JP2011504592A - Integrated separation and detection cartridge with magnetic particles having a bimodal size distribution - Google Patents
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Abstract
【課題】200μl未満の少量サンプルにおける標的分析対象の有無を、高い信頼度で効率的に検出すること可能とする、手動デバイスおよび方法を開発すること。
【解決手段】本発明は、液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスおよび方法に関し、該デバイスは、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質を含む、200μl未満の容量を持つ反応チェンバーを含み、前記固定基質は、好ましくは、少なくとも2峰性であるサイズ分布を持つ磁気材料を含む。
【選択図】図1To develop a manual device and method capable of efficiently and reliably detecting the presence or absence of a target analyte in a small sample of less than 200 μl.
The present invention relates to a device and method for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample, the device comprising an immobilized substrate capable of capturing the analyte of less than 200 μl The immobilized substrate preferably comprises a magnetic material having a size distribution that is at least bimodal.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、液体サンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイス、およびその使用に関する。 The present invention relates to a device for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample, and the use thereof.
本発明はさらに、200μl未満から成るサンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するための方法に関する。 The invention further relates to a method for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a sample comprising less than 200 μl.
ここ数年、生物学的、環境的、および工業的液体において、注目する標的分析対象の有無を速やかに検出するために、数多くの単純化試験システムが設計されている。それらの内もっとも単純な形式のものでは、これらのアッセイシステムおよびデバイスは、通常、その標的分析対象と反応して視覚的反応を与える試験試薬と、該試験試薬を流通させる吸収紙または膜の組み合わせを含む。 In the last few years, a number of simplified test systems have been designed to quickly detect the presence or absence of a target analyte of interest in biological, environmental, and industrial fluids. In their simplest form, these assay systems and devices typically comprise a combination of a test reagent that reacts with its target analyte to give a visual response and an absorbent paper or membrane that circulates the test reagent. including.
この接触は種々の方法で行うことが可能である。もっとも一般的には、試験試薬を含む、例えば、多孔性ポリエチレンまたはポリプロピレンなどの多孔性または吸収性部材、または膜の中を、または該多孔性または吸収性部材の一部の中を、毛管作用によって、水性サンプルを横断させる。別の場合では、試験試薬は、試験デバイスの外部であらかじめ混合され、次いで、デバイスの吸収部材に添加されて最終的に信号を発生する。 This contact can be done in various ways. Most commonly, the capillary action is contained in a porous or absorbent member, such as porous polyethylene or polypropylene, or in a membrane, or part of the porous or absorbent member, containing the test reagent. To cross the aqueous sample. In another case, the test reagent is premixed outside the test device and then added to the absorbent member of the device to ultimately generate a signal.
多くの市販のデバイスおよびアッセイシステムはさらに洗浄ステップを含む。このステップでは、免疫吸収ゾーンが洗浄されて、非特異的信号発生器が取り除かれるので、適切なゾーンにおける信号に関して該多孔部材を調べることによって、サンプル中の標的分析対象の有無または量を決定することが可能となる。 Many commercially available devices and assay systems further include a washing step. In this step, the immunoabsorption zone is washed away and the non-specific signal generator is removed so that the presence or amount of target analyte in the sample is determined by examining the porous member for the signal in the appropriate zone It becomes possible.
従来技術によるアッセイデバイスおよびシステムは、サンプルおよび試薬の担体として吸収膜を使用するという制限を含むが、それらの制限に加えてさらに、アッセイデバイスは、一般に、数多くの工程を含むが、この内、実験結果を左右するパイペッティング工程は、検査室環境では比較的熟練したユーザーによって実行されなければならない。したがって、デバイス中の試薬の流れを制御するだけでなく、デバイス中の特定チェンバーにおける試薬の流れをも制御する、一工程アッセイおよびシステムが求められる。さらに、実験結果を左右するパイペッティングデバイスを要せず、完全に定量的な方法を実行するアッセイデバイスが求められる。 Prior art assay devices and systems include the limitations of using absorbent membranes as sample and reagent carriers, but in addition to those limitations, assay devices generally include a number of steps, of which The pipetting process that affects experimental results must be performed by a relatively skilled user in a laboratory environment. Accordingly, there is a need for a one-step assay and system that not only controls reagent flow in the device, but also controls reagent flow in specific chambers in the device. Furthermore, there is a need for an assay device that performs a fully quantitative method without the need for a pipetting device that affects experimental results.
今日、多くの標的分析対象は、中央研究所に設置される大型装置(免疫分析器)を用いて測定される。その主な理由の一つは、今日では、高感度、再現可能、定量的免疫およびDNAアッセイにおいて実験結果を左右するパラメータを満足させることができる、小型の、手動装置が存在しないからである。 Today, many target analytes are measured using large devices (immunoanalyzers) installed at the central laboratory. One of the main reasons is that today there is no small, manual device that can satisfy the parameters that influence experimental results in sensitive, reproducible, quantitative immunization and DNA assays.
したがって、本発明の目的は、200μl未満の少量サンプルにおける標的分析対象の有無を、高い信頼度で効率的に検出すること可能とする、手動デバイスおよび方法を開発することである。 Accordingly, an object of the present invention is to develop a manual device and method that enables a reliable and efficient detection of the presence or absence of a target analyte in a small sample of less than 200 μl.
少量サンプルにおいて分析対象の有無を定量的に検出する場合の、主要な一問題点は、少量の分析対象検出の信頼性および再現性を妨げる、背景信号を排除または抑制することである。 One major problem in quantitatively detecting the presence or absence of an analyte in a small sample is to eliminate or suppress background signals that interfere with the reliability and reproducibility of the detection of a small amount of analyte.
したがって、本発明のもう一つの目的は、少量の液体サンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するためのもので、そこでは、非特異的背景信号が抑制または排除されるデバイス、および方法を開発することである。 Accordingly, another object of the present invention is to quantitatively detect the presence or absence of a target analyte in a small amount of liquid sample, where a non-specific background signal is suppressed or eliminated, and a method Is to develop.
本発明をもたらした実験開発中に、本発明人らは、少量サンプルにおいて分析対象の有無を定量的に検出するための、高感度、高再現性で、完全定量的なアッセイを実行するのに決定的に重要なパラメータは、背景ノイズを下げることによって信号対ノイズ比を増すことであることを見出した。さらに、標的分析対象と、追跡/捕捉抗体の間の効率的混合過程が、背景ノイズを低減するための効率的洗浄過程と同様に、好ましい。その上さらに、標的分析対象と追跡/捕捉抗体の間に、大きな反応面があることが好ましいことが見出れた。さらに好ましい特徴として、効率的増幅試薬、例えば、HRPまたはALP酵素に接合される追跡抗体、および、温度制御アッセイ使用の可能性がある。 During the experimental development that led to the present invention, we performed a highly sensitive, reproducible, fully quantitative assay for quantitatively detecting the presence or absence of analytes in small samples. It has been found that a critical parameter is to increase the signal to noise ratio by reducing the background noise. Furthermore, an efficient mixing process between the target analyte and the tracking / capture antibody is preferred, as is an efficient washing process to reduce background noise. Furthermore, it has been found that there is preferably a large reaction surface between the target analyte and the tracking / capture antibody. Further preferred features include the use of efficient amplification reagents such as tracking antibodies conjugated to HRP or ALP enzymes, and temperature controlled assays.
本発明人らは、微量液体と磁気粒子技術を特定配合において組み合わせることによって、決定的重要パラメータを制御することが可能であり、同様にして、200μl未満のサンプルを分析することが可能な、比較的小型の手動装置(500グラム未満)を取得することが可能であることを見出した。 We can control critical parameters by combining trace liquids and magnetic particle technology in specific formulations, and in the same way a sample of less than 200 μl can be analyzed Has found that it is possible to obtain a small manual device (less than 500 grams).
驚くべきことに、従来の、単峰性サイズ分布(smsMB)の代わりに、双峰性サイズ分布を持つ磁気ビーズ(bmsMB)を用いると、信号対ノイズ比が増加することが見出された。発明人らはさらに、bmsMBでは、双峰性サイズ分布を持つMB同士の間で混合がよく行われ、そのため磁気ビーズの洗浄が最適となるために、単峰性サイズ分布に比べると、より優れたアッセイ成績が得られることを示した。これもまた、望ましくない背景信号を抑える。さらに、大型および小型磁気ビーズの混合物の使用は、大きな反応面の取得(小型粒径の利点)が、該粒子の効率的捕捉と輸送--これは大型磁気粒子の利点である--と組み合わされるために、分析対象物の捕捉という点でも優れた結果をもたらすことが見出された。このようにして、双峰性サイズ分布を持つ磁気粒子を用いることによって、高い信号、低いノイズ、および優れた移動性が実現可能であることが見出された。 Surprisingly, it has been found that the signal-to-noise ratio is increased when magnetic beads (bmsMB) with a bimodal size distribution are used instead of the conventional unimodal size distribution (smsMB). Inventors further note that in bmsMB, mixing between MBs with bimodal size distribution is performed well, so the magnetic beads are optimally washed and therefore better than unimodal size distribution The assay results were obtained. This also suppresses unwanted background signals. In addition, the use of a mixture of large and small magnetic beads combined with the acquisition of large reaction surfaces (the advantage of small particle size) is efficient capture and transport of the particles--this is the advantage of large magnetic particles Thus, it has been found that it also provides excellent results in terms of analyte capture. Thus, it has been found that by using magnetic particles with a bimodal size distribution, high signal, low noise, and excellent mobility can be achieved.
したがって、本発明のある好ましい局面では、本発明は、200μl未満の容量を持つ液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質を含む反応チェンバーを含み、前記固定基質が、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有する磁気粒子を含むことを特徴とする、デバイスに関する。 Accordingly, in one preferred aspect of the present invention, the present invention is a device for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample having a volume of less than 200 μl, and capable of capturing the analyte A device comprising a reaction chamber comprising a fixed substrate, wherein the fixed substrate comprises magnetic particles having a size distribution that is at least bimodal.
ある好ましい局面では、本発明は、液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、200μl未満の容量を持つ毛細管チャンネルの形状を持つ反応チェンバーを含み、該反応チェンバーが:
a. 反応チェンバーと、分析対象を含むサンプル導入のためのサンプル流入口とを含む第1部分(3)であって、さらに、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有する磁気粒子を含む固定基質を含む、第1部分;
b. 標的分析対象の検出手段を含む第2部分(5および6)、
c. 洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8);
d. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分から第2部分へ、および逆方向へ移動させるための手段;および、
e. 廃棄産物放出のための放出口;
を含み、
第1部分と、第2部分は隔てられるが、その隔離が、チェンバーの第1部分の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように行われることを特徴とする、デバイスに関する。
In one preferred aspect, the present invention is a device for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample, comprising a reaction chamber having the shape of a capillary channel with a volume of less than 200 μl, the reaction chamber But:
a first part (3) comprising a reaction chamber and a sample inlet for introducing a sample containing the analyte, and further comprising a fixed substrate comprising magnetic particles having a size distribution that is at least bimodal. Including a first part;
b. the second part (5 and 6) containing the detection means of the target analyte,
c. Solution inlet (8) for introduction of washing liquid and reaction mixture;
d. means for moving the fixed analyte from the first part of the chamber to the second part and in the opposite direction; and
e. Outlet for waste product release;
Including
A device, characterized in that the first part and the second part are separated, but the isolation is carried out so that the liquid sample specimen of the first part of the chamber does not enter the second part of the chamber .
さらに別の局面では、本発明は、サンプルにおける標的対象物の有無の定量的検出における、本発明によるデバイスの使用に関する。 In yet another aspect, the invention relates to the use of a device according to the invention in the quantitative detection of the presence or absence of a target object in a sample.
さらに別の局面では、本発明は、200μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的分析対象物の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程:
a)200μl未満の液体から成る液体サンプルを含む分析対象を準備すること;
b)該液体サンプルを反応チェンバーに供給すること;
c)反応チェンバー中のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること、ここに、前記固定基質は、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有する磁気材料を含み;
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること;
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、洗浄液によって洗浄すること;
f)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの検出器部分に移送すること;および、
g)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法に関する。
In yet another aspect, the present invention is a method for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a sample consisting of less than 200 μl of liquid, comprising the following steps:
a) preparing an analyte containing a liquid sample consisting of less than 200 μl of liquid;
b) feeding the liquid sample to the reaction chamber;
c) contacting the sample in the reaction chamber with an immobilized substrate capable of capturing the analyte, wherein the immobilized substrate comprises a magnetic material having a size distribution that is at least bimodal;
d) immobilizing the immobilized substrate containing the captured analyte;
e) washing the immobilized substrate containing the capture analyte with a washing solution;
f) transferring the immobilized substrate containing the capture analyte to the detector portion of the chamber; and
g) detecting the presence / absence of the target analyte using conventional detection means;
Including a method.
さらに別の局面では、本発明は、本発明によるデバイスと磁気材料とを含む部品のキットに関する。
本発明は、図面を参照しながら下記に詳細に説明される。
In yet another aspect, the invention relates to a kit of parts comprising a device according to the invention and a magnetic material.
The present invention is described in detail below with reference to the drawings.
〔定義〕
本発明の背景においては、「毛細管チャンネル」とは、流体が通過することが可能な、細長いチューブまたはチャンネルを意味する。好ましくは、本発明による毛細管チャンネルの直径は、10mm未満である。さらに好ましくは、本発明による毛細管チャンネルの直径は、5mm未満、例えば、4mm未満、または3mm未満、場合によっては2mm未満である。もっとも好ましい局面では、毛細管チャンネルは、1mm以下の直径を有する。
[Definition]
In the context of the present invention, “capillary channel” means an elongated tube or channel through which fluid can pass. Preferably, the diameter of the capillary channel according to the invention is less than 10 mm. More preferably, the diameter of the capillary channel according to the invention is less than 5 mm, for example less than 4 mm, or less than 3 mm, and in some cases less than 2 mm. In the most preferred aspect, the capillary channel has a diameter of 1 mm or less.
本発明の背景においては、「単峰性」という用語は、単峰性の、通例の数学的意味を有する、すなわち、分布は、ただ一つのモード(最頻値)しか持たない。二つの順序集合の間の関数f(x)は、もしも、ある値m(モード)に関し、x≦mにおいて該関数が単調に増加し、x≧mにおいて該関数が単調に減少するならば、1峰性(単峰性)である。この場合、f(x)の最大値はf(m)であり、他に局所的最大値は無い。 In the context of the present invention, the term “unimodal” has the usual mathematical meaning of unimodal, ie the distribution has only one mode (mode). A function f (x) between two ordered sets, if for a value m (mode), if the function increases monotonically at x ≦ m and decreases monotonically at x ≧ m, Unimodal (unimodal). In this case, the maximum value of f (x) is f (m), and there is no other local maximum value.
本発明の背景においては、「双峰性」という用語は、双峰性の、通例の数学的意味を有する、すなわち、分布は二つのモードを持つ。一般に、双峰性分布は、異なる、二つの、単峰性分布の混合物である。 In the context of the present invention, the term “bimodal” has the usual mathematical meaning of bimodal, ie the distribution has two modes. In general, a bimodal distribution is a mixture of two different unimodal distributions.
微小流システムは感度がきわめて低く、信頼性、再現性の高い信号を発生するには大量の分析対象を必要とするため、信号検出はしばしば困難に見舞われる。これまで、より高感度で、洗練された検出手段を開発するために大きな努力が払われてきた。一方、驚くべきことに、非特異的信号(ノイズ)レベルの一掃または抑制のためには、それよりも僅かなことしか行われてこなかった。本発明人らは、驚くべきことに、システムノイズを抑制するという単純な施策が、該システムの感度を目覚しく改善することを見出した。 Signal detection often suffers because microfluidic systems are extremely insensitive and require a large amount of analyte to generate a reliable and reproducible signal. So far, great efforts have been made to develop more sensitive and sophisticated detection means. On the other hand, surprisingly little has been done to clean out or suppress non-specific signal (noise) levels. The inventors have surprisingly found that a simple measure of suppressing system noise can significantly improve the sensitivity of the system.
一般に、本発明の発明概念は、微小流システムにおいて、分析対象を結合、固定、および洗浄する工程と、該分析対象を検出する工程との物理的隔離と見なしてもよいかもしれない。好ましくは、非分析対象分子由来の信号(背景信号)は全て、デバイスの第1部分(3)(または、方法の第1工程)に残留し、一方、デバイスの第2部分(方法の後続工程)において、分析対象由来の信号が、背景信号最小の状態下に、検出される。 In general, the inventive concept of the present invention may be viewed as a physical isolation between the steps of binding, fixing, and washing an analyte and detecting the analyte in a microfluidic system. Preferably, all signals from the non-analyte molecules (background signal) remain in the first part of the device (3) (or the first step of the method), while the second part of the device (the subsequent step of the method) ), The signal derived from the analysis object is detected under the condition of the minimum background signal.
驚くべきことに、非単峰性サイズ分布、例えば、双峰性サイズ分布を有する磁気粒子を用いると、洗浄効率および時間の点でより効率的な性能が発揮されることが観察された。サイズ分布を混ぜ合わせた磁気粒子を用いた場合、粒子のより効率的な捕捉および移動と組み合わされた、分析対象のより効率的な結合が実現されるものと考えられる。したがって、本発明の好ましい局面では、固定基質は、少なくとも双峰性のサイズ分布を有する。本発明の別の局面では、固定基質は、3峰性サイズ分布を有する。 Surprisingly, it has been observed that using magnetic particles having a non-unimodal size distribution, eg, a bimodal size distribution, provides more efficient performance in terms of cleaning efficiency and time. When using magnetic particles with a mixed size distribution, it is believed that more efficient binding of analytes is achieved, combined with more efficient capture and movement of particles. Thus, in a preferred aspect of the invention, the immobilized substrate has at least a bimodal size distribution. In another aspect of the invention, the immobilized substrate has a trimodal size distribution.
したがって、本発明は、200μl未満の容量を持つ液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質を含む反応チェンバーを含み、前記固定基質が、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有することを特徴とする、デバイスに関する。 Accordingly, the present invention provides a device for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample having a volume of less than 200 μl, and comprising a reaction chamber including an immobilized substrate capable of capturing the analyte. And wherein the immobilized substrate has a size distribution that is at least bimodal.
別の実施態様では、サイズ分布は3峰性である。 In another embodiment, the size distribution is trimodal.
好ましくは、固定基質は、磁気材料を含む。 Preferably, the fixed substrate comprises a magnetic material.
好ましくは、固定基質のサイズ分布は、2峰性であり、一集団の粒子は、2μm未満、例えば、1.5μm以下、例えば、1.0μm以下の平均直径を有し、もう一方の集団の磁気粒子は、2μmを超える、例えば、2.5Mm以上、または2.8μm以上、または3.0μm以上、または場合によっては5.0μm以上の平均直径を有する。 Preferably, the size distribution of the immobilized substrate is bimodal and one population of particles has an average diameter of less than 2 μm, such as 1.5 μm or less, such as 1.0 μm or less, and the other population of magnetic particles Has an average diameter of more than 2 μm, for example 2.5 Mm or more, or 2.8 μm or more, or 3.0 μm or more, or in some cases 5.0 μm or more.
一般に、本発明の発明概念は、微小流システムにおいて、分析対象を結合、固定する工程と、該分析対象を検出する工程との物理的隔離と見なしてもよいかもしれない。好ましくは、非分析対象分子由来の信号(背景信号)は全て、デバイスの第1部分(3)(または、方法の第1工程)に残留し、一方、デバイスの第2部分(方法の後続工程)において、分析対象由来の信号が、背景信号最小の状態下に、検出される。 In general, the inventive concept of the present invention may be viewed as a physical isolation between the process of binding and fixing the analyte and the process of detecting the analyte in a microfluidic system. Preferably, all signals from the non-analyte molecules (background signal) remain in the first part of the device (3) (or the first step of the method), while the second part of the device (the subsequent step of the method) ), The signal derived from the analysis object is detected under the condition of the minimum background signal.
したがって、一局面では、本発明は、200μl未満の容量を持つ、液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、一つ以上の毛細管チャンネルの形状を持つ反応チェンバーを含むデバイスにおいて、該反応チェンバーが:
a. 200μl未満の容量を持つ毛細管チャンネル、分析対象を含むサンプル導入のためのサンプル流入口(1)、および、廃棄産物放出のための放出口(4b)を含む第1部分(3);
b. 標的分析対象の検出手段(14)、および、洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8)を含む第2部分(5);および、
c. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分から第2部分へ、および逆方向へ移動させるための手段、
を含み、
第1部分と、第2部分は隔てられるが、その隔離が、他の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように行われることを特徴とする、デバイスに関する。他のサンプル試料とは、分析対象を除くサンプル試料を意味する。
Thus, in one aspect, the present invention is a device for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample having a volume of less than 200 μl, wherein the reaction chamber has the shape of one or more capillary channels Wherein the reaction chamber includes:
a first part (3) comprising a capillary channel with a volume of less than 200 μl, a sample inlet (1) for sample introduction containing the analyte and an outlet (4b) for waste product release;
b. a second part (5) comprising a detection means (14) for the target analyte and a solution inlet (8) for introduction of the washing liquid and reaction mixture; and
c. means for moving the fixed analyte from the first part to the second part of the chamber and in the opposite direction;
Including
It relates to a device, characterized in that the first part and the second part are separated, but the isolation is performed such that no other liquid sample sample enters the second part of the chamber. The other sample sample means a sample sample excluding the analysis target.
もう一つの局面では、本発明は、200μl未満の容量を持つ液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって:
a. 反応チェンバーと、分析対象を含むサンプル導入のためのサンプル流入口とを含む第1部分(3)であって、さらに、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有する磁気粒子を含む固定基質を含む、第1部分;
b. 標的分析対象の検出手段を含む第2部分、
c. 洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8);
d. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分(3)から第2部分(5)へ、および逆方向へ移動させるための手段;および、
e. 廃棄産物放出のための放出口(4b);
を含み、
第1部分と、第2部分は隔てられるが、その隔離が、チェンバーの第1部分の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように行われることを特徴とする、デバイスに関する。
In another aspect, the present invention is a device for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a liquid sample having a volume of less than 200 μl:
a first part (3) comprising a reaction chamber and a sample inlet for introducing a sample containing the analyte, and further comprising a fixed substrate comprising magnetic particles having a size distribution that is at least bimodal. Including a first part;
b. a second part including means for detecting the target analyte;
c. Solution inlet (8) for introduction of washing liquid and reaction mixture;
d. means for moving the fixed analyte from the first part (3) of the chamber to the second part (5) and in the opposite direction; and
e. Outlet (4b) for waste product release;
Including
A device, characterized in that the first part and the second part are separated, but the isolation is carried out so that the liquid sample specimen of the first part of the chamber does not enter the second part of the chamber .
反応チェンバーは、いくつかの区画または部分を含んでもよい。さらに各部分は、そこにおいて特異的反応が行われる筈の、さらに細かい部分または区画に分割されてもよい。反応チェンバーを、分析対象と結合するための第1部分(3)と、該分析対象を検出するための第2部分(5)とに分離することによって、背景信号の著明な低下の実現が可能となると考えられる。 The reaction chamber may include several compartments or parts. Furthermore, each part may be divided into finer parts or compartments in which the specific reaction takes place. By separating the reaction chamber into a first part (3) for coupling with the analyte and a second part (5) for detecting the analyte, a significant reduction in the background signal can be realized. It is considered possible.
ある好ましい局面では、分析されるサンプルは、200μl未満の容量を有することが好ましい。さらに好ましい局面では、分析されるサンプルは、150μl未満の容量を有し、さらに好ましくは100μl未満の容量、さらに好ましくは90μl未満の容量、例えば、80μl未満、70μl未満、または場合によっては60μl未満の容量を有する。さらに好ましい局面では、分析されるサンプルは、50μl未満の容量、さらに好ましくは45μl未満、40μl未満、例えば、35μl未満、30μl未満、または場合によっては25μl未満の容量を有する。 In certain preferred aspects, it is preferred that the sample to be analyzed has a volume of less than 200 μl. In a further preferred aspect, the sample to be analyzed has a volume of less than 150 μl, more preferably less than 100 μl, more preferably less than 90 μl, for example less than 80 μl, less than 70 μl or even less than 60 μl. Have capacity. In a further preferred aspect, the sample to be analyzed has a volume of less than 50 μl, more preferably less than 45 μl, less than 40 μl, eg less than 35 μl, less than 30 μl, or in some cases less than 25 μl.
ある好ましい局面では、毛細管チャンネルの第1部分(3)は、100μl未満の容量を有する。さらに好ましい局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、90μl未満の容量を有し、さらに好ましくは80μl未満、さらに好ましくは70μl未満、例えば、60μl未満、50μl未満、または場合によっては40μl未満の容量を有する。さらに好ましい局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、30μl未満の容量を有し、さらに好ましくは25μl未満、さらに好ましくは20μl未満、例えば、15μl未満、10μl未満、または場合によっては5μl未満の容量を有する。同様の好ましい容量は、反応チェンバーの第2部分にも当てはまる。反応チェンバーは、第1部分(3)および第2部分(5)を含む。好ましい局面では、第1部分および第2部分は共に毛細管チャンネルから構成される。第1および第2部分は、例えば、収集チェンバー、それから残留サンプル試料および添加試薬が収集され、後に排出される収集チェンバーによって隔てられてもよい。このような収集チェンバー、およびその容量は、反応チェンバーの一部、およびその好ましい容量と理解してはならない。 In certain preferred aspects, the first portion (3) of the capillary channel has a volume of less than 100 μl. In a further preferred aspect, the first portion of the capillary channel has a volume of less than 90 μl, more preferably less than 80 μl, more preferably less than 70 μl, such as less than 60 μl, less than 50 μl, or even less than 40 μl. Have. In a further preferred aspect, the first portion of the capillary channel has a volume of less than 30 μl, more preferably less than 25 μl, more preferably less than 20 μl, such as less than 15 μl, less than 10 μl, or even less than 5 μl. Have. Similar preferred volumes apply to the second part of the reaction chamber. The reaction chamber includes a first part (3) and a second part (5). In a preferred aspect, both the first part and the second part are composed of capillary channels. The first and second parts may be separated by, for example, a collection chamber, from which residual sample samples and added reagents are collected and subsequently discharged. Such a collection chamber and its capacity should not be understood as part of the reaction chamber and its preferred capacity.
本発明のある好ましい局面では、チェンバーの第1部分から第2部分へ、およびその逆方向へ、固定化分析対象を移送するための手段は、外部の磁力発生源である。このものは、チェンバーに磁場を印加することが可能であり、かつ、必要に応じてチェンバーの辺縁にそって移動することが可能である。 In one preferred aspect of the invention, the means for transporting the immobilized analyte from the first part to the second part of the chamber and vice versa is an external source of magnetic force. This can apply a magnetic field to the chamber and can move along the edges of the chamber as required.
一局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、デバイスに一体化されるフィルター機構に接続される。サンプル(例えば、血清または血漿)の流入は、好ましくはこのフィルターデバイスを通じて行われる。 In one aspect, the first portion of the capillary channel is connected to a filter mechanism that is integrated into the device. Inflow of sample (eg serum or plasma) is preferably done through this filter device.
本発明の一局面では、第1および第2部分は、収集チェンバー(4a)によって隔てられる。この収集チェンバーは、第1と第2部分を隔てるが、その際その隔離が、第1および第2部分の間で積極的に輸送される分析対象分子以外の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に浸入することがないように行われてもよい。収集チェンバーはさらに、洗浄液および残留サンプル試料などの廃棄産物用の流出口としても役立つ。第1および第2部分の間に収集チェンバーを設置することによって、該収集チェンバーの、チェンバーの第1および第2両部分から出る試料の流出口としての使用が実現される。 In one aspect of the invention, the first and second parts are separated by a collection chamber (4a). This collection chamber separates the first and second parts, where the isolation is a liquid sample sample other than the analyte molecules that are actively transported between the first and second parts. It may be performed so as not to enter the part. The collection chamber also serves as an outlet for waste products such as cleaning liquid and residual sample samples. By installing a collection chamber between the first and second parts, the use of the collection chamber as an outlet for the sample exiting both the first and second parts of the chamber is realized.
本発明のある好ましい局面では、固定化分析対象を含む磁気粒子をもっとも効率的に移動させるために、必要に応じて、磁場は、チェンバーの頂上辺縁(3,5,6)にそって動かされる。 In one preferred aspect of the present invention, the magnetic field is moved along the top edge (3,5,6) of the chamber as needed to move the magnetic particles containing the immobilized analyte most efficiently. It is.
本発明のある好ましい局面では、第1および第2部分は隔てられるが、その際、隔離は、信号(例えば、光)の相当部分が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出部分に移送されることがないように行われる。相当部分とは、50%を超えるパーセント、例えば、75%、または場合によっては90%、または場合によっては99%を超えるパーゼントを意味する。これは、第1部分からの流出点と、第2部分への流入点を異なるレベルに設置することによって実現される。例えば、チェンバーの第1部分から第2部分への経路に曲線部(20')を導入し、その導入を、チェンバーの第1部分からの信号(光線の形状を取る)が、第2チェンバーの検出部分に侵入することがないように行うことによって実現される。もう一つの可能性は、チェンバーの第2部分に曲線部を導入するに際し、その導入を、検出部が、分析対象の、チェンバーの第2部分への流入点と直線的に揃うことがないようにすることである。好ましい可能性は、二つの部分の間に光不透過の障壁(20)を設けることであって、設置は、光の相当部分が、第2部分から第1部分に入ることを阻止されるように行われる。もちろん、この障壁は、第1および第2部分からの、分析対象(例えば、磁気粒子を介する)の移送を妨げてはならない。 In one preferred aspect of the present invention, the first and second parts are separated while the isolation is a detection of a substantial part of the signal (eg light) from the first part of the chamber to the second part of the chamber. This is done so that it is not transferred to the part. By substantial part is meant a percentage greater than 50%, such as 75%, or in some cases greater than 90%, or in some cases greater than 99%. This is achieved by setting the outflow point from the first part and the inflow point to the second part at different levels. For example, a curved portion (20 ′) is introduced in the path from the first part of the chamber to the second part, and the introduction of the signal from the first part of the chamber (which takes the shape of a light beam) This is realized by preventing the detection part from entering. Another possibility is that when introducing a curved part into the second part of the chamber, the introduction will not align the detection part linearly with the inflow point into the second part of the chamber being analyzed. Is to do. A preferred possibility is to provide a light impervious barrier (20) between the two parts, so that installation prevents a substantial part of the light from entering the first part from the second part. To be done. Of course, this barrier should not prevent the transfer of the analyte (eg, via magnetic particles) from the first and second parts.
好ましくは、反応チェンバー、または、反応チェンバーの少なくとも第2部分の内面の表面構造および内面の色は、それぞれ、無反射および/または光吸収性である。本発明の一局面では、この無反射および/または光吸収性表面は、表面を曇らせるか、および/または暗黒化することによって実現される。ある好ましい局面では、暗黒化は、黒色化である。もっとも好ましくは、反応チェンバーの内面の色は黒である。 Preferably, the surface structure and color of the inner surface of the reaction chamber or at least the second part of the reaction chamber are respectively non-reflective and / or light absorbing. In one aspect of the invention, this anti-reflective and / or light-absorbing surface is realized by clouding and / or darkening the surface. In certain preferred aspects, the darkening is blackening. Most preferably, the color of the inner surface of the reaction chamber is black.
本発明のある好ましい局面では、標的分析対象の検出手段は、表面音波(SAW)検出器、分光光度計、蛍光光度計、CCDセンサーチップ(単数または複数)、CCOSセンサーチップ(単数または複数)、PMT検出器(単数または複数)、または、適切なものであればいずれのものであってもよい光検出器の中から選ばれる。 In a preferred aspect of the present invention, the target analyte detection means includes a surface acoustic wave (SAW) detector, a spectrophotometer, a fluorometer, a CCD sensor chip (one or more), a CCOS sensor chip (one or more), It is selected from PMT detector (s) or any suitable photodetector.
ある好ましい局面では、反応チェンバー内部、または、少なくとも反応チェンバーの第1部分(3)内部の幅および高さは、それぞれ、0.1 - 5mmおよび0.05 - 2mmである。より好ましくは、反応チェンバー内部、または、少なくとも反応チェンバーの第1部分内部の幅および高さ、それぞれ、0.25 - 2mmおよび0.2 - 1mmである。 In certain preferred aspects, the width and height within the reaction chamber, or at least the first portion (3) of the reaction chamber, are 0.1-5 mm and 0.05-2 mm, respectively. More preferably, the width and height inside the reaction chamber, or at least inside the first part of the reaction chamber, are 0.25-2 mm and 0.2-1 mm, respectively.
ある好ましい局面では、反応チェンバーの長さは、2 - 30mm、より好ましくは5 - 20mmである。 In certain preferred aspects, the length of the reaction chamber is 2-30 mm, more preferably 5-20 mm.
本発明によるデバイスは、サンプルにおける標的分析対象物の有無を定量的に検出するために使用されてもよい。好ましくは、サンプルは血液から得られる。一局面では、サンプルは血清である。一局面では、サンプルは血漿である。血漿は、分析される血液サンプルに抗凝固剤を与えることによって取得することが可能である。好ましい抗凝固剤は、K3-EDTA、クエン酸塩、およびヘパリンから成る群から選ばれてもよい。 The device according to the invention may be used to quantitatively detect the presence or absence of a target analyte in a sample. Preferably, the sample is obtained from blood. In one aspect, the sample is serum. In one aspect, the sample is plasma. Plasma can be obtained by providing an anticoagulant to the blood sample to be analyzed. A preferred anticoagulant may be selected from the group consisting of K3-EDTA, citrate, and heparin.
本発明のある好ましい局面では、サンプルはヒト由来ものである。 In certain preferred aspects of the invention, the sample is human.
一局面において、本発明は、200μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程:
a)200μl未満の液体から成る液体サンプルを含む分析対象を準備すること;
b)該液体サンプルを反応チェンバーに供給すること;
c)反応チェンバー中のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること、ここに、前記固定基質は、好ましくは、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有する磁気材料を含み;
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること;
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、洗浄液によって洗浄すること;
f)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの検出器部分に移送すること;および、
g)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法に関する。
In one aspect, the present invention is a method for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a sample consisting of less than 200 μl of liquid, comprising the following steps:
a) preparing an analyte containing a liquid sample consisting of less than 200 μl of liquid;
b) feeding the liquid sample to the reaction chamber;
c) contacting the sample in the reaction chamber with an immobilized substrate capable of capturing the analyte, wherein the immobilized substrate is preferably a magnetic material having a size distribution that is at least bimodal. Including;
d) immobilizing the immobilized substrate containing the captured analyte;
e) washing the immobilized substrate containing the capture analyte with a washing solution;
f) transferring the immobilized substrate containing the capture analyte to the detector portion of the chamber; and
g) detecting the presence / absence of the target analyte using conventional detection means;
Including a method.
別の局面において、本発明は、200μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的対象物の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程:
a)200μl未満の液体から成る液体サンプルを含む分析対象を準備すること;
b)該液体サンプルを反応チェンバーに供給すること、その際、チェンバーは、第1反応部分および第2検出部分を含み、この二つの部分は物理的に隔てられ、その隔離は、該液体サンプルが、第2検出部分と接触することができないように行われ;
c)チェンバーの第1反応部分中のサンプルを、少なくとも2峰性のサイズ分布を持ち、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること;
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること;
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの第2部分に移送すること;
f)捕捉分析対象を含む固定基質を再び可動化し、洗浄液によって洗浄すること;
g)捕捉分析対象を含む固定基質を固定すること;
h)必要に応じて洗浄液を廃棄すること;
i)必要に応じて、捕捉分析対象を含む固定基質を再び可動化し、工程f)からh)を繰り返すこと;
j)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバー第2部分の検出器部分に移送すること;および、
k)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法に関する。
In another aspect, the present invention is a method for quantitatively detecting the presence or absence of a target object in a sample consisting of less than 200 μl of liquid, comprising the following steps:
a) preparing an analyte containing a liquid sample comprising less than 200 μl of liquid;
b) supplying the liquid sample to the reaction chamber, wherein the chamber includes a first reaction portion and a second detection portion, the two portions being physically separated, the isolation being such that the liquid sample is Carried out such that it cannot contact the second detection part;
c) contacting the sample in the first reaction part of the chamber with an immobilized substrate having at least a bimodal size distribution and capable of capturing the analyte;
d) immobilizing the immobilized substrate containing the captured analyte;
e) transferring the immobilized substrate containing the capture analyte to the second part of the chamber;
f) mobilizing the immobilized substrate containing the capture analyte again and washing it with a washing solution;
g) immobilizing the immobilized substrate containing the capture analyte;
h) Discard the cleaning solution as necessary;
i) If necessary, remobilize the immobilized substrate containing the capture analyte and repeat steps f) to h);
j) transferring the immobilized substrate containing the capture analyte to the detector portion of the chamber second portion; and
k) detecting the presence / absence of the target analyte using conventional detection means;
Including a method.
1区画において分析対象を結合させる工程a)-d)と、第2区画において分析対象を洗浄、検出する工程e)-k)とを分離することによって、背景信号の著明な減少が観察された。 By separating the steps a) -d) in which the analytes are combined in one compartment and the steps e) -k) in which the analytes are washed and detected in the second compartment, a significant decrease in the background signal is observed. It was.
ある好ましい局面では、本発明はさらに、分析対象を、該分析対象に結合することが可能な生物学的マーカーと接触させる工程a')を含む。この生物学的マーカーは、例えば、酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ビオチンまたはアルカリフォスファターゼ(ALP)を備える抗体であってもよい。このようにすると、分析対象は、検出用信号を増すためにより検出可能となる。本発明による方法の好ましい局面では、分析対象を、該分析対象に結合することが可能な生物学的マーカーに接触させる工程a')は、工程e)の前に実行される。このようにすると、本法の検出部分における未結合生物学的マーカーの存在は著明に抑えられる。本発明のある好ましい局面では、生物学的マーカーは、信号を増幅することが可能な基質と反応することが可能である。したがって、本発明の一局面では、方法はさらに、捕捉分析対象を含む固定基質を、生物学的マーカーと反応することが可能な基質と接触させる工程f')を含む。 In certain preferred aspects, the present invention further comprises the step a ′) of contacting the analyte with a biological marker capable of binding to the analyte. This biological marker may be, for example, an antibody comprising an enzyme, horseradish peroxidase (HRP), biotin or alkaline phosphatase (ALP). In this way, the analysis object can be detected by increasing the detection signal. In a preferred aspect of the method according to the invention, the step a ′) of contacting the analyte with a biological marker capable of binding to the analyte is performed before step e). In this way, the presence of unbound biological markers in the detection part of the method is markedly suppressed. In certain preferred aspects of the invention, the biological marker is capable of reacting with a substrate capable of amplifying the signal. Thus, in one aspect of the invention, the method further comprises the step f ′) of contacting the immobilized substrate comprising the capture analyte with a substrate capable of reacting with the biological marker.
本発明の好ましいある局面では、生物学的マーカーは、化合物、モノクロナール、オリゴクロナール、およびポリクロナール抗体、抗原、受容体、リガンド、酵素、タンパク質、ペプチド、および核酸から選ばれる一つ(またはそれ以上)である。好ましくは、生物学的マーカーは、光吸収、蛍光発射、りん光発射、またはルミネセンス発射の特性を有する群から選ばれる一つ以上である。 In one preferred aspect of the invention, the biological marker is one (or more) selected from compounds, monoclonals, oligoclonals, and polyclonal antibodies, antigens, receptors, ligands, enzymes, proteins, peptides, and nucleic acids. Above). Preferably, the biological marker is one or more selected from the group having the properties of light absorption, fluorescence emission, phosphorescence emission, or luminescence emission.
ある好ましい局面では、固定基質は磁気材料を含む。ある好ましい局面では、工程e)は、磁気源を、第1反応チェンバーの外部辺縁にそって、第2検出チェンバーの方に向けて動かすことによって実行される。 In certain preferred aspects, the immobilizing substrate comprises a magnetic material. In one preferred aspect, step e) is performed by moving the magnetic source along the outer edge of the first reaction chamber towards the second detection chamber.
磁気材料は、好ましくは、磁気粒子、磁気ナノ粒子、および超常磁性ナノ粒子を含む群から選ばれる。 The magnetic material is preferably selected from the group comprising magnetic particles, magnetic nanoparticles, and superparamagnetic nanoparticles.
本発明のある好ましい局面では、前記通例検出手段は、表面音波(SAW)検出器、分光光度計、蛍光光度計、CCDセンサーチップ(単数または複数)、CCOSセンサーチップ(単数または複数)、PMT検出器(単数または複数)、または、適切なものであればいずれのものであってもよい光検出器の中から選ばれる。 In a preferred aspect of the present invention, the usual detection means includes a surface acoustic wave (SAW) detector, a spectrophotometer, a fluorimeter, a CCD sensor chip (s), a CCOS sensor chip (s), and a PMT detection. The detector (s) or any suitable detectors are selected.
本発明による方法は、サンプルにおける標的分析対象物の有無を定量的に検出するために使用されてもよい。好ましくは、サンプルは血液から得られる。一局面では、サンプルは血清である。一局面では、サンプルは血漿である。血漿は、分析される血液サンプルに抗凝固剤を与えることによって取得してもよい。好ましい抗凝固剤は、K3-EDTA、クエン酸塩、およびヘパリンから成る群から選ばれてもよい。本発明のある好ましい局面では、サンプルはヒト由来ものである。 The method according to the present invention may be used to quantitatively detect the presence or absence of a target analyte in a sample. Preferably, the sample is obtained from blood. In one aspect, the sample is serum. In one aspect, the sample is plasma. Plasma may be obtained by providing an anticoagulant to the blood sample to be analyzed. A preferred anticoagulant may be selected from the group consisting of K3-EDTA, citrate, and heparin. In certain preferred aspects of the invention, the sample is human.
一局面では、本発明は、上に定義した通りのデバイス、および本発明による磁気材料を含む部品のキットに関する。好ましくは、このキットは、サンプルにおける標的対象の有無の検出に使用される。 In one aspect, the invention relates to a device as defined above and a kit of parts comprising a magnetic material according to the invention. Preferably, the kit is used for detecting the presence or absence of a target object in a sample.
統合型分離および検出デバイスにおけるアッセイサイクル
本実施例の目的は、下記を具体的に説明することである:
1. 例としての、分析対象、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)に関する測定原理
2. 検出限界
3. 検出範囲
4. 種々のBNP濃度におけるCV値
5. 血液サンプルにおけるBNPの測定。
Assay Cycle in Integrated Separation and Detection Device The purpose of this example is to illustrate the following:
1. As an example, the measurement principle for the analyte, brain natriuretic peptide (BNP)
2. Detection limit
3. Detection range
4. CV values at various BNP concentrations
5. Measurement of BNP in blood samples.
試料
標準:範囲0pg/ml - 16,000pg/mlのBNPを、本実施例の方法を用いて測定した。
サンプル:健康な志願者から得た4つの異なる血液サンプル、および心不全患者から得た4つの異なる血液サンプルを、本実施例の方法を用いて測定した。
抗体:BNP捕捉性モノクロナール抗体でコートした磁気粒子(MP)。追跡抗体は、HRP標識モノクロナールBNP抗体である。追跡抗体は、血液分離フィルターの中に直接置いた。
血液安定化剤:毛細管チャンネル、または血液サンプルのいずれかにEDTAを添加する。
洗浄液:TBS + 0.05 wt.vol% Twen および、0.05 wt.vol% BSA
検出液:Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(下記の工程17にしたがって、水泡Aからの1容量部の信号液、および水泡Bからの1容量部の信号液から構成される)。
検出器:PMT検出器(Hamamatsu)
アッセイ温度:19℃
機械系および電子系:機械部品、電子制御装置、およびソフトウェアは全て、出願企業によって企業内で製造された。
Sample standards: BNP in the
Samples: Four different blood samples obtained from healthy volunteers and four different blood samples obtained from patients with heart failure were measured using the method of this example.
Antibody: Magnetic particles (MP) coated with a BNP-capturing monoclonal antibody. The tracking antibody is an HRP-labeled monoclonal BNP antibody. The tracking antibody was placed directly in the blood separation filter.
Blood stabilizer: EDTA is added to either the capillary channel or the blood sample.
Cleaning solution: TBS + 0.05 wt.vol% Twen and 0.05 wt.vol% BSA
Detection solution: Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate (composed of 1 volume part of signal solution from water bubble A and 1 volume part of signal solution from water bubble B according to step 17 below).
Detector: PMT detector (Hamamatsu)
Assay temperature: 19 ° C
Mechanical and electronic systems: Mechanical parts, electronic controllers, and software were all manufactured in-house by the applicant company.
アッセイ手順
(分離および検出デバイスを、図6に示される通りに使用)
1. 36 - 50μlのサンプルまたは標準を、ろ過区域(2)に印加した。
2. 分離後、4.6μlの血漿が、血漿流入口(21)を通じて血漿チャンネルに入った(毛管力がサンプルを反応チェンバー内に引き込む)。
3. 血漿は血漿チャンネル(3)に進入し、光吸収性障壁および毛細管ストップ(22)まで駆け上る。
4. 血漿チャンネル(磁気粒子によってコートされる)において、磁気粒子は、血漿チャンネル(3)に進入する血漿に溶解した。
5. アッセイインキュベーション時間の間、外部の磁気駆動機構を用いて、血漿チャンネル(3)においてMPをゆっくりと前後に移動させる。
6. アッセイインキュベーション時間後、外部磁気駆動機構を用いて、全てのMPを毛細管ストップ位置(22)の近傍で、濃縮、固定する。
7. 洗浄液を含む水泡(23)を破裂させ、洗浄液を、チャンネル(25)に接続されるチャンネル(24)を通じて微小流システムに、次いで、(26)および(6)を通じて検出域に進入させる。
8. 洗浄液はさらに、洗浄チャンネル(5)を通じて流れ、最終的に毛細管ストップ(22)に到達し、そこにおいて、洗浄液は、血漿の前線に接触し、側方チャンネル(27)を持つ収集チェンバーを通じて直接廃棄物容器(図示せず)に向かって進む。
9. MPは、外部の磁気駆動機構によって、毛細管ストップ(22)障壁を通じて洗浄チャンネル(5)の中に移動させられる。
10. MPは、外部の磁気駆動機構によって、洗浄チャンネル(5)においてゆっくりと前後に動かされる。
11. MPは、外部の磁気駆動機構によって、洗浄チャンネル(5)の中央において濃縮、固定される。
12. 洗浄液含有水泡(23)を通じて、より多くの洗浄液が注入される。
13. 収集チェンバーおよび側方チャンネル(27)には(血漿チャンネルに比べて)より高い圧が存在するために、新たに注入された洗浄液は、比較的低圧の血漿チャンネル(3)中に進入し、血漿を、さらに後方、血液ろ過域(2)の方に押し戻す。
14. 工程10および11を繰り返すことによって、続けて洗浄サイクルを実行してもよい。
15. 外部磁気駆動機構は、MPを検出域(ウィンドウ)(6,14)に移動させ、そこにおいて、MPは、検出ウィンドウ(6,14)の中心の上方に固定される。
16. 洗浄液は、下記のようにして、水泡(28)および(29)中の光発生液によって置換される。
17. 信号液水泡A(28)および信号液水泡B(29)は、チャンネル(31)に接続されるチャンネル(30)を通じて1:1で混合されて(32)に送り込まれる。
18. 最初の60μlの混合液は、チャンネル(32)を通じて、チャンネル(33)を満たす。
19. チャンネル(33)の末端において圧が増加すると、信号(光)発生液は、チャンネル(34)を通じて混合ユニットの中に入る。
20. 二つの溶液は、混合ユニット(35)において混ぜ合わされる。
21. 三次元(x,y,z)混合ユニットにおいて7混合サイクルを経過した後、信号(光)発生液は、検出域(6,14)に進入し、さらに洗浄チャンネル(5)に進み、毛細管ストップ(22)に到達し、そこにおいて、信号発生液は、対称的廃棄チャンネル(27)と血漿チャンネル(3)の間の圧差のために--工程13参照--洗浄液と交換された血漿前線に到達する。
22. 検出域の中心の上にMPを固定する(工程15)外部磁気駆動機構は、素早くろ過域(2)の方に移動させられ、そのため、検出ウィンドウ(6,14)上にMPの集合が実現される。
23. PMT検出器は、フォトン計数によってMPから発射される光をカウントする。
Assay procedure (using separation and detection devices as shown in Figure 6)
1. 36-50 μl of sample or standard was applied to the filtration zone (2).
2. After separation, 4.6 μl of plasma entered the plasma channel through the plasma inlet (21) (capillary force pulls the sample into the reaction chamber).
3. Plasma enters the plasma channel (3) and runs up to the light-absorbing barrier and capillary stop (22).
4. In the plasma channel (coated with magnetic particles), the magnetic particles dissolved in the plasma entering the plasma channel (3).
5. During the assay incubation time, the MP is slowly moved back and forth in the plasma channel (3) using an external magnetic drive mechanism.
6. After the assay incubation period, concentrate and fix all MPs near the capillary stop position (22) using an external magnetic drive mechanism.
7. The bubble (23) containing the washing solution is ruptured and the washing solution is allowed to enter the microfluidic system through the channel (24) connected to the channel (25) and then into the detection zone through (26) and (6).
8. The wash fluid further flows through the wash channel (5) and finally reaches the capillary stop (22), where the wash solution contacts the plasma front and passes through the collection chamber with the side channel (27). Proceed directly towards the waste container (not shown).
9. The MP is moved by an external magnetic drive mechanism through the capillary stop (22) barrier and into the wash channel (5).
10. The MP is slowly moved back and forth in the cleaning channel (5) by an external magnetic drive mechanism.
11. The MP is concentrated and fixed in the center of the washing channel (5) by an external magnetic drive mechanism.
12. More cleaning liquid is injected through the cleaning liquid-containing water bubbles (23).
13. Due to the higher pressure in the collection chamber and the side channel (27) (compared to the plasma channel), the freshly injected wash fluid enters the relatively low pressure plasma channel (3) and plasma Is pushed back further toward the blood filtration zone (2).
14. By repeating
15. The external magnetic drive mechanism moves the MP to the detection area (window) (6, 14), where the MP is fixed above the center of the detection window (6, 14).
16. The cleaning liquid is replaced by the photogenerating liquid in the water bubbles (28) and (29) as follows.
17. The signal liquid foam A (28) and the signal liquid foam B (29) are mixed at a ratio of 1: 1 through the channel (30) connected to the channel (31) and sent to (32).
18. The first 60 μl of mixture fills channel (33) through channel (32).
19. As the pressure increases at the end of the channel (33), the signal (light) generating liquid enters the mixing unit through the channel (34).
20. The two solutions are mixed in the mixing unit (35).
twenty one. After 7 mixing cycles in the three-dimensional (x, y, z) mixing unit, the signal (light) generating liquid enters the detection zone (6,14) and further proceeds to the washing channel (5) to stop the capillary. (22), where the signal generating liquid is introduced into the plasma front exchanged with the washing liquid, due to the pressure difference between the symmetrical waste channel (27) and the plasma channel (3)-see step 13. To reach.
twenty two. The MP is fixed on the center of the detection zone (Step 15). The external magnetic drive mechanism is quickly moved toward the filtration zone (2), so a set of MPs is realized on the detection window (6, 14). Is done.
twenty three. The PMT detector counts the light emitted from the MP by photon counting.
結果
標準曲線は、0 - 10,000pg/mlの正当な測定範囲において、範囲0 - 2000pg/mlについて直線性を示す(図8)。
Results The standard curve shows linearity for the range 0-2000 pg / ml in a valid measurement range of 0-10,000 pg / ml (FIG. 8).
予期した通り、健康な志願者および心不全患者から得た血液サンプルの結果から、健康な志願者のBNP濃度は、範囲の低レベル末端にあるが、患者のBNP濃度は、それよりも5-10倍高いことが明らかになった。
表1:全血サンプルの測定結果
As expected, blood sample results from healthy volunteers and patients with heart failure indicate that healthy volunteers have BNP concentrations at the lower end of the range, but patient BNP concentrations are 5-10 higher than that. It became clear that it was twice as expensive.
Table 1: Measurement results of whole blood samples
結論
結果から、本分離/検出デバイスにとって下記の最重要機能特性が達成されることが明らかになった。
*比較的低い検出限界:5pg/ml未満
*測定範囲:0から10,000pg/ml
*精度:CVは、中等/高レベル範囲では5%未満、下限では15%未満
*1回の所要時間:15分未満
*サンプル試料
+ヒト全血、場合によって指先から直接採取したもの。
+EDTA安定化血
+遠心による単離血漿
Conclusion The results show that the following most important functional properties are achieved for this separation / detection device:
* Relatively low detection limit: less than 5pg / ml * Measurement range: 0 to 10,000pg / ml
* Accuracy: CV is less than 5% in the medium / high level range, less than 15% at the lower limit * Time required for one round: less than 15 minutes * Sample sample + human whole blood, optionally taken directly from fingertips
+ EDTA stabilized blood + Isolated plasma by centrifugation
前述の実施例に基づけば、5pg/mlを下回る濃度領域で十分に小さいCV値下に、かつ、0 - 2000pg/mlに直線性範囲を持ちながら、<5pg/mlから>10,000pg/mlの検出範囲に亘って分析対象BNPを検出することが可能であると結論することが可能である。 Based on the previous examples, <5 pg / ml to> 10,000 pg / ml with a sufficiently low CV value in a concentration range below 5 pg / ml and a linearity range of 0-2000 pg / ml. It can be concluded that the analyte BNP can be detected over the detection range.
デバイスの毛細管チャンネルを親水性物質によってコートすること
直径が1μmまたは2.8μmで、抗原(分析対象)と相互作用を持つ抗体によって標識される磁気粒子(MP)は、表面張力の低い安定化水溶液として保存された。このMPを、最終含量が5wt.vol%となるようにスクロース液と混合した。投与のための最終溶液における典型的MP濃度は、6ng/mlである。
Coating the capillary channel of the device with a hydrophilic substance Magnetic particles (MP) labeled with an antibody that interacts with the antigen (analyte) with a diameter of 1 μm or 2.8 μm can be used as a stabilized aqueous solution with low surface tension Saved. This MP was mixed with a sucrose solution so that the final content was 5 wt. A typical MP concentration in the final solution for administration is 6 ng / ml.
磁気粒子の投与
毛細管チャンネルを、2-プロパノールの50vol%水溶液で超音波洗浄し、25W/2sでコロナ処理して、投与前に親水性を高めた。調整済み磁気粒子を、高精度自動化投与装置(Nanodrop NS-1 Stage)を用いて上述の毛細管チャンネルに投与した。250nl、4滴、合計1μlをチャンネルにそって投与した。投与パターンおよび用量は、チャンネル表面は覆われるが、毛細管ストップの形状はそのまま保全されるように調整することが可能である。
The capillary channel of magnetic particles was ultrasonically washed with a 50 vol% aqueous solution of 2-propanol and corona treated with 25 W / 2s to enhance hydrophilicity before administration. The adjusted magnetic particles were administered to the aforementioned capillary channel using a high-precision automated dosing device (Nanodrop NS-1 Stage). 250 nl, 4 drops, 1 μl total was administered along the channel. The dosing pattern and dose can be adjusted so that the channel surface is covered but the capillary stop shape remains intact.
乾燥および保存
毛細管チャンネルを含むデバイスを室温で3 - 5分水平に放置し、液体コーティングを毛細管チャンネルから蒸発させ、磁気粒子およびスクロースを残留させた。これによって、毛細管チャンネルの底部に、保護され、すぐに溶解することが可能な、一層のMPが得られる。
The device containing the dried and stored capillary channels was left horizontally at room temperature for 3-5 minutes to evaporate the liquid coating from the capillary channels, leaving magnetic particles and sucrose. This results in a further MP at the bottom of the capillary channel that is protected and can be readily dissolved.
調整済みのカートリッジは、優れた長期の安定性を実現するために、最終的に、封印されたアルミニウムフォイル・バッグにおいて4 - 8℃で保存される。 The conditioned cartridge is finally stored at 4-8 ° C in a sealed aluminum foil bag to achieve excellent long-term stability.
スクロース液で処理され、保存された毛細管チャンネルを含むデバイスでは、スクロース処理をしない場合よりも、処理をした方がはるかに早く(約3倍)充填されることが観察された。さらに、より再現性の高い、最終検出アッセイが実現された。 It was observed that devices containing capillary channels treated and stored with sucrose solution were filled much faster (approximately 3 times) with treatment than without sucrose treatment. In addition, a more reproducible final detection assay was realized.
磁気粒子の双峰性サイズ分布
磁気粒子の単峰性サイズ分布(smsMP)と比べ、双峰性サイズ分布(bmsMP)を用いた場合の信号/背景比を、BNPアッセイにおいて調べた。
Bimodal size distribution of magnetic particles The signal / background ratio when using the bimodal size distribution (bmsMP) compared to the unimodal size distribution of magnetic particles (smsMP) was examined in the BNP assay.
方法:
smsMPの調製
BNPのC末端部分に対して特異的なヒト抗体に対するビオチニル化マウスモノクロナール抗体を備えるストレプトアビジン磁気粒子(2.8μm Dynal M280)を、5wt.vol%スクロースの最終溶液において6ng/mlの最終濃度となるように調製した。この磁気粒子縣濁液を、0.2ml PCRチューブに保存し、投与の直前に混ぜ合わせた。
Method:
smsMP preparation
Streptavidin magnetic particles (2.8 μm Dynal M280) with a biotinylated mouse monoclonal antibody against a human antibody specific for the C-terminal part of BNP were added at a final concentration of 6 ng / ml in a final solution of 5 wt. It was prepared as follows. This magnetic particle suspension was stored in a 0.2 ml PCR tube and mixed just prior to administration.
bmsMPの調製
BNPのC末端部分に対して特異的なヒト抗体に対するビオチニル化マウスモノクロナール抗体を備えるストレプトアビジン磁気粒子(2.8μm Dynal M280、および1μm Seramac)を、5wt.vol%スクロースの最終溶液において6ng/mlの最終濃度となるように1:1で混合した。この磁気粒子縣濁液を、0.2ml PCRチューブに保存し、投与の直前に混ぜ合わせた。
bmsMP preparation
Streptavidin magnetic particles (2.8 μm Dynal M280, and 1 μm Seramac) with a biotinylated mouse monoclonal antibody against a human antibody specific for the C-terminal portion of BNP, 6 ng / ml in a final solution of 5 wt. Was mixed at a ratio of 1: 1 to obtain a final concentration of This magnetic particle suspension was stored in a 0.2 ml PCR tube and mixed just prior to administration.
このMPを、実施例2の記載の通りに毛細管チャンネルに投与した。 This MP was administered to the capillary channel as described in Example 2.
表2は、磁気粒子の双峰性サイズ分布を用いた場合に対し、磁気粒子の単峰性サイズ分布を用いた場合の、BNPアッセイ間に見られる差を示す。
表2:smsMPとbmsMPの間のアッセイ比較
Table 2 shows the differences seen between BNP assays when using a magnetic particle unimodal size distribution versus using a magnetic particle bimodal size distribution.
Table 2: Assay comparison between smsMP and bmsMP
結果から、BNPアッセイでは、双峰性サイズ分布の磁気粒子を使用する方が、際立って優れた信号/背景比を得ることが可能であることが明らかになった。 The results show that in the BNP assay, it is possible to obtain a significantly better signal / background ratio when using magnetic particles with a bimodal size distribution.
さらに、BNPアッセイにおいて、磁気粒子の単峰性サイズ分布(smsMP)と比べた場合の、双峰性サイズ分布(bmsMP)を用いた場合の、アッセイの再現性(低い%CVにおける優れた再現性結果)を調べた。 In addition, in BNP assays, assay reproducibility (excellent reproducibility at low% CV) when using bimodal size distribution (bmsMP) compared to unimodal size distribution (smsMP) of magnetic particles. Result).
表3は、双峰性サイズ分布の磁気粒子を用いた場合に対し、単峰性サイズ分布の磁気粒子を用いた場合の、BNPアッセイ間の再現性の差を示す。
表3:smsMPとbmsMPの間のアッセイ比較
Table 3 shows the reproducibility difference between BNP assays when using unimodal size distribution magnetic particles versus using bimodal size distribution magnetic particles.
Table 3: Assay comparison between smsMP and bmsMP
BNPアッセイでは、双峰性サイズ分布の磁気粒子を使用する方が、際立って優れた%CV値を得ることが可能であることが見て取れる。 It can be seen that in the BNP assay, it is possible to obtain significantly superior% CV values when using magnetic particles with a bimodal size distribution.
Claims (19)
a. 反応チェンバー(3)と、分析対象を含むサンプルの導入のためのサンプル流入口とを含む第1部分;
b. 該標的分析対象の検出手段を含む第2部分(6)、
c. 洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8);
d. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分(3)から第2部分(5および6)へ、および逆方向へ移送するための手段;および、
e. 廃棄産物放出のための放出口(4b);
を含み、
第1部分と、第2部分は隔てられるが、その隔離が、チェンバーの第1部分の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように行われることを特徴とする、デバイス。 A device according to claim 1 or 2, wherein:
a. a first part comprising a reaction chamber (3) and a sample inlet for introduction of a sample containing the analyte;
b. a second part (6) comprising means for detecting the target analyte;
c. Solution inlet (8) for introduction of washing liquid and reaction mixture;
d. means for transferring the fixed analyte from the first part (3) of the chamber to the second part (5 and 6) and in the reverse direction; and
e. Outlet (4b) for waste product release;
Including
A device characterized in that the first part and the second part are separated, but the isolation is carried out such that the liquid sample specimen of the first part of the chamber does not enter the second part of the chamber.
a)200μl未満の液体から成る液体サンプルを含む分析対象を準備すること;
b)該液体サンプルを反応チェンバーに供給すること;
c)反応チェンバー中のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能で、少なくとも2峰性であるサイズ分布を有する、固定基質と接触させること;
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること;
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、洗浄液によって洗浄すること;
f)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの検出器部分に移送すること;および、
g)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法。 A method for quantitatively detecting the presence or absence of a target analyte in a sample comprising less than 200 μl of liquid, comprising the following steps:
a) preparing an analyte containing a liquid sample comprising less than 200 μl of liquid;
b) feeding the liquid sample to the reaction chamber;
c) contacting the sample in the reaction chamber with an immobilized substrate having a size distribution that is capable of capturing the analyte and is at least bimodal;
d) immobilizing the immobilized substrate containing the captured analyte;
e) washing the immobilized substrate containing the capture analyte with a washing solution;
f) transferring the immobilized substrate containing the capture analyte to the detector portion of the chamber; and
g) detecting the presence / absence of the target analyte using conventional detection means;
Including a method.
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