JP2011196852A - 蛍光観察装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】励起光を標本Aに照射する一方、標本Aからの蛍光を集光する対物光学系40と、対物光学系40の径方向外側に配置され、標本Aからの蛍光を取り込む付加光学系50と、対物光学系40および付加光学系50により集光された標本Aからの蛍光を検出する光検出器17,23とを備える蛍光観察装置1を採用する。
【選択図】図1
Description
本発明は、励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備える蛍光観察装置を採用する。
標本の深部においては、集光点で励起されて発生した蛍光が標本中を進む距離が、散乱の平均自由行程(散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値)を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本内で多重散乱して標本表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本表面から射出されるので、標本表面から付加光学系までの距離が離れていると、標本表面からの出射方向が付加光学系から外れてしまい、付加光学系に取り込まれる蛍光が急激に減少する。
このようにすることで、細径先端部を標本内に挿入した状態で、標本の観察を行うことができる。これにより、励起光が標本内を通る距離を短くすることができ、標本内における励起光の散乱を少なくして集光点における励起光の光密度が高め、励起効率を向上することができる。また、標本からの蛍光が標本内を通る距離を短くすることで、標本内における蛍光の散乱が少ない状態で対物光学系により集光することができ、光検出部による蛍光の検出効率を向上することができる。
付加光学系を正レンズとすることで、集光点からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出部に導くことができる。また、付加光学系を対物光学系を中心とする環状に形成することで、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を効率的に取り込むことができる。
このようにすることで、付加光学系の入射面全体を標本表面に密着させることができ、標本表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。
集光点で発生した蛍光は、付加光学系の入射面で対物光学系の光軸方向に向けて屈折する。この屈折角に導光部の光軸方向を合わせて配置することで、蛍光の検出効率を向上することができる。この構成は、標本の散乱が比較的小さく、集光点からの非散乱光が多い場合に特に有効である。
このようにすることで、標本へのダメージを抑えて、付加光学系を標本内に挿入することができる。これにより、付加光学系を集光点に近づけるができ、付加光学系に取り込む蛍光の光量を増加させ、画像のSN比を向上することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、1つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、SN比を高めることができる。
このようにすることで、対物光学系により集光された蛍光と付加光学系により取り込まれた蛍光とを光合成手段により合成し、合成した光を同一の光検出部により検出することができる。これにより、光検出部を1つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、1つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、画像のSN比を高めることができる。
導光部を通って、導光部の基端側から射出された蛍光は、付加光学系コリメートレンズで屈折され、略平行光束になる。付加光学系コリメートレンズを出た蛍光は、偏向素子によって、対物光学系の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系の光束の外側を通って、蛍光観察装置本体に入射する。蛍光観察装置本体に入射した蛍光は、同一の光検出部により検出される。
本発明の第1の実施形態に係る蛍光観察装置1について、図1から図8を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置1は、図1に示すように、励起光を射出するとともに標本Aにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体10と、顕微鏡本体10とは別個に設けられ、標本Aからの蛍光を検出する光検出ユニット20と、顕微鏡本体10からの励起光および標本Aからの蛍光を導く光学系30とを備えている。
顕微鏡本体10は、励起光である短パルスレーザ光を射出するレーザ光源11と、標本A上において短パルスレーザ光の集光点を光軸に直交する方向に走査する走査ミラー12と、短パルスレーザ光の瞳をリレーするリレー光学系13と、励起光と標本Aからの蛍光とを分離するダイクロイックミラー14と、標本Aからの蛍光の瞳をリレーするリレー光学系16と、ダイクロイックミラー14とリレー光学系16との間に設けられた励起光カットフィルタ15と、標本Aからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器17とを備えている。
入射面41は、標本A上に載置されたカバーガラス32に近接または当接され、標本Aの集光点(ピント位置)34において発生した蛍光が入射するようになっている。
なお、対物レンズ42および蛍光出口部53はともに着脱自在になっていて、対物光学系40および付加光学系50は交換可能とされている。
レーザ光源11から励起光として射出された短パルスレーザ光は、走査ミラー12により偏向された後、リレー光学系13により瞳がリレーされる。そして、短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー14により対物光学系40に向けて反射され、対物光学系40(対物レンズ42)により標本A内の集光点34に集光される。
標本A内で発生した蛍光のうち、対物光学系40の開口範囲内に入ったもの(直接光および散乱光)は、対物光学系40(対物レンズ42)により集光され、ダイクロイックミラー14を透過する。ダイクロイックミラー14を透過した蛍光は、励起光カットフィルタ15により励起光が取り除かれた後、リレー光学系16を介して光検出器17により検出され、電気信号に変換される。
なお、走査ミラー12の走査位置による明るさのムラを少なくするために、光検出器17の位置は、対物光学系40の瞳位置と共役な位置近傍にあることが望ましい。
また、対物光学系40の側面は大きさの制限が無いので、光ファイバ束52の径を大きくすることで、蛍光の光量を増やすことも可能である。
このような形状とすることで、蛍光取り込み窓51の先端側(入射面51)が平面なので、標本Aと蛍光取り込み窓51との間にある媒質の屈折率の影響を受けにくくすることができ、対物光学系40が水浸または油浸タイプの場合に好適である。
なお、図8に示す例において、光ファイバ束52の光軸の向きを、蛍光取り込み窓51における蛍光の屈折角と略同じ角度となるように、光ファイバ束52を配置することが好適である。
上記の構成は、標本Aの散乱が比較的小さく、集光点34からの非散乱光が多い場合に特に有効である。
光ファイバ束52を液体ファイバとした場合、ファイバとファイバとの隙間が無いため、蛍光の取得効率をさらに高め、蛍光画像のSN比を向上することができる。
また、対物光学系40に対して付加光学系50の先端部が光軸方向に可動するように構成し、蛍光取り込み窓51の光軸方向の位置を自由に決められるようにしてもよい。
また、対物光学系40に有限系の顕微鏡対物レンズを使用してもよい。
次に、本発明の第2の実施形態に係る蛍光観察装置1について、主に図9から図14を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置2について、第1の実施形態に係る蛍光観察装置1と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
図9に示すように、対物光学系40は、標本A内部に損傷を少なく挿入できるように、対物光学系40が、先端の径が小さく形成された細径先端部43を有している。具体的には、細径先端部43の直径は2mm以下で、より望ましくは1mm以下が好適である。
蛍光取り込み窓51は、図10に示すように、複数の薄い(例えば厚さ0.3mm程度)平行平板ガラスが対物光学系40の細径先端部43を取り囲むように配置されて形成されている。
第1の実施形態と同様に、複数の光ファイバ束52は途中位置で1つの束にまとめられている。複数の光ファイバ束52は、例えば、外径は5mm、内径は細径先端部43の外径よりも少し大きい径である。
次に、本発明の第3の実施形態に係る蛍光観察装置3について、主に図15から図19を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置3について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置3は、図15に示されるように、対物光学系40を通った蛍光と付加光学系50を通った蛍光を同一の光検出器17で検出できるようにしたものである。
本実施形態では、光ファイバ束52の基端側(蛍光出口部53)と有限系レンズ45,46の基端側の瞳位置をともに無限大(すなわちテレセントリック)に構成している。
第1の実施形態と同様に顕微鏡本体10から射出され、平行光束で対物光学系40に入射した励起光は、アダプタレンズ62(無限遠系レンズ)によって対物光学系40内の中間結像面61上で一旦集光され、有限系レンズ45,46によって再び標本A内の集光点34に集光される。
図17において、標本A内の集光点34で発した蛍光のうち、対物光学系40の有限系レンズ45,46の開口範囲内に入ったもの(直接光および散乱光)は実線で示している。また、標本A内の集光点34で発した蛍光のうち、付加光学系50に入ったもの(直接光および散乱光)は点線で示している。なお、図17は、励起光が走査されて、対物光学系40の光軸から外れたときの状態を示している。
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置3によれば、第1の実施形態と同様に、付加光学系50を対物光学系40の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Aに近づけた際に、付加光学系50が邪魔になることはない。そのため、対物光学系40の先端部を標本Aに近づけて、標本Aの表面から深い位置に対物光学系40のピントを合わせることができ、標本Aの深部の観察精度を向上することができる。
なお、これらの光学系の瞳位置の配置は、上記に限定されるものではなく、対物光学系40の有限系レンズ45,46の基端側の瞳位置と付加光学系50の基端側の瞳位置が一致するように構成し、これらの瞳がアダプタレンズ62によって、光検出器17の位置にリレーされるようにしてあればよい。
図18に示すように、本変形例に係る蛍光観察装置3’は、対物光学系40の先端に細径先端部43を有している。また、第2の実施形態と同様に、光ファイバ束52が蛍光取り込み窓51に固定されており、蛍光取り込み窓51が、対物光学系40の光軸方向に移動可能になっている。
上記構成を有する蛍光観察装置3’によれば、第2の実施形態と同様に、励起効率や蛍光の検出効率を上げることができ、画像のSN比を向上することができる。
具体的には、例えば図16に示すように、励起光の走査範囲に遮光部材47を設け、付加光学系50の蛍光出口部53を走査範囲の外に配置することが考えられる。
また、光ファイバ束52(導光手段)は蛍光を蛍光出口部53まで導けば良く、第1の実施形態と同様に他の導光手段に変更することも可能である。
次に、本発明の第4の実施形態に係る蛍光観察装置4について、主に図20を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置4について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置4は、図20に示されるように、第3の実施形態に係る蛍光観察装置3において、蛍光出口部53の部分が変形された態様である。
第3の実施形態に係る蛍光観察装置3と異なる点は、有限系レンズ45,46の中間像面が、光ファイバ束52の基端部(蛍光出口部53)ではなく、光ファイバ束52の基端部の共役面である中間結像面61に形成される点である。
付加光学系50のリレーレンズ55の基端側(ミラー56で反射後)の瞳位置は、付加光学系50からの蛍光が効率よく光検出器17に入るように、対物光学系40の光軸方向に有限系レンズ45,46と瞳位置を略一致させている。
第3の実施形態において、付加光学系50の光ファイバ束52の基端部のNAと有限系レンズ45,46の中間像側のNAが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズ62のNAを大きいほうにあわせる必要がある。しかし、本実施形態のように付加光学系50のリレーレンズ55を使って、付加光学系50の中間結像面61におけるNAを有限系レンズ45,46のNAにあわせることで、アダプタレンズ62のNAをどちらかに大きいほうにあわせる必要がなくなる。
なお、目的に合わせて、付加光学系50の仕様(光ファイバ束52の太さやNA,蛍光取り込み窓51の形状など)を交換しても、有限系レンズ45,46やアダプタレンズ62を変える必要が無い。
さらに、光ファイバ束52が同じNAであれば、光ファイバ束52の基端部から着脱してもよい。
次に、本発明の第5の実施形態に係る蛍光観察装置5について、主に図21から図28を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置5について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
なお、図21に示す例では、細径先端部43を有する対物光学系40を示しているが、それ以外の対物光学系40でもよい。
周辺部74は、光ファイバ束52の基端部から蛍光が入射するコリメートレンズ(付加光学系コリメートレンズ)71と、コリメートレンズ71からの蛍光を偏向するプリズム(偏向素子)72で構成されている。なお、プリズム72に代えて、ミラーを配置することとしてもよい。
対物光学系40を通った蛍光は、対物光学系40で略平行光束になって、蛍光合成部70の中心部73を通り、顕微鏡本体10に入射する。
1つ目は、顕微鏡本体10の視野が対物光学系40の視野と比較して大きい場合であり、この場合には対物光学系40の視野外に付加光学系50からの蛍光を通すことが有利である。
2つ目は光検出器17の検出領域が対物光学系40で使用する領域よりも大きい場合であり、この場合には対物光学系40の瞳の外側に付加光学系50からの蛍光を通すことが有利である。
まず、1つ目の条件のときの蛍光合成部70での光の条件設定、すなわち対物光学系40の視野外に付加光学系50の光を通す場合について説明する。
図24および図25は、蛍光の光路を示している。
図24および図25においてダイクロイックミラー14と励起光カットフィルタは省略してある。また、実線は対物光学系40の最大視野のマージナル光線、点線は付加光学系50を通る光束を示している。また、符号81は対物光学系40の瞳面、符号82はコリメートレンズ71の瞳面を示している。
このときの光束の角度は以下のように設定している。
コリメートレンズ71の瞳位置の設定は、ミラー75によって対物光学系40の光束を遮らない範囲で、対物光学系40の瞳とできるだけ多く重なるようにするとよい。
上記の設定を行うことで、図26に示すように、光検出器17の中心付近に付加光学系50を通った光を多く導くことができ、蛍光の検出効率を高めることができる。このように、付加光学系50を通った蛍光を、対物光学系40の視野外を通して光検出器17まで到達させることができる。
図27は、光ファイバ束52の基端部の中心とコリメートレンズ71の光軸を一致させて、ミラー75によりコリメートレンズ71の光軸を顕微鏡本体10側に直角に曲げている例を示している。また、符号81は対物光学系40の瞳面、符号82はコリメートレンズ71の瞳面、符号83はコリメートレンズ71の瞳相当面を示している。
本実施形態では、コリメートレンズ71の基端側の瞳位置(ミラー75より先端側にある場合は瞳に相当する位置)を、光軸方向で対物光学系40の瞳位置の近傍に配置している。また、横方向は、ミラー75が対物光学系40の最大視野の光束を遮らない範囲で、できるだけ光軸に近いところに互いの瞳が重ならないようにずらして配置している。
上記の設定を行うことで、付加光学系50を通った蛍光を、対物光学系40の瞳の外側を通して光検出器17まで到達させることができる。
1,2,3,3’,4,5 蛍光観察装置
10 顕微鏡本体
11 レーザ光源
12 走査ミラー
13 リレー光学系
14 ダイクロイックミラー
15 励起光カットフィルタ
16 リレー光学系
17 光検出器(光検出部)
20 光検出ユニット
21 リレー光学系
22 励起光カットフィルタ
23 光検出器(光検出部)
30 光学系
34 集光点(ピント位置)
40 対物光学系
41 入射面
42 対物レンズ
43 細径先端部
45 有限系レンズ
46 有限系レンズ
50 付加光学系
51 蛍光取り込み窓(入射面)
52 光ファイバ束(導光部)
53 蛍光出口部
54 正レンズ
55 リレーレンズ(付加光学系リレーレンズ)
56 ミラー
61 中間結像面
62 アダプタレンズ
70 蛍光合成部(光合成手段)
71 コリメートレンズ(付加光学系コリメートレンズ)
72 プリズム(偏向素子)
73 中心部
74 周辺部
75 ミラー(偏向素子)
Claims (11)
- 励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、
該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、
前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備える蛍光観察装置。 - 前記付加光学系が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられた請求項1に記載の蛍光観察装置。
- 前記対物光学系が、前記標本内に挿入するための細径先端部を有する請求項1に記載の蛍光観察装置。
- 前記付加光学系が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズである請求項1に記載の蛍光観察装置。
- 前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成されている請求項1に記載の蛍光観察装置。
- 前記入射面に入射させた蛍光を導光する導光部を備え、
該導光部の光軸が、前記入射面における蛍光の屈折角と略同じ角度で配置されている請求項5に記載の蛍光観察装置。 - 前記付加光学系が、先端に向かって径が小さくなるように形成されている請求項1に記載の蛍光観察装置。
- 前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、
前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備える請求項1に記載の蛍光観察装置。 - 前記付加光学系が、
前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面と、
該入射面に入射させた蛍光を導光する導光部と、
該導光部の基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズとを備える請求項8に記載の蛍光観察装置。 - 前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備える請求項1に記載の蛍光観察装置。
- 前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、
前記周辺部が、前記導光部の基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有する請求項10に記載の蛍光観察装置。
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