステップで中間体を精製する必要がないような純度で合成することが記載されている。この方法では、可溶性イオン性担体は、N-メチルイミダゾールおよび2-ブロモエタノールから合成され、次いで陰イオン交換クロマトグラフィーで単離される。この3'-スクシニル化5'-DMT-チミジン誘導体は、アセトニトリル中ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および触媒量の4-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)を使用してイオン性液体にカップリングして、イオン性液体にグラフト化されたヌクレオシドを生成した。イオン性液体を、エチルエーテル/酢酸エチル溶液から沈殿により単離および精製し、クロロホルム中で処理し、水で洗浄した。その方法を使用して、様々なオリゴヌクレオチドが対応するグラフト化ヌクレオシドから得られた。

米国特許第6001966号には、モノマー単位の反応によってオリゴヌクレオチドを溶液中で逐次合成する方法が記載されている。

リン酸化モノマーの生成について、Parangら、Organic Letters、Vol. 3、No. 2(2001)には、シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトで官能化された架橋ポリスチレン-ジビニルベンゼンコポリマーをホスフィチル化剤として使用して、炭水化物モノリン酸およびヌクレオシドを生成するための担持試薬が記載されている。その固定化された試薬を、ポリマーに結合しているホスフィット-トリエステルを生成し、次いで対応するホスホトリエステルに酸化するために、1H-テトラゾールの存在下でアルコールとカップリングさせる。次いで、固定化されたリン酸誘導体を脱保護し、固体担体から切断する。

したがって、ヌクレオチドを合成するのに様々な方法が知られているが、固相合成についても、溶液中での合成についても、依然として問題、特に低収率および長く時間のかかる精製手順の問題がある。トリリン酸ヌクレオシドの合成については、トリリン酸ヌクレオシドを高収率で生成し、かつ多くの基質に適用できる一般方法が本当に求められている(BurgessおよびCook、Synthesis of Nucleoside Triphosphates, Chem Rev.、100(6)、2047〜2060頁(2000))。

したがって、ヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドアナログを、大量に低コストでかつ手間のかかる精製ステップなしで生成する方法が求められている。

国際公開第2006/096963号 米国特許第6001966号

Gallopら、J. Med. Chem.、37、1233頁(1994) Goldら、Annu Rev. Biochem.、64、763頁(1995) Thompsonら、Chem Rev、96、555頁(1996) Mutterら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、10、811頁(1971) Bayerら、Nature (London)、237、512頁(1972) Bayer, E.、Angew. Chem. Int. Ed. Engl、30、113頁(1991) Pfaenderら、Peptides;Proc. Eight Eur. Pep. Symp;Ann Arbor Science;North Holland、137頁(1967) Blecherら、Liebigs. Ann Chem、1263頁(1973) Bayerら、Liebigs An Chem、1671頁(1974) Geckelerら、Makromol. Chem、175、1995頁(1974) Dongaら、J. Org. Chem.、71、7907〜7910頁(2006) Parangら、Organic Letters、Vol. 3、No. 2 (2001) BurgessおよびCook、Synthesis of Nucleoside Triphosphates, Chem Rev.、100(6)、2047〜2060頁(2000) Eur. J. Org. Chem.、2005、5171〜83頁

本出願の一目的は、ヌクレオチドモノマー合成に関する先行技術のこれらの問題を克服することである。

本発明は、リン酸化ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログの新規調製方法(下記のスキーム)

[式中、R₂〜R₅は、下記に示す意味を有する]
に関する。

この手法は、担体上での合成の利点(過剰の試薬を使用しないこと、精製を容易にすること)と溶液中での合成の利点(反応追跡およびキャラクタリゼーション)とによって利益を得ることができる。結果として、合成収率が改善され、それによって、化合物の単離が、通常の方法体系(溶液合成)に比べて非常に大幅に容易になり、生成コストが実質的に低下する。

本発明は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを生成するのに可溶性担体を使用する方法に関する。本発明は、ヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドアナログを高収率で調製する方法を提供する。

本発明によれば、得られるモノマーは、一リン酸化、二リン酸化、または三リン酸化ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログである。

本発明のヌクレオチドモノマー調製方法において、精製ステップが大幅に簡易化される。これは収率に好ましい影響を及ぼす。

本発明は、本方法によって得られた、生物学的ツールとしてのヌクレオチドモノマーおよびヌクレオチドアナログモノマーにも関する。

これらの生物学的ツールは、酵素学において、薬理学において、また目的とする分子、特に抗ウイルス薬および/または抗癌薬の合成の出発物としても使用することができる。

本発明は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログモノマーを調製する方法であって、(1)少なくとも1つの二酸またはエーテル-酸リンカーおよびヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログモノマーを具備している可溶性ポリエチレングリコール担体を、カップリング剤を使用してヌクレオシドの環外アミンまたはヒドロキシル基にカップリングさせるステップと、(2)担体にカップリングさせた前記ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの、リン酸化剤での少なくとも1つのリン酸化を実施するステップとを含む方法に関する。次いで、担体とモノマー間のリンカーの切断を行うことができ、したがってヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログモノマーの回収が可能になる。

したがって、一般に、本発明によれば、リンカーを可溶性PEG型担体に結合させ、次いでその担体を、リンカーを介してヌクレオシドまたはアナログにカップリングさせ、次いでカップリングしているヌクレオシドを1つまたは複数のリン酸化ステップでリン酸化する。次に、ヌクレオチドを回収するために切断することができる。

本方法によれば、通常の長く時間がかかり細心の注意を要する厄介な精製ステップを回避して、天然であろうとなかろうと求める生物学的ツールまたはリン酸化エフェクター(一リン酸化、二リン酸化、または三リン酸化ヌクレオシド)、ヌクレオチドまたはアナログを得ることができる。合成は溶液中で行われるので、反応を追跡することができ、通常の技法を用いて中間体のキャラクタリゼーションを行うことができる。この担体上の技法は、通常イオン性の中間体および最終生成物の精製を容易にする利点を有し、過剰に使用する試薬をなくすことができる。一例として、市販のAraCTPは、提案された本発明の方法を用いた費用価格(試薬および機器)の13倍を上回る高価である。収率に関して、本発明の方法は、また通常の方法より高い収率も有する。

本発明は、以下の説明および好ましい実施態様、ならびに以下の実施例および添付図面から、さらによく理解されよう。

一方では、様々なリンカーの可溶性担体への結合(a)、およびこれらのリンカーが担体に結合されると、ヘテロ環R'NH2の環外アミン官能基を介して、ヌクレオシドとカップリングさせることによる可溶性担体の官能化(b)を示すスキームである。この図は、(c)に、本発明の方法において担体にカップリングさせることができる様々なアミノ化ヘテロ環も示す:プリン塩基ヌクレオシド(c-1)、ピリミジン塩基ヌクレオシド(c-2)、糖修飾によるヌクレオシドアナログを示す、糖および塩基が修飾されたピリミジン塩基構造アナログ(c-3)、ならびに塩基修飾によるヌクレオシドアナログを示すプリン塩基ヌクレオシドアナログ(c-4)。 一方では、様々なリンカーの可溶性担体への結合(a)、およびこれらのリンカーが担体に結合されると、ヘテロ環R'NH2の環外アミン官能基を介して、ヌクレオシドとカップリングさせることによる可溶性担体の官能化(b)を示すスキームである。この図は、(c)に、本発明の方法において担体にカップリングさせることができる様々なアミノ化ヘテロ環も示す:プリン塩基ヌクレオシド(c-1)、ピリミジン塩基ヌクレオシド(c-2)、糖修飾によるヌクレオシドアナログを示す、糖および塩基が修飾されたピリミジン塩基構造アナログ(c-3)、ならびに塩基修飾によるヌクレオシドアナログを示すプリン塩基ヌクレオシドアナログ(c-4)。 (a-2)の場合について、特に図1のグラフト化ヌクレオシドから出発して実施することができるリン酸化ステップを示すスキームである。直接二リン酸化(d)と一リン酸化(e)を示すが、一リン酸化(e)は、活性化ステップに続いて、第2の一リン酸化(g)を行い、二リン酸化ヌクレオシドを生成し、あるいはやはり一リン酸化(g)を連続して2回または二リン酸化(f)を1回行い、三リン酸化ヌクレオシドを生成してもよい。

本明細書で使用される「モノマー」という用語は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、塩基、糖、およびヌクレオチドの場合には1つまたは複数のリン酸基を含むことを意味すると考えられる。したがって、オリゴマーは除外される。

本発明の第1のステップは、リンカーを有する可溶性担体にヌクレオシドモノマーをカップリングさせることからなる。

本発明によれば、使用される可溶性担体は、少なくとも1つの酸、二酸、またはエーテル-酸結合リンカーを有するポリエチレングリコール(PEG)担体であってもよい。「少なくとも1つのリンカー」という用語は、1つまたは2つを意味する。さらに正確には、少なくとも1つのリンカーを具備しているPEGは、次式:
(I)RO-C₂H₄-O-PEG-O-C₂H₄-O-C(O)-(CH₂)_p-COOH[式中、Rは、アルキルもしくはベンジルもしくはアリール基、または-C(O)-(CH₂)_n'-COOHであり、pおよびn'は互いとは独立に、0または1から10の整数を表す]、または
(II)RO-C₂H₄-O-PEG-O-C₂H₄-O-(CH₂)_m-COOH[式中、Rは、アルキルもしくはベンジルもしくはアリール基、または-(CH₂)_m'-COOHであり、mおよびm'は互いとは独立に、0または1から3の整数を表す]を有することができる。

好ましくは、本発明によれば、式(I)においてpまたはn'は6未満であり、好ましくは式(I)においてpまたはn'は0から4の整数であり、式(II)においてmおよびm'は、好ましくは1または2である。詳細な説明から明らかになるように、好ましいリンカーは、スクシネート型である。

上記の式において、アルキル基は、好ましくは直鎖状または分枝状のC₁〜C₁₂であり、アリール基は、好ましくはフェニル、トリル、およびo-トリルから選択される。好ましくは、Rはメチルまたはベンジルである。

「ポリエチレングリコール」(PEG)という用語は、ポリエチレングリコールそれ自体に限定されないが、例えばその両端にヒドロキシル基をまたはその一端にヒドロキシル基および他端にメトキシ基を含む任意のポリエチレングリコール誘導体、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、およびポリ(オキシエチレン)グリコールまたはアナログを包含する。

さらに一般に、本明細書で使用される「可溶性担体」は、二酸リンカーもしくはエーテル-酸リンカー、またはこうした2つのリンカーを有するポリエチレングリコール型担体を意味する。好ましくは、本発明の可溶性担体は、少なくとも1つの二酸リンカーまたはエーテル-酸リンカーを含むポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、またはポリ(オキシエチレン)グリコールである。

本発明の前記PEGの分子量は、好ましくは約3000から約6000の範囲である。好ましくは、PEGの分子量は約4000である。

結合させるリンカーのタイプに応じて様々な方法で、二酸またはエーテル-酸リンカーをPEGに結合させるが、一般方法を実施例に示す。

一例として、スクシネート型リンカーをPEGに結合させなければならない場合、手順には、PEGを溶媒に溶解するステップ、対応する酸無水物を添加するステップ、周囲温度で撹拌するステップ、次いで反応混合物を減圧下で濃縮するステップ、および二酸リンカーを含むPEGを沈殿させるステップが含まれる。まさにスクシネートリンカーの場合、リンカープロモーターは無水コハク酸である。オキサレートリンカーの場合は、塩化オキサリルが使用される。さらに一般に、例えばカルボン酸、無水物、または酸塩化物を使用して、PEGを官能化させてもよい。例えば、エーテル-酸リンカーは、実施例に示すような担体の末端アルコールの酸化を含む2つの合成経路によって、またはPEGとアクリル酸アルキルの反応によって得ることができる。

リンカーがエタン酸である場合、リンカーを形成する方法は、例えばPEGをクロム塩で酸化するステップ、混合物を周囲温度で撹拌するステップ、および修飾PEGを沈殿させるステップを含む。

一例として、下記を使用してもよい:

スクシニルリンカーを含む官能化担体;
またはPEG-酸型官能化担体:

上記の2式および下記のスキームにおいて、nはPEGの分子量に依存する。

リン酸化反応は、リンカーの性質にかかわらず同じように実施される。この変形では、切断ステップの間、リンカーをPEG担体に結合させたままでもよい。好ましいPEG-酸担体は、m"=1のものである。

上記のリンカーは、m"=0の場合「酸」リンカーと呼ばれる。

当業者は、リンカーを結合させる方法を、選択された可溶性担体および必要とされたリンカーに適合させることができる。図1で見ることができるように、PEGは2官能性の(HO-PEG-OH)であり、RはHを表し、2つのリンカーを備え(a-2;a-4)、または単官能性の(RO-PEG-OH)であり、その場合は1つのリンカーを備え(a-1;a-3)、Rはアルキル、ベンジル、またはアリールを表す。

本発明の特定の実施態様において、PEG-OHは、次のスキームに従って、アクリル酸t-ブチルで官能化され、脱保護ステップ後に、官能化PEG-酸であるPEG-O(CH₂)₂-COOHが得られる:

したがって、本発明によれば、特定の実施態様に従って、PEG-O-ビス(スクシニル-ヌクレオシド)が使用される。

別の特定の実施態様において、PEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-ヌクレオシド)が使用される。

3-ヒドロキシプロパン酸リンカーによって官能化されたPEGの特別な利点は、その後の手順の単純化にある。

リンカーが可溶性担体に結合すると、担体をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの存在下におく。

可溶性担体とのカップリングは、カップリング剤を使用して環外アミン基を介して行われ、アミド結合を形成することができ(この変形は図1(b)に示されている)、あるいはヌクレオシドアナログまたはヌクレオシドのヒドロキシル基を介して行われ、エステル結合を形成することができる。

好ましくは、本発明によれば、カップリングは、環外アミン官能基上で行われる。したがって、カップリングは、好ましくはヌクレオシド塩基の環外窒素上で行われる。例えば、図1(bおよびc)に示すピリミジン塩基のシトシン、およびプリン塩基のアデニンまたはグアニンの環外アミン官能基である。

カップリング方法は、カップリング対象のヌクレオシドおよび選択された担体に応じて変わることがある。一般に、リンカーを含むPEGを、リン酸化する対象のヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログと混合し、カップリング剤を混合物に添加する。反応混合物を、カップリングが行われるのに十分な時間撹拌し、溶媒を蒸発除去させると、最終生成物が沈殿し、またはおそらく再結晶する。

本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、一方で糖と他方でヘテロ環を含む様々な化合物を意味する。天然ヌクレオシドは、加水分解によって、1分子のリボースまたはデオキシリボースとプリンヘテロ環(アデニン、グアニン)またはピリミジンヘテロ環(シトシン、ウラシル、チミン)を生じる物質である。本発明のヌクレオシドモノマー、ヌクレオシド、およびヌクレオシドアナログは、天然であっても、合成であってもよい。

本発明で使用される「ヌクレオシドアナログ」または「アナログヌクレオシド」という用語は、任意の修飾ヌクレオシド、すなわちヌクレオシドと類似している構造を有する化合物を意味する。

同様に、本発明で使用される「アナログヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」という用語は、任意の修飾ヌクレオチド、すなわちヌクレオチドと構造類似性を有することを意味する。

したがって、アナログは、オシド環および/またはアグリコン環上に1つまたは複数の修飾を含みうる。例えば、ピリミジンまたはプリン塩基は、そのヘテロ環に修飾を有しうる。

図1は、これらの化合物のいくつかを示し、オシド環上のR₁〜R₆は、天然または非天然オシド残基上の通常の置換基を表す。したがって、R₁〜R₆は互いとは独立に、H、OH、ハロゲン、アルキル、O-アルキル、アルケニル、C₁〜C₄アルキニル、アルキルアミノ、アミン、ヒドロキシルアミノ、アジド、ニトロ、シアノ、または修飾ヌクレオシドを形成することができる任意の他の置換基を表すことができる。

図1において、カップリング対象のヌクレオシドは、R'NH₂で表される。それは、環外アミン(NH₂)を有する糖-塩基アセンブリであり、R'は、塩基の前記環外アミンNH₂を含まない糖-塩基アセンブリを表し、前記環外アミンNH₂は可溶性担体とカップリングする(b)。

図1(c-3)における糖を修飾したアナログ化合物において、塩基はピリミジン性であり、オシド環におけるWは、YおよびZも炭素原子であるときCH₂、CHX、またはCX₂(Xは、本明細書ではハロゲンを表す)を表して、炭素環を形成してもよいが、WはOまたはSを表し、YおよびZは炭素原子を表してもよく、あるいはさらにはWおよびZは0またはSを表し、YはCH₂を表してもよく、あるいはYおよびWはOまたはSを表し、ZはCH₂を表してもよい。塩基はハロゲンX'を有してもよく、X'は、好ましくはHまたはFを表す。

図1の修飾アナログ化合物(c-4)において、塩基は修飾プリンであり、W'は、CHまたはCFを表し、X'はその場合Hを表し、またはNを表し、X'はその場合、例えばFを表すことができる。

糖は、リボースもしくはデオキシリボース、または例えばアラビノフラノース型の任意の他のアナログとすることができる。

さらに詳細には、図1の続きに、エーテル-酸の場合(m"=1)、すなわち図1(a-3)、(a-4)、および(b)の特定の場合を示す。

本発明のヌクレオシドアナログの定義は、図1に示される化合物だけに限定もされず、また非限定的な例示によって上記に示されたX、X'、W、W'、Y、Z、およびR₁〜R₆の定義によっても限定されない。

本発明の方法において出発物として使用されるヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログは、可溶性担体のリンカーにカップリングすることを可能にする環外アミノまたはヒドロキシル基を含む。

塩基を含むヌクレオシドの例は、例えばアデノシン、グアノシン、シチジンである。これらは、対応するデオキシヌクレオシドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジンとすることもできる。

ヌクレオシドアナログは、塩基であるプリンもしくはピリミジン上で、かつ/または炭水化物基(糖)上で修飾することができる。

出発物として使用されるヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログのより正確な例を以下に示す:3'-O-アセチル-2'-デオキシシチジン、アロプリノールリボシド、2-アミノ-6-クロロプリンリボシド、2'-デオキシウリジン、シチジン、2'-デオキシシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、8-アザグアニン、8-ブロモグアノシン、8-ブロモグアノシン、2-クロロアデノシン、2-クロロ-N⁶-シクロペンチルアデノシン、5-クロロシトシンアラビノシド、2-クロロ-2'-デオキシアデノシン、5-クロロ-2'-デオキシウリジン、6-クロロプリンリボシド、2'-デオキシアデノシン一水和物、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシグアノシン一水和物、3'-デオキシグアノシン、2'-デオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン2'-デオキシリボシド、2',3'-ジデオキシアデノシン、2',3'-ジデオキシシチジン、5,6-ジヒドロデオキシウリジン、6-(γ,γ-ジメチルアリルアミノ)プリンリボシド、1,N⁶-エテノ-2'-デオキシアデノシン、5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシウリジン、5-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジル)-6-チオグアノシン、S-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジル)-6-チオイノシン、5-ヨード-2'-デオキシシチジン、N⁴-イソブチリル-2'-デオキシシチジン、イソシトシン、2',3'-O-イソプロピリデングアノシン、8-メルカプトグアノシン、5-メトキシウリジン、2'-O-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、2'-O-メチルシチジン、3-メチルシチジンメトスルフェート、N⁶-メチル-2'-デオキシアデノシン、7-メチルグアノシン、N²-メチルグアノシン、6-メチルメルカプトプリンリボシド、3'-O-メチルウリジン、オロト酸、2-チオ-6-アザウリジン、4-チオウリジン、チミン1-β-D-アラビノフラノシド、ウラシル1-β-D-アラビノフラノシド、ゼアチンリボシド、2',3'-ジデオキシ-3'-チア-β-L-シチジン、2',3'-ジデオキシ-3'-チア-β-L-5-フルオロシチジン、9[2-(ホスホニルメトキシ)プロピル]アデニン、9[2-(ホスホニルメトキシ)エチル]アデニン、1(β-D-リボフラノシル)-1H-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド、β-D-2'-C-メチルシチジン、β-D-2'-C-メチル5-フルオロシチジン、β-D-2'-デオキシ-2'-フルオロ-2'-C-メチルシチジン、β-D-2'-デオキシ-2',2'-ジフルオロシチジン、7-デアザ-β-D-2'-C-メチルアデノシン、7-デアザ-7-フルオロ-β-D-2'-C-メチルアデノシン、2'-デオキシ-β-L-チミジン、2'-デオキシ-β-L-シチジン、1-(2'-フルオロ-β-L-リボフラノシル)-ウラシル、9-(β-D-アラビノフラノシル)-2-フルオロ-アデニン、9-(β-D-アラビノフラノシル)-アデニン、1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシンおよびアナログ。

カップリングは、カルボジイミド、芳香族オキシム、もしくはオニウム型カップリング剤、すなわち例えば求核性アニオンのアンモニウム、ホスホニウム、もしくはウロニウム、またはそれらのアナログから選択することができる少なくとも1つのカップリング剤を使用して実施される。

一例として挙げることができるカルボジイミドは、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはジイソプロピルカルボジイミド(DIC)である。

一例として挙げることができる芳香族オキシムは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)または1-ヒドロキシ-7-アザ-ベンゾトリアゾール(HOAt)、およびアナログである。

一例として挙げることができるオニウム、特にホスホニウムは、(2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(HBTU)ヘキサフルオロホスフェート、(2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(HATU)ヘキサフルオロホスフェート、またはベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホニウム(PyBOP)ヘキサフルオロホスフェート、およびアナログである。別のカップリング剤はジメチルアミノピリジン(DMAP)である。

カップリング反応で使用されるその量は、使用されるヌクレオシドまたはアナログの量に依存する。一般に、ヌクレオシド1から5当量に対して、カップリング剤1から10当量が使用される。ヌクレオシド1から2当量、およびカップリング剤1から4当量を使用することも可能である。

一般に、1つまたは2つのリンカーを含む可溶性担体1当量が、ヌクレオシドまたはアナログ1または2当量にカップリングする。

本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、ヘテロ環と糖と少なくとも1つのリン酸化基とによって構成されたモノマーを意味する。本出願の方法を使用して生成されるヌクレオチドは、モノリン酸、ジリン酸、またはトリリン酸ヌクレオシドを含む。したがって、ヌクレオチドは、天然、または合成とすることができる。

出発物のヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログがそうであったように、本発明によるリン酸化ステップまたは下記に示すステップの終わり、および切断後に、糖または塩基上で修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが得られ、1つまたは複数のリン酸上で修飾することができたヌクレオチドも得られる。

一例として、塩基-修飾ヌクレオチドアナログは、以下の通りとすることができる:2'-デオキシイノシン5'-トリリン酸、2-アミノ-2-デオキシアデノシン5'-トリリン酸、5-アミノアリル-2'-デオキシシチジン5'-トリリン酸、5-フルオロシチジン5'-モノリン酸、2-フルオロアデノシン5'-モノリン酸、5-ヨードデオキシウリジン5'-トリリン酸、5-トリフルオロメチルチミジン5'-トリリン酸、5-(2-クロロエチル)デオキシウリジン5'-トリリン酸、5-エチルデオキシウリジン5'-トリリン酸、(E)-5-(2-ブロモビニル)デオキシウリジン5'-トリリン酸、5-フルオロデオキシウリジン5'-トリリン酸、6-チオプリンリボシド5'-トリリン酸、2-クロロデオキシアデノシン5'-トリリン酸、5-アザシチジン5'-トリリン酸、3-デアザウリジン5'-トリリン酸、チアゾフリン5'-トリリン酸、リバビリン5'-トリリン酸、アロプリノールリボシド5'-トリリン酸、ホルマイシンB 5'-トリリン酸、8-ブロモグアノシン5'-トリリン酸、8-メルカプトグアノシン5'-トリリン酸、7-メチル-8-オキソグアノシン5'-トリリン酸、7-チア-8-オキソグアノシン5'-トリリン酸、およびアナログ。

糖部分上で修飾されたトリリン酸ヌクレオシドの例は、以下の通りである:2',3'-ジデオキシアデノシン5'-トリリン酸、2',3'-デオキシシチジン5'-トリリン酸、2'アミノ-2'-デオキシアデノシン5'-トリリン酸、およびアナログ。

塩基上とオシド残基上の両方で修飾されたヌクレオチドアナログの例は、以下の通りである:アラビノシル-5-アザシトシン5'-トリリン酸、2-フルオロアラビノフラノシルアデノシン5'-トリリン酸、1-(β-L-リボフラノシル)-2-イソプロピルアミノ-5,6-ジクロロベンゾイミダゾール5'-トリリン酸、7-デアザ-2'-C-メチルアデノシン5'-トリリン酸、2-アミノ-9-β-D-アラビノフラノシル-6-メトキシ-9H-プリン5'-トリリン酸、1-(β-L-2-フルオロ-2-デオキシアラビノフラノシル)-5-メチルウラシル5'-トリリン酸。

リン酸上で修飾されたヌクレオシドの例は、以下の通りである:
2',3'-ジデオキシアデノシン5'-O-(1-チオトリリン酸)、2',3'-ジデオキシシチジン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、2',3'-ジデオキシグアノシン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、2'-デオキシアデノシン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、2'-デオキシシチジン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、2'-デオキシグアノシン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、2'-デオキシチミジン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、アデノシン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、シチジン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、グアノシン-5'-O-(1-チオトリリン酸)、サイクリックアデノシン3',5'モノリン酸およびアナログ。

対応するモノリン酸およびジリン酸の合成も、下記および実施例に示されるように、本発明によれば可能である。

可溶性担体上に固定されたヌクレオシドまたはアナログから出発して、ヌクレオシドは、1回または2回または3回のリン酸化ステップで一リン酸化、二リン酸化、または三リン酸化される。

図2で見られるように、モノリン酸を得るために、一リン酸化(e)を実施する。

二リン酸化モノマーを得るために、二リン酸化を実施する。これは、直接二リン酸化剤を用いた単一のステップ(d)で実施しても、または2回連続した一リン酸化ステップ(e)、次いで(g)で実施してもよく、第2の一リン酸化ステップ(g)では、おそらく活性化を行う。

三リン酸化モノマーを得るために、三リン酸化を実施する。これは、二リン酸化剤を用いた二リン酸化(d)、次いで一リン酸化によって、または一リン酸化(e)と、その後に続く二リン酸化(f)もしくはその後に続く2回連続した一リン酸化(g)とによって実現することができる。

好ましくは、第2のリン酸化では、活性化を行う。

リン酸化を実施するために、リン酸化剤が使用される。このリン酸化剤の性質および反応性に応じて、事前活性化が必要になる可能性がある。

ポリマー担体上のヌクレオシドの一リン酸化では、オキシ塩化リン型リン酸化剤を、好適な溶媒中のポリマー担体上のヌクレオシドの溶液に添加し、担体付きモノリン酸ヌクレオシドを抽出し、かつ/または沈殿によって単離する。

ポリマー担体上のモノリン酸ヌクレオシドをリン酸化するために、担体付きのモノリン酸ヌクレオシドを適切な溶媒に溶解し、活性化し、次いでトリブチルアンモニウムホスフェート型リン酸化剤の存在下におくと、期待される化合物が沈殿する。

ポリマー担体上のモノリン酸ヌクレオシドを二リン酸化するために、ポリマー担体上のモノリン酸ヌクレオシドを適切な溶媒中で活性化し、次いでトリブチルアンモニウムピロホスフェート型リン酸化剤の存在下におくと、期待される生成物が沈殿物として析出する。

リン酸化剤は、一リン酸化の場合、Z'=PX¹ ₃タイプ(式中、Z'はO、S、またはSeである)の化合物、もしくは二リン酸化の場合、W¹[(P=Z')X¹]₂(式中、W¹は、O、NH、CH₂、CHOH、CHNH₂、CHCH₃、CHX²、またはCX² ₂であり、Z'はO、S、またはSeであり、X¹およびX²はハロゲンである)の化合物、または好適なアナログから選択してもよい。

一リン酸化および二リン酸化することができる他のリン酸化剤Z'=P(O^-)₃およびW¹[(P=O)(O^-)₂]₂(式中、W¹およびZ'は、上記に示す意味を有する)はあまり効果的でなく、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの活性化を必要とすることがある。

特に列挙することができるリン酸化剤は、リン(III)の誘導体またはリン(V)の誘導体である。一リン酸化に適切なオキシ塩化リン型リン酸化剤の例は、オキシ塩化リン、チオホスフェートトリクロリド、4-ニトロフェニルジクロロホスフェート、O-(2-クロロフェニル)ジクロロチオホスフェート、アミノメチルホスホン酸、アミノメチル(メチル)ホスホン酸、2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホラン、2-クロロ-2-オキソ-1,3,2-ジオキサホスホラン、2-クロロ-4H-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン、2-シアノエチルリン酸バリウム、ジエチルクロロチオホスフェート、ジメチルクロロチオホスフェート、メチルホスホロジクロリデート、フェニルジクロロホスフェート、メチルジクロロホスフィット、およびジフェニルホスフィット、ならびにアナログ、さらには2-クロロフェニルホスホロジクロリデート、4-クロロフェニル-ホスホロジクロリデート、ジフェニル-クロロホスフェート、およびジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトから選択される。本発明に従って好ましい物質は、オキシ塩化リン、チオホスフェートトリクロリド、4-ニトロフェニルジクロロホスフェート、トリブチルアンモニウムホスフェート、およびジフェニルホスフィットである。

列挙することができるトリブチルアンモニウムピロホスフェート型二リン酸化剤は、エチドロン酸、イミドジリン酸塩、イミノジ(メチルホスホン酸)、ピロホスホリルテトラクロリド、メチルビス(ジクロロホスホネート)、およびメチレンビスホスホン酸である。本発明に従って好ましい物質は、トリブチルアンモニウムピロホスフェートおよびメチレンビスホスホン酸である。

使用されるリン酸化剤の量は、その反応性に依存する。一般に、担体にカップリングさせたヌクレオシド1から2当量に対して、リン酸化剤10から30当量、好ましくはリン酸化剤15から30当量を使用する。

例として挙げることができる活性化剤は、メシチルスルホニルニトロトリアゾール(MSNT)、メシチルスルホニルトリアゾール(MST)、メシチルスルホニルクロリド(MSCl)、トリ-イソプロピルスルホニルクロリド(TPSCl)、Tf₂O/ジメチルアミノピリジン(DMAP)系、1,1-カルボニルジイミダゾール(CDI)などである。活性化剤は、1から10当量程度、好ましくは3から6当量の量で使用される。

その後のリン酸化ステップにおいて、可溶性担体を、得られたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから分離してもよく、これは切断剤を使用して実施される。

切断剤として、任意の塩基または任意の求核試薬を使用してもよい。使用することができる例は、アンモニア、水酸化ナトリウム、ナトリウムメチレート、アンモニア性メタノール、またはシアン化カリウムなどである。

本発明によれば、一般に、過剰の塩基が使用される。

本出願の方法で生成するように担体から切断されたヌクレオチドは、次いで当技術分野で知られている任意の方法で単離してもよい。液体クロマトグラフィー(LC)またはHPLCを、例えば逆相カラムで使用してもよい。

これらは、特に切断による残基がまだなくなっていないとき、透析で精製することもできる。透析は、好適な任意の方法を用いて、例えばセルロースエステル膜で実施してもよい。

一般に、スクシネート型の2官能性リンカーの場合、切断されたリンカーは、基質および担体と分離する。これは、精製について透析を有利にすることができる。したがって、リンカーの加水分解に由来する化合物が基質を汚染する可能性があるが、その場合には透析を精製ステップとして想定することができる。一方、エーテル-酸型リンカーの場合、リンカーはPEG担体上に残ったままであるので、透析を必要としない可能性がある。

一リン酸化、二リン酸化、または三リン酸化ステップ(または複数のステップ)後、特にPEG-O(CH₂)₂-COOHの場合は、リンカーの切断により、ポリマーの担体を除去した直後に、透析を実施する必要なしに期待されるヌクレオチドを生成することができる。

したがって、実施例において明らかになるように、3-ヒドロキシプロパン酸に対応するリンカーで官能化されたPEG(PEG-O(CH₂)₂-COOH)を使用すると、透析ステップなしで済ますことができるので、手順を単純化することができる。

上記に示すように、得られたヌクレオチドおよびアナログは、研究、診断学、または任意の治療もしくは前臨床用途のための生物学的ツールであるエフェクターとして使用することができる。

本発明は、好ましいモードで表して本明細書に記載されているが、専門家は、均等形態、修正形態、置換形態、省略形態、または変形形態が、本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを理解するであろう。

(実施例)
(実施例1)
ポリエチレングリコール-ビス-スクシネート、PEG₄₀₀₀-ビス-スクシネート

20g(4.76ミリモル)のPEG₄₀₀₀を無水ピリジンと共蒸発させ、160mLのピリジンに溶解した。5g(49.90ミリモル)の無水コハク酸および0.30g(2.49ミリモル)のジメチルアミノピリジンを添加し、混合物を周囲温度で2日間撹拌した。溶液を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、最小限のジクロロメタンに溶解した。形成した褐色沈殿物を濾過により除去した。濾液を減圧濃縮し、ジクロロメタン/N,N-ジメチルホルムアミド(3/7(v/v))混合物に溶解した。過剰の冷ジエチルエーテルを添加することによって、PEGビス-スクシネートを沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、KOHペレットで真空乾燥すると、PEGビス-スクシネートが白色固体の形で生成した(18.14g、86%)。
¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ 4.18 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 3.40-3.75 (m, (OCH₂)_PEG), 2.57 (s, 4H, CH_2succ).
¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz) δ 173.9, 172.2 (s, C=O_succ), 70.5 (s, (OCH₂)_PEG), 68.9 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.2 (s, (OCH₂α)_PEG), 29.3, 28.9 (s, CH_2succ).

(実施例2)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス(2-ヒドロキシ酢酸)

1gのPEG₄₀₀₀(0.25ミリモル)を10mLのアセトンに溶解し、0.85mLのジョーンズ試薬(1ミリモルのCrO₃)を添加した。添加が終了すると、青緑色のクロム塩が反応媒体から沈殿物として析出した。混合物を周囲温度で16時間撹拌した。0.15mLのイソプロパノールおよび0.10gの活性炭を添加することによって、反応を止め、撹拌を3時間継続した。次いで、活性炭をブフナー漏斗で濾過により除去し、濾液を減圧濃縮した。残渣を最小限のジクロロメタンに溶解し、過剰の冷ジエチルエーテルを添加することによって沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、次いでKOHペレットで真空乾燥すると、期待される生成物が白色固体の形で生成した(3.26g、81%)。
IR 1643cm^-1 (COOH), 3418cm^-1(OH).
¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz) δ 171.6 (s, C=O), 70.8 (s, (OCH₂α)_PEG), 70.4 (s, (OCH₂)_PEG), 68.5 (s, (OCH₂COOH)_PEG).

(実施例2-2)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス(2-ヒドロキシプロパン酸)

1gのPEG₄₀₀₀(2.5ミリモル、1当量)およびカリウムtert-ブトキシド(0.25ミリモル、0.1当量)のトルエン(25mL)溶液を、40℃で20分間撹拌し、tert-ブチルアクリレート(15ミリモル、6当量)を添加した。混合物を40℃で6時間撹拌した。溶媒を、減圧下で蒸発させることによって除去した。得られた残渣をジクロロメタン(100mL)に溶解し、この溶液を過剰の冷ジエチルエーテル(1L)にゆっくりと添加した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで数回洗浄し、次いでKOHペレットで終夜真空乾燥した。

PEG-ビス(O-(CH₂)₂-COOtBu)をジクロロメタン(20mL)に溶解し、等体積のTFA(トリフルオロ酢酸)を添加し、混合物を周囲温度で終夜撹拌した。

溶媒を減圧下で蒸発除去し、得られたオイルをジクロロメタン(100ml)に溶解し、この溶液を過剰の冷ジエチルエーテル(1L)にゆっくりと添加した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで数回洗浄し、次いでKOHペレットで終夜真空乾燥した。最終生成物であるPEG-ビス(OCH₂CH₂-COOH)が、白色固体の形で得られた(8.63g、83%)。
¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ 3.87-3.42 (m, (OCH₂)_PEG), 2.60 (t, 2H, CH₂a).
¹³C NMR (CDCl₃, 75MHz) δ 173.0 (s, C=O), 70.5 (s, (OCH₂)_PEG), 66.9 (s,CH₂b), 34.7 (s, CH₂a).

(実施例3)
方法A:二官能化PEGとヌクレオシドのカップリング
ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ(2当量)のN,N-ジメチルホルムアミド(30mL)溶液を、2つのリンカーを含むPEG(0.95ミリモル、1当量)、例えばPEGビス-スクシネートのジクロロメタン(70mL)溶液に添加した。N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド(3.79ミリモル、4当量)およびN-ヒドロキシルベンゾトリアゾール(1.89ミリモル、2当量)を添加し、得られた混合物を、60℃で7時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発除去し、得られた残渣を最小限のジクロロメタンに溶解し、4℃で終夜静置した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過により分離した。濾液を減圧濃縮し、N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)に溶解した。得られた溶液を、過剰体積の冷ジエチルエーテルでゆっくりと除去した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。最終生成物を無水エチルアルコール(40mL)で再結晶し、KOHペレットで真空乾燥した。

(実施例4)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル)スクシネート]

PEG-ビス-スクシネート(4g、0.95ミリモル)とヌクレオシドaraC(0.46g、1.89ミリモル)のカップリングを実施例3の方法Aで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(3.65g、83%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 7/3, v/v): 0.7.
¹H NMR (D₂O, 200MHz) δ 8.16 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.26. (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.10 (d, J_1'-2'=4.6Hz, 1H, H_1'), 4.34 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=4.6Hz, 1H, H_2'), 4.16 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 4.02-3.92 (m, 2H, H_3' H_4'), 3.73 (m, 2H, 2H_5'), 3.70-3.33 (m, (OCH₂)_PEG), 2.76-2.62 (m, 4H, CH_2succ).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.5 (s, C₄), 156.7 (s, C₂), 146.7 (s, C₆), 97.3 (s, C₅), 87.1 (s, C_1'), 84.0 (s, C_4'), 75.4 (s, C_2'), 75.2 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 60.7 (s, C_5'), 31.5, 28.5 (2s, CH_2succ).

(実施例5)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]

PEG-ビス-スクシネート(4.84g、1.15ミリモル)と2'-デオキシシチジン(0.52g、2.30ミリモル)のカップリングを実施例3の方法Aで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(4.60g、87%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 6/4, v/v): 0.9.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.25 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.27 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₅), 6.13 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.2Hz, 1H, H_1'), 4.30 (m, 1H, H_3'), 4.19 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 4.04 (m, 1H, H_4'), 3.85-3.50 (m, 2H_5' (OCH₂)_PEG), 2.80-2.65 (m, 4H, CH_2succ), 2.43 (m, 1H, H_2'a), 2.23 (m, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=O_succ), 162.4 (s, C₄), 156.7 (s, C₂), 145.5 (s, C₆), 97.7 (s, C₅, 87.4 (s, C_1') 87.3 (s, C_4'), 70.2 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 61.0 (s, C_5'), 40.1 (s, C_2'), 31.5, 28.4 (2s, CH_2succ).

(実施例6)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]

PEG-ビス-スクシネート(5g、1.20ミリモル)とシチジン(0.58g、2.4ミリモル)のカップリングを実施例3の方法Aで実施し、化合物が白色固体の形で得られた(4.80g、87%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 6/4, v/v): 0.9.
¹H NMR (D₂O, 200MHz) δ 8.26 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.26 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.79 (d, J_1'-2'=2.7Hz, 1H, H_1'), 4.19-4.14 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG) 4.06 (d, J_2'-1'=2.7Hz, 1H, H_2'), 3.98-3.25 (m, H_3' H_4' 2H₅, (OCH₂)_PEG), 2.64-2.76 (m, 4H, CH_2succ).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.6 (s, C₄), 156.9 (s, C₂), 145.6 (s, C₆), 97.8 (s, C₅), 91.3 (s, C_1'), 83.8 (s, C_4'), 74.5 (s, C_3'), 69.5 (s, (OCH₂)_PEG), 68.6 (s, C_2'), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 60.1 (s, C_5'), 31.5, 28.4 (2s, CH_2succ).

(実施例7)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)シトシル)スクシネート]

0.25gのPEG-ビス-スクシネート(0.06ミリモル)と0.025gの2',3'-ジデオキシシチジン(0.12ミリモル)のカップリングを実施例3の方法Aで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(0.23g、87%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 8/2, v/v): 0.8.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.33 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.26 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.97 (dd, J_1'-2'a=6.6Hz, J_1'-2'b=2.0Hz, 1H, H_1'), 4.20 (m, 3H, (OCH₂α)_PEG H_4'), 3.86-3.81 (m, 2H, 2H_5'), 3.73-3.62 (m, OCH₂)_PEG), 2.79-2.65 (m, 4H, CH_2succ), 2.45 (m, 1H, H_2'a), 2.05 (m, 1H, H_2'b), 1.97 (m, 1H, H_3'a), 1.65 (m, 1H, H_3'b).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.4 (s, C₄), 156.9 (s, C₂), 145.7 (s, C₆), 97.4 (s, C₅), 88.3 (s, C_1'), 83.3 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 62.3 (s, C_5'), 32.5 (s, C_2'), 31.5, 28.5 (2s, CH_2succ), 24.1 (s, C_3').

(実施例8)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-3'-チア-β-D-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]

1gのPEG-ビス-スクシネート(0.23ミリモル)と0.10gの3TC(0.47ミリモル)のカップリングを実施例3の方法Aで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(0.88g、80%)
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 8/2, v/v): 0.8.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.42 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.25 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.24 (dd, J_1'-2'a=2.7Hz, J_1'-2'b=5.4Hz, 1H, H_1'), 5.31 (t, J_4'-5'=3.6Hz, 1H, H_4'), 4.20-4.17 (m, (OCH₂α)_PEG), 3.99 (dd, J_5'a-4'=3Hz, J_5a'-5'b=12.9Hz, 1H, H_5'a), 3.90-3.34 (m, OCH₂)_PEG H_5'b H_2'a), 3.22 (dd, J_2'b-1'=2.4Hz, J_2'b-_2'a=12.6Hz, 1H, H_2'b), 2.79-2.65 (m, 4H, CH_2succ).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.6 (s, C₄), 156.6 (s, C₂), 146.1 (s, C₆), 97.3 (s, C₅), 88.0 (s, C_1'), 87.9 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 61.5 (s, C_5'), 38.0 (s, C_2'), 31.5, 28.5 (2s, CH_2succ).

(実施例8-2)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[6-N-(1-(2'-デオキシ-3',5'-O-((テトライソプロピル)ジシロキサン-1,3-ジイル)-β-D-リボフラノシル)-アデノシル)スクシネート

PEGビス-スクシネート(1g、0.24ミリモル)と2'-デオキシアデノシン(0.24g、0.48ミリモル)のカップリングを方法Aで実施し、PEG-O-ビス(スクシニル-3',5'-TIPS、2'dA)が白色固体の形で得られた(0.95g、78%)。
R_f (ジクロロメタン／メタノール98/2): 0.57
¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ 8.74 (s, 1H, NH), 8.58 (s, 1H, H₈), 8.13 (s, 1H, H₂), 6.25 (m, 1H, H_1'), 4.90 (m, 1H, H_3'), 4.20 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 4.12 (m, 3H, H_4' 2H_5'), 3.85-3.32 (m, (OCH₂)_PEG), 3.19 (m, 2H, CH_2succ ), 2.72 (m, 2H, CH_2succ ), 2.61 (m, 2H, H_2'), 0.962 (m, 28H, ((CH₃)₂ CH)₄).

(実施例8-3)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[6-N-(1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-アデノシル)スクシネート

PEG-O-ビス(スクシニル-3',5'-TIPS、2'dA)(0.21ミリモル、1当量)をテトラヒドロフラン(10mL)に溶解し、この溶液に1.06mLのフッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)(テトラヒドロフラン5当量中、1M TBAF溶液)を添加した。得られた混合物を周囲温度で1時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタン(3mL)で希釈し、有機相を水および塩水で洗浄した。減圧下で蒸発させた後、残渣をジクロロメタン(2ml)に溶解し、過剰体積の冷ジエチルエーテル(20mL)にゆっくりと添加した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。最終生成物を無水エタノール(2mL)で再結晶し、KOHペレットで真空乾燥した。生成物であるPEG-O-ビス(スクシニル-2'dA)が、白色固体の形で得られた(0.82g、90%)。
R_f (ジクロロメタン／メタノール98/2): 0.43
¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ 9.15 (s, 1H, NH), 8.63 (s, 1H, H₈), 8.19 (s, 1H, H₂), 6.41 (m, 1H, H_1'), 4.73 (m, 1H, H_3'), 4.22 (m, 4H, 2H_5', (OCH₂α)_PEG), 3.98 (m, 1H, H_4'), 3.86-3.39 (m, (OCH₂)_PEG), 3.22 (m, 2H, CH_2succ), 2.96 (m, 1H, 1 H_2'), 2.80 (m, 2H, CH_2succ), 2.61 (m, 2H, CH_2succ), 2.37 (m, 1H, 1 H_2').

(実施例9)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-β-D-アラビノフラノシル)-シトシル)2-ヒドロキシアセトアミド]

0.5gのPEG-ビス(OCH₂-COOH)(0.12ミリモル)と0.06gのaraC(0.24ミリモル)のカップリングを実施例3の方法Aで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(0.46g、82%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 6.5/3.5, v/v): 0.9
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.22 (d, J_6-5=7.0Hz, 1H, H₆), 7.32 (d, J_5-6=7.0Hz, 1H, H₅), 6.14 (s, 1H, H_1'), 4.38 (m, 1H, H_2'), 4.22 (m, 2H, (OCH₂COOH)_PEG), 4.05 (m, 3H, H_3' (OCH₂α)_PEG), 4.05-3.20 (m, H_4' 2H_5'(OCH₂)_PEG).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 172.3 (s, C=O), 162.1 (s, C₄), 156.5 (s, C₂), 147.0 (s, C₆), 97.3 (s, C₅), 87.2 (s, C_1'), 84.3 (s, C_4'),
75.5 (s, C_2'), 75.2 (s, C_3'), 70.6 (s, (OCH₂α)_PEG), 70.0 (s, (OCH₂)_PEG), 60.5 (s, OCH₂COOH)_PEG), 60.4 (s, C_5').

(実施例9-2)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル)-3-ヒドロキシプロパンアミド]

PEG-ビス(OCH₂CH₂-COOH)(3g、0.72ミリモル)とaraC(0.35g、1.44ミリモル)のカップリングを方法Aで実施し、化合物が白色固体の形で得られた(2.40g、72%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 85/15, v/v): 0.7
¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ 8.30 (d, J_6-5=7.2Hz, 1H, H₆), 7.16 (d, J_5-6=7.2Hz, 1H, H₅), 6.09 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=5.4Hz, 1H, H_1'), 4.46 (m, 1H, H_2'), 4.32 (m, 1H, H_3'), 4.14 (m, 1H, H_4'), 3.97-3.40 (m, 2H_5'(OCH₂)_PEG), 2.69 (m, 2H, CH₂b).

(実施例9-3)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル)-3-ヒドロキシプロパンアミド]

PEG-ビス(OCH₂CH₂-COOH)(3g、0.72ミリモル)と2'-デオキシシチジン(0.33g、1.44ミリモル)のカップリングを方法Aで実施し、化合物が白色固体の形で得られた(2.75g、83%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 85/15, v/v): 0.8
¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ 8.42 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.38 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.16 (t, J J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.2Hz, 1H, H_1'), 4.50 (m, 1H, H_3', 4.11 (m, 1H, H_4'), 3.85-3.50 (m, 2H_5' (OCH₂)_PEG), 3.39 (t, J_CH_2a-CH_2b=4.5Hz, 2H, CH₂a), 2.54 (m, 1H, H_2'a), 2.32 (m, 1H, H_2'b).

(実施例10)
方法B:ポリマー担体上のヌクレオシドの一リン酸化
40℃に加熱されたリン酸トリエチル(6mL)または5℃のアセトニトリル中のPEG-O-ビス(スクシニル-ヌクレオシド)もしくはPEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-ヌクレオシド)、すなわちポリマー担体上のヌクレオシド(1当量)の溶液に、過剰のオキシ塩化リンを添加し、混合物を1時間撹拌した。水性重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝溶液(1M、pH=7)(25mL)を添加することによって、過剰のオキシ塩化リンを加水分解し、混合物を減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン(180mL)に溶解し、有機相を水で洗浄した。水相をジクロロメタンで数回抽出した。有機相を合わせ、減圧下で蒸発させた。過剰の冷ジエチルエーテルを添加することによって、担体付きモノリン酸がジクロロメタン溶液から沈殿した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、KOHで真空乾燥した。

(実施例11)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル-5'-モノリン酸)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

実施例4からの3g(0.64ミリモル)のPEG-O-ビス(スクシニル-araC)の一リン酸化を実施例10の方法Bで実施して、化合物を白色固体の形で生成した(2.99g、92%)。
HPLC tr_araCMP: 18.9分 tx (一リン酸化): 97%.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.34 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.10 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.18 (d, J_1'-2'=5.0Hz, 1H, H_1'), 4.42 (m, 1H, H_2'), 4.19 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 4.10-4.15 (m, 4H, H_3' H_4' 2H_5'), 3.30-3.90 (m, (OCH₂)_PEG), 3.10 (q, J=7.3Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.62-2.85 (m, 4H, CH_2succ), 1.18 (t, J=7.3Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.7, 174.4 (s, C=O_succ), 159.0 (s, C₄), 148.1 (s, C₂), 145.2 (s, C₆), 96.9 (s, C₅), 87.0 (s, C_1', 82.3 (d, J_C4'-P=8.0Hz, C_4'), 75.8 (s, C_2'), 74.1 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β_PEG), 64.1 (s, OCH₂α)_PEG), 63.6 (s, C_5'), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 31.6, 28.3 (s, CH_2succ), 8.2 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.26 (s).

(実施例11-2)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル-5'-モノリン酸)-3-ヒドロキシプロパンアミド]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-AraC)(1.1g、0.24ミリモル)の一リン酸化を方法Bで実施し、PEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-AraCMP)が白色固体の形で得られた(0.95g、84%)。
¹H NMR (D₂O, 200MHz) δ 8.29 (d, J_6-5=7.2Hz, 1H, H₆), 7.27 (d, J_5-6=7.2Hz, 1H, H₅), 6.17 (m, 1H, H_1'), 4.42 (m, 1H, H_2'), 4.09 (m, 4H, H_3'. H_4' 2H_5'), 3.96-3.25 (m, (OCH₂)_PEG), 3.10 (q, J=7Hz, 6H, (CH₃CH₂)₃NH), 2.62 (t, JCH_2a-CH_2b=6Hz, 2H, CH₂a), 1.18 (t, J=7Hz, 9H, (CH₃CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 81MHz) δ 0.22 (s).

(実施例12)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-モノリン酸)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

実施例5からの1g(0.21ミリモル)のPEG-O-ビス(スクシニル-dC)の一リン酸化を、30当量のオキシ塩化リン(0.59mL、6.49ミリモル)を用いて、実施例10の方法Bで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(0.93g、86%)。
HPLC tr_dCMP: 13.07分 tx (一リン酸化): 80%.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.38 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.16 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.17 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.1Hz, 1H, H_1'), 4.45 (m, 1H, H_3'), 4.19 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 4.11-3.95 (m, 3H, H_4' 2H_5'), 3.95-3.35 (m, (OCH₂)_PEG), 3.10 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂)₃NH), 2.82-2.62 (m, 4H, CH_2succ), 2.48 (m, 1H, H_2'a), 2.25 (m, 1H, H_2'b), 1.18 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.7, 174.5 (2s, C=O_succ), 161.5 (s, C₄), 155.2 (s, C₂), 146.5 (s, C₆), 97.5 (s, C₅), 87.5 (s, C_1'), 86.3 (d, J_C4'-P=8.0Hz, C_4'), 70.4 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.2 (s, (OCH₂α)_PEG), 64.1 (d, J_C5'-P=8.0Hz, C_5'), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 40.1 (s, C_2'), 31.6, 28.4 (2s, CH_2succ), 8.2 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.19 (s).

(実施例13)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-モノリン酸)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

実施例6からの0.50gのPEG-O-ビス(succ-C)(0.11ミリモル)の一リン酸化を、30当量のオキシ塩化リン(0.29g、3.30mL)を用いて、実施例10の方法Bで実施した。化合物が白色固体の形で得られた(4.80g、89%)。
HPLC tr_CMP: 14.17分 tx (一リン酸化): 96%.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.59 (d, J_6-5=7.8Hz, 1H, H₆), 7.10 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.97 (s, 1H, H_1'), 4.91-4.12 (m, 7H, H_2' H_3' H_4' 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.94-3.47 (m, (OCH₂)_PEG), 3.20 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.95-2.75 (m, 4H, CH_2succ), 1.28 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.7, 174.4 (2s, C=O_succ), 161.1 (s, C₄), 154.0 (s, C₂), 147.3 (s, C₆), 97.3 (s, C₅), 91.1 (s, C_1'), 86.4 (d, J_C4'-P=8.0Hz, C_4'), 74.3 (s, C_2'), 69.6 (s, C_3' (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 64.0 (s, C_5'), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 31.6, 28.2 (2s, CH_2succ), 8.2 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.12 (s).

(実施例14)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-モノリン酸)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

実施例7からの0.04gのPEG-O-ビス(スクシニル-ddC)(0.09ミリモル)の一リン酸化を、30当量のオキシ塩化リン(0.24mL、2.70ミリモル)を用いて、活性化モレキュラーシーブ(3Å)の存在下、実施例10の方法Bで実施した。期待される化合物が白色固体の形で得られた(0.41g、96%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.49 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.13 (d, J_5-6=7.3Hz, 1H, H₅), 5.98 (d, J_1'-2'=5.1Hz, 1H, H_1'), 4.35 (m, 1H, H_4'), 4.18-3.92 (m, 4H, (OCH₂α)_PEG 2H_5'), 3.85-3.36 (m, OCH₂)_PEG), 3.10 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.79-2.68 (m, 4H, CH_2succ), 2.46 (m, 1H, H_2'a), 2.08 (m, 1H, H_2'b), 1.97 (m, 1H, H_3'a), 1.83 (m, 1H, H_3'b), 1.18 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.37 (s).

(実施例15)
方法C:二リン酸化:ポリマー担体上のモノリン酸ヌクレオシドのリン酸化
PEG-O-ビス(スクシニル-ヌクレオシドモノリン酸)(1当量)のトリブチルアミン(2.50mL)懸濁液を周囲温度で10分間撹拌した。冷ジエチルエーテル(50mL)を添加し、沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、KOHペレットで終夜真空乾燥した。ポリマー担体上のモノリン酸ヌクレオシドを無水N,N-ジメチルホルムアミド(3.75mL)に溶解し、1,1'-カルボニルジイミダゾール(0.59ミリモル、6当量)を添加した。反応混合物を周囲温度で2時間撹拌し、無水メタノール(0.10mL)で処理した。15分間撹拌した後、トリブチルアンモニウムホスフェートの無水N,N-ジメチルホルムアミド溶液(1M、1.49ミリモル、15当量)を添加し、懸濁液を周囲温度で24時間撹拌した。混合物を等体積のメタノールで処理し、次いで減圧濃縮した。冷ジエチルエーテル(50mL)を加えて、残渣を沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。粗生成物をRP18逆相カラムクロマトグラフィーにかけた(アセトニトリルグラジエント:水中で0から70%)。

(実施例16)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル-5'-ジリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

0.5g(0.09ミリモル)のPEG-O-ビス(succ-CMP)の二リン酸化を実施例15の方法Cで実施し、凍結乾燥した後、化合物が白色固体の形で得られた(0.36g、66%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.24 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.27 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.17 (d, J_1'-2'=5.1Hz, 1H, H_1'), 4.42 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.1Hz, 1H, H_2'), 4.28-4.05 (m, 6H, H_3'. H_4' 2H₅. (OCH₂α)_PEG), 3.89-3.35 (m, (OCH₂)_PEG), 2.92 (t, J=7.7Hz, 12H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.80-2.68 (m, 4H, CH_2succ), 1.54 (m, 12H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.29 (m, 12H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.81 (t, J=7.2Hz, 18H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, C=O_succ), 162.5 (s, C₄), 156.8 (s, C₂), 146.8 (s, C₆), 97.6 (s, C₅), 86.6 (s, C_1'), 82.0 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 75.1 (s, C_2'), 74.3 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 64.1 (s, C_5'), 52.6 (s, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 31.6, 28.4 (2s, CH_2succ), 25.2 (s, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 19.2 (s, CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 12.8 (s, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.44 (m, P_β), -11.03 (m, P_α).

(実施例17)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-ジリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

0.30gのPEG-O-ビス(succ-dCMP)(0.06ミリモル)の二リン酸化を実施例15の方法Cで実施し、凍結乾燥した後、化合物が白色固体の形で得られた(0.28g、81%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.36 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.29 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.22 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.3Hz, 1H, H_1'), 4.52 (m, 1H, H_3'), 4.24-4.09 (m, 5H, H_4' 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.89-3.56 (m, (OCH₂)_PEG), 3.13 (m, 12H, (CH₃CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.80-2.68 (m, 4H, CH_2succ), 2.50 (ddd, J_2'a-1'=6.0Hz, J_2'a-3'=3.8Hz, J_2'a -_2'b=13.8Hz, 1H, H_2'a), 2.28 (m, 1H, H_2'b), 1.59 (m, 12H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.31 (m, 12H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.86 (m, 18H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.7, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.4 (s, C₄), 156.8 (s, C₂), 145.8 (s, C₆), 98.3 (s, C₅, 87.3 (s, C_1'), 86.0 (d, J_C4'-P=8.0Hz, C_4'), 70.4 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.9 (d, J_C5'-P=6.0Hz, C_5'), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 52.7 (s, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 39.9 (s, C_2'), 31.6, 28.5 (2s, CH_2succ), 25.8 (s, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 19.2 (s, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 12.7 (s, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.69 (d, J_β-α=19.3Hz, P_β), -11.26 (d, J_β-α=17.3Hz, P_α).

(実施例18)

0.55gのPEG-O-succ-CMP(0.11ミリモル)の二リン酸化を実施例15の方法Cで実施した。凍結乾燥した後、混合物(対応する2',3'カーボネート誘導体を含む)が白色固体の形で得られた(0.34g、60%)。
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-ジリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.32 (d, J_6-5=6.9Hz, 1H, H₆), 7.25 (d, J_5-6=6.9Hz, 1H, H₅), 5.88 (d, J_1'-2'=1.8Hz, 1H, H_1'), 4.30-4.07 (m, 7H, H_2', H_3', H_4' 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.88-3.33 (m, (OCH₂)_PEG), 3.09 (m, 12H, ((CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.84-2.62 (m, 4H, CH_2succ), 1.54 (m, 12H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.30-1.15 (m, 12H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.92-0.68 (m, 18H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.79 (m, P_β), -11.85 (m, P_α).
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-カルボニル-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-ジリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.12 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.24 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.98 (s, 1H, H_1'), 5.53, 5.46 (dd, J_2'-3'=7.5Hz, J_2'-1'=J_3'-4'=1.8Hz, 2H, H_2', H_3'), 4.84 (m, 1H, H_4') 4.07-4.30 (m, 4H, 2H_5'a (OCH₂α)_PEG), 3.88-3.33 (m, (OCH₂)_PEG), 3.09 (m, 12H, ((CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.84-2.62 (m, 4H, CH_2succ), 1.54 (m, 12H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.30-1.15 (m, 12H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.68-0.92 (m, 18H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.79 (m, P_β), -11.85 (m, P_α).

(実施例19)
方法D:三リン酸化;ポリマー担体上のヌクレオシドモノリン酸の二リン酸化
PEG-O-ビス(スクシニル-ヌクレオシドモノリン酸)またはPEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-ヌクレオシドモノリン酸)(1当量)のトリブチルアミン(2.50mL)懸濁液を周囲温度で10分間撹拌した。冷ジエチルエーテル(50mL)を添加し、沈殿物を濾過し、洗浄し、KOHペレットで終夜真空乾燥した。ポリマー担体上のヌクレオシドモノリン酸を無水N,N-ジメチルホルムアミド(3.75mL)に溶解し、1,1-カルボニルジイミダゾール(0.59ミリモル、6当量)を添加した。反応混合物を周囲温度で2時間撹拌し、無水メタノール(0.10mL)で処理した。15分後、トリブチルアンモニウムピロホスフェートの無水N,N-ジメチルホルムアミド溶液(1M、1.49ミリモル、15当量)を添加した。懸濁液を周囲温度で24時間撹拌した。混合物を等体積のメタノールで処理し、次いで減圧濃縮した。冷ジエチルエーテル(50mL)を加えて、残渣を沈殿物として析出させた。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。粗生成物をRP18逆相カラムクロマトグラフィーにかけた(アセトニトリルグラジエント:水中で0から70%)。

(実施例20)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

0.50gのPEG-O-ビス(succ-araCMP)(0.09ミリモル)の三リン酸化を実施例19の方法Dで実施し、凍結乾燥した後、化合物が白色固体の形で得られた(0.43g、69%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.29 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.17 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.17 (d, J_1'-2'=5.1Hz, 1H, H_1'), 4.41 (t, _J2'-1'=J_2'-3'=5.1Hz, 1H, H_2'), 4.27-4.05 (m, 6H, H_3' H_4' 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.88-3.30 (m, (OCH₂)_PEG), 3.03 (t, J=7.4Hz, 18H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.87-2.65 (m, 4H, CH_2succ), 1.57 (m, 18H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.27 (m, 18H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.83 (t, J=7.1Hz, 27H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.7, 174.5 (2s, C=O_succ), 161.5 (s, C₄), 155.1 (s, C₂), 147.6 (s, C₆), 97.2 (s, C₅), 86.6 (s, C_1'), 82.0 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 75.2 (s, C_2'), 74.0 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.2 (s, (OCH₂α)_PEG), 64.1 (d, J_C5'-P=8.0Hz, C_5'), 52.6 (s, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 31.6, 28.4 (2s, CH_2succ), 25.2 (s, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 18.3 (s, CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 12.8 (s, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.94 (d, J_γ-β=19.43Hz, P_γ), -11.32 (d, J_α-β=19.43Hz, P_α), -23.28 (t, J_β-γ=J_β-α19.43Hz, P_β).

(実施例20-2)
ポリ(オキシエチレン)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)-3-ヒドロキシプロパンアミド]、トリブチルアンモニウム塩

PEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-AraCMP)(0.70g、0.15ミリモル)の三リン酸化を方法Dで実施し、凍結乾燥した後、PEG-ビス(OCH₂CH₂-COAraCTP)が白色固体の形で得られた(0.41g、55%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.29 (d, J_6-5=7.2Hz, 1H, H₆), 7.27 (d, J_5-6=7.2Hz, 1H, H₅), 6.17 (m, 1H, H_1'), 4.42 (m, 1H, H_2'), 4.09 (m, 4H, H_3' H_4' 2H_5'), 3.94-3.30 (m, (OCH₂)_PEG), 3.06 (t, J=7.9Hz, 18H, (CH₃CH₂CH₂CH₂)₃NH), 2.62 (t, JCH_2a-CH_2b=6Hz, 2H, CH₂a), 1.51 (m, 18H, (CH₃CH₂CH₂CH₂)₃NH), 1.26 (m, 18H, (CH₃CH₂CH₂CH₂)₃NH), 0.94 (t, 27H, (CH₃CH₂CH₂CH₂)₃NH) .
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.80 (d, J_γ-β=21.17Hz, P_γ), -11.84 (d, J_α-β=21.17Hz, P_α), -23.31(t, J_β-γ=J_β-α=21.17Hz, P_β).

(実施例21)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

0.30gのPEG-O-ビス(succ-dCMP)(0.06ミリモル)の三リン酸化を実施例19の方法Dで実施し、凍結乾燥した後、化合物が白色固体の形で得られた(0.27g、73%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.35 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₅), 7.17 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.17 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.3Hz, 1H, H_1'), 4.51 (m, 1H, H_3'), 4.21-4.13 (m, 5H, H_4' 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.89-3.31 (m, (OCH₂)_PEG), 3.17-2.95 (m, 18H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.79-2.62 (m, 4H, CH_2succ), 2.47 (m, 1H, H_2'a), 2.26 (m, 1H, H_2'b), 1.59-1.45 (m, 18H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.40-1.25 (m, 18H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 0.90-0.75 (m, 27H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.8, 174.6 (2s, C=O_succ), 161.8 (s, C₄), 155.4 (s, C₂), 146.3 (s, C₆), 98.0 (s, C₅), 87.4 (s, C_1'), 86.2 (s, C_4'), 70.3 (s, C_3'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 65.2 (s, C_5'), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 52.6 (s, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 40.0 (s, C_2'), 31.6, 28.4 (2s, CH_2succ), 25.2 (s, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 19.1 (s, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 12.8 (s, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.73 (d, J_γ-β=20.6Hz, P_γ), -11.34 (d, J_β-α=19.4Hz, P_α), -22.81 (m, P_β).

(実施例22)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

0.30gのPEG-O-ビス(succ-CMP)(0.11ミリモル)の三リン酸化を実施例19の方法Dで実施した。凍結乾燥した後、期待される化合物と対応する2',3'カーボネート誘導体の混合物(1/1)が白色固体の形で得られた(0.26g、70%)。
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.30 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.22 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.87 (d, _J1'-2'=2.8Hz, 1H, H_1'), 4.25-4.14 (m, 7H, H_2' H_3' H_4' H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.97-3.25 (m, (OCH₂)_PEG), 3.14-2.98 (m, 18H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.74-2.60 (m, 4H, CH_2succ), 1.63-1.48 (m, 18H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.13-1.35 (m, 18H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.86-0.78 (m, 27H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 81MHz) δ -10.65 (m, P_γ), -12.10 (m, P_α), -22.94 (m, P_β).
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-カルボニル-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.12 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 7.21 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 5.97 (s, 1H, H'), 5.50 (m, 2H, H_2' H_3'), 4.86 (m, 1H, H_4'), 4.25-4.14 (m, 4H, 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.97-3.25 (m, (OCH₂)_PEG), 3.14-2.98 (m, 18H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.74-2.60 (m, 4H, CH_2succ), 1.63-1.48 (m, 18H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.35-1.13 (m, 18H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.86-0.78 (m, 27H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 81MHz) δ -10.65 (m, P_γ), -12.10 (m, P_α), -22.94 (m, P_β).

(実施例23)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩およびカルボニルジイミダゾリウム塩

0.32gのPEG-O-ビス(succ-CMP)(0.06ミリモル)の三リン酸化を実施例19の方法Dで実施した。カルボニルジイミダゾール(3当量)を用いて、活性化を30分間だけ実施した。凍結乾燥した後、標題の化合物が白色固体の形で得られた(0.17g、42%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.60 (s, 2H, N=CH-N), 8.31 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.38 (s, 4H, N=CH=CH), 7.23 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.89 (d, J_1'-2'=2.8Hz, 1H, H_1'), 4.28-4.19 (m, 7H, H₂, H_3' H_4' 2H_5' (OCH₂α)_PEG), 3.86-3.34 (m, (OCH₂)_PEG), 3.10 (q, J=7.3Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.79-2.62 (m, 4H, CH_2succ), 1.18 (t, J=7.3Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.75 (d, J_γ-β=19.4Hz, P_γ, -11.37 (d, J_α-β=19.4Hz, P_α), -23.08 (t, J_β-γ=J_β-α=19.4Hz, P_β).

(実施例24)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

0.36gのPEG-O-ビス(succ-ddCMP)(0.07ミリモル)の三リン酸化を実施例19の方法Dで実施した。凍結乾燥した後、標題の化合物が白色固体の形で得られた(0.27g、60%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.47 (d, J_6-5=7.2Hz, 1H, H₆), 7.09 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.97 (m, 1H, H_1'), 4.36 (m, 1H, H_4'), 4.26 (m, 1H, H_5'a), 4.18 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 4.08 (m, 1H, H_5'b), 3.83-3.35 (m, (OCH₂)_PEG), 3.02 (t, J=7.4Hz, 18H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.81-2.65 (m, 4H, CH_2succ), 2.44 (m, 1H, H_2'a), 2.15-1.80 (m, 2H, H_2'b H_3'a), 1.82 (m, 1H, H_3'b), 1.56 (m, 18H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.28 (m, 18H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.82 (t, J=7.1Hz, 27H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz): 174.8, 174.5 (2s, C=O_succ), 161.0 (s, C₄), 155.0 (s, C₂), 144.8 (s, C₆), 97.3 (s, C₅), 88.6 (s, C_1', 81.8 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 66.0 (s, C_5', 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 52.6 (s, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 32.5 (s, C_2'), 31.6, 28.4 (2s, CH_2succ), 25.2 (s, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 23.8 (s, C_3'), 19.2 (s, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 12.8 (s, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -11.00 (m, P_γP_α), -22.85 (m, P_β).

(実施例25)
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-ジリン酸)スクシネート]、トリブチルアンモニウム塩

PEG-O-ビス(succ-ddCMP)(0.20g、0.04ミリモル)の二リン酸化を実施例15の方法Cで実施した。凍結乾燥した後、標題の化合物が白色固体の形で得られた(0.18g、80%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.35 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.21 (d, J_5-6=7.3Hz, 1H, H₅), 5.94 (d, J_1'-2'=5.6Hz, 1H, H_1'), 4.31 (m, 1H, H_4'), 4.16 (m, 3H, (OCH₂α)_PEG H_5'a), 4.03-3.93 (m, 1H, H_5'b), 3.80-3.33 (m, OCH₂)_PEG), 3.00 (m, 12H, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 2.74-2.62 (m, 4H, CH_2succ), 2.37 (m, 1H, H_2'a), 2.00 (m, 2H, H_2'b H_3'a), 1.77 (m, 1H, H_3'b), 1.55 (m, 12H, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 1.23 (m, 12H, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 0.80 (m, 18H, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, C=O_succ), 162.2 (s, C₄), 155.8 (s, C₂), 146.0 (s, C₆), 97.7 (s, C₅), 88.2 (s, C_1'), 81.7 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 66.2 (s, C_5'), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 52.6 (s, (CH₃CH₂CH₂ CH ₂ )₃NH), 32.6 (s, C_2'), 31.5, 28.4 (2s, CH_2succ), 25.2 (s, (CH₃CH₂ CH ₂ CH₂)₃NH), 24.1 (s, C_3'), 19.3 (s, (CH₃ CH ₂ CH₂CH₂)₃NH), 12.8 (s, (CH ₃ CH₂CH₂CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.29 (m, P_β), -10.97 (m, P_α).

(実施例26)
方法E:ヌクレオチドのその担体からの切断
担体付きヌクレオチド(0.05ミリモル、1当量)を濃アンモニア(2mL)に溶解した。溶液を周囲温度で1時間撹拌し、次いで減圧下で蒸発させた。RP18逆相カラムクロマトグラフィー(定組成;水)で精製を実施し、続いてセルロースエステル膜を用いて透析を実施した。

(実施例26-2)
方法E-2:担体上のヌクレオチドの切断
担体上のヌクレオチド(0.05ミリモル、1当量)を濃アンモニア(2mL)に溶解した。溶液を周囲温度で1時間撹拌し、次いで減圧下で蒸発除去した。RP18逆相カラムクロマトグラフィー(定組成;水)で精製を実施し、続いて凍結乾燥を実施した。

実施例26からの逸脱として、透析ステップを実施しなかった。

(実施例27)
1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.15gのPEG-O-ビス(スクシニル-araCMP)(0.02ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製すると、araCMPとスクシンアミドの混合物(15mg)が93/7の比で得られた。スクシンアミドを水(2mL)中で透析により終夜除去し、凍結乾燥した後、araCMP(13mg、68%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 6/2/2, v/v/v): 0.2.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.88 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.11 (d, J_1'-2'=5.3Hz, 1H, H_1'), 6.02 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 4.34 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.3Hz 1H, H_2'), 4.11-3.96 (m, 4H, H_3' H_4' 2H_5').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.45 (s).
UV (H₂O) λ_max 272nm (ε 7100), λ_min 247nm (ε 4100).
LC/MS (M-NH₄ ⁺) m/z: 322 tr: 11.7分 純度: 97%.

(実施例27-2)

方法E-2をPEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-AraCMP)(0.15g、0.02ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製すると、凍結乾燥した後、araCMPが白色固体の形で得られた(0.51g、70%)。

(実施例28)
1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシン-5'-ジリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.34gのPEG-O-ビス(スクシニル-araCDP)(0.05ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製すると、araCDPとスクシンアミドの混合物(55mg)が88/12の比で得られた。混合物の試料10mgを水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、araCDP(8.5mg、96%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.3.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.85 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.14 (d, J_1'-2'=5.4Hz, 1H, H_1'), 6.03 (d, J_5-6 =7.6Hz, 1H, H₅), 4.35 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.4Hz, 1H, H_2'), 4.20-4.10 (m, 3H, H_3' 2H_5'), 4.00 (m, 1H, H4,).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.42 (d, J_β-α=20.6Hz, P_β), -11.10 (d, J_α-β=20.6Hz, P_α).
UV (H₂O) λ_max 274nm (ε 7900), λ_min 246nm (ε 3800).
LC/MS (M+H-2NH₄ ⁺): m/z: 402 tr: 13.36分 純度: 86.7%.

(実施例29)
1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシン-5'-トリリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.43gのPEG-O-ビス(スクシニル-araCTP)(0.07ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、araCTPとスクシンアミドの混合物(68mg)が95/5の比で得られた。混合物の試料(8.5mg)を水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、AraCTP(8mg、92%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.2.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.85 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.14 (d, J_1'-2'=5.4Hz, 1H, H_1'), 6.04 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 4.35 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.4Hz, 1H, H_2'), 4.20-4.12 (m, 3H, H_3' 2H_5'), 4.01 (m, 1H, H_4').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.45 (d, J_γ-β=18.2Hz, P_γ), -11.20 (d, J_α-β=19.4Hz, P_α), -22.96 (t, J_β-γ=J_β-α=18.2Hz, P_β).
UV (H₂O) λ_max 273nm (ε 8700), λmin 246nm (ε 4500).
LC/MS (M+2H-3NH₄ ⁺): m/z: 482 tr: 19.25分 純度: 83.3%.

(実施例29-2)

方法E-2をPEG-ビス(OCH₂CH₂-CO-AraCTP)(0.20g、0.04ミリモル)に適用した。RP18逆相クロマトグラフィーによる精製および凍結乾燥の後、AraCTPが白色固体の形で得られた(14mg、79%)。

(実施例30)
1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.14gのPEG-O-ビス(スクシニル-dCMP)(0.03ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、dCMPとスクシンアミドの混合物(17mg)が86/14の比で得られた。混合物の試料(10mg)を水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、dCMP(8.6mg、73%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 6/2/2, v/v/v): 0.5.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.07 (d, J_6-5=7.8Hz, 1H, H₆), 6.19 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.5Hz, 1H, H_1'), 6.09 (d, J_5-6=7.8Hz, 1H, H₅), 4.45 (m, 1H, H_3'), 4.12 (m, 1H, H_4'), 4.04-3.90
(m, 2H, 2H_5'), 2.44-2.32 (ddd, J_2'a-1'=6.2Hz, J_2'a-3'=3.7Hz, J_2'a-2'=14.1Hz, 1H, H_2'a), 2.27-2.18 (m, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 161.8 (s, C₄), 151.7 (s, C₂), 143.3 (s, C₆), 95.5 (s, C₅), 86.4 (s, C_1'), 86.0 (d, J_C4'-P=8.0Hz, C_4'), 70.7 (s, C_3'), 64.4 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5'), 39.5 (s, C_2').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.23 (s).
UV (H₂O) λ_max 273nm (ε 9100), λ_min 246nm (ε 4800).
LC/MS (M-NH₄ ⁺): m/z: 306 tr: 11.23分 純度: 92.5%.

(実施例31)
1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-ジリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.21gのPEG-O-ビス(スクシニル-dCDP)(0.03ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、dCDPとスクシンアミドの混合物(27mg)が90/10の比で得られた。混合物の試料(10mg)を水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、9mgのdCDP(86%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.6.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.08 (d, J_6-5=7.8Hz, 1H, H₆), 6.19 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.6Hz, 1H, H_1'), 6.16 (d, J_5-6=7.8Hz, 1H, H₅), 4.52 (m, 1H, H_3'), 4.16-4.06 (m, 3H, H_4' 2H_5'), 2.43-2.34 (ddd, J_2'a-1'=6.3Hz, J_2'a-3'=3.6Hz, J_2'a-2'=Hz, 1H, H_2'a ), 2.27-2.18 (m, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 160.5 (s, C₄), 147.9 (s, C₂), 143.9 (s, C₆), 95.4 (s, C₅), 86.5 (s, C_1', 86.0 (s, C_4'), 70.6 (s, C_3'), 64.9 (s, C_5', 39.5 (s, C_2').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.68 (d, J_β-α=19.3Hz, P_β), -11.25 (d, J_α-β=16.5Hz, P_α).
UV (H₂O) λ_max 273nm (ε 9100), λ_min 246nm (ε 4600).
LC/MS (M+H-2NH₄ ⁺): m/z: 386 tr: 13.89分 純度: 77.4%.

(実施例32)
1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-トリリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.25gのPEG-O-ビス(スクシニル-dCTP)(0.04ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、dCTPとスクシンアミドの混合物(30mg)が94/6の比で得られた。混合物の試料10mgを水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、9mgのdCTP(70%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/ H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.6.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.04 (d, J_6-5=7.8Hz, 1H, H₆), 6.23 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b =6.3Hz, 1H, H_1'), 6.18 (d, J_5-6=7.8Hz, 1H, H₅), 4.56 (m, 1H, H_3'), 4.17 (m, 3H, H_4' 2H_5'), 2.45-2.37 (ddd, J_2'a-1'=6.0Hz, J_2'a-3'=3.3Hz, J_2'a-2'=14.4Hz, 1H, H_2'a), 2.34-2.23 (m, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 143.2 (s, C₆), 95.8 (s, C₅), 86.4 (s, C_1'), 86.7 (s, C_4'), 70.6 (s, C_3'), 65.2 (s, C_5'), 39.5 (s, C_2').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -9.62 (m, P_γ), -11.07 (d, J_α-γ=16.4Hz, P_α), -21.93 (m, P_β).
UV (H₂O) λ_max 273nm (ε 10100), λ_min 245nm (ε 4300).
LC/MS (M+2H-3NH₄ ⁺): m/z: 466 tr: 18.81 純度: 84.5%.

(実施例33):
1-(β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、アンモニウム塩

実施例26の方法Eを0.13gのPEG-O-ビス(スクシニル-CMP)(0.02ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、CMPとスクシンアミドの混合物(17mg)が80/20の比で得られた。混合物の試料10mgを水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、CMP(7mg、82%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 6/2/2, v/v/v): 0.3.
¹H NMR (D₂O, 400MHz) δ 7.98 (d, J_6-5=7.7Hz, 1H, H₆), 6.08 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.89 (d, J_1'-2'=2.6Hz, 1H, H_1'), 4.28-4.18 (m, 3H, H_2' H_3' H_4'), 4.17-3.94 (m, 2H, 2H_5').
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 163.6 (s, C₄), 154.4 (s, C₂), 142.3 (s, C₆), 96.0 (s, C₅), 89.4 (s, C_1'), 83.0 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 74.3 (s, C_2'), 69.2 (s, C_3'), 63.7 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.29 (s).
LC/MS (M-NH₄ ⁺): m/z: 322 tr: 10.20分 純度: 86%.

(実施例34)
1-(β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-ジリン酸、アンモニウム塩

0.20gのPEG-O-ビス(スクシニル-CDP)(0.03ミリモル)のエタノール/水混合物(6mL、1/1(v/v))溶液に、0.5mLのトリエチルアミンを添加した。混合物を周囲温度で3時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣を実施例25の方法Eに従って処理した。生成物をカラムクロマトグラフィーにかけると、CDPとスクシンアミドの混合物(30mg)が95/5の比で得られた。混合物の試料(10.5mg)を水(2mL)に溶解し、セルロースエステル膜を用いて透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、9mgのCDP(93%)が白色固体の形で得られたが、環状のシチジン5'-ジリン酸-2,3'-モノリン酸アナログであると同定された副生物が7%混入していた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.4.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.85 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 5.98 (d, J_5-6=7.8Hz, 1H, H₅), 5.83 (d, J_1'-2'=3.9Hz, 1H, H_1'), 4.24-4.00 (m, 5H, H_2' H_3' H_4' 2H_5').
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 163.1 (s, C₄), 154.2 (s, C₂), 140.5 (s, C₆), 94.8 (s, C₅), 87.8 (s, C_1'), 81.3 (d, J_C4'-P=9.1Hz, C_4'), 72.7 (s, C_2'), 67.7 (s, C_3'), 62.9 (d, J_C5'-P=5.4Hz, C_5').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.21 (d, J_β-α=20.3Hz, P_β), -11.13 (d, J_α-β=20.3Hz, P_α).
UV (H₂O) λ_max 270nm (ε 10500), λ_min 241nm (ε 6700).
LC/MS (M+H-2NH₄ ⁺): m/z: 402 tr: 14.15分 純度: 71.8%.

(実施例35)
1-(β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-トリリン酸、アンモニウム塩

0.19gのPEG-O-ビス(スクシニル-CTP)(0.03ミリモル)のエタノール/水混合物(6mL、1/1、v/v)溶液に、0.5mLのトリエチルアミンを添加した。混合物を周囲温度で3時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣を実施例25の方法Eに従って処理した。生成物をカラムクロマトグラフィーにかけると、CTPとスクシンアミドの混合物(24mg)が80/20の比で得られた。混合物の試料(16mg)を水(2mL)に溶解し、セルロースエステル膜を用いて透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、13mgのCTP(81%)が白色固体の形で得られたが、環状のシチジン-2',3'モノリン酸-5'-トリリン酸アナログであると同定された副生物が10%混入していた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.3.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.94 (d, J_6-5=7.7Hz, 1H, H₆), 6.10 (d, J_5-6=7.7Hz, 1H, H₅), 5.88 (d, J_1'-2'=4.2Hz, 1H, H_1'), 4.31-4.11 (m, 5H, H_2'. H_3', H_4' 2H_5').
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 162.2 (s, C₄), 152.8 (s, C₂), 142.9 (s, C₆), 95.9 (s, C₅), 89.2 (s, C_1'), 83.1 (d, J_C4'-P=9.3Hz, C_4'), 74.3 (s, C_2'), 69.1 (s, C_3'), 64.5 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -9.72 (d, J_γ-β=19.1Hz, P_γ), -11.22 (d, J_α-β=19.4Hz, P_α), -22.69 (t, J_β-γ=J_β-α=19.4Hz, P_β).
UV (H₂O) λ_max 270nm (ε 12500), λ_min 228nm (ε 5300).
LC/MS (M+2H-3NH₄ ⁺): m/z: 482 tr: 17.74 純度: 75.9%.

(実施例36)
1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-トリリン酸)、アンモニウム塩

実施例26の方法EをPEG-O-ビス(スクシニル-ddCTP)(0.20g、0.03ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、期待される化合物であるddCTPとスクシンアミドの混合物(30mg)が92/8の比で得られた。混合物の試料10.5mgを水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、ddCTP(9.50mg、67%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.7.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.02 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 6.08 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.02 (dd, J_1'-2'a=6.6Hz, J_1'-2'b=2.0Hz, 1H, H_1'), 4.34 (m, 1H, H_4'), 4.25 (m, 1H, H_5'a), 4.08 (m, 1H, H_5'b), 2.43-2.33 (m, 1H, H_2'a), 2.10-1.97 (m, 2H, H_2'b H_3'a), 1.95-1.96 (m, 1H, H_3'b).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 164.9 (s, C₄), 155.4 (s, C₂), 145.0 (s, C₆), 97.1 (s, C₅), 89.2 (s, C_1'), 82.8 (d, J_C4'-P=8.5Hz, C_4'), 68.3 (d, J_C4'-P=5.4Hz, C_5'), 33.9 (s, C_2'), 26.1 (s, C_3').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ - 9.76 (d, J_γ-β=19.3Hz, P_γ), -10.90 (d, J_α-β=18.9Hz, P_α), -22.38 (t, J_β-γ=J_β-α=18.9Hz, P_β).
UV (H₂O) λ_max 279nm (ε 11277), λ_min 242nm (ε 2283).
LC/MS (M+2H-3NH₄ ⁺): m/z: 450 tr: 16.7 純度: 76%

(実施例37)
1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-モノリン酸)、アンモニウム塩

実施例26の方法EをPEG-O-スクシニル-ddCMP(0.16g、0.03ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、期待される化合物であるddCMPとスクシンアミドの混合物(17mg)が86/14の比で得られた。スクシンアミドを、水(2mL)中で終夜透析することによって除去した。凍結乾燥した後、ddCMP(14mg、79%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.3
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.06 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.02 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 5.93 (dd, J_1'-2'a=6.6Hz, J_1'-2'b=2.7Hz, 1H, H_1'), 4.27 (m, 1H, H_4'), 4.07 (m, 1H, H_5'a), 3.88 (m, 1H, H_5'b), 2.37-2.32 (m, 1H, H_2'a), 2.07-1.83 (m, 3H, H_2'b H_3'a H_3'b).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 162.3 (s, C₄), 151.6 (s, C₂), 143.3 (s, C₆), 94.8 (s, C₅), 87.3 (s, C_1'), 81.2 (d, J_C4'-P=8.4Hz, C_4'), 65.2 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5'), 32.0 (s, C_2'), 24.0 (s, C_3').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.42 (s).
UV (H₂O) λ_max 279nm (ε 12276), λ_min 245nm (ε 2408).
LC/MS (M-NH₄ ⁺): m/z: 290 tr: 10.75 純度: 93%

(実施例38)
1-(2',3'-ジデオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシル-5'-ジリン酸)、アンモニウム塩

実施例26の方法EをPEG-O-スクシニル-ddCDP(0.18g、0.03ミリモル)に適用した。カラムクロマトグラフィー精製により、期待される化合物であるddCDPとスクシンアミドの混合物(17mg)が92/8の比で得られた。混合物の試料16mgを水(2mL)に溶解し、透析により終夜精製した。凍結乾燥した後、ddCDP(14.8mg、66%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.5
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.10 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.09 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 5.95 (dd, J_1'-2'a=6.6Hz, J_1'-2'b=2.7Hz, 1H, H_1'), 4.30 (m, 1H, H_4'), 4.18 (m, 1H, H_5'a), 3.99 (m, 1H, H_5'b), 2.45-2.30 (m, 1H, H_2'a), 2.10-1.80 (m, 3H, H_2'b H_3'a H_3'b).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 161.7 (s, C₄), 151.8 (s, C₂), 143.6 (s, C₆), 94.8 (s, C₅), 87.4 (s, C_1'), 81.2 (d, J_C4'-P=8.3Hz, C_4'), 66.1 (s, C_5'), 32.0 (s, C_2'), 24.1 (s, C_3').
³¹P NMR (D₂O, 81MHz) δ - 10.72 (m, P_β), -11.03 (m, P_α).
UV (H₂O) λ_max 275nm (ε 9803), λ_min 245nm (ε 3514).
LC/MS (M+H-2NH₄ ⁺): m/z: 370 tr: 14.6 純度: 72%

(実施例39)
比較:方法F:ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの溶液中での一リン酸化:
ヌクレオシド(1当量)のリン酸トリエチル(2mL)懸濁液に、0℃でオキシ塩化リン(2当量)を添加した。混合物を0℃で4時間、次いで周囲温度で3時間撹拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝水溶液(1M、pH=7)(5mL)をゆっくり添加することによって、過剰のオキシ塩化リンを加水分解した。DEAE-セルロースSephadexカラムクロマトグラフィーで、水性重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液の直線グラジエント(0-1M)を用いて精製を実施した。残留するリン酸塩を、RP18逆相クロマトグラフィー(定組成;水)により除去した。

(実施例40)
1-(β-D-アラビノフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、ナトリウム塩

AraC(0.2g、0.82ミリモル)の一リン酸化を方法F(実施例36)で実施した。Dowex Na⁺でイオン交換し、凍結乾燥した後、araCMPが白色固体の形で得られた(0.2g、70%)。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 6/2/2, v/v/v): 0.2.
¹H NMR (D₂O, 400MHz) δ 8.01 (d, J_6-5=7.8Hz, 1H, H₆), 6.13 (d, J_1'-2' 5.4Hz, 1H, H_1'), 6.12 (d, J_5-6=7.8Hz, 1H, H₅), 4.39 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.4Hz, 1H, H_2'), 4.15-4.08-(m, 2H, H_3' H_5'a), 4.06-4.00 (m, 2H, H_4' H_5'b).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 161.2 (s, C₄), 151.0 (s, C₂), 144.4 (s, C₆), 94.7 (s, C₅), 85.5 (s, C_1'), 81.5 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 75.3 (s, C_2'), 73.5 (s, C_3'), 63.1 (d, J_C5'-P=4.0Hz, C_5').
³¹P NMR (D₂O 121MHz) δ 0.80 (s).
UV (H₂O) λ_max 272nm (ε 8100), λ_min 247nm (ε 4900).
LC/MS (M-Na+): m/z: 322 tr: 12.82分 純度: 97.7%.

(実施例41)
1-(β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、トリエチルアンモニウム塩

シチジン(0.20g、0.82ミリモル)の一リン酸化を方法Fで実施した。RP18逆相カラム精製(定組成;水)すると、凍結乾燥した後、CMP(0.13g、36%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 6/2/2, v/v/v): 0.3.
¹H NMR (D₂O, 400MHz) δ 7.91 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.02 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 5.88 (d, J_1'-2'=3.5Hz, 1H, H_1'), 4.22-4.15 (m, 3H, H_2' H_3'. H_4'), 4.04-4.11 (m, 1H, H_5'a), 3.94-4.01 (m, 1H, H_5'b), 3.10 (q, J=7.3Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 1.17 (t, J=7.3Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.46 (s).
UV (H₂O) λ_max 272nm (ε 10238), λ_min 247nm (ε 6530).
LC/MS (M-HNEt₃ ⁺): m/z: 322 tr: 10.7分 純度: 99% .

(実施例42)
1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、トリエチルアンモニウム塩

2'-デオキシシチジン(塩酸塩の形)(0.20g、0.76ミリモル)の一リン酸化を、以下の修正を行った方法Fで実施した。0℃ではなく15℃で4時間、次いで周囲温度で3時間、混合物を撹拌した。RP18逆相カラム精製(定組成;水)すると、凍結乾燥した後、dCMP(0.15g、48%)が白色固体の形で得られ、少量の5'3'dCMP(0.05g、11%)も白色固体の形で単離された。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 6/2/2, v/v/v): 0.5
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.96 (d, J_6-5=7.7Hz, 1H, H₆), 6.20 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b=6.6Hz, 1H, H_1'), 6.06 (d, J_5-6=7.7Hz, 1H, H₅), 4.45 (m, 1H, H_3'), 4.11 (m, 1H, H_4'), 4.03-3.90 (m, 2H, 2H_5'), 3.10 (q, J=7.3Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.40-2.31 (ddd, J_2'a-1'=6.1Hz, J_2'a-3'=3.7Hz, J_2'a-2'=14.1Hz, 1H, H_2'a), 2.26-2.16 (m, 1H, H_2'b), 1.19 (t, J=7.3Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.27 (s)
UV (H₂O) λ_max 271nm (ε 9700), λ_min 247nm (ε 6100).
LC/MS (M-HNEt₃ ⁺): m/z: 306 tr: 11.9分 純度: 100%.

(実施例43)
1(β-Dアラビノフラノシル)-シトシン-5'-ジリン酸、ナトリウム塩

モノ(トリエチルアンモニウム)塩の形のaraCMP(0.10g、0.23ミリモル)の水(1.80mL)溶液に、トリブチルアミン(0.46ミリモル、2当量)を添加した。混合物を周囲温度で30分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発除去した。エタノール、次いで無水ピリジンと共蒸発した後、モノリン酸をP₂O₅で終夜真空乾燥した。このモノリン酸のN,N-ジメチルホルムアミド(5mL)懸濁液に、0.23g(1.41ミリモル)の1,1'-カルボニルジイミダゾールを添加した。反応混合物を周囲温度で2時間撹拌し、無水メタノール(0.10ml、2.50mmol)で処理して、過剰の1,1'-カルボニルジイミダゾールを分解した。15分後、トリブチルアンモニウムホスフェートのN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1M、1.41ml、1.41ミリモル)を添加した。懸濁液を周囲温度で24時間撹拌し、次いで濾過した。濾液を等体積のメタノールで処理し、減圧濃縮した。

DEAE-Sephadexカラムで精製(TEABの直線グラジエント、0-1M)した後、残留するリン酸塩をRP18逆相クロマトグラフィー(定組成;水)により除去した。DOWEX Na⁺でイオン交換し、凍結乾燥した後、araCDP(45mg、42%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.3.
¹H NMR (D₂O, 400MHz) δ 7.85 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.17 (d, J_1'-2'=5.6Hz, 1H, H_1'), 6.03 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 4.37 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.6Hz, 1H, H_2'), 4.22 (t, J_3'-2'=6.0Hz, 1H, H_3'), 4.17 (m, 2H, 2H_5'), 4.01 (m, 1H, H_4').
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 166.1 (s, C₄), 157.4 (s, C₂), 142.7 (s, C₆), 95.7 (s, C₅), 85.1 (s, C_1'), 81.1 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 75.3 (s, C_2'), 73.6 (s, C_3'), 63.6 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -8.46 (m, P_β), -10.84 (m, P_α).
UV (H₂O) λ_max 271nm (ε 9100), λ_min 247nm (ε 5700).
LC/MS (M+H-2Na+): m/z: 402 tr: 15.8分 純度: 84.5%

(実施例44)
比較:方法G:ヌクレオシドの溶液中での三リン酸化
G1:「ワンポット」法
所望のヌクレオシド(1当量)のリン酸トリエチル(2mL)懸濁液に、0℃でオキシ塩化リン(1.64ミリモル、2当量)を添加した。混合物を0℃で4時間撹拌した。トリブチルアンモニウムピロホスフェートの無水N,N-ジメチルホルムアミド溶液(1M、4.11ミリモル、5当量)、およびトリブチルアミン(0.90ミリモル、1.1当量)を添加した。混合物を5分間激しく撹拌し、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝溶液(1M、30mL)をゆっくりと添加した。溶媒を減圧下で蒸発除去した。DEAE-Sephadexカラムクロマトグラフィーで、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液の直線グラジエント(0-1M)を用いて溶離して精製を実施した。残留するピロリン酸塩を、RP18逆相クロマトグラフィー(定組成;水)により除去した。

G2:カルボニルジイミダゾール活性化法:
モノ(トリエチルアンモニウム)塩(1当量)の形の必要とされたモノリン酸の水(1.80mL)溶液に、トリブチルアミン(0.46ミリモル、2当量)を添加した。混合物を周囲温度で30分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発除去した。エタノール、次いで無水ピリジンと共蒸発した後、モノリン酸をP₂O₅で終夜真空乾燥した。このモノリン酸のDMF(5mL)懸濁液に、1,1'-カルボニルジイミダゾール(1.41ミリモル、6当量)を添加した。反応混合物を周囲温度で2時間撹拌し、無水メタノール(2.30ミリモル、10当量)で処理して、過剰のカルボニルジイミダゾールを分解した。15分後、トリブチルアンモニウムピロホスフェートの無水N,N-ジメチルホルムアミド溶液(1M、1.41ミリモル、6当量)を添加した。懸濁液を周囲温度で24時間撹拌し、次いで濾過した。濾液を等体積のメタノールで処理し、次いで減圧濃縮した。DEAE-Sephadexカラムクロマトグラフィーで、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液の直線グラジエント(0-1M)を用いて溶離して精製を実施した。残留するピロリン酸塩を、RP18逆相クロマトグラフィー(定組成;水)で除去した。

(実施例45)
AraCTP

araCMP(0.20g、0.82ミリモル)の三リン酸化を、上述する方法G1で実施した。DOWEX Na⁺でイオン交換し、凍結乾燥した後、araCTP(0.045mg、10%)が白色固体の形で得られた。

araC(0.10g、0.23ミリモル)の三リン酸化も、上述する方法G2で実施した。DEAE-SephadexカラムおよびRP18逆相カラムで2回精製した後、Dowexでイオン交換し、次いで凍結乾燥すると、araCTP(0.015mg、11%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.2.
¹H NMR (D₂O, 400MHz) 7.84 (d, J_6-5=7.6Hz, 1H, H₆), 6.17 (d, J_1'-2'=5.4Hz, 1H, H_1'), 6.03 (d, J_5-6=7.6Hz, 1H, H₅), 4.37 (t, J_2'-1'=J_2'-3'=5.4Hz, 1H, H_2'), 4.25-4.16 (m, 3H, H_3' 2H_5'), 4.03 (m, 1H, H_4').
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 166.0 (s, C₄), 157.3 (s, C₂), 142.8 (s, C₆), 95.7 (s, C₅), 85.3 (s, C_1'), 81.1 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 75.4 (s, C_2'), 73.6 (s, C_3'), 64.0 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) -9.55 (d, J_γ-β=19.4Hz, P_γ), -11.12 (d, J_α-β=19.4Hz, P_α), -22.69 (t, J_β-γ=J_β-α=19.4Hz, P_β).
UV (H₂O) λ_max 271nm (ε 10800), λ_min 245nm (ε 6600).
LC/MS (M+2H-3Na+): m/z: 482 tr: 18.5分 純度: 84.7%

(実施例46)
CTP

モノ(トリエチルアンモニウム)塩の形のCMP(0.10g、0.23ミリモル)の三リン酸化を方法G2で実施した。DEAE-Sephadexカラム、次いでRP18逆相カラム(定組成;水)で精製すると、凍結乾燥した後、白色固体の形で得られたCTP(0.70g、37%)が生成した。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.3.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ7.97 (d, J_6-5=7.7Hz, 1H, H₆), 6.10 (d, J_5-6=7.7Hz, 1H, H₅), 5.88 (d, J_1'-2'=4.3Hz, 1H, H_1') 4.30-4.12 (m, 5H, H_2' H_3' H_4' 2H_5'), 3.09 (q, J=7.3Hz, 18H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 1.17 (t, J=7.3Hz, 27H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 163.4 (s, C₄), 154.1 (s, C₂), 142.5 (s, C₆), 96.1 (s, C₅), 89.1 (s, C_1'), 83.0 (d, J_C4'-P=12.0Hz, C_4'), 74.3 (s, C_2'), 69.2 (s, C_3'), 64.5 (d, J_C5'-P=7.0Hz, C_5'), 46.62 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 8.18 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.78 (d, J_γ-β=19.4Hz, P_γ), -11.36 (d, J_α-β=20.6Hz, P_α), -23.20 (t, J_β-γ=J_β-α=19.4Hz, P_β).
UV (H₂O) λ_max 272nm (ε 12500), λ_min 242nm (ε 7200).
LC/MS (M+2H-3HNEt3+): m/z: 482 tr: 17.1分 純度: 97.1%

(実施例47)
ヌクレオシド3TCと担体のカップリング:

PEGスクシネート(1g、0.23ミリモル)と3TC(0.10g、0.47ミリモル)のカップリングを方法Aで実施し、PEG-3TCが白色固体の形で得られた(0.88g、80%)。
R_f (CH₂Cl₂/MeOH, 8/2, v/v): 0.8.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.42 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.25 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.24 (dd, J_1'-2'a=2.7Hz, J_1'-2'b=5.4Hz, 1H, H_1'), 5.31 (t, J_4'-5'a=J_4'-5'b 3.6Hz, 1H, H_4'), 4.20-4.17 (m, (OCH₂α_PEG), 3.99 (dd, J_5'a-4'=3.0Hz, J_5a'-5'b=12.9Hz, 1H, H_5'a), 3.90-3.34 (m, (OCH₂)_PEG H_5'b H_2'a), 3.22 (dd, J_2'b-1'=2.4Hz, J_2'b-_2'a=12.6Hz, 1H, H_2'b), 2.79-2.65 (m, 4H, CH_2succ).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.6 (s, C₄), 156.6 (s, C₂), 146.1 (s, C₆), 97.3 (s, C₅), 88.0 (s, C_1'), 87:9 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 61.5 (s, C_5'), 38.0 (s, C_2'), 31.5, 28.5 (2s, CH_2succ).

(実施例48)
ポリマー担体上のヌクレオシドのH-ホスホネートの酸化による一リン酸化
方法B'1:H-ホスホネート5'-モノエステルヌクレオシドの合成
PEG-ヌクレオシド(ポリマー担体上のヌクレオシド)(1当量)の無水ピリジン(3.75mL)溶液に、ジフェニルホスフィット(1.60ミリモル、30当量)を添加した。溶液を周囲温度で20分撹拌し、トリエチルアミン水溶液(1.25mL、1/1(v/v))を15分後に添加し、次いで混合物を減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン(30mL)に溶解し、有機相を5%NaHCO₃水溶液(20mL)で洗浄した。水相をジクロロメタン(30mL)で数回抽出した。有機相を合わせ、減圧下で蒸発させた。

過剰体積の冷ジエチルエーテル(25mL)を添加することによって、担体付きH-ホスホネートヌクレオシドがジクロロメタン溶液から沈殿した。

沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。最終生成物を無水エタノール(5mL)で再結晶し、KOHペレットで真空乾燥した。

(実施例49)
ヌクレオシドddCの担体付きモノリン酸の合成への適用
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-5'-ヒドロゲノホスホニル-β-D-リボ-フラノシル)-シトシル)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-ddC(0.25g、0.05ミリモル)を実施例48の方法B'1で処理し、担体付きddCのH-ホスホネート5'-モノエステルが白色固体の形で得られた(0.23g、86%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.34 (d, J_6-5=7.4Hz, 1H, H₆), 7.26 (d, J_5-6=7.4Hz, 1H, H₅), 6.67 (d, J_H-P=637.2Hz, 1H, H_HP), 5.99 (m, 1H, H_1'), 4.32 (m, 1H, H_4'), 4.18-4.09 (m, 3H, (OCH₂α)_PEG H_5'a), 3.94 (m, 1H, H_5'b), 3.83-3.36 (m, (OCH₂)_PEG), 3.09 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.82-2.66 (m, 4H, CH_2succ), 2.45 (m, 1H, H_2'a), 2.08-1.97 (m, 2H, H_2'b H_3'a), 1.78 (m, 1H, H_3'b), 1.17 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=O_succ), 162.3 (s, C₄), 156.9 (s, C₂), 146.8 (s, C₆), 97.6 (s, C₅), 88.2 (s, C_1'), 86.6 (d, J_C4'-P=7.6Hz, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 63.9 (d, J_C5'-P=3.9Hz, C_5'), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 32.5 (s, C_2'), 31.5, 28.5 (2s, CH_2succ), 24.1 (s, C_3'), 8.2 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 6.53 (s).

(実施例50)
ヌクレオシド3TCの担体付きモノリン酸の合成への適用
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-5'-ヒドロゲノホスホニル-3'-チア-β-L-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-3TC(0.30g、0.06ミリモル)を実施例48の方法B'1で処理し、担体付き3TCのH-ホスホネート5'-モノエステルが白色固体の形で得られた(0.28g、87%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.39 (d, J_6-5=7.4Hz, 1H, H₆), 7.26 (d, J_5-6=7.4Hz, 1H, H₅), 6.71 (d, J_H-P=641.9Hz,1H, H_HP), 6.25 (s, 1H, H_1'), 5.40 (s, 1H, H_4'), 4.29-4.13 (m, 4H, (OCH₂α)_PEG H_5'a H_5'b), 3.85-3.36 (m, OCH₂)_PEG H_2'a), 3.22 (m, 1H, H_2'b), 3.10 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.79-2.65 (m, 4H, CH_2succ), 1.18 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.6 (s, C₄), 156.6 (s, C₂), 146.1 (s, C₆), 97.6 (s, C₅), 88.0 (s, C_1'), 86.1 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.2 (s, (OCH₂α)_PEG), 63.5 (s, C_5'), 46.5 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 37.8 (s, C_2'), 31.6, 28.5 (2s, CH_2succ), 8.1 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 6.35 (s).

(実施例51)
方法B'2:ヌクレオシドH-ホスホネートの酸化によるモノリン酸の合成
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-5'-O-モノホスホリル-β-D-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-ddC-H-ホスホネートモノエステル(0.10g、0.02ミリモル)の無水アセトニトリル(1.50mL)溶液に、0.20mL(0.81ミリモル)のN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドと、続いて無水トリエチルアミン(0.06mL、0.40ミリモル)を添加した。溶液を50℃で4時間撹拌して、対応するシリル化ホスフィット中間体を生成した。混合物を0℃に冷却し、tert-ブチルペルオキシドのデカン溶液(0.36mL、5〜6M、2.00ミリモル)を周囲温度で添加することによって、酸化を実施した。混合物を3時間撹拌し、過剰のMeOH-NEt₃(0.50mL、5/5(v/v))で処理し、撹拌を1時間継続した。溶媒を減圧下で蒸発除去し、残渣をジクロロメタン(10mL)に溶解した。有機相を5%重炭酸ナトリウム水溶液(7mL)で洗浄し、水相をジクロロメタン(10mL)で数回抽出した。有機相を合わせ、減圧下で蒸発させた。過剰体積の冷ジエチルエーテル(100mL)を添加することによって、担体上のヌクレオシド5'-モノリン酸がジクロロメタン溶液から沈殿した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。モノリン酸が白色固体の形で得られた(0.09g、89%)が、少量の出発物がわずかに混入している(84%/16%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.49 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.13 (d, J_5-6=7.3Hz, 1H, H₅), 5.98 (d, J_1'-2'=5.1Hz, 1H, H_1'), 4.35 (m, 1H, H_4'), 4.19 (m, 3H, (OCH₂α)_PEG H_5'a), 3.98-3.92 (m, 1H, H_5'b), 3.85-3.36 (m, (OCH₂)_PEG), 3.10 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.79-2.68 (m, 4H, CH_2succ), 2.46 (m, 1H, H_2'a), 2.08 (m, 1H, H_2'b), 1.97 (m, 1H, H_3'a), 1.83 (m, 1H, H_3'b), 1.18 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.5, 174.5 (2s, C=O_succ), 161.9 (s, C₄), 156.0 (s, C₂), 146.3 (s, C₆), 97.4 (s, C₅), 88.3 (s, C_1'), 81.8 (d, J_C4'-P=9.0Hz, C_4'), 69.5 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 65.2 (s, C_5'), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 32.6 (s, C_2'), 31.5, 28.4 (s, CH_2succ), 23.8 (s, C_3'), 8.2 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.37 (s).

(実施例52)
ヌクレオシド5'H-ホスホネートモノエステルの酸化-方法B'2の代替法
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-5'-O-モノホスホリル-3'-チア-β-L-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-3TC-H-ホスホネートモノエステル(0.15g、0.03ミリモル)の無水ピリジン(2.50mL)溶液に、0.30mL(1.21ミリモル)のN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドを添加した。溶液を50℃で4時間撹拌して、対応するシリル化ホスフィット中間体を生成した。ヨウ素(75mg、0.30ミリモル)のピリジン-水混合物溶液200mM(1.50mL、56/44(v/v))を周囲温度で添加することによって、酸化を実施した。混合物を1時間撹拌し、過剰のMeOH-NEt₃(1.50mL、50/50(v/v))で処理し、撹拌を1時間継続した。溶媒を減圧下で蒸発除去し、残渣をジクロロメタン(15mL)に溶解した。有機相を5%チオ硫酸ナトリウム水溶液(10mL)で洗浄し、水相をジクロロメタン(15mL)で数回抽出した。有機相を合わせ、減圧下で蒸発させた。過剰体積の冷ジエチルエーテル(150mL)を添加することによって、担体上の5'-モノリン酸ヌクレオシドがジクロロメタン溶液から沈殿した。沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。最終生成物を無水エタノール(5mL)で再結晶し、KOHペレットで真空乾燥した。モノリン酸PEG-3TCMPが黄色固体の形で得られた(0.15g、103%)が、ヨウ素の残渣が混入している。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.44 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.26 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.25 (s, 1H, H_1'), 5.40 (s, 1H, H_4'), 4.42-4.07 (m, 4H, (OCH₂α)_PEG H_5'a H_5'b), 3.84-3.36 (m, (OCH₂)_PEG H_2'a), 3.20 (m, 1H, H_2'b), 3.10 (q, J=7.2Hz, 6H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.82-2.67 (m, 4H, CH_2succ), 1.15 (t, J=7.2Hz, 9H, (CH₃CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 174.6, 174.5 (2s, C=O_succ), 162.6 (s, C₄), 156.6 (s, C₂), 146.3 (s, C₆), 97.6 (s, C₅), 88.1 (s, C_1'), 86.2 (d, J_C4'-P=8.4Hz, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.8 (s, C_5'), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 37.9 (s, C_2'), 31.6, 28.5 (s, CH_2succ), (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.72 (s).

(実施例53)
方法Cによる3TCのジリン酸誘導体の合成
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-5'-O-ジホスホリル-3'-チア-β-L-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-3TCMP(0.25g、0.05ミリモル)の二リン酸化を方法Cで実施した。DOWEX HNEt₃ ⁺でイオン交換し、RP18(逆相)カラムで精製した後、凍結乾燥すると、PEG-3TCDPジリン酸が黄色固体の形で得られた(0.17g、62%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.40 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.20 (d, J_5-6=7.8Hz, 1H, H₅), 6.24 (m, 1H, H_1'), 5.42 (m, 1H, H_4'), 4.48-4.31 (m, 2H, H_5'a H_5'b), 4.18 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 3.84-3.34 (m, (OCH₂)_PEG H_2'a), 3.21 (dd, J_2'b-1'=2.7Hz, J_2'b-_2'a=12.6Hz, 1H, H_2'b), 3.10 (q, J=7.2Hz, 18H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.77-2.66 (m, 4H, CH_2succ), 1.17 (t, J=7.2Hz, 27H, (CH ₃ CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 174.5, 174.4 (2s, C=O_succ), 162.6 (s, C₄), 156.6 (s, C₂), 146.2 (s, C₆), 97.7 (s, C₅), 88.1 (s, C_1'), 85.9 (d, J_C4'-P=8.6Hz, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α_PEG), 65.7 (s, C_5'), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 37.8 (s, C_2'), 31.6, 28.4 (2s, CH_2succ), 8.2 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.37 (d, J_β-α=21Hz, P_β), -11.36 (d, J_α-β=20.2Hz, P_α).

(実施例54)
方法Dによる3TCのトリリン酸誘導体の合成
ポリ(エチレングリコール)₄₀₀₀ビス[4-N-(1-(2',3'-ジデオキシ-3'-チア-5'-O-トリホスホリル-β-L-リボフラノシル)-シトシル)スクシネート]、トリエチルアンモニウム塩

PEG-3TCMP(0.25g、0.05ミリモル)の三リン酸化を方法Dで実施した。DOWEX HNEt₃ ⁺でイオン交換し、RP18(逆相)カラムで精製した後、凍結乾燥すると、PEG-3TCTPトリリン酸が黄色固体の形で得られた(0.16g、54%)。
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.41 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 7.20 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 6.24 (m, 1H, H_1'), 5.42 (m, 1H, H_4'), 4.45-4.22 (m, 2H, H_5'a HS_5'b), 4.17 (m, 2H, (OCH₂α)_PEG), 3.84-3.35 (m, (OCH₂)_PEG H_2'a), 3.23-3.18 (m, 1H, H_2'b), 3.09 (q, J=7.2Hz, 18H, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 2.77-2.66 (m, 4H, CH_2succ), 1.17 (t, J=7.2Hz, 27H, (CH ₃CH₂)₃NH).
¹³C NMR (D₂O, 100MHz) δ 174.6, 174.4 (2s, C=O_succ), 162.7 (s, C₄), 156.4 (s, C₂), 146.3 (s, C₆), 97.6 (s, C₅), 88.1 (s, C_1'), 86.2 (s, C_4'), 69.6 (s, (OCH₂)_PEG), 68.4 (s, (OCH₂β)_PEG), 64.1 (s, (OCH₂α)_PEG), 65.9 (s, C_5'), 46.6 (s, (CH₃ CH ₂ )₃NH), 37.8 (s, C_2'), 31.6, 28.5 (2s, CH_2succ), 8.3 (s, (CH ₃ CH₂)₃NH).
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ -10.83 (d, J_γ-β=18.9Hz, P_γ), -11.59 (d, J_α-β=20.5Hz, P_α), -23.17 (t, J_β-γ=J_β-α=20.1Hz, P_β).

(実施例55)
方法Eを用いた切断ステップ後の、ヌクレオシド3TCのモノリン酸、ジリン酸、およびトリリン酸誘導体が取得
1-(2',3'-ジデオキシ-3'-チア-β-L-リボフラノシル)-シトシン-5'-モノリン酸、アンモニウム塩

方法EをPEG-3TCMP(0.14g、0.03ミリモル)に適用した。RP18カラムクロマトグラフィー精製と、続いて透析ステップを行うと、凍結乾燥した後、3TCMP(10.40mg、64%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.4.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 7.97 (d, J_6-5=7.5Hz, 1H, H₆), 6.22 (t, J_1'-2'=4.8Hz, 1H, H_1'), 5.96 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.35 (m, 1H, H_4'), 4.16 (ddd, J_5'a-4'=3.3Hz, J_5'a-5'b=11.7Hz, J_5'a-P=5.6Hz, 1H, H_5'a), 4.07-3.99 (m, 1H, H_5'b), 3.45 (dd, J_2'a-2'b=12.3Hz, J_2'a-1=5.4Hz, 1H, H_2'a), 3.13 (dd, J_2'b-2'a=12.3Hz, J_2'b-1'=4.2Hz, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 165.8 (s, C₄), 156.7 (s, C₂), 142.0 (s, C₆), 95.8 (s, C₅), 87.4 (s, C_1'), 84.6 (d, J_C4'-P=8.6Hz, C_4'), 65.3 (d, J_C5'-P=4.7Hz, C_5'), 36.8 (s, C_2').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ 0.83 (s).
UV (H₂O) λ_max 271nm (ε 7771), λ_min 248nm (ε 5277).
LC/MS (M-NH₄ ⁺): m/z: 308 rt: 10.80分 純度: 99%

(実施例56)
1-(2',3'-ジデオキシ-3'-チア-β-L-リボフラノシル)-シトシン-5'-ジリン酸、アンモニウム塩

方法EをPEG-3TCDP(0.25g、0.05ミリモル)に適用した。RP18カラムクロマトグラフィー精製と、続いて透析ステップを行うと、凍結乾燥した後、3TCDP(12mg、51%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.4.
¹H NMR (D₂O, 200MHz) δ 8.05 (d, J_6-5=7.7Hz, 1H, H₆), 6.22 (t, J_1'-2'=4.8Hz, 1H, H_1'), 6.02 (d, J_5-6=7.7Hz, 1H, H₅), 5.37 (m, 1H, H_4'), 4.35-4.24 (m, 1H, H_5'a), 4.20-4.07 (m, 1H, H_5'b), 3.45 (dd, J_2'a-_2'b=12.2Hz, J_2'a-1'=5.2Hz, 1H, H_2'a), 3.15 (dd, J_2'b-_2'a=12.2Hz, J_2'b-1'=4.2Hz, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 163.6 (s, C₄), 153.9 (s, C₂), 143.0 (s, C₆), 95.4 (s, C₅), 87.4 (s, C_1'), 84.8 (d, J_C4'-P=8.5Hz, C_4'), 65.9 (d, J_C5'-P=5.0Hz, C_5'), 37.0 (s, C_2').
³¹P NMR (D₂O, 81MHz) δ -10.69 (d, J_β-α=20.5Hz, P_β), -11.53 (d, J_α-β=20.5Hz, P_α).
UV (H₂O) λ_max 272nm (ε 7769), λ_min 248nm (ε 5008).
LC/MS (M+H-2NH₄ ⁺): m/z: 388 rt: 13.40分 純度: 79%.

(実施例57)
1-(2',3'-ジデオキシ-3'-チア-β-L-リボフラノシル)-シトシン-5'-トリリン酸、アンモニウム塩

方法EをPEG-3TCTP(0.25g、0.05ミリモル)に適用した。RP18カラムクロマトグラフィー精製と、続いて透析ステップを行うと、凍結乾燥した後、3TCTP(9mg、35%)が白色固体の形で得られた。
R_f (iPrOH/H₂O/NH₄OH, 5.5/3.5/1, v/v/v): 0.6.
¹H NMR (D₂O, 300MHz) δ 8.10 (d, J_6-5=7.8Hz, 1H, H₆), 6.22 (t, J_1'-2'=4.8Hz, 1H, H_1'), 6.07 (d, J_5-6=7.5Hz, 1H, H₅), 5.38 (m, 1H, H_4'), 4.37-4.31 (m, 1H, H_5'a), 4.22-4.14 (m, 1H, H_5'b), 3.47 (dd, J_2'a-2'b=12.3Hz, J_2'a-1'=5.4Hz, 1H, H_2'a), 3.18 (dd, J_2'b-2'a=12.3Hz, J_2'b-1'=3.9Hz, 1H, H_2'b).
¹³C NMR (D₂O, 75MHz) δ 163.1 (s, C₄), 150.8 (s, C₂), 143.2 (s, C₆), 95.3 (s, C₅), 87.4 (s, C_1'), 84.8 (d, J_C4'-P=8.5Hz, C_4'), 66.1 (d, J_C5'-P=5.5Hz, C_5'), 37.0 (s, C_2').
³¹P NMR (D₂O, 121MHz) δ - 10.46 (d, J_γ-β=19.1Hz, P_γ), -11.39 (d, J_α-β=18.9Hz, P_α), -22.77 (t, J_β-γ=J_β-α=18.9Hz, P_β).
UV (H₂O) λ_max 272nm (ε 7444), λ_min 248nm (ε 4451).
LC/MS (M+2H-3NH₄ ⁺): m/z: 468 rt: 16.10分 純度: 87%.

(実施例58)
保護基の使用によるプリンヌクレオシドの結合
ヌクレオシドは、Eur. J. Org. Chem.、2005、5171〜83頁に従って、保護基としてTIPS(テトラ-イソプロピルシリルエーテル)を用いて保護した。

ヌクレオシドをピリジンと共蒸発させ(3回)、KOHペレットで真空乾燥した。

ヌクレオシド(3.71ミリモル、1当量)のピリジン(10mL)溶液に、テトラ-イソプロピルシリルクロリド(3.79ミリモル、1.02当量)を添加し、得られた混合物を周囲温度で1時間30分撹拌した。

溶媒を減圧下で蒸発除去した。油状残渣をクロロメタン(20ml)に溶解し、有機相を飽和NaHCO₃水溶液、次いで塩水で2回洗浄した。減圧下で蒸発させた後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:ジクロロメタン/メタノール 96/4)により精製した。

(実施例59)
PEG-O-ビス(スクシニル-2'dA)の合成

実施例58に記載のように、2'-デオキシアデノシン(1g、3.71ミリモル)から合成を実施し、精製した後、2'dA-TIPSが白色固体の形で得られた(1.20g、65%)。
R_f (ジクロロメタン／メタノール96/4): 0.45
¹H NMR (CDCl₃, 300MHz) δ 8.25 (s, 1H, H₈), 7.96 (s, 1H, H₂), 6.22 (t, J_1'-2'a=J_1'-2'b =2.4Hz, 1H, H_1'), 5.89 (s, 2H, NH₂), 4.87 (m, 1H, H_3'), 3.98 (m, 2H, 2H_5'), 3.82 (m, 1H, H_4'), 2.60 (m, J_2'a-1'=J_2'b-1'=2.4Hz, 2H, H_2'), 0.962 (m, 28H, ((CH₃)₂CH)₄).

Claims (28)

1. ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログモノマーを調製する方法であって、(1)少なくとも1つの酸、二酸、またはエーテル-酸リンカーおよびヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログモノマーを具備している3000から6000の範囲の分子量を有する可溶性ポリエチレングリコール担体を、カップリング剤を使用してヌクレオシドの環外アミンまたはヒドロキシル基にカップリングさせるステップと、(2)前記担体にカップリングさせた前記ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの、リン酸化剤でのリン酸化の少なくとも1ステップとを含む方法。
2. 少なくとも1つの二酸またはエーテル-酸リンカーを具備している前記ポリエチレングリコール担体が、次式:
   (I)RO-C₂H₄-O-PEG-O-C₂H₄-O-C(O)-(CH₂)_p-COOH
   [式中、Rは、アルキル、ベンジル、もしくはアリール基、または-C(O)-(CH₂)_n'-COOH基であり、pおよびn'は互いとは独立に、0または1から10の整数を表す]、または
   (II)RO-C₂H₄-O-PEG-O-C₂H₄-O-(CH₂)_m-COOH
   [式中、Rは、アルキル、ベンジル、もしくはアリール基、または-(CH₂)_m'-COOH基であり、mおよびm'は互いとは独立に、0または1から3の整数を表す]を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
3. 前記ポリエチレングリコール担体が、式(I)を有する少なくとも1つの二酸リンカーを具備しており、式(I)におけるpが6未満であることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
4. 式(I)におけるpまたはn'が、0から4の整数であることを特徴とする、請求項2または請求項3に記載の方法。
5. Rが、直鎖状または分枝状のC₁〜C₁₂アルキルもしくはベンジル基、またはフェニル、トリル、およびo-トリルから選択されるアリール基であることを特徴とする、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
6. Rがメチルまたはベンジル基であることを特徴とする、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
7. PEGが、少なくとも1つの3-ヒドロキシプロパン酸PEG-O(CH₂)₂-COOHリンカーで官能化されていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
8. ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログが環外アミンを有することを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
9. カップリングが、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの環外アミンと1つまたは2つのスクシネートまたは3-ヒドロキシプロパン酸リンカーを含むPEGとの間で実施されることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
10. 少なくとも1つの二酸リンカーを具備している前記ポリエチレングリコール担体が、式PEG-[O-C(O)-(CH₂)₂-COOH]₂またはPEG-O(CH₂)₂-COOHを有することを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
11. カップリングが、ジメチルアミノピリジン、カルボジイミド、芳香族オキシム、またはオニウム、アンモニウム、ホスホニウム、もしくはウロニウム型のカップリング剤から選択される少なくとも1つのカップリング剤を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
12. カップリングが、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1-ヒドロキシ-7-アザ-ベンゾトリアゾール(HOAt)、(2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(HBTU)ヘキサフルオロホスフェート、(2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム(HATU)ヘキサフルオロホスフェート、およびベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホニウム(PyBOP)ヘキサフルオロホスフェートから選択される少なくとも1つのカップリング剤を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
13. カップリングが、ジメチルアミノピリジンを用いて実施されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
14. 可溶性担体が分子量約4000のPEGであることを特徴とする、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
15. 担体にカップリングしているヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログが、1つ、2つ、または3つのリン酸化ステップで一リン酸化、二リン酸化、または三リン酸化されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
16. リン酸化が、リン(III)の誘導体またはリン(V)の誘導体を用いて、活性化剤の存在下または活性化剤の非存在下で実施されることを特徴とする、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
17. リン酸化が、オキシ塩化リン、トリアルキルアンモニウムピロホスフェート、およびテトラアルキルアンモニウムホスフェートから選択されるリン酸化剤を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
18. リン酸化が、オキシ塩化リン、チオホスフェートトリクロリド、4-ニトロフェニルジクロロホスフェート、トリブチルアンモニウムホスフェート、O-(2-クロロフェニル)ジクロロチオホスフェート、アミノメチルホスホン酸、アミノメチル(メチル)ホスホン酸、2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホラン、2-クロロ-2-オキソ-1,3,2-ジオキサホスホラン、2-クロロ-4H-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オン、2-クロロフェニルホスホロジクロリデート、4-クロロフェニル-ホスホロジクロリデート、2-シアノエチルリン酸バリウム、ジエチルクロロチオホスフェート、ジメチルクロロチオホスフェート、ジフェニル-クロロホスフェート、メチル-ホスホロジクロリデート、フェニル-ジクロロホスフェート、ジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト、メチルジクロロホスフィット、およびジフェニルホスフィットから選択されるリン酸化剤、またはトリブチルアンモニウムピロホスフェート、エチドロン酸、イミドジリン酸塩、イミノジ(メチルホスホン酸)、ピロホスホリルテトラクロリド、メチルビス(ジクロロホスホネート)、およびメチレンビスホスホン酸から選択されるリン酸化剤を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
19. リン酸化が、オキシ塩化リン、チオホスフェートトリクロリド、4-ニトロフェニルジクロロホスフェート、ジフェニルホスフィット、およびトリブチルアンモニウムホスフェートから選択されるリン酸化剤を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
20. リン酸化が、トリブチルアンモニウムピロホスフェートまたはメチレンビスホスホン酸を用いて実施されることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
21. リン酸化がオキシ塩化リンを用いて実施されることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
22. リン酸化が、活性化剤の非存在下でリン(V)誘導体を用いた、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログの一リン酸化または二リン酸化であることを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
23. 1回の一リン酸化ステップ後に得られた担体付きヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログモノリン酸が、活性化剤を用いた二リン酸化ステップまたは1回もしくは2回の一リン酸化ステップにかけられることを特徴とする、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
24. リン酸化が活性化され、活性化剤が、メシチルスルホニルニトロトリアゾール(MSNT)、メシチルスルホニルトリアゾール(MST)、メシチルスルホニルクロリド(MSCl)、トリ-イソプロピルスルホニルクロリド(TPSCl)、Tf₂O/4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)系、および1,1-カルボニルジイミダゾール(CDI)から選択されることを特徴とする、請求項1から21または23のいずれか一項に記載の方法。
25. リンカーの切断が、リン酸化後に塩基を使用して実施されることを特徴とする、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
26. リンカーの切断が、NH₄OH、MeONa、およびNH₃MeOHから選択される塩基を使用して実施されることを特徴とする、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
27. ヌクレオチドまたはアナログも回収されることを特徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
28. 3000から6000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール担体とカップリングしている、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法で得られた生物学的ツールとしてのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ。

Images