JP2011504364A

JP2011504364A - 新規ｂａｎｋ１スプライスバリアント

Info

Publication number: JP2011504364A
Application number: JP2010534490A
Authority: JP
Inventors: アブデライム，アディ; ベー．コジレフ，セルゲイ
Original assignee: メルクセローノソシエテアノニム
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2011-02-10
Also published as: AU2008328881A1; WO2009068481A1; EP2215112A1; CA2700823A1; IL205987A0; US20130004512A1; US8105816B2; US20100260746A1

Abstract

本発明は、ＢＡＮＫ１の新規スプライスバリアント、ＢＡＮＫにおけるＳＮＰの診断用の使用、及びＢＡＮＫ１及び／又はＢＡＮＫ１経路を調節するためのアンタゴニストの使用に関する。

Description

本発明は、ＢＡＮＫ１の新規スプライスバリアント、ＢＡＮＫ１に関連したＳＮＰｓの診断用の使用、並びにＢＡＮＫ１及び／又はＢＡＮＫ１経路を調節するためのアンタゴニストの使用に関する。

遺伝子操作によって、個体の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を同定することができる。ＳＮＰｓとは、たった１つのヌクレオチド中の遺伝子の変化である。ＳＮＰｓを同定して、特定の疾患を示唆する生物学的経路と相関させることができる。また、統計学的分析を用いて、多型と疾患の素因やリスクとを相関させてもよい。その結果、疾患に関連した特定の生物学的経路を標的とすることが、このような病気を治療する手段となる。

Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）刺激の際、アンキリンリピートを有するＢ細胞足場タンパク質（Ｂ−ｃｅｌｌｓｃａｆｆｏｌｄｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｎｋｙｒｉｎｒｅｐｅａｔｓ（ＢＡＮＫ１））がＢ細胞中で発現し、チロシンがリン酸化される。ＢＡＮＫ１遺伝子は２８４ｋｂである。ＢＡＮＫ１は主にＢ細胞中で発現するアダプタータンパク質（６，７）である。全長７８５個及び７５５個のアミノ酸からなる２つのアイソフォームは、選択的エクソン１Ａ（図１ｅ）にコードされるＮ末端領域において３０個のアミノ酸が異なり、ＢＡＮＫ１、ＢＣＡＰ及びＤｏｆアダプタータンパク質間において構造がよく似ているアンキリンリピートモチーフ及びコイルドコイル領域を含む（８）。ＢＣＲ結合を介してＢ細胞が活性化されると、ＢＡＮＫ１のチロシンがリン酸化され、これにより、タンパク質チロシンキナーゼであるＬｙｎ及びカルシウムチャンネルであるＩＰ３Ｒとの結合が促進される（３）。ＬｙｎによるＩＰ３Ｒのリン酸化及び活性化、それに続く小胞体に貯蔵されたＣａ²⁺の放出の橋渡しをし、容易にするドッキングステーションとして、ＢＡＮＫ１は機能する（３、９）。ＩＰ３Ｒの結合に必要不可欠な領域に位置するＳＮＰであるｒｓ１０５１６４８７に、ＩＰ３Ｒが関連することが以前に発見された。

ＢＡＮＫ１のＳＮＰｓであるｒｓ１７２６６５９４及びｒｓ３７３３１９７についても、文献に記載されている。

炎症性、自己免疫又は神経性疾患を予測するにあたって、上記ＳＮＰｓが有用であることは文献に記載されていない。

ＢＡＮＫ１及びそれに関与する経路は、炎症性及び自己免疫障害を示唆すると考えられている。特に、ＢＡＮＫ１はＢ細胞で発現するため、ＢＡＮＫ１に関与する経路は、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等のＢ細胞と関連した疾患を示唆する。多発性硬化症（ＭＳ）はＴ細胞と関係するが、この疾患でもＢ細胞の役割について議論がなされている。このため、ＢＡＮＫ１遺伝子の多型を用いて、ＭＳの素因やリスクを診断できる可能性がある。更に、ＢＡＮＫ１経路は、ＭＳを示唆している可能性がある。その結果、この経路とその調節を標的とすることは、ＭＳを予防又は治療する手段となり得る。

本発明の一態様によれば、ＢＡＮＫ１の新規スプライスバリアントを提供する。

本発明の他の態様によれば、ＢＡＮＫ１の経路が関与する自己免疫又は炎症性疾患の素因、それらを発症するリスク又は罹患することについて、個体を診断する方法を提供する。

本発明の他の態様によれば、ＢＡＮＫ１、ＢＡＮＫ１の生物学的経路及び／又はＢＡＮＫ１経路に関係した因子を標的とするアンタゴニストを用いて、自己免疫又は炎症性疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。

本発明の他の態様によれば、ＢＡＮＫ１、ＢＡＮＫ１の生物学的経路及び／又はＢＡＮＫ１経路に関係した因子を標的とするアンタゴニストを用いて、ＢＡＮＫ１の経路が関与する疾患を治療する方法を提供する。

（配列及び図面の簡単な説明）
配列番号１、３及び５は、それぞれ、ヒト、チンパンジー及びマウスのＢＡＮＫ１デルタ２スプライスバリアントの核酸配列である。

配列番号２、４及び６は、それぞれ、ヒト、チンパンジー及びマウスのＢＡＮＫ１デルタ２スプライスバリアントのアミノ酸配列である。

ｒｓ１７２６６５９４とＢＡＮＫ１の完全長アイソフォーム増大レベルの関連。分離した単核球部分母集団におけるＢＡＮＫ１遺伝子の全発現量。ｒｓ１７２６６５９４とＢＡＮＫ１の完全長アイソフォーム増大レベルの関連。全ヒト脾臓ｃＤＮＡから増幅したＢＡＮＫ１のコード部分をＲＴ−ＰＣＲにかけたもので、ゲル上に２つバンドが現れている。左側は１ｋｂラダー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を示す。上の２．３ｋｂバンド及びそれより小さい１．９ｋｂバンドの両方を塩基配列解析により同定した。ｒｓ１７２６６５９４とＢＡＮＫ１の完全長アイソフォーム増大レベルの関連。ヒトＰＢＭＣから精製した全ＲＮＡに定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うことによって決定した、ＢＡＮＫ１の完全長及びデルタ２アイソフォームの相対的なｍＲＮＡ発現レベル。データは平均±標準偏差を表す。分岐点部位ＳＮＰにＴＴ遺伝子型を有する３９人、ＴＣ遺伝子型を有する３４人及びＣＣ遺伝子型を有する１０人について分析した。完全長転写物：ＴＴ対ＣＣ、Ｐ＝０．０００４（スチューデントのｔ検定）；デルタ２転写物：ＴＴ対ＣＣ、Ｐ＝０．００８８。ｒｓ１７２６６５９４とＢＡＮＫ１の完全長アイソフォーム増大レベルの関連。ＳＮＰであるｒｓ１７２６６５９４は、ＢＡＮＫ１の全発現量に有意に影響しなかった。ｒｓ１７２６６５９４とＢＡＮＫ１の完全長アイソフォーム増大レベルの関連。遺伝子の５’末端の概略的な構造。イントロン１の分岐点部位に位置するＳＮＰであるｒｓ１７２６６５９４は、完全長及びデルタ２転写物のスプライシング効率を変える。ＳＮＰであるｒｓ１０５１６４８７により、Ａｒｇ₆₁からＨｉｓへの非同義置換が生じる。選択的スプライシングにより、ＢＡＮＫ１の完全長及びエクソン２全体のインフレーム欠失が生じたデルタ２の２つのアイソフォームが生じる。そのため、短いタンパク質アイソフォームにはＩＰ３Ｒ結合の推定ドメインがなく、完全長タンパク質からのシグナル伝達を弱めてしまうドミナントネガティブなアイソフォームとして機能している可能性がある。ＩＰ３ＲＢＤ−イノシトール１，４，５−三リン酸受容体結合ドメイン。ＬｙｎＢＤ−チロシンキナーゼＬｙｎ結合ドメイン。Ｂａｎｋ１全体の連鎖不平衡及びハプロタイプブロック構造。スウェーデン人患者及びコントロールを用いたデータのＨａｐｌｏｖｉｅｗ解析で計算したデータについて、遺伝子全体で３０種類のＳＮＰｓを調べた。ＢＡＮＫ１の全てのＳＮＰｓのＲ２。図２ａ及び２ｂを合わせたもの。ｒｓ１７２６６５９４及びｒｓ１０５１６４８７から構成されるハプロタイプ頻度（７４．１％ＴＧ、２４．２％ＣＡ）並びにｒｓ３７３３１９７の対立遺伝子頻度（６８．０％Ｇ，３２．０％Ａ）。この図は、３つ全てのＳＮＰｓを含むハプロタイプ頻度も示す（６４．１％ＴＧＧ，１０．１％ＴＧＡ，２０．３％ＣＡＡ，３．８％ＣＡＧ）。全ての母集団を合わせてデータを計算した。

以下の段落には本発明において使用される言葉の定義が含まれており、より広い定義を明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲全体において均等に適用される。

本発明は、エクソン２が欠失したＢＡＮＫ１の配列を含む単離核酸配列に関する。好ましい実施形態において、核酸はヒト、チンパンジー又はマウス由来である。ＢＡＮＫ１配列の参考文献として、Ｎａｔｕｒｅ４３１（７０１１）、９３１−９４５（２００４）を参照してもよい。

ＮＣＢＩのヒトゲノムアセンブリ（ｂｕｉｌｄ３６）に記載されたヒトＢＡＮＫ１配列において、染色体４のエクソン／イントロンは以下の通りである。

ＢＡＮＫ１のエクソン２の一部だけが欠失することも好ましくあり得る。本発明によれば、そのような分子も同様に有用である。

一の実施形態において、単離核酸は、配列番号：１、３又は５、あるいは当該核酸配列の相補的鎖を含む。

一の実施形態において、本発明は、
配列番号：１、３又は５、あるいは前記核酸配列の相補鎖からなる群より選ばれた核酸と、
ａ．高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションし、又は
ｂ．少なくとも約３０個のヌクレオチドの連なりと少なくとも約８５％の同一性を示す
単離核酸に関する。

本発明の他の実施形態は、上記いずれかの核酸配列にコードされたポリペプチドである。

他の実施形態は、上記核酸を含むベクターであって、好ましくは配列番号：１、３又は５、あるいは前記核酸配列の相補鎖からなる群より選ばれた核酸である。

原核又は真核宿主細胞において前記コードされたポリペプチドを発現させる少なくとも１つの発現調節配列に、前記核酸分子を含むベクターが作用可能に連結することが好ましい。

他の実施形態は、上記ベクター又は核酸で形質転換した宿主細胞である。

本発明の更に他の実施形態は、前記核酸を発現させる条件下で上記定義された宿主細胞を培養し、当該核酸にコードされたポリペプチドを培養液から回収することを含む上記ポリペプチドを生産する方法である。

他の実施形態は、
ａ．個体のサンプルから核酸を単離するステップと、
ｂ．二対立遺伝子マーカーに、ｒｓ１０５１６４８７のグアニン又はアデニン、ｒｓ１７２６６５９４のチロシン又はシトシン、ｒｓ３７３３１９７のアデニン又はグアニンがあるか否かを決定するステップと
を含む遺伝子型解析方法である。

好ましい方法においては、前記個体のゲノムにある前記二対立遺伝子マーカーの両コピーについて、当該二対立遺伝子マーカーにおける前記ヌクレオチドの同一性を決定する。

本発明による遺伝子型解析方法をマイクロシーケンシング法で行うのが好ましい。この方法は、前記決定するステップより前に、前記二対立遺伝子マーカーを含む配列の一部を増幅することを更に含むことが好ましい。前記増幅をＰＣＲ法で行うのが好ましい。本発明による方法は、前記遺伝子型解析のステップの結果と自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患するリスク又は素因とを相関させるステップを更に含む。

好ましい実施形態において、前記個体におけるｒｓ１０５１６４８７のグアニン、ｒｓ１７２６６５９４のチロシン及びｒｓ３７３３１９７のチロシンの存在は、当該個体が前記自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患し、素因を有し又は罹患するリスクがあることを示す前記方法を行う。

前記疾患が全身性エリテマトーデス又は多発性硬化症の場合において、本発明の方法を用いるのが好ましい。

ところで、本願発明者らは、ＢＡＮＫ１とＳＬＥ、ＭＳ又は関係した疾患の関連の確証を得たため、遺伝子又はポリペプチドにおける他の感受性変化も、例えば実施例に開示された方法を用いて、同定され得ることが分かる。

ＢＡＮＫ１遺伝子の変化の存在を、シーケンシング法、ピロシーケンシング法、選択的ハイブリダイゼーション法、選択的増幅法及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（Ｇｕｔｅｔａｌ．，２００４）等の質量分析法など、当業者に本質的に知られている任意の技術で検出してもよい。特定の実施形態において、１つ以上の特異的プライマーを用いた選択的核酸増幅によって、変化を検出できる。この変化は、１つ以上の特異的プローブを用いた選択的ハイブリダイゼーションによって検出される。

他の技術として、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、多重ＰＣＲ法、オリゴヌクレオチド連結法及びミニシーケンシング法などのゲル電気泳動を基礎とした遺伝子型解析法；オリゴヌクレオチド連結法、ピロシーケンシング法、蛍光検出される一塩基伸長法、ＴａｑＭａｎ等を用いた均一溶液ハイブリダイゼーション法及びＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎｓを用いた遺伝子型解析などの蛍光色素を基礎とした遺伝子型解析技術；ローリングサークル増幅法及びインベーダーアッセイ法、並びにＤＮＡチップを基礎としたマイクロアレイ法及び質量分析遺伝子型解析技術（Ｓｈｉｅｔａｌ，２００１）等が挙げられる。

更に、サブトラクティブハイブリダイゼーション法、定量的ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ、ディファレンシャルディスプレイ逆転写ＰＣＲ法、ｃＤＮＡの連続的、断片的な配列決定法（発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列決定及び遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ法））、標識されたｃＤＮＡとグリッドに固定された特異的なプローブとのパラレルなハイブリダイゼーション法（マクロ及びマイクロアレイ並びにＤＮＡチップ）等の、当該技術分野において知られている方法によって、変化した遺伝子のＲＮＡ発現を定量化することができる。特定の方法として、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅法、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、サザン及びノーザンブロット法及び締付変性ゲル電気泳動法が挙げられる。

当該技術分野において様々なタンパク質発現分析方法が知られており、二次元ゲル電気泳動法、質量分析法及び抗体マイクロアレイ（Ｆｒｅｅｍａｎｅｔａｌ．，２００４及びＺｈｕｅｔａｌ．，２００３）等が挙げられる。

自動シーケンサーを用いて、当該技術分野の周知技術により配列決定を行うことができる。遺伝子全体に対して配列決定を行ってもよいが、一般的に有害な突然変異又はその他の変異を有することが知られている又は推定されている特定のドメインについて行うのがより好ましい。

ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）及び鎖置換増幅法（ＳＤＡ）等、当該技術分野において知られている様々な技術によって増幅を行ってもよい。市販の試薬及びプロトコルを用いてこれらの技術を行うことができる。好ましい技術は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法である。

ＢＡＮＫ１遺伝子の配列を増幅するのに有用な核酸プライマーは、感受性変化部分と近接又は重複するＢＡＮＫ１の一部と特異的にハイブリダイズすることができる。プライマーがハイブリダイズするＢＡＮＫ１遺伝子の配列中にその変化部分が含まれている場合、プライマー配列は変化部分と重複する。当該変化部分から好ましくは３００ｂｐ未満、より好ましくは２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０ｂｐ未満の距離に位置したＢＡＮＫ１の部分とプライマーがハイブリダイズする場合、プライマー配列は変化部分に近接する。当該変化部分から５、４、３、２、１ｂｐの距離又は直接隣接したＢＡＮＫ１の部分とプライマーがハイブリダイズすることが好ましい。

他の実施形態において、本発明によれば、個体が自己免疫疾患又は炎症性疾患の素因又はリスクを有するか否かを検出する方法は、
ａ．個体の核酸を単離するステップと、
ｂ．ＢＡＮＫ１完全長核酸を検出及び定量化するステップと、
ｃ．ＢＡＮＫ１デルタ２核酸を検出及び定量化するステップと、
ｄ．ステップｂ及びｃの結果の比であるｂ．／ｃ．及び／又はｃ．／ｂ．を決定するステップと
を含む。

この方法において、前記核酸がｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ又はｃＤＮＡであることが好ましい。

上記方法のステップｄにおいて、決定した比は疾患又は増大した感受性を示す。完全長ｍＲＮＡがより多く、デルタ２スプライスバリアントがより少ない場合、個体の疾患に対するリスクがより高くなる。特に、この比がｂ．／ｃ．相関関係においてより高く、この比がｃ．／ｂ．相関関係においてより低い場合、特にＳＬＥやＭＳのような自己免疫又は炎症性疾患が発症するリスクがより高くなる。

本願発明者らは、ＢＡＮＫ１のｍＲＮＡの総量が、特定のＳＮＰｓの存在によって影響を受けないことを見出した。特に、ＳＮＰｓであるｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ１７２６６５９４及びｒｓ３７３３１９７によって、ＢＡＮＫ１のｍＲＮＡの総含有量は変動しない。したがって、ＢＡＮＫ１のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの完全長対デルタ２スプライスバリアントの比は、本発明のＳＮＰｓの存在に影響されない。ｂ．／ｃ．比又はｃ．／ｂ．比は約１であることが好ましい。本発明において有用な比は、上述したようにｂ．／ｃ．又はｃ．／ｂ．である。

ｒｓ１７２６６５９４におけるＴＴからＴＣ、ＣＣへの変化は、検出できるデルタ２ＢＡＮＫ１スプライスバリアントのｍＲＮＡの量に影響する。ｂ．／ｃ．比が１超である場合、好ましくは１より有意に大きい場合、自己免疫又は炎症性疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス又は多発性硬化症を罹患し又はその素因があることを示す。ｃ．／ｂ．比が１未満の場合、好ましくは１より有意に小さい場合、自己免疫又は炎症性疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス又は多発性硬化症を罹患し又はその素因があることを示す。この予測をするにあたって、このＳＮＰのＴＴからＣＣへの変化を最も信頼して用いてもよい。オッズ比（ＯＲ）を計算して、罹患又は素因を表してもよい。自己免疫又は炎症性疾患の素因を検出するために、ＳＮＰであるｒｓ１７２６６５９４及び／又はＢＡＮＫ１の完全長及び／又はデルタ２スプライスバリアントのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの変化を検出及び／又は計算する任意の方法を用いてよいことは、当業者に認識されるであろう。一の実施形態において、サンプルのＢＡＮＫ１デルタ２スプライスバリアントのｍＲＮＡをコントロールと比較して、本発明を用いてもよい。１つのサンプル又は複数のプールサンプルからコントロールを選んでもよい。

ＳＮＰｓであるｒｓ１０５１６４８７及びｒｓ３７３３１９７を用いて罹患又は素因を予測することもでき、それらを間接マーカーとして使用してもよい。本発明によれば、上記マーカーとの連鎖が検出できるのであれば、他のＳＮＰｓを予測マーカーとして用いてもよい。このような連鎖、好ましくは強い連鎖は、ＬＤで表され、好ましくはＤ’０．７、好ましくはＤ’０．８、より好ましくはＤ’０．９である。当該技術分野において知られている通常の技術を用いて、このようなマーカーを同定することができる。

他の実施形態において、本発明は、ＢＡＮＫ１、ＢＡＮＫ１の生物学的経路及び／又はＢＡＮＫ１経路に関係する因子を標的とするアンタゴニストを用いて、自己免疫又は炎症性疾患から選ばれた疾患を治療及び／又は予防する方法に関する。前記疾患が全身性エリテマトーデス又は多発性硬化症であることが好ましい。

アンタゴニストは、所望の標的を部分的又は本質的に完全にアンタゴナイズする任意の分子であればよい。前記アンタゴニストがＢＡＮＫ１、ＬＹＮ及び／又はＩＰ３Ｒ、あるいはこれらの相互作用を標的とすることが好ましい。アンタゴニストが前記ＢＡＮＫ１の核酸を標的とすることが好ましい。一の実施形態において、前記アンタゴニストは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、ペプチド又は小分子である。他の実施形態において、アンタゴニストは、標的であるＢＡＮＫ１、ＬＹＮ及び／又はＩＰ３Ｒに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。ＩＰ３Ｒに特異的に結合又はＩＰ３Ｒの機能を阻害するアンタゴニストが特に好ましい。この場合、疾患の発症又は疾患の兆候に関与するＢ細胞の影響を正に調節、好ましくは阻害することが好ましく達成できる。

本発明において用いられる好ましいＳＮＰｓは以下の通りである。

ｒｓ１０５１６４８７のリスク対立遺伝子はＧである。ｒｓ１７２６６５９４のリスク対立遺伝子はＴであり、ｒｓ３７３３１９７の場合はＡである。明細書中に記載されている本発明の観念において、連鎖不平衡（ＬＤ）中の他のＳＮＰｓを用いてもよいことが分かる。

本願に引用されている全ての参照文献は、参照によって本願明細書に引用したものとする。以下に、本発明について以下の実施例を用いて説明するが、本発明の範囲を限定するものと理解し、解釈してはならない。

１００ｋＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＳＮＰｓアレイで、スウェーデン人ＳＬＥ患者２７９人及びスウェーデン人コントロール５１５人のセットについて、遺伝子型解析を行った。選別後、８５０４２個のＳＮＰｓのデータを用いた。非ＭＨＣ遺伝子及び重要な機能的多型を同定することが目的であったため、遺伝子砂漠を除去し、既知の遺伝子内にある関連ＳＮＰｓの遺伝子位置の分析を進めた。データ分析の結果、全ての非ＭＨＣ関連ＳＮＰｓのうち、１つ（ｒｓ１０５１６４８７）は、ＢＡＮＫ１翻訳タンパク質のアミノ酸位置６１（エクソン１Ａから）において、アルギニンからヒスチジン（トリプレットｃＧｃ→ｃＡｃ、Ａｒｇ→Ｈｉｓ）に非同義的置換していたことが分かった（対立遺伝子関連、Ｐ＝６．４×１０^-3、遺伝子型関連、Ｐ＝２．０１×１０^-2）。このＳＮＰは、対立遺伝子関連分析で全ゲノムスキャンの６７９位、遺伝子型テストで２１４８位であった。これらにおいて、推定ＦＤＲ（偽検出率（ＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅ））はそれぞれ７１．１％及び７７．５％であった。ＢＡＮＫ１の更に４つのＳＮＰについても、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘスキャンにおいて、ＳＬＥと関連があることが分かった。上述したＢＡＮＫ１のＢ細胞に特異的な発現及びＢ細胞受容体介在活性化における潜在的役割から、この遺伝子を追求することにした（３、４）。

ＢＡＮＫ１遺伝子の２８４ｋｂ全てにわたるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＳＮＰｓを含む３０個のＳＮＰｓについて、スウェーデン人患者及びコントロール３５２人の遺伝子型解析を行った。この集団において、２つのＳＮＰｓは多型ではなかった。各ＳＮＰ分析により、ｒｓ１０５１６４８７を含む９つのＳＮＰｓが関連していることが分かった（表１）。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗから入手できるソリッド−スパイン（ｓｏｌｉｄ−ｓｐｉｎｅ）ＬＤ（連鎖不平衡）ハプロタイプブロック定義を用いると、５ＬＤブロックを認識できた。遺伝的関連を示す全てのＳＮＰｓは、ブロック２、３及び４に位置していた。ブロック５に位置するＳＮＰｓでは、遺伝的関連が検出されなかった（表１、付表２及び図２ａ）。遺伝的関連を確認するために、ドイツ、スペイン、イタリア及びアルゼンチンの更に４つのセットの患者及びコントロールについて、ｒｓ１０５１６４８７の遺伝子型解析を行った。アルゼンチンのセットについては有意性まで届かないまでも明らかな傾向があったが、ヨーロッパのセットについては全て遺伝的関連の確証がとれた（表２）。Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定を用いて、セットの均一性及び統合可能性の分析を行った。データを統合できたため、３９７１人からなる全てのセットについてメタ分析を行った。Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌ（ＭＨ）検定において、対立遺伝子関連について、Ｐ値がゲノムワイドな有意性に届き、プールしたオッズ比が１．３８（Ｘ²＝３９．２４３、Ｐ＝３．７４×１０^-10、９５％Ｃｌ１．２５−１．５３）であることが明らかになった。遺伝子型関連の有意性についても観察された（表２）。

ＢＡＮＫ１の発現及び構造について、詳細な分析を行った。上述したように、ＢＡＮＫ１が主にＣＤ１９＋Ｂ細胞において高レベルで発現し、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ１４＋細胞において非常に低レベルで発現していたことを確かに観察した（図１ａ）。そして、ＳＬＥ患者２４人とコントロール８人の近位プロモーター領域、エクソン１Ａ、エクソン１Ｂ及びエクソン２（ハプロブロック２が位置する場所）、並びにこれらエクソンの５００ｂｐ上流および下流の配列決定を行った。これらの領域で新規ＳＮＰは見つからなかった。機能分析を行うために、発現ベクター中のＢＡＮＫ１のｃＤＮＡをクローニングするにあたって、遠位プライマーを用いて完全長ｃＤＮＡを増幅した。意外にも、ＰＣＲ後のゲル上において２つのバンドが検出された（図１ｂ）。その後のクローニング及び配列決定によって、エクソン２全体のインフレーム欠失が起こった新しいアイソフォームが明らかになった（ＢＡＮＫ１のデルタ２アイソフォーム）。健常者８３人及びＳＬＥ患者３０人のｃＤＮＡを分析し、このアイソフォームが各サンプルに存在していたことを見出した。このことは、構成的にスプライシングされたことを示す。更に、このアイソフォームがチンパンジー及びマウスの脾臓のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によっても検出され、種に渡って発現が保存されていたことが示唆される。このため、エクソン１Ａ又はエクソン１Ｂ及びデルタ２アイソフォームを用いて、３つのＢＡＮＫ１のアイソフォーム（２つは完全長）の転写物を検出した。

次に、末梢血単核球におけるアイソフォームの発現について、定量分析を行った。最初に、２つの完全長アイソフォーム（エクソン１Ａ及びエクソン１Ｂの順）の相対的なレベルを決定した。後者の転写物の存在が非常に低レベルであったため、通常の完全長アイソフォームのレベルを測定して分析を続けた。完全長（ＦＬ）アイソフォームとデルタ２の比が一定でないことに気付き、分析したサンプルの遺伝子型に関係なくデルタ２が同等に発現していると予測した。逆に、ＦＬ／デルタ２アイソフォームの比にしたがって、サンプルが分類されている可能性もあった。スプライシングに影響する推定シグナルが位置するエクソン２周辺のゲノム配列について詳しく調べた後、１つのＳＮＰ（ｒｓ１７２６６５９４）が推定分岐点部位にあることが分かり、スプライシングに影響している可能性があった。このＳＮＰにしたがって、発現データを再分類してみると、遺伝子型間に明らかな違いがあることが観察できた（図１ｃ）。Ｔ対立遺伝子がホモであり、それにより分岐点部位（５）（ＹＮＹＴＧＡＹＹＮ）が古典的構造である個体においては、両方のアイソフォームが同等の発現をしていた。一方、マイナー対立遺伝子Ｃがホモである個体においては、完全長転写物の発現が著しく抑制され（最大で４０％）、同時にデルタ２アイソフォームの発現が増加していた。全ＢＡＮＫ１の転写レベルは、そのＳＮＰに有意に影響されなかった（図１ｄ）。患者とコントロールの全てのセットについてｒｓ１７２６６５９４の遺伝子型解析を行い、Ｔ対立遺伝子がＳＬＥと関連していることが分かった（表２；Ｐ＝４．７４×１０^-11、ＯＲ＝１．４２、９５％ＣＩ１．２８−１．５８）。

ＳＮＰｓであるｒｓ１７２６６５９４及びｒｓ１０５１６４８７は互いに１５３ヌクレオチド（ｎｔ）離れており、強いＬＤ関係にある（Ｄ’＝０．９５、Ｒ２＝０．９０、図２ｂ）。第１のＳＮＰのＴ対立遺伝子と第２のＳＮＰのＧ対立遺伝子が、ＳＬＥに関連した同じリスクハプロタイプにあることを見出した（表２の下、Ｐ＝４．７５×１０^-6、ＯＲ＝１．３０、９５％ＣＩ１．１６−１．４５）及び図３。

データベースにおいて、非同義的置換を５ヶ所同定した。ほぼ全てのＳＮＰは非多型であったが、１つ（ｒｓ３７３３１９７）は、アンキリンリピート様モチーフをコードするエクソン７のアミノ酸位置３８３（トリプレットＧｃａ→Ａｃａ）においてアラニンからスレオニンに置換されたものであり、スウェーデン人及びスカンジナビア人セット全体の最初の分析において関連がなかったものの、統合したサンプル（Ｘ²＝１６．５７６、Ｐ＝４．６７×１０^-5（ＯＲ＝１．２３、９５％Ｃｌ１．１１−１．３６）において関連があることが分かった（表１及び付表３）。このＳＮＰはｒｓ１０５１６４８７（Ｄ’＝０．７２、Ｒ２＝０．３９）及びｒｓ１７２６６５９４（Ｒ２＝０．２７）から８８２１１ｂｐ離れたハプロブロック４（図２ａ）にあり、他の２つのＳＮＰｓからなるリスクハプロタイプと分離できる場合があり（図３）、軽度の機能多型である可能性がある。

よって、ここで、ＳＬＥに関連したＢＡＮＫ１の機能多型を３つ同定する。ｒｓ１７２６６５９４の関連したＴ対立遺伝子は、ＢＡＮＫ１の完全長アイソフォームの増大レベルと相関する。このため、両方の多型を組み合わせると、ＩＰ３Ｒ結合ドメイン中のアルギニン残基を有するタンパク質をコードする完全長転写物のより効果的なスプライシングを通して、より活性度の高いタンパク質の高発現という１つの効果が達成される可能性がある。デルタ２アイソフォームは、ＩＰ３Ｒ結合及びＰＨドメインをコードするエクソン２全体を欠失しているため、ドミナントネガティブなアイソフォームとして機能し、それによってＢＡＮＫ１介在シグナル伝達が弱くなってしまう可能性がある（図１ｅ）。

心不整脈及び心臓突然死とアダプタータンパク質であるアンキリンＢ中の単一アミノ酸置換の関連が発見されたことにより、ＩＰ３Ｒの相互作用におけるアンキリンモチーフの突然変異の重要性が最近注目された（１０）。アラニンはＳＬＥと関連しており、ｒｓ３７３３１９７の稀な対立遺伝子であるＡがスレオニンキナーゼ（１１）の部位を構成している可能性がある。

ＳＬＥの場合、Ｂ細胞が最も影響を受ける細胞型である。新規療法では、自己抗体産生細胞のみとしてではなく、抗原提示及びサイトカイン介在シグナル伝達を通して先天性及び後天性免疫応答の重要な制御因子としても機能している可能性がある活性過剰なＢ細胞を除去することを目的としている（１２）。狼瘡におけるＢ細胞中のシグナル伝達物質の機能及び発現異常について、記載されている。興味深い事実として、ＢＡＮＫ１の結合相手であるＬｙｎがヒト及びマウスの狼瘡のような自己免疫疾患において極めて重要なことが挙げられる（１３−１８）。

免疫応答の際のＢ細胞反応亢進又はＢ細胞活性化の制御の欠如
これまでに発表された２つの論文において、Ｂ細胞活性化におけるＢＡＮＫ１の刺激又は抑制の役割について矛盾したデータが示されているため、ＢＡＮＫ１のＢＣＲ介在シグナル伝達における役割は正確にはまだ分からない。エクソン２の選択的スプライシングの存在について未だに発表されていないことを考慮すると、ＫＯモデルに割り当てられたＢＡＮＫ１の負の役割が一部あることについて推測することができる。これは、デルタ２アイソフォームの残存発現があり、このエクソンはＫＯコンストラクトの標的とされているからである（４）。

ＤＮＡサンプル
１００ｋアレイで患者２７９人及びコントロール５１５人の遺伝子型解析を行った。これらの個体について、患者２７９人及びコントロール３５２人の遺伝子型を決定し、表１にＢＡＮＫ１関連を示した。

機能的多型を調べるため、更にスウェーデン人患者１８５人の遺伝子型解析を行い、コントロール４６５人についてｒｓ１７２６６５９４及びｒｓ３７３３１９７の遺伝子型解析を行った。最終的なＭＨ（ＭａｎｔｅｌＨａｅｎｔｓｅｌ）分析及びＯＲ（オッズ比）推定のため、表２に示すスカンジナビア人セットを含むスウェーデン人患者と共に、デンマーク人患者８４人も加えた。複製セットには北ドイツ人患者３８４人、コントロール３７４人、アルゼンチン人患者２８８人及びコントロール３７２人、イタリア人患者２８６人及びコントロール２５２人が含まれた。スペイン人コホートには、スペインのいくつかの地域からの患者７９９人及びコントロール５４２人が含まれた。ｒｓ１０５１６４８７及びｒｓ３７３３１９７について患者７０７人及びコントロール４６９人、ｒｓ１７２６６５９４について患者６７８人及びコントロール４５７人の遺伝子型解析を行った。これは、何人かのコントロールからＤＮＡを入手できなかったためである。ドイツ人、スペイン人及びアルゼンチン人患者については、全て既に記載されている（１９）。イタリア人患者は、複数の医療機関にまたがった、イタリア北部及ぶ中部であるローマ、シエナ、ミラノ及びナポリから患者とそれらに合うコントロールからなる。全ての患者はＳＬＥ分類においてＡＣＲ（米国リウマチ学会）診断基準を満たす。

遺伝子型解析
製造元の説明書にしたがって、１００ｋＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイで遺伝子型解析を行った。ＳＮＰｓであるｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ１７２６６５９４及びｒｓ３７３３１９７の精密なマッピング及び複製を、ＴａｑＭａｎＳＮＰｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇａｓｓａｙｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。フランスのエブリーに所在するＳｅｒｏｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（現在のＭｅｒｃｋＳｅｒｏｎｏＳＡ）にて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子型解析及び精密なマッピングを行った。機能的多型の複製を行った。確認のためサンプル１０６個の遺伝子型解析を２回行い、１００％一致した。全てのサンプルの遺伝子型解析の成功率は９２％を超えた。

統計分析
１００ＫＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘで全ゲノム走査解析を行うために、前処理として選別を行った。（ｉ）失った遺伝子型の割合が５％を超えた場合、（ｉｉ）相対的マイナー対立遺伝子頻度が１％未満の場合、又は（ｉｉｉ）ハーディ−ワインベルグ平衡にしたがう、サンプルしたＳＮＰの観測した遺伝子型分布の確率が０．０２未満の場合、ＳＮＰｓを破棄した。男性個体と女性個体間の均一性のため、常染色体のＳＮＰｓのみを保存した。ＳＮＰ配列をＮＣＢＩ３６ヒトゲノムアセンブリーにマッピングし、複数箇所に局在化したＳＮＰｓを破棄した。残りの各ＳＮＰについては、患者とコントロールの遺伝子型及び対立遺伝子頻度を算定し、正確（非漸近）で不偏のアルゴリズムを用いて対応する確率値を計算する（２１）。そして、Ｆｏｒｎｅｒ，ｅｔａｌ．による方法を用いて、偽検出率（ＦＤＲ）を推定する（２）。

精密なマッピング解析を行うために、遺伝的関連、ハプロタイプの推定、ＬＤ及びＲ２について、全てＨａｐｌｏｖｉｅｗ（ｖ４．０ＲＣ２）を用いて推定した。ＳｔａｔｓＤｉｒｅｃｔソフトウェア（ｖ２．４．６）を用いて、統合可能性のためのＢｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定及びＭａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌ検定を行った。Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定で層の統合可能性が見出せたため、解析にあたって、固定効果を調べるためにＭＨ検定を用いた。ＰＨＡＳＥソフトウェア（ｖ２．１）を用いて、ハプロタイプを推定した（２２、２３）。Ｕｎｐｈａｓｅｄソフトウェア（ｖ３．０．９）を用いて遺伝子型オッズ比を算定した（２４）。

配列決定
ＵｐｐｓａｌａＧｅｎｏｍｅＣｅｎｔｅｒで、配列決定を行うＤＮＡフラグメントを対応するプライマーで増幅し（付表４を参照）、ＱＩＡｑｕｉｃｋｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でアガロースゲルから精製し、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ３．１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列を決定した。

ＲＮＡ精製及びＢＡＮＫ１発現分析
健康なドナー及び狼瘡患者から同意して得た末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）から全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製した。５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４ＵのＲＮａｓｅ阻害剤及び５μＭのオリゴ−ｄＴを含むＰＣＲバッファーＩＩ中で、２μｇのＲＮＡを２ＵのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ転写酵素で逆転写した。全ての試薬はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。４２℃で８０分間ｃＤＮＡ合成を行い、その後９５℃で５分間に反応を終わらせた。全てのｃＤＮＡサンプルを１５ｎｇ／μｌまで希釈した。

ＳＤＳ１．９．１ソフトウェア付きのＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＢＡＮＫ１発現を決定した。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ及び関係したプライマーを用いて、全てのＢＡＮＫ１、つまり選択的完全長アイソフォーム及びデルタ２アイソフォームを定量化した（付表４を参照）。最初の変性を９５℃で５分間行い、その後ＰＣＲ（９５℃で１５秒、６２℃で１５秒、７２℃で３０秒）を４５サイクル行った。酵素を含むＰＣＲバッファーに、３ｍＭのＭｇＣＩ₂、２００μＭの各ｄＮＴＰ、プライマー、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）、１５ｎｇのｃＤＮＡを及び０．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。市販の試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した同じサンプルのＴＢＰレベルまで、発現レベルを標準化した。全ての実験を３回ずつ行った。独立したｃＤＮＡ合成を２回行った。

ヒト、マウス及びチンパンジーのＢＡＮＫ１デルタ２アイソフォームのクローニング
上述したヒトＰＢＭＣと同様に、マウス脾臓の全ＲＮＡの精製及びｃＤＮＡ合成を行った。チンパンジー（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）脾臓の全ＲＮＡは、ＵｐｐｓａｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＴｏｍａｓＢｅｒｇｓｔｒｏｍ博士及びＬｕｃｉａＣａｖｅｌｉｅｒ博士に提供していただいた。ヒト遺伝子はＨｕｍａｎＳｐｌｅｅｎＢＤＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で増幅した。最初の変性を９５℃で５分間行った後、２ｍＭのＭｇＳＯ₄、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの対応する各プライマー（付表４を参照）及び０．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ−ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｅｎｚｙｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＣＲバッファー中で、３５サイクル（９５℃で２０秒、６０℃で１５秒、７２℃で２分３０秒）行った。チンパンジーのｃＤＮＡをヒト特異的プライマーで増幅した。製造元の説明書にしたがって、ＰＣＲ生産物をアガロースゲルから精製し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングした。陽性クローンのプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、配列決定により確認した。

アクセションコード
ＢＡＮＫ１のデルタ２転写物について、ヒトはＥＵ０５１３７６、チンパンジーはＥＵ０５１３７７、マウスはＥＵ０５１３７８のアクセション番号でＧｅｎｂａｎｋに保管された。

ＵＲＬｓ．Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ：ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／；
ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ；
Ｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓａｐｓ／；ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／，ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ／。

Claims

エクソン２が欠失したＢＡＮＫ１の配列を含む単離核酸配列。
ヒト配列、チンパンジー配列又はマウス配列である請求項１記載の単離核酸。
配列番号：１、３又は５、あるいは前記核酸配列の相補鎖を含む請求項１記載の単離核酸。
配列番号：１、３又は５、あるいは前記核酸配列の相補鎖からなる群より選ばれた核酸と、
ａ．高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションし、又は
ｂ．少なくとも約３０個のヌクレオチドの連なりと少なくとも約８５％の同一性を示す
単離核酸。
請求項１から４のいずれか１項記載の核酸にコードされたポリペプチド。
請求項１から５のいずれか１項記載の核酸を含むベクター。
原核又は真核宿主細胞において前記コードされたポリペプチドを発現させる少なくとも１つの発現調節配列に、前記核酸分子が作用可能に連結した請求項６記載のベクター。
請求項１から４又は請求項６から７のいずれかに記載のベクター又は核酸で形質転換した宿主細胞。
前記核酸を発現させる条件下で請求項８記載の細胞を培養し、当該核酸にコードされたポリペプチドを培養液から回収することを含む請求項５記載のポリペプチドを生産する方法。
ａ．個体のサンプルから核酸を単離するステップと、
ｂ．二対立遺伝子マーカーに、ｒｓ１０５１６４８７のグアニン又はアデニン、ｒｓ１７２６６５９４のチロシン又はシトシン、ｒｓ３７３３１９７のアデニン又はグアニンがあるか否かを決定するステップと
を含む遺伝子型解析方法。
前記個体のゲノムにある前記二対立遺伝子マーカーの両コピーについて、当該二対立遺伝子マーカーにおける前記ヌクレオチドの同一性を決定する請求項１０記載の方法。
前記決定をマイクロシーケンシング法で行う請求項１０又は１１のいずれかに記載の方法。
前記決定するステップより前に、前記二対立遺伝子マーカーを含む配列の一部を増幅することを更に含む請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
前記増幅をＰＣＲ法で行う請求項１３に記載の方法。
前記遺伝子型解析のステップの結果と自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患するリスク又は素因とを相関させるステップを更に含む請求項１０から１４のいずれかに記載の方法。
前記個体におけるｒｓ１０５１６４８７のグアニン、ｒｓ１７２６６５９４のチロシン及びｒｓ３７３３１９７のチロシンの存在は、当該個体が前記自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患し、素因を有し又は罹患するリスクがあることを示す請求項１０から１５のいずれかに記載の方法。
前記疾患が全身性エリテマトーデス又は多発性硬化症である請求項１６に記載の方法。
ａ．個体の核酸を単離するステップと、
ｂ．ＢＡＮＫ１完全長核酸を検出及び定量化するステップと、
ｃ．ＢＡＮＫ１デルタ２核酸を検出及び定量化するステップと、
ｄ．ステップｂ及びｃの結果の比であるｂ．／ｃ．及び／又はｃ．／ｂ．を決定するステップと
を含む、個体が自己免疫疾患又は炎症性疾患の素因又はリスクを有するか否かを検出する方法。
前記核酸がｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ又はｃＤＮＡである請求項１８に記載の方法。
ＢＡＮＫ１、ＢＡＮＫ１の生物学的経路及び／又はＢＡＮＫ１経路に関係した因子を標的とするアンタゴニストを用いて、自己免疫又は炎症性疾患から選ばれた疾患を治療及び／又は予防する方法。
前記疾患が全身性エリテマトーデス又は多発性硬化症である請求項２０に記載の方法。
前記アンタゴニストがＢＡＮＫ１、ＬＹＮ及び／又はＩＰ３Ｒ、あるいはこれらの相互作用を標的とする請求項２０又は２１のいずれかに記載の方法。
前記アンタゴニストが前記ＢＡＮＫ１の核酸を標的とする請求項２２に記載の方法。
前記アンタゴニストがアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、ペプチド、抗体又はこれらのフラグメント、あるいは小分子である請求項２０から２３のいずれかに記載の方法。