KR910001313B1 - Method and apparatus for immunoassays - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 본 발명에 따라 면역 분석을 수행하기 위한 장치의 횡단면도.1 is a cross-sectional view of a device for performing an immunoassay in accordance with the present invention.
제2도는 분석된 시료로부터 항원을 제거하기 위해 본 발명의 장치에 사용되는 다공성 부재의 평면도.2 is a plan view of a porous member used in the device of the present invention to remove antigen from a sample analyzed.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명* Explanation of symbols for main parts of the drawings
10 : 원통형 용기 12 : 상부 개구부10 cylindrical container 12 upper opening
14 : 용기의 측벽 16 : 하부 개구부14 side wall of the
18 : 플러그 20 : 다공성 부재18
21 : 분리막 22 : 원통형 흡수 부재21 separator 22 cylindrical absorber
24 : 벽 28 : 리간드 결합 영역24: wall 28: ligand binding region
본 발명은 리간드-수용체 면역 분석법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 모노클로날 항체를 사용하는 면역 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 면은 이와 같은 면역 분석을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다.The present invention relates to ligand-receptor immunoassays. In particular, the present invention relates to immunoassay methods using monoclonal antibodies. Another aspect of the invention relates to a device for performing such an immunoassay.
최근 20년 동안, 면역 분석 방법은 각종 질병 또는 기타 임상학적으로 중요한 물리적 상태와 관련된 항원을 시험관내 검출하기 위한 민감한 진단 수단으로서 제공되어 왔다. 원래, 이와 같은 폴리클로날 항체 제조에 사용된 불균일 분석법은 고체상으로 한정되었다. 이와 같은 분석법에 있어서, 표지된 항원의 용액은 고체상 항체에 대해 분석하고자 하는 시료중에서 항원과 직접 경쟁이 가능하거나, 또는 후속 공정에서 항체에 첨가된다. 표지된 항원이 어느 정도까지 고체상에 결합하는가, 또는 액체상에서 어느 정도까지 검출 가능한가는 분석하고자 하는 시료중의 항원의 존재 및 양에 대한 척도로서 사용될 수 있다.In recent 20 years, immunoassay methods have been provided as sensitive diagnostic means for in vitro detection of antigens associated with various diseases or other clinically important physical conditions. Originally, the heterogeneous assay used to prepare such polyclonal antibodies was limited to the solid phase. In such assays, a solution of the labeled antigen can be directly competed with the antigen in the sample to be assayed for the solid phase antibody or added to the antibody in a subsequent process. The extent to which the labeled antigen binds to the solid phase or to the extent detectable in the liquid phase can be used as a measure of the presence and amount of the antigen in the sample to be analyzed.
결과적으로, 비경쟁적 면역 측정 분석법이 사용될 수 있게 되었다. 이와 같은 분석법에서는 또한 고체상에 결합된 폴리클로날 항체를 제조하여 사용하였다. 예상되는 항원을 함유하는 시료를 항원이 고체상에 있는 항체와 결합할 수 있도록 고체상과 접촉시켰다. 전형적으로, 인큐베이션 단계 후 시료를 고체상으로 부터 분리하여, 세척하고, 표지된 예를 들면 방사성 핵종, 효소 또는 형광 성분으로 표지된 추가의 폴리클로날 항체 용액과 함께 인큐베이션시켰다.As a result, noncompetitive immunoassay assays can be used. This assay also produced and used polyclonal antibodies bound to the solid phase. A sample containing the expected antigen was contacted with the solid phase so that the antigen could bind to the antibody in the solid phase. Typically, after the incubation step, the samples were separated from the solid phase, washed and incubated with additional polyclonal antibody solutions labeled, for example labeled with radionuclides, enzymes or fluorescent components.
이 2단계 인큐베이션 후, 표지된 비결합 항체를 고체상으로부터 분리하여, 액체상으로 있는 항체의 양 또는 항체 : 항원 : 항체의 샌드위치 형태로 고체상에 결합되어 있는 표지된 항체의 양을 시험 시료 중의 항원의 존재 여부 및(또는) 농도에 대한 척도로서 측정하였다.After this two-step incubation, the labeled unbound antibody is separated from the solid phase, and the amount of the antibody in the liquid phase or the amount of the labeled antibody bound to the solid phase in the form of an antibody: antigen: antibody is present in the test sample. It was measured as a measure of whether and / or concentration.
더욱 최근에는, 면역 분석 방법을 모노클로날 항체를 사용하는 것으로 변형되었다. 예를 들면, 미합중국 특허 제4,376,110호에는 모노클로날 항체 쌍, 즉 하나는 고체상에 결합되어 있고, 다른 하나는 검출가능하도록 표지된 항체 쌍들을 사용하는 2 부위(two-site) 면역 분석법이 기재되어 있다. 항원에서 상이한 에피토프 부위를 인식하는 모노클로날 항체 쌍을 사용하면, 항원과 표지된 항체를 인큐베인션할 때 종래 방법의 중간 세척 단계가 불필요한 동시 면역 측정 분석법을 수행할 수 있게 된다.More recently, the immunoassay method has been modified to use monoclonal antibodies. For example, US Pat. No. 4,376,110 describes a two-site immunoassay using monoclonal antibody pairs, one bound to a solid phase and the other labeled to be detectably labeled antibody pairs. have. The use of monoclonal antibody pairs that recognize different epitope sites in the antigen allows for simultaneous immunoassay assays that do not require the intermediate washing steps of conventional methods when incubating the antigen with the labeled antibody.
종래 방법에 있어서, 고체상 항체는 전형적으로 비드(bead) 또는 작은 입자에 결합되거나, 또는 표면에 코우팅된다 이들 방법은 모두 특징적으로 고체상과 표지된 항체 모두에 대한 인큐베이션 기간이 요구되므로, 동시에 수행한다하더라도 시간이 소요된다. 실제로, 분석 과정을 완료하는데 몇 시간이 걸리는 것은 생소한 것이 아니다. 더우기, 이러한 방법들은 시간이 정해진 인큐베이션 단계와 측정 시약으로 여러번 세척해야 하기 때문에, 고도로 훈련된 사람과 이와 같은 분석에 사용될 수 있는 복잡한 장치를 보유하고 있는 큰 병원 및 관련 임살 실험실로 그 이용이 제한된다. 결과적으로, 면역 분석 수행에 비교적 간단한 장치가 사용되고, 그 장치가 보편적인 것이어서 의사 처방 없이 판매될 수 있어, 전문의원에서는 물론, 가정 위생 프로그램에도 사용할 수 있는 간단하고 빠른 면역 분석 방법이 요구되고 있다.In conventional methods, solid phase antibodies are typically bound to beads or small particles, or coated on the surface. Both of these methods are performed concurrently, as they all require incubation periods for both solid phase and labeled antibodies. Even if it takes time. In fact, it is not uncommon to take several hours to complete the analysis process. Moreover, these methods require multiple washings with timed incubation steps and measurement reagents, limiting their use to highly trained persons and large hospitals and associated killing laboratories with complex devices that can be used for such analyses. . As a result, a relatively simple device is used for performing an immunoassay, and the device is universal and can be sold without a doctor's prescription, and thus a simple and rapid immunoassay method that can be used not only in specialists but also in home hygiene programs is required.
본 발명은 간단하고 신속하게 수행할 수 있는 리간드-수용체 분석법, 예를 들면, 면역 분석법 및 면역 측정법과, 간단한 장치를 사용하고, 장시간의 인큐베이션 단계가 필요없는 핵산 올리고머의 혼성화를 이용하는 분석법을 제공하는 것이다. 본 발명의 장치는 제1부재로서, 분석하고자 하는 표적 분석체(리간드)에 대한 수용체가 결합 또는 고정되거나, 또는 분석하고자 하는 리간드와 결합함으로써 리간드를 다공성 부재에 고정시키는 분석 세포형 물질 또는 분석 세포형 물질의 파편을 시료로부터 분리시킬 수 있는 막 또는 필터와 같은 다공성 부재를 포함한다. 예를 들면, 리간드가 항원인 면역 분석 및 면역 측정법의 경우에, 항체, 적합하기로는 모노클로날 항체는 수용체로서 다공성 부재에 결합된다. 본 발명의 장치는 또한 제2부재로서, 일반적으로 그 내부에 상부 표면과 하부 표면을 총체적으로 횡단하는 모세관 통로를 갖는 흡수성 부재를 포함한다.The present invention provides a ligand-receptor assay, such as immunoassay and immunoassay, which can be performed simply and quickly, and an assay using hybridization of nucleic acid oligomers using a simple device and without the need for prolonged incubation steps. will be. The device of the present invention is an analyte cell-like substance or analytical cell which fixes a ligand to a porous member by binding or immobilizing a receptor for a target analyte (ligand) to be analyzed or binding to a ligand to be analyzed as a first member. It includes a porous member such as a membrane or a filter that can separate the debris of the mold material from the sample. For example, in the case of immunoassays and immunoassays in which the ligand is an antigen, the antibody, suitably a monoclonal antibody, is bound to the porous member as a receptor. The apparatus of the present invention also includes an absorbent member as a second member, generally having a capillary passage therein generally crossing the upper surface and the lower surface.
여기에 사용된 "모세관"이란 용어는 액체가 흡수성 부재를 통과할 수 있게 해주는 모세관 또는 다른 통로를 의미한다. 제2부재는 모세관을 통해 다공성 제1부재와 연통되며, 모세관 세공 크기는 액체가 분석에 사용되는 시료 및 후속 부가물의 정수압이 제1부재를 통한 흐름에 충분하지 않은 경우에도, 외부 수단의 사용없이 제1부재를 통한 액체의 흐름이 가능하도록 선택된다. 제2부재는 또한 제1부재의 지지체로서 제공될 수도 있다.The term "capillary" as used herein refers to a capillary or other passage that allows liquid to pass through the absorbent member. The second member communicates with the porous first member through a capillary tube, the capillary pore size being used without the use of external means, even if the hydrostatic pressure of the liquid and the sample used for analysis is not sufficient for flow through the first member. The flow of liquid through the first member is selected to enable. The second member may also be provided as a support of the first member.
본 발명에 의한 분석법은, 액체 시료를 다공성 부재에 가함으로써, 액체가 부재를 통하여 흘러갈 때, 다공성 부재에 결합된 수용체가 시료중의 가용성 리간드 또는 현탁된 리간드와, 부재를 통한 흐름이 없을 때 관찰되는 속도보다 실질적으로 더 빠른 속도로 결합하거나, 또는 리간드가 세포형 물질의 표면에 존재하는 경우, 세포형 물질이 다공성 부재에 고정된 수용체에 의해 결합되거나, 또는 시료가 흘러갈 때 부재에 의해 포획되는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시 태양에 있어서, 시료를 첨가한 후에는 검출가능하도록 표지된 리간드에 대한 수용체 용액의 첨가가 수반된다. 예를 들면 항원에 대한 면역 측정법에 있어서, 항체, 바람직하기로는 제1수용체의 결합을 방해하지 않는 에피토프에서 항원과 결합하는 모노클로날 항체의 용액이 사용된다. 바람직한 표지는, 다른 표지 예를 들면 방사성 핵종이나 형광 표지도 또한 사용될 수 있으나, 효소가 좋다. 항체는 결합 항체 또는 세포형 물질의 포획에 의해 시료로부터 미리 추출되는 항원에 결합된다. 표지된 항체를 첨가한 후 즉시, 또는 감도를 증가시키기 위해 간단히 인큐베이션시켜 보다 많이 항원과 표지된 항체를 결합시킨 후, 미결합된 표지 항체를 제거하기 위한 세척 단계가 후속된다. 이어서, 다공성 부재상의 표지 항체의 존재를 시료중의 표적 항원의 존재에 대한 지표로서 측정한다. 효소 표지의 경우에, 이 단계는 컬러 형성 물질 용액을 다공성 부재에 가하여 기질이 효소와 반응할 수 있도록 해줌으로써 수행한다.The assay according to the invention is characterized by the fact that when a liquid flows through the member by adding a liquid sample to the porous member, the receptor bound to the porous member has no soluble or suspended ligand in the sample and no flow through the member. Binding at a rate substantially faster than the rate observed, or when ligands are present on the surface of the cellular material, the cellular material is bound by a receptor anchored to the porous member, or by the member when the sample flows The steps being captured. In a preferred embodiment of the invention, addition of the sample involves the addition of a receptor solution to the detectably labeled ligand. For example, in immunoassays against antigens, a solution of monoclonal antibodies that bind antigens in epitopes that do not interfere with the binding of antibodies, preferably the first receptor, is used. Preferred labels may also be used, although other labels, such as radionuclides or fluorescent labels, may also be used. The antibody binds to an antigen previously extracted from the sample by capture of binding antibody or cell-like material. Immediately after adding the labeled antibody, or simply incubated to increase sensitivity, more antigens are combined with the labeled antibody, followed by a washing step to remove unbound labeled antibody. The presence of the labeled antibody on the porous member is then measured as an indicator of the presence of the target antigen in the sample. In the case of enzyme labeling, this step is performed by adding a color forming material solution to the porous member to allow the substrate to react with the enzyme.
상기한 바와 같이, 본 발명의 장치는 제1부재로서, 리간드의 수용체가 결합되거나, 또는 항수용체에 결합되거나, 또는 리간드가 세포형 물질과 결합되는 경우 분석하고자 하는 시료로부터 세포형 물질을 여과할 수 있는 다공성 막 또는 필터를 포함한다. 후자의 경우, 막 또는 필터는 이러한 분리가 가능한 세공 크기를 갖도록 선택된다. 여과용 부재로는 유리 섬유 필터 및 각종 합성 또는 천연 물질의 필터를 포함하여 여러가지 필터 부재를 사용할 수 있다.As described above, the device of the present invention, as a first member, filters the cell-like material from the sample to be analyzed when the receptor of the ligand is bound or the anti-receptor or the ligand is bound to the cell-type material. Porous membrane or filter, which may be used. In the latter case, the membrane or filter is chosen to have a pore size that allows this separation. As the filtration member, various filter members can be used, including glass fiber filters and filters of various synthetic or natural materials.
다공성 부재가 여기에 결합된 수용체를 갖는 경우에, 이 수용체는 표적 리간드와 선택적으로 직접 결합할 수 있는 그의 능력에 따라 선택된다. 예를 들면, 리간드가 항원인 경우에, 수용체는 항체, 바람직하기로는 모노클로날 항체가 될 수 있다. 표적 리간드가 항체인 경우에, 수용체는 항원 또는 항항체가 될 수 있다. 리간드가 효소인 경우에, 수용체는 그 효소에 대한 수용체가 될 수 있다. 리간드가 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA인 경우에, 수용체는 DNA 또는 RNA의 상보성 올리고머가 될 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 제1부재는 항체 제제가 공유 결합되는 막 또는 필터이다. 항체 제제는 안티세라로부터 유래된 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있지만 모노클로날 항체가 바람직하다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조 기술은 잘 알려져 있으므로 여기에서 더 설명할 필요는 없을 것이다.If the porous member has a receptor bound thereto, this receptor is selected according to its ability to selectively bind directly with the target ligand. For example, when the ligand is an antigen, the receptor can be an antibody, preferably a monoclonal antibody. If the target ligand is an antibody, the receptor may be an antigen or an antibody. If the ligand is an enzyme, the receptor may be the receptor for that enzyme. If the ligand is a nucleic acid such as RNA or DNA, the receptor may be a complementary oligomer of DNA or RNA. In a preferred embodiment, the first member is a membrane or filter to which the antibody formulation is covalently bound. Antibody preparations may use polyclonal antibodies derived from antisera, but monoclonal antibodies are preferred. Techniques for preparing polyclonal and monoclonal antibodies are well known and will not be described further herein.
다공성 부재의 재료는 수용체 또는, 사용되는 경우 항수용체가 결합될 수 있는 물질로부터 선택된다. 단백질 수용체 또는 항수용체(예, 항체 또는 항원)의 경우에, 바람직한 물질은 아미노기 잔기를 갖거나, 또는 화학적인 방법에 의해 이와 같은 기들이 도입된 나일론인데, 이것은 공지된 그루타르알데히드법에 의해 단백질과 커플링될 수 있다. 항체는 아미노실란을 통하여 유리 섬유에 커플링될 수 있다. 기타 직접 또는 중간 물질을 통하여 수용체에 커플링될 수 있는 천연 또는 합성 물질을 사용할 수도 있다.The material of the porous member is selected from the materials to which the receptor or, if used, the antireceptor can bind. In the case of protein receptors or anti-receptors (e.g. antibodies or antigens), preferred substances are nylons which have amino group residues or which are introduced by such chemical methods, which are known by the known glutaraldehyde method. Can be coupled with. The antibody may be coupled to the glass fiber through an aminosilane. It is also possible to use natural or synthetic materials which can be coupled to the receptor via other direct or intermediate materials.
이상은 수용체 또는 수용체의 다공성 부재와의 화학적 결합에 특징이 있다. 그러나, 적당한 경우에, 수용체 또는 항수용체는 다공성 부재상에 코우팅되거나 또는 다공성 부재의 상호 작용 범위내에 포획되는 입자일 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 사용된 "결합된"이란 용어는 수용체 또는 항수용체를 다공성 부재에 고정시키기 위한 어떠한 수단을 지칭하는 용어이다.The above is characterized by chemical bonding of the receptor or the porous member of the receptor. However, where appropriate, the receptor or antireceptor may be particles coated on the porous member or captured within the interaction range of the porous member. Thus, as used herein, the term "bound" refers to any means for immobilizing a receptor or antireceptor to a porous member.
제2부재는 일반적으로 상부 표면과 하부 표면을 총체적으로 횡단하는 모세관 통로를 갖는 흡수성 부재이다. 제2부재는 제1부재의 세공 또는 틈과 제2부재의 모세관 사이를 직접 연통 가능한 방식으로 제1부재와 조립된다. 따라서, 액체를 제1부재에 가하여 제1부재가 포화된 경우에, 액체는 흡수 부재로 끌어 당겨진다. 그 결과, 액체 시료를 제1부재의 상부 표면에 가했을 때, 유체의 정수압이 제1부재를 통해 유체를 강제로 흐르도록 하기 위해 압력을 가하거나, 또는 제1부재를 통하여 유체를 쁩아내기 위한 진공 없이는 제1부재를 통하여 흐를 수 없을 만큼 낮은 압력에서도 제1부재를 통한 흐름이 유도될 수 있다.The second member is generally an absorbent member having capillary passageways that collectively traverse the upper and lower surfaces. The second member is assembled with the first member in a manner capable of directly communicating between the pores or gaps of the first member and the capillary of the second member. Thus, when the liquid is added to the first member and the first member is saturated, the liquid is attracted to the absorbing member. As a result, when a liquid sample is applied to the upper surface of the first member, the hydrostatic pressure of the fluid is applied to force the fluid to flow through the first member, or to replenish the fluid through the first member. Flow through the first member can be induced even at a pressure low enough that it cannot flow through the first member without vacuum.
제2부재의 재료 선택은 중요하지 않으며, 여러가지 섬유 필터 재료를 사용할 수 있다. 통상적인 재료는 담배 필터에서와 같이 배향된 셀룰로오스 아세테이트 섬유이다. 당 업계의 숙련자들은 셀룰로오스 아세테이트 대신에 폴리에스테르, 폴리올레핀 또는 기타 재료로 된 다른 흡수 부재도 사용할 수 있음을 알 수 있을 것이다.The material selection of the second member is not critical and various fiber filter materials can be used. Typical materials are cellulose acetate fibers oriented as in tobacco filters. Those skilled in the art will appreciate that other absorbent members of polyester, polyolefin or other materials may be used instead of cellulose acetate.
제1도로 돌아가서, 제1도는 본 발명의 장치와 함께 사용되어 분석을 수행할 수 있는 장치의 횡단면도를 나타낸 것이다. 따라서, 제1도에서, 원통형 용기(10)(이 용기는 임의의 적당한 형태를 취할 수 있음)은 측벽(14)에 의해 경계가 정해지는 상부 개구부(12)를 갖는다. 이 용기는 유리, 플라스틱 또는 다른 적당한 재료로 만들 수 있다. 제1도에 나타낸 바와 같이, 용기(10)은 또한 하부 개구부(16)을 가지며, 여기에는 제거 가능한 플러그(10)이 삽입되어 있어, 다공성 부재(20), 즉 원형막 또는 필터 디스크와 원통형 흡수 부재 (22)에 의존하여 임의의 막(21) (이 막의 기능은 다음에 설명됨)의 삽입이 가능하며, 이것은 또한 하부 개구부(16)을 통하여 삽입 가능하다.Returning to FIG. 1, FIG. 1 shows a cross-sectional view of a device that can be used with the device of the present invention to perform an analysis. Thus, in FIG. 1, the cylindrical container 10 (which can take any suitable form) has an upper opening 12 bounded by the
용기(10)의 일부는 참조 번호(24)에 의해 제1도에 나타낸 바와 같이, 잘록한 형태를 취함으로써 시료를 부재(20)상에 집중시키고 시료와 기타 부재(20)에 첨가되는 첨가물의 효과적인 세척을 보장한다.A portion of the
부재(22)의 크기 및 용기(10)의 잘록한 부분 하부의 용적은 분석하는 동안 장치에 첨가되는 액체 모두가 흡수 부재(22)에 수용되어 보유될 수 있도록 선택하는 것이 적합하다. 배기 수단(제1도에 나타내지 않음), 예를 들면 작은 배기구가 용기(10)의 바닥 부근에 제공되어 치환된 공기를 배출시킬 수 있다. 필요에 따라서, 용기(10)의 바닥을 제거함으로써, 액체가 부재(20)과 (22)를 통과하여, 바닥을 통하여 용기를 빠져나갈 수 있게 할 수 있다. 그러나, 이 제품은 시료를 간단하고 위생적으로 처리할 수 있고 처리를 촉진하기 위한 것이기 때문에, 제1도에 나타난 구조를 사용하는 것이 바람직하다.The size of the member 22 and the volume under the concave portion of the
상기한 바와 같이, 부재(20)은 시료로 부터 세포형 물질을 여과하거나 또는 분석하고자 하는 리간드에 대한 결합 수용체의 지지체로서 사용될 수 있다. 어느 경우에나, 액체 시료는 개구부(12)를 통하여 도입함으로써 부재에 가할 수 있다. 액체가 부재(20)을 침투하고, 부재(20)을 통하여 흡수 부재 (22)로 도입된 후, 표지된 수용체 용액이 개구부(12)를 통하여 부재(20)에 첨가된다.As described above, the
이어서, 표지된 수용체는 부재(20)의 수용체에 결합된 리간드에 결합되거나 부재(20)의 표면에 포획된 세포형 물질과 결합한다. 면역 측정법인 경우, 부재(20)이 여기에 결합된 모노클로날 항체를 갖고, 표지된 항체가 또한 모노클로날 항체인 경우, 2개의 항체는, 미합중국 특허 제4,376,110호 및 1981년 6월 6일자 출원된 미합중국 특허 출원 제323,498호에 기재된 바와 같이, 비간섭성 항원 결합 부위에 결합할 수 있도록 선택된다. 상기 특허 및 특허 출원을 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용한다.The labeled receptor then binds to a ligand bound to the receptor of
가용성 수용체는, 적당한 조건하에서 다른 종래의 분석 표지를 사용할 수도 있지만, 효소로 표지하는 것이 적합하다. 예를 들면, 프루오레스세인 또는 피코에리트린과 같은 형광 표지 또는 방사성 핵종을 사용할 수도 있다. 또한, 표지로서는 착색 염료 또는 형광 입자로 도포시킨 미소 구체를 사용할 수 있다. 기타 유용한 표지로는 착색 염료 또는 형광 입자로 도포시킨 리포좀 또는 기타 소포를 들 수 있다.Soluble receptors may be used with other conventional assay labels under appropriate conditions, but they are suitable for labeling with enzymes. For example, fluorescent labels or radionuclides such as gluorescein or phycoerythrin may be used. As the label, microspheres coated with colored dyes or fluorescent particles can be used. Other useful labels include liposomes or other vesicles coated with colored dyes or fluorescent particles.
표지된 수용체 용액을 부재(20)을 거쳐 통과시킨 후, 세척액을 부재(20)에 가하여, 미결합된 표지 수용체를 부재(20)으로부터 부재(22)로 씻어낸다. 벽(24)의 경사 구조는 완전한 깔대기를 제공하여, 세척액을 벽에 용이하게 가할 수 있게 해줌으로써 표지된 수용체 용액의 고착된 잔류물을 용이하게 제거할 수 있게 해준다.After passing the labeled receptor solution through the
표지된 수용체 용액과 세척액을 첨가하기 전에 짧은 인큐베이션 단계를 선행함으로써 부재(20)의 틈 위에, 또는 틈 중에 포획된 용액중의 수용체 또는 리간드에 의한 보다 광범위한 결합을 가능하게 하므로써, 분석 감도를 증가시킬 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 이와 같은 인큐베이션 단계는 불필요하거나, 또는 매우 짧다(일반적으로 60초 이하임)는 것을 발견하였다. 리간드 또는 표지된 수용체를 함유하는 용액이 부재(20)을 통해 흘러가면, 실제로 흐름이 없는 곳에서 관찰된 것 보다 상당히 더 빠른 결합 속도가 얻어진다.A short incubation step prior to the addition of the labeled receptor solution and the wash solution allows for a wider range of binding by receptors or ligands in the solution captured in or in the gap, thereby increasing assay sensitivity. Can be. However, the inventors have found that such incubation steps are unnecessary or very short (generally less than 60 seconds). If a solution containing a ligand or labeled receptor flows through the
수용체 표지가 효소인 경우에는, 부재(20)으로부터 미결합 수용체를 제거하기 위하여 세척한 후, 효소 기질의 용액을 부재(20)에 첨가한다. 표적 리간드가 부재(20)에 결합된 수용체나, 또는 부재(20)의 세포형 물질에 결합되는 경우, 리간드는 표지된 수용체의 일부에 결합될 것이다 효소는, 적당히 선택될 경우, 기질에 반응을 일으켜 가시적인 색상 변화를 일으킬 것이다.If the receptor label is an enzyme, it is washed to remove the unbound receptor from the
본 발명자들은 셀룰로오스 아세테이트를 흡수 부재(22)의 재료로서 사용할 경우, 그의 상부 표면에서 표지된 수용체와 비특이적으로 결합할 수 있다는 것을 발견하였다. 그리하여, 몇가지 가시적인 색상 변화가 부재(20)의 바로 아래의 표면에서 일어날 수 있다. 이 색상 변화가 부재(20)를 통해서 가시화되는 것을 피하기 위해서, 다공성 폴리에틸렌 또는 비특이적으로 수용체와 결합하지 않는 기타 재료로 된 분리막(제1도에 참조 번호(21)로 나타냄)을 부재(20)과 (22) 사이에 배치시키는 것이 적합하다.The inventors have found that when cellulose acetate is used as the material of the absorbent member 22, it can bind nonspecifically with a labeled receptor on its upper surface. Thus, some visible color change can occur at the surface directly below the
이제 제2도로 돌아가서, 제2도는 부재(20)의 평면도를 나타낸 것이다. 점선(26)은 바람직한 실시 태양에서 리간드가 결합된 영역(28)의 외부 경계를 나타낸다. 이 영역은 그 가장 좁은 지점에서 벽(24)에 의해 형성된 제한 직경보다 작은 직경을 갖는다. 따라서, 수용체 표지로서 효소를 사용할 경우, 다음과 같은 결과가 일어날 수 있다. 즉, (l) 부재(20)의 주변에서 보다 영역(28)에서 보다 많은 색상이 현색되는 것을 양의 결과로서 읽는다. (2) 부재(20)에서 색상 현색이 전혀 관찰되지 않을 경우를 음의 결과로서 읽는다. (3)세척 후 일부 표지된 수용체가 부재(20)중에 잔류할 경우, 가시화 가능한 표면 전체에 걸쳐서 균일하고 약한 색상 변화가 일어날 수 있다. 이러한 결과 역시 음의 결과로서 해석할 수 있다.Turning now to FIG. 2, FIG. 2 shows a top view of the
이제까지 본 발명의 장치 및 방법을 일반적으로 기술하였다. 본 발명자들은 시료의 도입으로부터 5분 이내에 양의 결과를 읽는데까지 면역 분석을 수행하는데 본 발명이 유용하다는 것을 발견했다. 그리하여, 특정 실시예에 있어서, 임산부의 뇨에서 증가되는 항원인 인체 코리오고나도르토핀(HCG)에 대한 모노클로날 항체를 글루타르알데히드 기법을 사용하여 제1도의 (10)과 같은 용기 중에 넣고, 이를 셀룰로오스 아세테이트의 흡수 부재로 지지하였다. 다만, 다공성 나일론 막과 흡수 부재는 폴리에틸렌 디스크에 의해서 서로 분리된다.The apparatus and method of the present invention have been described in general. The inventors have found that the present invention is useful for performing immunoassays up to reading positive results within 5 minutes of introduction of a sample. Thus, in a specific embodiment, monoclonal antibodies against human coriogonadororphin (HCG), an antigen that is increased in the urine of pregnant women, are placed in a container such as (10) of FIG. 1 using glutaraldehyde techniques. It was supported by the absorbent member of cellulose acetate. However, the porous nylon membrane and the absorbent member are separated from each other by the polyethylene disk.
뇨 시료 4ml(HCG를 0 및 50mIU/ml 함유함)를 상기 장치에 첨가하고, 부재(20) 및 (21)을 통해서 흡수물질(22)로 뽑아냈다. 이어서, 알칼리 포스파타제가 결합된 HCG에 대한 제2모노클로날 항체 용액 3 방울을 첨가했다. 약 1분 동안 짧게 배양시킨 후, 그 시간 동안에 결합체는 부재(20)을 통해서 빠져나가고, 물4ml를 첨가해서 부재(20)으로부터 미결합 항체를 제거했다. 이 첨가에 이어서, 알칼리 포스파타제에 대한 기질인 인독실 포스페이트를 함유하는 용액 3 방울을 첨가했다. 2분 후 HCG(0mIU/ml)를 함유하지 않은 시료를 시험하기 위해 사용된 장치에서는 전혀 발색이 일어나지 않았다. 50mIU/ml HCG 시료에 대해서는, 명확한 청색이 30초내에 디스크 중심에 현색되어 2분 이내에 암청색으로 되었다. 디스크의 주변은 전혀 현색되지 않았다. 분석에 소요된 총시간은 약 5분이었다. 이 분석의 감도는 부피 또는 배양 시간을 변화시킴으로써 조절할 수 있다.4 ml of urine sample (containing 0 and 50 mIU / ml of HCG) were added to the apparatus and drawn out as absorbent material 22 through
본 발명을 분석법 또는 실시예로써 HCG를 사용하는 기재하였지만, 다른 항원에 대한 유사한 분석도 수행할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 표적 항원의 전체 리스트는 너무 길어서 기재하지 않았지만, IgE와 같은 항원을 제외한 프로스타틴산 포스파타제, 프로스타트 특히 항원, 알파페토프로테인, 카르시노엠브리온계항원, 레우테나이징 호르몬, 크레아틴 키나아제 MB 및 혈청, 혈장, 뇨 또는 기타 액상 매질 중의 다른 항원도 검출할 수 있다. 또한, 박테리아, 기생충, 균류, 또는 예를 들면 연쇄상 구균속 A 및 B군, 임균(Neisseria gonorrhea) 가르드네렐라바기날리스(Gardnerella Vaginalis), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 아구창 칸디다(Candida albicans), 클라미디아 트리코마티스(Chlamydia trachomatis), B형 간염 및 시토메갈로비루스(Cytomegalovirus)를 포함하는 비루스와 결합된 항원과 같은 항원을 갖는 물질을 함유하는 액체 시료도 세포형 물질을 포집(trap)하는 필터 또는 필터에 항원에 대한 특이 항체가 결합된 필터를 부재(20)으로서 사용해서 검출할 수 있다. 표지된, 예를 들면 효소로 표지된, 모노클로날 항체용액을 첨가하면 항원에 항체가 결합될 것이다. 세척하고 기질을 첨가하면 세포형 물질에 표지된 항체의 존재와 관련하여 색 변화가 일어나며, 이를 가시적으로 또는 기기의 도움에 의해 검출할 수 있다.Although the present invention has been described using HCG as an assay or example, it will be appreciated that similar assays for other antigens can be performed. The full list of target antigens is too long and not described, but prostatin phosphatase, prostat in particular antigens, alpha fetoproteins, carcinoembrione antigens, reutenizing hormones, creatine kinase MB and serum, plasma except for antigens such as IgE Other antigens can also be detected in urine, or other liquid media. Also, bacteria, parasites, fungi, or groups of streptococci A and B, for example, Neisseria gonorrhea Gardnerella Vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida albicans ), Liquid samples containing antigen-containing substances, such as Chlamydia trachomatis, hepatitis B, and viruses, including hepatitis B and Cytomegalovirus, are filters that trap cell-like substances. Alternatively, the filter in which the specific antibody to the antigen is bound to the filter can be detected using the
효소 이외의 표지를 사용하면, 이 과정을 변화시킬 수 있다. 형광표지를 사용할 경우에는 막의 형광을 측정할 수 있다.125I와 같은 방사성핵종 표지를 사용할 경우에는 막을 제거하여 계수할 수 있다.Use of labels other than enzymes can change this process. When fluorescent labels are used, the fluorescence of the film can be measured. Radionuclide labels such as 125 I can be counted by removing the membrane.
이제까지는 본원 발명을 모노클로날 항체를 사용하는 연속적인 면역분석법 즉, 다공성 부재에 제1모노클로날 항체 수용체와 표지된 제2의 모노클로날 항체 수용체를 사용하는 면역분석법에 중점을 두고 설명하였다. 시료를 다공성 부재에 첨가하고 이어서, 표지 항체를 첨가한다. 그러나, 다른 변형시킨 분석법도 가능하다. 예를 들면, 면역측정법의 경우에는 다공성 부재에 첨가시키기 전에 표지 항체와 혼합시킨다.Thus far, the present invention has been described focusing on continuous immunoassay using monoclonal antibodies, i.e. immunoassay using a first monoclonal antibody receptor and a labeled second monoclonal antibody receptor in a porous member. . The sample is added to the porous member followed by the labeled antibody. However, other modified assays are possible. For example, for immunoassay, it is mixed with the labeling antibody before addition to the porous member.
본 발명의 장치는 또한 고체상에 제1수용체로서 항원을 사용하며, 제2수용체로서 표지된 항원 또는 표지된 항항체를 사용하는 항체 분석법에 응용될 수 있다. 후자는 특히 알레르기 특이 분석법에 적당하며, 여기서 제1수용체는 다공성 부재에 결합된 알레르겐이며, 제2수용체는 항체, 적합하기로는 IgG에 대한 모노클로날 항체이다. 다른 경우에, 알레르겐에 대한 IgG 반응은 유사하게, 즉 제2수용체로서 IgG에 대한모노클로날 항체와 같은 항체를 사용해서 측정할 수 있다. 이러한 방법으로 행할 수 있는 다른 항체 시험으로서는 포진, 풍진, 간염 시토메갈로비루스 및 HTL-III에 대한 항체 시험 등을 들 수 있다.The device of the present invention is also applicable to antibody assays that use an antigen as the first receptor on a solid phase and that use labeled antigens or labeled anti-antibodies as the second receptor. The latter is particularly suitable for allergy specific assays where the first receptor is an allergen bound to the porous member and the second receptor is an antibody, suitably a monoclonal antibody against IgG. In other cases, the IgG response to the allergen can be measured similarly, ie using an antibody such as a monoclonal antibody to IgG as the second receptor. Other antibody tests that can be performed by this method include herpes, rubella, antibody test against hepatitis cytomegalovirus and HTL-III, and the like.
본 발명의 다른 실시 태양에서는 이 장치를 경쟁적인 분석, 즉 리간드 수용체가 다공성 부재에 결합되고, 시료 중의 리간드가 시료 용액 또는 후속 첨가되는 시료에 첨가된 표지된 리간드의 고정량과 경쟁하는 분석법을 수행하기 위해 사용한다. 경쟁 면역 분석법은 항체, 예를 들면, 고체상에 결합된 수용체로서 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 제제를 사용해서 상기 방식으로 수행하는 것이 편리하다. 표지된 항원은 시료를 다공성 부재에 첨가하기 전에 시료에 첨가할 수 있다. 다른 방법으로는, 표지된 항원을 시료 첨가와 동시 또는 그 후에 첨가할 수 있다.In another embodiment of the invention, the device is subjected to a competitive assay, i.e., wherein the ligand receptor is bound to the porous member and the ligand in the sample competes with a fixed amount of labeled ligand added to the sample solution or subsequently added sample. Use to do Competitive immunoassays are conveniently carried out in this manner using monoclonal or polyclonal antibody preparations as antibodies, eg, receptors bound to a solid phase. The labeled antigen can be added to the sample prior to adding the sample to the porous member. Alternatively, the labeled antigen can be added simultaneously with or after sample addition.
본 발명의 장치는 또한 효소의 수용체를 분석 수용체로서 다공성부재에 결합시킴으로써 효소를 검출하는데 사용할 수 있다. 효소에 대해 표지된 항체는 다공성 부재 상의 수용체-효소 결합체의 형성을 검출하는데 사용할 수 있다.The device of the present invention can also be used to detect enzymes by binding the receptor of the enzyme to the porous member as an assay receptor. Antibodies labeled against enzymes can be used to detect the formation of receptor-enzyme conjugates on porous members.
또한, 다공성 부재는 시료 중의 핵산 물질에 대한 프로브-수용체로서 헥산 올리고머를 기재로 할 수 있다. 프로브는 예를 들면 목적하는 헥산의 서열에 대해 상보성인 DNA올리고머가 될 수 있고, 경우에 따라 리간드로서 RNA 또는 DNA를 결합시키는 데 사용할 수 있다. 리간드-수용체 결합체의 검출은 목적하는 헥산 리간드의 비간섭 부분에 상보성인 제2의 헥산 올리고머를 사용하여 행할 수 있는데, 이 제2올리고머는 검출 가능하도록 표지되어 있다.The porous member may also be based on hexane oligomers as probe-receptors for nucleic acid material in the sample. The probe can be, for example, a DNA oligomer that is complementary to the sequence of the desired hexane, and optionally can be used to bind RNA or DNA as a ligand. Detection of the ligand-receptor conjugate can be performed using a second hexane oligomer that is complementary to the non-interfering portion of the desired hexane ligand, which second oligomer is labeled so as to be detectable.
본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 다공성 부재는 이 다공성 부재에 결합된 항수용체를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "항수용체"란 말은 리간드-수용체 쌍의 수용체에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 시약을 말한다. 예를 들면, 리간드가 항원이고, 수용체가 항체 예를 들면, 쥐 IgG 항체(적합하기로는 모노클로날 항체) 일 경우에 항수용체는 항체, 적합하기로는 쥐의 IgG에 대한 모노클로날 항체가 될 수 있다. 다른 경우에, 수용체는 항수용체와 선택적으로 결합하는 부분과 결합될 수 있다. 예를 들면, 이 부분은 하프텐(hapten)이고 항수용체는 하프텐에 대한 항체가 될 수 있다. 이러한 하프텐 중 적합한 것은 플루오 레스세인이다. 다른 경우에, 항수용체는 아비딘(avidin)이 될 수 있다. 이 경우, 수용체는 여기에 결합된 비오틴(biotin)을 가질 것이다. 다른 경우에, 수용체는 헥산 올리고머이거나, 여기에 결합된 이러한 올리고머를 가질 수 있고, 항수용체는 리간드와 결합하는 수용체를 손상시키지 않는 수용체 올리고머의 일부에 상보성인 헥산 단편이 될 수 있다. 당업계에 숙련된 사람들은 이상으로부터 여러가지 항수용체 : 수용체의 조합을 사용할 수 있음을 이해할 것이다.In another embodiment of the present invention, the porous member may have an anti-receptor bound to the porous member. As used herein, the term "antireceptor" refers to a reagent capable of selectively binding to a receptor of a ligand-receptor pair. For example, where the ligand is an antigen and the receptor is an antibody, eg, a murine IgG antibody (preferably a monoclonal antibody), the anti-receptor would be an antibody, preferably a monoclonal antibody against murine IgG. Can be. In other cases, the receptor may be associated with a moiety that selectively binds to the antireceptor. For example, this moiety is hapten and the antireceptor can be an antibody against haften. Suitable among these halftenes are fluorescein. In other cases, the antireceptor may be avidin. In this case, the receptor will have biotin bound to it. In other cases, the receptor may be a hexane oligomer or may have such oligomer bound thereto, and the antireceptor may be a hexane fragment that is complementary to a portion of the receptor oligomer that does not damage the receptor that binds the ligand. Those skilled in the art will understand from the above that various antireceptor: receptor combinations can be used.
항수용체를 사용할 경우, 시료는 여러가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면 "샌드위치식 분석(sandwich assay)"에서는 제1수용체와 제2의 표지된 수용체를 다공성 부재에 첨가시키기 전에 시료와 혼합하여 리간드와 결합시킬 수 있다. 다른 방법으로는, 제1수용체와 시료를 다공성 부재에 첨가시키기 전에 혼합하거나, 또는 제1수용체와는 결합하지만 표지된 수용체와는 결합하지 않도록 선택한다.If antireceptors are used, the sample can be analyzed in several ways. For example, in a "sandwich assay", the first receptor and the second labeled receptor may be mixed with the sample and bound to the ligand prior to addition to the porous member. Alternatively, the first receptor and the sample are mixed prior to addition to the porous member, or selected to bind to the first receptor but not to the labeled receptor.
다공성 부재에 결합된 항수용체의 사용은 현색 및 리간드-수용체 분석중에 유용한 다공성 부재의 제조를 단순화할 수 있게 해준다. 예를 들면, 수용체가 다공성 부재에 결합될 경우에는 분석 패널(panel)에 요구되는 각 수용체의 결합을 최적화시키기 위하여 결합 방법을 수정하는 것이 필요할 수 있다. 그러나, 다공성부재에 결합된 단일 항수용체는 여러번 분석에 사용할 수도 있다. 그 결과, 현색 노력 및 제조방법은 이러한 "만능" 다공성 부재가 가능할 경우에 아주 단순화될 수 있다.The use of an antireceptor bound to the porous member makes it possible to simplify the preparation of a porous member that is useful during color development and ligand-receptor analysis. For example, when receptors are bound to porous members, it may be necessary to modify the binding method to optimize the binding of each receptor required for the assay panel. However, a single antireceptor bound to the porous member may be used for multiple assays. As a result, the color development effort and manufacturing method can be greatly simplified where such "all-round" porous members are possible.
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