JP2011173909A - 免疫治療組成物、その製造方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫系をモジュレーションするための組成物及び方法の提供。
【解決手段】ＦＡＤＤ（内因性ｆａｓ関連デスドメイン分子）依存性シグナリング経路モジュレーターを含む組成物。さらには、核酸及び／又はタンパク質、例えば、ＦＡＤＤ依存性シグナリング経路モジュレーターを送達して、免疫応答の種々の経路をブーストするようにデザインされた、生物分解性マイクロ粒子、例えば、キトサンマイクロ粒子、又はＰＬＧＡ／ＰＥＩマイクロ粒子の利用及び該生物分解性マイクロ粒子を製造する方法。また、キトサン及び他のポリカチオンマイクロ粒子を使用して、ＦＡＤＤ依存性シグナリング経路モジュレーターを送達して、免疫系をモジュレーションし、感染性疾患及びガンを予防及び／又は処置する方法。
【選択図】なし

Description

本願は、それぞれ、2003年12月11日に出願されたU.S. Provisional Application Serial No.60/528,613及び2004年8月31日に出願されたU.S. Provisional Application Serial No.60/605,554からの優先権を主張する。両provisional applicationの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景
本発明は、免疫治療の分野に関する。更に詳しくは、本発明は、内因性ｆａｓ関連デスドメイン分子(fas-associated death domain molecule)（ＦＡＤＤ）−ＲＩＰ１依存性シグナリング経路及び外因性Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）依存性経路のいずれか又は両方を活性化することができる組成物及び自然適応的免疫応答(innate adaptive immune responses)をより有効にカップリングさせるための方法に関する。組成物は、ウイルス、真菌(fungal)及びバクテリア病原体に対する自然免疫応答をモジュレーションする(modulate)のに特に有用であり、そしてガンを処置するのにも特に有用である。

技術の背景
微生物病原体、例えば、ウイルス、バクテリア及び真菌(fungi)への宿主暴露は、自然免疫応答の活性化をトリガーして、初期宿主防御機構を刺激し(galvanize)、そして細胞傷害性Ｔ細胞活性及び抗体産生を伴う適応的免疫応答の活性化を促す(invigorate) [Medzhitov, et al., Semin. Immunol., 10:351-353, (1998)]。病原性微生物の認識及び自然免疫カスケードのトリガリングは、過去数年間にわたる熱心な研究の対象となった。

病原性微生物の保存された成分（病原体関連分子パターン−ＰＡＭＰｓと呼ばれる）、例えば、リポ多糖及びＣｐＧ ＤＮＡ（図１）を認識することを担っている重要表面分子として現れたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）の役割に最近特に注目が集まった[Medzhitov, et al., Semin. Immunol., 10:351-353, (1998)]。ＴＬＲｓは、最初Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）において同定され、そしてハエ発生並びに真菌及びグラム陽性菌に対する宿主の防御において重要な役割を演じていることが証明された。[Impler, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 270:53-79, (2002)]。

ＴＬＲの関与は、細胞の核にシグナルを伝達し、細胞がある種のタンパク質、例えばサイトカインを産生するのを開始することを誘発させ、宿主防御の他の成分に警報を出す。哺乳動物細胞では、少なくとも１０種のＴＬＲメンバーが存在するらしく、その各々は細胞外リポ多糖（ＬＰＳ）及びｄｓＲＮＡを含む種々の異なる刺激に応答する[Takeda, et al., Ann. Rev. Immunol., 21:335-376, 2003]。リガンド結合に続いて、すべてのＴＬＲｓの細胞質ゾル領域に存在するＴｏｌｌ／インターロイキン（ＩＬ）−１受容体（ＴＩＲ）ドメインによりトリガーされるホモフィリック相互作用(homophilic interactions)をとおして、シグナリング経路が開始される[Akira,Jour.Biol.Chem., 278:38105-38108, 2003]。ＴＬＲ−２、−４及び−5を含む多くのＴＬＲｓは、ＭＹＤ８８と呼ばれる共通のアダプタータンパク質を使用し、このＭＹＤ８８はＴＩＲドメイン及びデスドメイン（ＤＤ）を含有する。ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ、ＴＲＡＭ及びＴＩＲＡＰ／Ｍａｌと呼ばれるＭＹＤ８８と同様に機能する（ＤＤを欠いているけれども）他のアダプター分子が今や単離され、そしてＴＬＲ活性のモジュレーションにおいて同様に機能する[Horng, et al., Nat. Immunol., 2:835-841, (2001); Oshiumi, et al., Nat. Immunol., 4:161-167, (2003); Yamamoto, et al., Science, 301:640-643, (2003); Yamamoto, et al., Natl. Immunol., 4: 1144-1150, (2003)]。ＭＹＤ８８の常在性ＤＤ(resident DD)は、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ(IL-1 receptor-associated kinase)(IRAK)ファミリーのメンバー、例えば、ＴＲＡＦ−６のリン酸化及び活性化に関与するＤＤ含有セリン−トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫ−１及び−４、との相互作用を多分促進する[Cao, et al., Science, 271:1128-1131, (1996); Ishida, et al., J. Biol. Chem., 271: 28745-28748, (1996); Muzio, et al., Science, 278:1612-1615, (1997); Suzuki, et al., Nature, 416: 750-756, (2002)]。

すべてのＴＬＲｓは、結局、転写因子ＮＦ−κＢ並びにマイトジェンで活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、細胞外シグナルで調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８及びｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化をもたらす共通のシグナリング経路をトリガーする[Akira, J. Biol. Chem., 278:38105-38108, (2003)]。更に、ＴＬＲ−３又は−４の刺激は、正確な機構はまだ明らかにされていないけれども、多分、非正統的ＩκＢキナーゼ相同体(noncanonical IκB kinase homologues)、ＩκＢキナーゼ−ε（ＩＫＫε）及びＴＡＮＫ結合キナーゼ１(TANK-binding kinase-1)（ＴＢＫ１）のＴＲＩＦ媒介活性化によって、転写因子インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）−３を活性化することができる[Doyle, et al., Immunity, 17: 251-263,(2002): Fitzgerald, et al., Nat. Immunol., 4: 491-496, (2003)]。

ＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３応答シグナリングカスケードの活性化は、結局、炎症応答を含む自然免疫応答及び適応的免疫応答を調節する多数の遺伝子の転写刺激をもたらす。

一次自然免疫応答遺伝子、例えば、ＩＦＮ−βの活性化は、抗ウイルス遺伝子を誘発するのみならず、ＮＫ細胞が関与する自然免疫応答、ＤＣｓの成熟並びにケモカイン及びＴ細胞応答を促進するＭＨＣの如き分子のアップレギュレーション、を促進する分子も誘発する。ＩＦＮは、抗体応答の産生のために決定的に重要であることも示された。かくして、自然免疫応答を理解し、そして強力に調節することは、自然免疫応答及び適応的免疫応答の両方のための、新規な治療及びワクチン接種方法並びに疾患をターゲティングする組成物を開発するための好機を与える。

免疫治療の重要な観点は、有効な薬物／抗原送達システムの開発である。細胞に薬物、抗原及び他のシグナル分子を送達するための粒子担体が考案された[Aideh, et al., J. Microencapsul., 14:567-576 (1997); Akbuga, et al., Microencapsul., 13:161-167(1996); Akbuga, et al., Int. J.(1994); Aral, et al., STP Pharm. Sci., 10:83-88(2000)]。これらの送達担体の要件は用途に依存して異なる。例えば、ケモカインの担体は、長期間の時間（通常、日）ロードされた分子の安定な勾配を与える必要があり、そして粒子はファゴサイトーシスされるのを回避するために、相対的に大きい（２００〜７００μm）ことが必要である。

他方、抗原がより小さな粒子により担われ、該粒子はそれらの表面を介して細胞と相互作用するのみならず、樹状細胞、マクロファージ又は他の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により飲み込まれることもできる場合、免疫感作はより強い。ファゴサイトーシスは、１０μmより小さい粒子で最適であり、これは抗原担体のサイズを規定する。

キトサンはキチン由来の天然産物である。それは、植物繊維の主要構成物であるセルロースに化学的に類似しており、そして繊維としての多くの性質を有する。キトサンは、粘膜に対する高い付着力(adhesion)及び良好な生物分解性を有し、そして粘膜表面を横切る大きな分子の侵入(penetration)を高める能力も有することが示された[Illum, et al., Pharm. Res., 9: 1326-1331 (1992)]。キトサンナノ粒子は、インシュリンの鼻吸収を改善するのに非常に有効であり、そして破傷風トキソイドに対する局部的及び全身系免疫応答においても非常に有効であることが証明された[Vila, et al., J Controlled Release, 17; 78(1-3): 15-24 (2002)]。免疫系の同様なブーストが、ジフテリアに対するキトサンマイクロ粒子による粘膜ワクチン接種 [Inez, et al., Vaccine, 21:1400-1408(2003)]：経口ワクチン接種後のＤＲに対する保護的全身系及び局所免疫応答及び鼻投与後のＩｇＧ産生の有意な増強において証明された。最近、キトサンは、結腸への送達薬物のための担体として有望であることが示された[Zhang, et al., Biomaterials, 23:2761-2766 (2002)]。

発明の要約
本発明の１つの観点は、哺乳動物における自然免疫系をモジュレーションするための組成物に関する。この組成物は、ポリカチオンポリマーを含むマイクロ粒子；ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及びＴＬＲ経路のモジュレーターを含み、該ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及び該ＴＬＲ経路のモジュレーターは、該マイクロ粒子と会合しており、そして、該マイクロ粒子は抗原提示細胞によりファゴサイトーシスされることができる。

１つの態様では、ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ポリ（ＩＣ）、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、ＦＡＤＤ依存性経路の成分をコードするＤＮＡプラスミド、バクテリア及び真菌(fungus)よりなる群から選ばれる。

他の態様では、ＴＬＲ経路のモジュレーターは、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物(synthetic mimetic)及びＴＬＲのリガンド、バクテリア及び真菌よりなる群から選ばれる。

他の態様では、マイクロ粒子は、抗原提示細胞に特異的に結合するターゲティング分子で更にコーティングされる。

本発明の他の観点は、核酸及びタンパク質をロードされたファゴサイトーシス可能なキトサンマイクロ粒子を含む、宿主における免疫系をモジュレーションするための組成物に関する。

本発明のなお更に他の観点は、有効量の上記した組成物を対象(subject)に投与することを含む、対象におけるウイルス、バクテリア、真菌感染及びガンを処置する方法に関する。

本発明の更に他の観点は、免疫モジュレーションのための多機能性マイクロ粒子を製造する方法に関する。この方法は、沈殿、ゲル化及び噴霧によりキトサンマイクロ粒子を製造する(fabricating)工程、及びキトサンマイクロ粒子を、核酸、タンパク質又はその両方を含む溶液中でインキュベーションする工程を含む。

本発明の他の観点は、自然及び適応的免疫応答を活性化することができる多重／多機能作用物質(multiple/multifunctional agents)を有する粒子を創造することに関する。

本発明の更に他の観点は、ＦＡＤＤシグナリング経路に関する抗ウイルス遺伝子を同定する方法に関する。この方法は、ＦＡＤＤ欠如細胞(FADD-deficient cells)及び対応する野生型細胞をポリ（ＩＣ）で処理する工程、ポリ（ＩＣ）処理されたＦＡＤＤ欠如細胞及びポリ（ＩＣ）処理された野生型細胞からＲＮＡｓを単離させる工程；単離されたＲＮＡｓを遺伝子アレイにハイブリダイゼーションさせる工程、及びポリ（ＩＣ）処理された野生型細胞と比べてポリ（ＩＣ）処理されたＦＡＤＤ欠如細胞において差次的に発現される(differentially expressed)遺伝子を同定する工程を含む。

ＴＬＲｓを介する宿主細胞によるＰＡＭＰｓの検出を示す。 インターフェロンの抗ウイルス機構を示す。 ＴＮＦ−α経路の略図である。 抗原のプロセッシング及び主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子への送達の経路の略図である。 ポリ（ＩＣ）処理プロトコールの略図である。 ２つのウイルスシグナリング経路、外因性ＴＬＲ３依存性経路及び内因性ＦＡＤＤ依存性経路を活性化してＩＦＮを産生することにより自然免疫を高める提唱された方法の略図である。 キトサンの構造式である。 単球由来のヒト樹状細胞によりファゴサイトーシスされたポリスチレンビーズを示す顕微鏡写真である。 分岐状ＰＥＩの構造式である。 （１）酵母ｄｓＲＮＡ、（２）スペルミジン−ポリグルシン−グルタチオンコンジュゲート及び（３）ハイブリッドタンパク質ＴＢＩ−ＧＳＴからなる人工的ウイルス様粒子である。 図１１ａ〜１１ｆは、ＩＦＮ予備処理後ですらＭＥＦｓにおけるＶＳＶ複製の阻止のためには、ＦＡＤＤが必要とされるがカスパーゼ−８は必要ではないことを示す実験データである。図１１ａは、ＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理にもかかわらずＶＳＶ誘発ＣＰＥ(VSV-induced CPE)に感受性であり、そして顕微鏡写真は感染の４８時間後に撮られたことを示す。図１１ｂは、ＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓがＩＦＮ予備処理によりＶＳＶでトリガーされた細胞死から保護されないことを示す。細胞生存度は、トリパンブルー排除分析により感染後の指示された時間に決定された。図１１ｃは、ＩＦＮ予備処理は、ＦＡＤＤ−／−ＥＦｓにおけるＶＳＶ複製を遅らせるが阻止はしないことを示す。図１１ｄは、カスパーゼ８欠如は、ＭＥＦｓにＶＳＶ誘発ＣＰＥに対する感受性を増加する素因を与えないことを示す。図１１ｅは、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＭＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理によりＶＳＶ誘発細胞死から等しく十分に保護されることを示す。図１１ｆは、ＩＦＮ予備処理が、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＥＦｓの両方においてＶＳＶ複製を有効に阻害することを示す。 図１２ａ〜１２ｄは、ＦＡＤＤの不存在は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）及びインフルエンザウイルス（ＦＬＵ）感染による感染に細胞を感作させることを示す実験データである。図１２ａは、ＥＭＣＶ誘発ＣＰＥに対して保護するのにＦＡＤＤが必要であることを示す。細胞は感染の２４時間後に写真に撮られた（倍率２００倍）。図１２ｂは、（ａ）における如く感染した細胞がトリパンブルー排除により細胞生存度について分析されたことを示す。図１２ｃは、ＥＭＣＶ誘発ＣＰＥに対して保護するのにＦＡＤＤが必要であることを示す。細胞は感染の２４時間後に写真に撮られた（倍率２００倍）。図１２ｄは、（ｃ）における如く感染した細胞がトリパンブルー排除により細胞生存度について分析されたことを示す。 図１３ａ〜１３ｆは、ＩＦＮシグナリングがＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいて破壊されないことを示す実験データである。図１３ａは、ＦＡＤＤの不存在下に正常なＳＴＡＴ１リン酸化を示す。図１３ｂは、ＩＦＮ処理の後のＳＴＡＴ１の核トランスロケーションがＦＡＤＤの不存在下に正常に起こることを示す。図１３ｃは、ＦＡＤＤは、ＩＦＮでトリガーされた遺伝子誘発のために必要ではないことを示す。図１３ｄは、ＩＦＮ応答プロモーターがＦＡＤＤ不存在下に正常に機能することを示す。図１３ｅは、外因性ＩＦＮ−βは、感染後に加えられると、ＶＳＶ誘発ＣＰＥからＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを保護することができることを示す。細胞は感染の４８時間後に写真に撮られた。図１３ｆは、外因性ＩＦＮ−βは、感染後に加えられると、ＶＳＶ複製及びその結果としての細胞死からＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを保護することができることを示す。 図１４ａ及び１４ｂは、ＩＦＮα／β予備処理にもかかわらず、ＶＳＶ感染の後野生型ＭＥＦｓの連続した保護を与えるのに、ＩＦＮ−βの新規な合成が必要であることを示す実験データである。図１４ａは、ＦＡＤＤ＋／−細胞は、ＩＦＮα／β予備処理にもかかわらず、中和性抗ＩＦＮ−β抗血清の存在下に、ＶＳＶに感受性であることを示す。写真は感染の４８時間後に撮られた（倍率、２００倍）。図１４ｂは、（ａ）における如く処理されたＦＡＤＤ＋／−細胞を、ＶＳＶ子孫収率又はトリパンブルー排除による細胞生存度について調べたことを示す。 図１５ａ〜１５ｇは、ＦＡＤＤの不存在下に細胞内ｄｓＲＮＡによる不完全なＩＦＮ−β遺伝子誘発を示す実験データである。図１５ａは、ＩＦＮ−βプロモーターのトランスフェクションされたｄｓＲＮＡ媒介活性化はＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいて不完全であることを示す。図１５ｂは、ＩＦＮ−αのｄｓＲＮＡ誘発産生はＦＡＤＤの不存在下では不完全であることを示す。図１５ｃは、マウス（Ｍ）ＦＡＤＤのＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓへの再構成は、ｄｓＲＮＡシグナリングを部分的に救済することができることを示す。図１５ｄは、カスパーゼ−８は、細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングのために必要ではないことを示す。図１５ｅは、ＰＫＲは細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングのために必要ではないことを示す。ＰＫＲ＋／＋及びＰＫＲ−／−ＭＥＦｓをＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションした。 図１５ｆは、ＦＡＤＤのＲＮＡｉ媒介ノックダウンが細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングを無効にするが、ＰＫＲ又はＴＬＲ３はそうではないことを示す。図１５ｇは、ＴＬＲ３の過剰発現は、細胞外ｄｓＲＮＡに対する応答を与えるが、細胞内ｄｓＲＮＡに対しては与えないことを示す。 図１６ａ〜１６ｅは、ＴＬＲ３シグナリングはＦＡＤＤを必要としないことを示す実験データである。図１６ａは、ＴＬＲ３及び他のＴＬＲシグナリング成分は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいてＩＦＮ−βを正常に誘発することを示す。図１６ｂは、ＴＲＡＦ６欠如は、ＭＥＦｓをＩＦＮの存在下においてＶＳＶ感染を受けやすくしないことを示す。顕微鏡写真は、感染の４８時間後に撮られた。図１６ｃ及び１６ｄは、ＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓがＩＦＮ予備処理によりＶＳＶでトリガーされる細胞死から保護されることを示す。細胞生存度は、感染の４８時間後にトリパンブルー排除分析により決定された。図１６ｅは、ＩＦＮ予備処理がＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓをＶＳＶから保護することを示す。 図１７ａ〜１７ｆは、ＲＩＰ欠失はＦＡＤＤ機能破壊(FADD ablation)によく似ることを示す実験データである。図１７ａは、ＲＩＰ欠如ＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理にもかかわらずＶＳＶ誘発ＣＰＥに非常に感受性であることを示す。図１７ｂは、ＲＩＰ欠失ＥＦｓは、ＩＦＮ予備処理により、ＶＳＶでトリガーされた細胞死から保護されないことを示す。図１７ｃは、ＩＦＮ予備処理はＲＩＰの不存在下にウイルス複製を有効に阻害することができないことを示す。図１７ｄ及び１７ｅは、ＲＩＰの不存在下に不完全な(defective)細胞内ｄｓＲＮＡシグナリングを示す。図１７ｆは、ＴＬＲ３シグナリングのためにＲＩＰが必要ではないことを示す。 図１８ａ〜１８ｊは、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ及びＩＲＦ−３を介するＦＡＤＤシグナルを含む抗ウイルスシグナリングを示す実験データである。図１８ａは、ＩＦＮα／β（１００Uml２１）予備処理のあるなしで野生型又はＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ＩＫＫ−γ及びＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓのＶＳＶ（ＭＯＩ １／４ １０）による感染を示す。図１８ｂは、選ばれた組の抗ウイルス遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析である。図１８ｃは、ポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理の後のＩＦＮ−β産生を示す。図１８ｄは、指示された量のポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理後のＩＦＮ−α産生を示す。図１８ｅは、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−細胞において１時間ポリ（ＩＣ）でトランスフェクションした後のＩＲＦ−３の局在化である。図１８ｆは、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおける不完全なＩＲＦ−３応答プロモーター活性化(defective IRF-3-responsive promoter activation)である。図１８ｇは、ＩＦＮα／β（１００Uml２１）又はＩＦＮ−γ（０．５ng ml２１）予備処理のあるなしでＩｒｆ３＋／＋及びＩｒｆ３−／−ＭＥＦｓのＶＳＶ（ＭＯＩ １／４ １０）による感染である。図１８ｈは、ポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理後のＩＦＮ−β産生を示す。図１８ｉは、ポリ（ＩＣ）によるトランスフェクション後の又はポリ（ＩＣ）単独による処理後のＩＦＮ−αの産生を示す。図１８ｊは、選ばれた組の抗ウイルス遺伝子についてのＤＮＡマイクロアレイ分析である。誤差バーは平均±ｓ．ｄを示す。 図１９ａ〜１９ｃは、ＦＡＤＤ−／−細胞がグラム陽性及びグラム陰性細胞内バクテリアによる感染に対して感受性であることを示す実験データである。図１９ａは、ＦＡＤＤ−／−細胞が、細胞内Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染により誘発されたＣＰＥに対して極めて感受性であることを示す。図１９ｂは、ＦＡＤＤ−／−細胞が、細胞内Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染により誘発された細胞死に対して感受性であることを示す。図１９ｃは、ＦＡＤＤ−／−細胞が、細胞内Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染により誘発されたＣＰＥに対して極めて感受性であることを示す。 乱流受け取り器を有する改変されたエレクトロスプレー装置である。 乱流攪拌を有する改変されたエレクトロスプレーにより製造されたキトサンマイクロ粒子のＥＳＥＭ像である。 ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、ポリ（ＩＣ）の構造式である。 エチジウムホモ二量体の構造式である。 インターカレーションされたエチジウムホモ二量体の蛍光によりポリ（ＩＣ）を測定するための較正曲線を示す。 エチジウムホモ二量体インターカレーターをインターカレーションさせることを使用して束縛されていない及び結合したポリ（ＩＣ）を測定する比較を示す。 （Ａ）溶液中の遊離ポリ（ＩＣ）を測定する； （Ｂ）マイクロ粒子中の結合したポリ（ＩＣ）を測定する。１−イルミネーター、２−検出器、３−フィルター、４−プレートウエル。 エチジウムホモ二量体と相互作用時のポリ（ＩＣ）をロードされたキトサン粒子の時間依存性蛍光を示す。 キトサンマイクロ粒子からのポリ（ＩＣ）の時間放出を示す。 図２８ａ及び図２８ｂは、一価銅のタンパク質及びビシンコニン酸との紫色の錯体を示す。 Ａはペプチド窒素とのビウレット錯体である。 Ｂはビシンコニン酸とのキレート錯体である。 オブアルブミンのビシンコニン酸アッセイのための較正曲全を示す。 キトサンマイクロ粒子からのオブアルブミンの時間放出を表す。 図３１ａ及び図３１ｂは、凍結乾燥されたプロタサン／ポリ（ＩＣ）粒子のＳＥＭ像である。 Ａはミクロンより上のサイズ粒子、Ｘ１００である。バーは２００μmを示す。 Ｂはサブミクロンサイズの粒子、Ｘ５０００である。バーは５μmを示す。 図３２ａ〜図３２ｃは、異なるｐＨにおけるミクロンより上のプロタサン粒子によるポリ（ＩＣ）の収着である。 Ａは収着の結果として減少するポリ（ＩＣ）の光学的スペクトルを示す。 Ｂは、ポリ（ＩＣ）の収着後の粒子のペレットを示す。 Ｃは異なるｐＨにおける粒子の収着容量を示す。 図３３ａ及び図３３ｂは、ＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子の収着特性である。 Ａは、異なる方法により得られた粒子のポリ（ＩＣ）の収着を示す。 Ｂは異なるｐＨにおけるポリ（ＩＣ）の収着を示す。 図３４ａ及び図３４ｂは、後で可溶化を伴う乾燥ステンレス鋼電極に対するエレクトロスプレーにより得られたＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ポリ（ＩＣ）粒子を示す。 Ａは、可溶化後のＳＥＭＸ５０００であり、そして Ｂは、収着容量を示す：高い又は低いイオン強度における可溶化により影響を受けた。 図３５ａ及び図３５ｂは、ＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ポリ（ＩＣ）の粒子を示す。 ＡはＳＥＭ像Ｘ５０００であり、そして Ｂは希釈された水懸濁液の蛍光顕微鏡写真、Ｘ２００である。 ポリ（ＩＣ）を有するＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子によるヒト樹状細胞のＤＣ１及びＤＣ２サブセットにおけるＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αの誘発を示す。 ポリ（ＩＣ）を有するＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子によるヒト樹状細胞のＤＣ１及びＤＣ２サブセットにおけるＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αの誘発を示す。 ポリ（ＩＣ）を有するマイクロ粒子を介する細胞外ＴＬＲ３誘発を示す。 ポリ（ＩＣ）を有するマイクロ粒子を介する細胞外ＴＬＲ３誘発を示す。 末梢ヒト血液サンプル中のＤＣ２がＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサン粒子（融合された(amalgamated)ｄｓＲＮＡを有するか又は有さない）に暴露され、そして粒子への暴露の３〜６時間後のＩＦＮ−α発現について監視されたことを示す。

発明の詳細な説明
本発明は、抗原に対する自然免疫応答をモジュレーションするための方法及び組成物を提供する。この組成物は、ｆａｓ関連デスドメイン分子（ＦＡＤＤ）／ＲＩＰ依存性経路のためのアクチベーターを含有する。ＦＡＤＤを含むシグナリング経路は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）非依存性であることが見出され、それ故、ＦＡＤＤは、Ｉ型ＩＦＮの産生を含む、重要な抗ウイルス応答の誘発のために決定的に重要な細胞内ｄｓＲＮＡ種の認識において機能することにより、ウイルス感染に対する自然免疫において必須の役割を演じ、そしてそのＦＡＤＤは、バクテリア及び真菌の如き他の病原体の認識にも関与している。その結果として、ＦＡＤＤ関連経路(FADD-related pathway)は、殆ど確実に、病原体による破壊(disruption)のための重要なターゲットであり、そして感染性疾患及びガンを含む種々の疾患における重要な役割を演じることができる。

特許請求の範囲に与えられた範囲を含めて、明細書及び特許請求の範囲の明白な且つ首尾一貫した理解を提供するために、下記の定義が与えられる。

以後使用される「抗原提示細胞」とは、抗原をプロセッシングし、そしてＴ細胞受容体に提示することにより細胞免疫応答を媒介する免疫担当細胞の異種グループ(heterogeneous group)を指す。伝統的抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及びＢリンパ球を含むが、それらに限定はされない。濾胞樹状細胞も抗原提示細胞であると考えられる。

「自然免疫応答」は、身体が、微生物、ウイルス、及び身体に対して異物であり、そして潜在的に有害と認識された物質、に対してそれ自体を認識し、そして防御する方法である。自然免疫応答は、広範囲の感染性及び毒性作用物質に対する最初の防御線として機能する。歴史的には、この応答は、ファゴサイトーシス活性を有する細胞、例えばマクロファージ及び多形核細胞、及び／又は強力な細胞傷害性活性を有する細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マスト細胞及び好酸球に帰されてきた。これらの異なる細胞集団の活性は、集約的に急性期タンパク質として知られている多数の異なる可溶性分子、例えば、インターフェロン、補体カスケードの特異的成分及びサイトカインにより支援され(aided)そして支持され(abetted)、これらの分子は、ファゴサイトーシス及び細胞傷害性活性を高める働きをし、そして組織損傷の部位にこれらの細胞を蓄積させる。これらの最初の防御線が突破されると、次いで、適応的免疫応答の活性化が続いて起こり、多数の異なる特徴のいずれかを発揮することができる特異的免疫応答の形成をもたらす。この獲得免疫応答の発生は、リンパ球の専門的特性である。

自然免疫と比較して、適応的免疫は、身体が種々の抗原にさらされるとき発生し、そしてその抗原に対して特異的な防御を構築する。

以後使用される「免疫応答」とは、問題の抗原に対して体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答の哺乳動物対象における発生である抗原を指す。「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な観点は、細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」ｓ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬｓは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりコードされたタンパク質と会合して存在し、そして細胞の表面に発現されたペプチド抗原、に対する特異性を有する。ＣＴＬｓは、細胞内微生物の破壊又はこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘発し、そして促進するのを助ける。

本明細書で使用された「抗原」という用語は、抗体により認識されるいかなる作用物質（例えば、いかなる物質、化合物、分子[巨大分子を含む]又は他の部分(moiety)）をも指すが、「免疫原」という用語は、個体において免疫学的応答を誘発することができるいかなる作用物質（例えば、如何なる物質、化合物、分子[巨大分子を含む]又は他の部分(moiety)）をも指す。これらの用語は、個々の巨大分子を指すか、又は抗原性巨大分子の均質又は不均質集団を指すのに使用されうる。この用語は、１つ以上のエピトープを含有するタンパク質分子又はタンパク質分子の少なくとも１つの部分を包含することが意図される。多くの場合に、抗原は免疫原でもあり、かくして「抗原」という用語は、「免疫原」という用語と相互に交換可能にしばしば使用される。その場合に、この物質は、免疫感作された動物の血清中の適切な抗体の存在を検出するためのアッセイにおいて抗原として使用することができる。

「腫瘍特異的抗原」は、哺乳動物において腫瘍発生の時点で腫瘍細胞中にのみ存在する抗原を指す。例えば、メラノーマ特異的抗原は、メラノーマ細胞においてのみ発現されるが、正常なメラニン細胞では発現されない抗原である。

図２に示されたとおり、ウイルス感染の主要な結果、相当なｄｓＲＮＡ種を発生する事象は、一次自然免疫応答遺伝子、例えばＩＦＮ−βの活性化を含む。ＩＦＮ−βの産生は、抗ウイルス遺伝子を誘発するのみならず、ＮＫ細胞が関与する免疫応答、ＤＣｓの成熟、並びにケモカイン及びＴ細胞応答を促進する分子、例えばＭＨＣのアップレギュレーションを促進する分子も誘発する。

図３に示されたとおり、細胞内及び細胞外ｄｓＲＮＡは多岐シグナリング経路を利用してＩＦＮ−βを誘発する。特に、ウイルス複製の結果として発生した細胞内ｄｓＲＮＡ種は、ＴＬＲ非依存性ＦＡＤＤ関連経路により認識される。簡単に言えば、ウイルスｄｓＲＮＡは細胞内受容体分子により認識され、これは、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１を動員して「インネイテオソーム」複合体('innateosome' complex)とし、ＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３経路を活性化する。ＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３応答性シグナリングカスケードの活性化は、炎症性応答を含む自然及び適応的免疫応答を調節する多数の遺伝子の発現をもたらす。他方、ｄｓＲＮＡ及びＬＰＳを含む細胞外ＰＡＭＰｓは、ＴＬＲ関連経路を介して認識され、これはＮＦ−κＢ、ＥＲＫ／ＪＮＫ及びＩＲＦ−３応答シグナリングカスケードの活性化ももたらする。ウイルス感染に加えて、ＦＡＤＤ依存性経路及びＴＬＲ依存性経路の両方共他の病原体、例えば、バクテリア及び真菌の認識にも関与している（例えば、Imler et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 270: 53-79, (2002)及び実施例６を参照のこと）。

免疫活性化における他の重要な問題は、ＭＨＣ分子によるタンパク質抗原の有効な送達である。図４に示されたとおりＭＨＣ分子への抗原プロセッシング及び送達の経路、細胞質ゾルタンパク質は、プロテオソームにより分解されてペプチド断片を発生し、これは特殊化されたペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）により小胞体に輸送される。ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合された後に、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、小胞体から放出されてゴルジ装置により細胞表面に移行する。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体はＣＤ８Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）に対するリガンドである。細胞外異物抗原は、細胞内小胞、エンドソームに取り込まれる。エンドソーム内のｐＨが次第に下がるにつれて、プロテアーゼが活性化されて、抗原を消化してペプチド断片にする。ＭＨＣクラスＩＩ分子を含有する小胞と融合した後、抗原ペプチドは抗原結合溝に配置される。ロードされたＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は細胞表面に輸送され、そこでそれらはＣＤ４Ｔ細胞のＴＣＲｓにより認識される。更に、図４に示されたとおり、細胞外又は外因性抗原は、ＤＣｓによりファゴサイトーシスされ、このＤＣは、次いでこれらの抗原をリソソーム区画に局在化させ、そこでタンパク質分解酵素が抗原を消化し、そしてプロセッシングする。次いで抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で細胞表面に移動させられ、決してＤＣの細胞質ゾル中にはない。対照的に、ＤＣの細胞質ゾル中に存在する可溶性タンパク質は、プロテアソームにより連続的に分解される。これらの抗原性分子は、小胞体中のクラスＩＭＨＣと組み合わされ、小胞体はそれらを小胞を介して細胞表面に移動させる。

最近、ＭＨＣＩ経路とＭＨＣＩＩ経路の厳密な二分(strict dichotomy)は、外因性タンパク質から発生したペプチドが細胞質ゾルへのアクセスを得ることができ、それ故クラスＩＭＨＣ分子上に提示されることができることを示したいくつかの研究によりチャレンジされた[Roake, et al., J. Exp. Med., 181:2237-2247, 1995; Cumbertach, et al., Immunology, 75:257, 1992; Paglia, et al., J. Exp. Med., 178: 1893-1901, 1993: Porgador, et al., J. Exp. Med., 182:255-260, 1995; Celluzzi, et al., J. Exp. Med., 183:283-287, 1996; Zitvogel, et al., J. exp. Med., 183: 87-97, 1996; Bender, et al., J. Exp. Med., 182:1663-1671, 1995 ]。固体ポリマー微小球(microspheres)に吸収された[Raychaudhuiri, et al., Nat. Biotechnol. 16:1025-1031, 1998］、微小球中にカプセル化された[Maloy, et al., IMMUNOLOGY, 81: 661-667, 1994]、又は抗体との免疫複合体の形態で凝集させた[Rodriguez, et al., Nat. Cell Biol., 1:362-368, 1999]、粒子状形態で送達された抗原は、抗原がクラスＩＭＨＣ上にロードされることを可能とする有効な「交差提示("cross-presentation")」経路をトリガーすることが発見された。

この理解に基づいて、本発明の１つの観点は、細胞内経路及び細胞外経路の両方を交差シグナリングすることができる自然免疫応答をモジュレーションするための組成物を提供する。更に、この組成物は、抗原がクラスＩＭＨＣにロードされることを可能とし、そしてウイルス感染又は腫瘍形成が起こる前にウイルス又は悪性腫瘍抗原に対する免疫反応の発生を可能とする「交差提示」経路をトリガーすることができる。

１つの態様では、組成物は、細胞内ＦＡＤＤ依存性シグナリング経路のための第１モジュレーター及び細胞外ＴＬＲ非依存性シグナリング経路のための第２モジュレーターを含有する。モジュレーターは、専門的ＡＰＣ、例えばＤＣによりファゴサイトーシスされうるキトサンをベースとするマイクロ粒子にロードされる。本明細書で使用した、「ロードされた」という用語は、カプセル化又は表面付着によるマイクロ粒子へのアクチベーターの会合を指す。

ＦＡＤＤ依存性シグナリング経路のモジュレーターの例は、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、例えば、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１、ＦＡＤＤ経路の成分をコードするＤＮＡ、並びにバクテリア、真菌、及びＦＡＤＤ依存性経路を活性化又は抑制することが知られている他の抗原を含むが、それらに限定はされない。

ＴＬＲ依存性シグナリング経路のモジュレーターの例は、ＴＬＲリガンド、例えば、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物及びＬＰＳ；ＴＬＲ依存性経路の成分、例えば、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ、ＴＲＡＭ及びＴＩＲＡＰ／Ｍａｌ、並びにバクテリア、真菌、及びＴＬＲ依存性経路を活性化又は抑制することが知られている他の抗原を含むが、それらに限定はされない。

ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターはＴＬＲ依存性経路のモジュレーターとしても機能することができることに留意されるべきである。故に、本発明の組成物中の第１モジュレーターと第２モジュレーターは同じ分子であってもよい。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、ＦＡＤＤ依存性経路とＴＬＲ依存性経路の両方を活性化することができる。ｄｓＲＮＡがＦＡＤＤ依存性経路のサプレッサーをコードするならば、同じ分子が、ＦＡＤＤ依存性経路を抑制しながら、ＴＬＲ依存性経路を活性化することができる。逆に、もしｄｓＲＮＡがＴＬＲ依存性経路のサプレッサーをコードするならば、同じ分子が、ＴＬＲ依存性経路を抑制しながら、ＦＡＤＤ依存性経路を活性化することができる。

ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターは、ウイルス、バクテリア又は真菌感染により誘発又は抑制される遺伝子産物であることもできる。これに関して、本発明は、ＦＡＤＤ−／−及びＦＡＤＤ＋／＋細胞を使用してＦＡＤＤ依存性経路を介して誘発された抗ウイルス遺伝子、抗バクテリア遺伝子及び抗真菌遺伝子を同定する方法も提供する。図５は、ＦＡＤＤシグナリング経路を介して誘発された抗ウイルス遺伝子を同定するための１つの態様を示す。簡単に言えば、ＦＡＤＤ−／−及びＦＡＤＤ＋／＋細胞をポリ（ＩＣ）で処理する。処理された細胞から単離されたＲＮＡを、遺伝子のＤＮＡアレイにハイブリダイゼーションさせて、ｄｓＲＮＡで誘発された遺伝子を決定する。ｄｓＲＮＡで誘発された遺伝子の発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより更に確認する。

他の態様では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を発生させてｄｓＲＮＡで誘発された遺伝子の発現を阻害し、そしてＲＮＡｉ処理された細胞におけるウイルス感染に対する感受性を検査する。ＲＮＡｉは、相同性ｍＲＮＡの分解を引起すある種の生物及び細胞型へのｄｓＲＮＡの導入の現象である。

ＲＮＡｉは、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初に発見され、そしてそれはそれ以来広範囲の生物で作動することが見出された。近年では、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡｓ（ｄｓＲＮＡ）を使用して特定の転写産物をマークしてｉｎ ｖｉｖｏで分解する、外因性の、有効で強力な遺伝子特異的サイレンシング技術となった。ＲＮＡｉ技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９１９，６１９及びＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＷＯ９９／１４３４６及びＷＯ０１／２９５０８に開示されている。

１つの態様では、本発明の組成物の第１及び第２モジュレーターは、同じｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡをロードされたマイクロ粒子は、ＴＬＲに結合し、そしてＴＬＲ依存性シグナリング経路を活性化するであろう。一方、ｄｓＲＮＡをロードされたマイクロ粒子は、ファゴサイトーシスされ（マクロファージ、ＤＣｓ、単球により）、そしてＦＡＤＤ依存性シグナリング経路を活性化するであろう。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、免疫アクチベーターをコードする。細胞の内側に入ると、ｄｓＲＮＡは開かれ(opened)、そして翻訳されて、自然免疫経路を更に活性化する免疫アクチベーターを産生する。例えば、ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ経路の成分、例えば、細胞に導入されるとＩＦＮ−βのＴＬＲ媒介活性化及び他の自然免疫応答を増大させるＴＲＩＦ又はＩＲＡＫｓをコードすることができる。

他の態様では、第１モジュレーターはｄｓＲＮＡであり、そして第２モジュレーターはＴＬＲ経路の成分及びＴＬＲ経路の成分をコードするＤＮＡ分子である。

他の態様では、第１モジュレーターはＦＡＤＤ依存性経路の成分、例えば、ＦＡＤＤ、又はＦＡＤＤ依存性経路の成分をコードするＤＮＡ分子であり、そして第２モジュレーターはｄｓＲＮＡである。

他の態様では、第１及び第２モジュレーターは、抗原性産物、ＦＡＤＤ経路の成分及び／又は免疫応答を更に高める産物、例えばサイトカイン、のいかなる組み合わせもコードするｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。コードされた産物は、一旦細胞内で発現されると、それぞれ、細胞表面でのＭＨＣＩ又はＭＨＣＩＩ提示のためにエンドソーム経路又はリソソーム経路を介してプロセッシングされるであろう。ｄｓＲＮＡはＦＡＤＤ依存性自然免疫経路を活性化するであろう。このシナリオは、図６に略図で示される。細胞内経路は、免疫応答を促進するのに役割を演じることが提唱されたＰＫＲの活性化もするようである。

更に他の態様では、ｄｓＲＮＡ含有マイクロ粒子は、ＴＬＲ３に対するリガンドで更にコーティングして、ＴＬＲ３経路を活性化するか、あるいはｇｐ９６又はＶＳＶＧタンパク質のような熱ショックタンパク質で更にコーティングして、専門的ＡＰＣｓ、例えば、ＤＣｓをターゲットとすることができる。

他の態様では、マイクロ粒子は、貪食に続いて抑制のための遺伝子をターゲットとすることができるサイレンシングＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡｓ）を表現するｄｓＲＮＡをロードされることができる。１つの態様では、ｓｉＲＮＡは、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、例えばＦＡＤＤの発現を抑制し、そして抗原プロセッシングをダウンレギュレーションする。

他の態様では、組成物は、ポジティブ鎖ウイルス（例えば、ペスチウイルス、ウシ下痢症ウイルス［ＢＶＤＶ］又はアルファウイルスからの）に基づく自己複製性ＲＮＡ（レプリコン）を含有する。これらのＲＮＡ構築物は、バイシストロンであり(bicistronic)、レプリコンＩＲＥＳ機能にとって重要な５’末端ＯＲＦｓからなり、そして翻訳のための天然開始コドンを含有する。異物遺伝子、例えば、インフルエンザウイルス又は他の病原体からの遺伝子は、第２ＩＲＥＳの下流に配置されることができる。レプリコンは、キトサン粒子上にロードすることができ、そしてｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的細胞をターゲットとするのに使用することができる。一旦ファゴサイトーシスされると、レプリコンは、それ自身を高いレベルに再現して、相当なｄｓＲＮＡを発生させることができ、それは、ＦＡＤＤ／ＲＩＰ依存性経路を活性化し、上記したとおりアジュバントとして機能する。更に、レプリコンは、異物遺伝子を翻訳して、抗原を産生し、この抗原はＭＨＣクラスＩ又はＩＩ経路を介してプロセッシングされて、使用される抗原に対して特異的なＣＤ４及びＣＤ８細胞を刺激する。レプリコンは、プロアポトーシス分子(pro-apoptotic molecules)、例えば、カスパーゼを共発現するために使用することができ、又は細胞死を誘発させるための精製されたプロアポトーシス分子（又は精製されたターゲット抗原）を共ロードされることができ、これは抗原提示プロセスを高めることができる。

他の態様では、ｄｓＲＮＡ（上記したとおり）のごとき細胞内又は細胞外ＦＡＤＤ又はＴＯＬＬ活性化分子をロードされたキトサン粒子は、精製された抗原、例えば、インフルエンザウイルス又はプロセッシングされてＣＤ４、ＣＤ８細胞を刺激することができる他の病原体関連分子を共ロードされることができる。

本発明は、ＦＡＤＤ依存性経路及びＴＬＲ依存性経路のモジュレーターのための送達システムとしてポリカチオンマイクロ粒子を利用する。キチン及びキトサン（キチノサン（chitinosanes））は、水素イオンとの会合を介して中性ｐＨで正の電荷を獲得する多数のアミノ基を有する生物分解性ポリマーである（図７）。他のポリマーから作られたマイクロ粒子と比較して、キトサンをベースとするマイクロ粒子は、減少した凝集及び負に帯電した分子、特に核酸のためのより良好なローディング能力を与える。プロタサン、キトサンのより精製されたバージョンは、本明細書では相互に交換可能に使用されるであろう。

本発明の組成物のマイクロ粒子は、３重の目標：送達、身体における（主として）酵素による破壊からの一時的保護及びロードされた生物分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質及びペプチド、モード抗原等）の暴露又は放出、を達成するようにデザインされる。一般に、本発明のマイクロ粒子は、会合したＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質分子をターゲット細胞に入った後に急速に放出又は暴露して、激しい免疫応答を与えるようにデザインされる。しかしながら、ある用途では、会合した分子、例えば、サイトカインを時間依存的方式で放出することが望ましいことがある。

サイトカインの例は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦ；並びにケモカイン、例えば、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−３β、ＳＬＣ、ｆＭＬＰ、ＩＬ−８、ＳＤＦ−１α及びＢＬＣを含むが、それらに限定はされない。

キトサンマイクロ粒子は、当該技術分野で知られた方法を使用して製造することができる。Ravi Kumar et al.[Ravi Kumar, et al., Biomaterials, in press, 2003]は、その表面にＤＮＡを有するキトサンで安定化されたＰＬＧＡカチオンナノ粒子を示し；このＤＮＡは水溶液から簡単な混合により結合され、かくして分子の統合性(integrity)及びコンホメーション(conformation)を保存している。他方、担体溶液との激しい混合を伴う標準エマルジョン技術及びエマルゲーションスキーム(emulgation scheme)も、タンパク質抗原と共にプラスミドのキトサンカプセル化にも適当である[Thiele, et al., J.Controlled Release, 76:59-71, 2001]。これらのプロトコールを利用して、前記したｄｓＲＮＡ及び／又はＤＮＡプラスミドと共にサイトカイン又は熱ショックタンパク質の種々の組を有する粒子を調製することができる。

小さなマイクロ粒子（０．５〜５０ミクロン）を製造するための好ましい方法は、マイクロガン及び改変されたエレクトロスプレー技術であり、これは実施例でより詳細に述べられる。「しわくちゃの紙("crumpled paper")」形状は、タンパク質及び核酸のための高い吸着容量のための高い表面積を有するこれらの粒子を可能とした。

キトサンポリマーは、架橋剤で架橋することができる。架橋剤の例は、無機ポリイオン、例えば、トリポリホスフェート（ＴＰＰ），硫酸ナトリウム及び有機作用物質、例えば、グルタルアルデヒド及びゲニピン(genipin)を含むが、それらに限定はされない。

キトサン粒子中への核酸及び／又はタンパク質のローディングは、核酸及び／又はタンパク質をマイクロ粒子の製造期間中にキトサンと直接混合すること、予備製造されたマイクロ粒子を核酸及び／又はタンパク質溶液で外部的に飽和させること、又はそれらの組み合わせにより達成することができる。実施例で示されたとおり、外部的飽和方法は直接混合法よりも高いローディング効率を与える。しかしながら、２つの方法の組み合わせは、ローディング効率を高めるのに相乗効果を示した。

本発明のマイクロ粒子は、ＡＰＣｓ、例えばＤＣｓ及びマクロファージ並びにそれらの前駆体、例えば、単球により有効にファゴサイトーシスされ、そしてプロセッシングされるのに十分に小さい。好ましい態様では、マイクロ粒子のサイズは、０．５〜７０ミクロンの範囲にあり、更に好ましくは、０．５〜２０ミクロンの範囲にある。例えば、図8は、単球由来のヒトＤＣｓによりファゴサイトーシスされたポリスチレンビーズ、４．５μmを示す[(Thiele et al., J cont. release 76:59-71(2001))

他の態様では、マイクロ粒子のファゴサイトーシス的性質は、親水性キトサンポリマーと１種以上の疎水性ポリマーとの混合物を使用することにより改変される。マイクロ粒子のサイズ及び表面性質のモジュレーションは、ＴＲＲ／ＦＡＤＤ経路の活性化の相対的有効性を制御するための格別の手段となるであろうということが考えられる。ファゴサイトーシスには不適当なより大きく且つより親水性の粒子に切り替えることにより、ｄｓＲＮＡシグナル分子を主としてＴＲＲ表面に暴露することが可能である。ナノサイズのキトサン粒子は、実施例に記載の方法を使用して製造することができる。数百マイクロメートルまでのより大きいキトサン粒子は、Denkbas et al.のプロトコールを使用して合成することができる[Denkbas, et al.,Rreactive & Functional Polymers, 50: 225-232, (2002)]

キトサン粒子からの核酸及び／又はタンパク質の放出速度は、キトサンの分子量、キトサンの脱アセチル化の程度、及びキトサンとロードされた生物分子間の重量／チャージ比(weight/charge ratios)を含むいくつかの因子を調節することにより制御されうる。

１つの態様では、キトサンをベースとする、ｄｓＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質をロードされたマイクロ粒子は、サイトカイン又は抗原を含有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）マトリックス／マイクロ粒子内にカプセル化される。ＰＬＧＡは生物分解性であることが示され、そしてそれは身体から最終的に除去される毒物学的に許容されうる乳酸及びグリコール酸に分解する。サイトカイン及びキトサン粒子の放出速度は、モノマー比／ＰＬＧＡの分子量を含む、ＰＬＧＡカプセル化に関与するパラメーターを調節することにより更に制御されうる。キトサン／プロタサン（protasan）は親水性であるので、より疎水性のＰＬＧＡ中にキトサン／プロタサン粒子をカプセル化することにより、細胞膜を横切る細胞への粒子の取り込みは高められうる。

あるいは、他のタイプのポリマーを、キトサンをベースとするマイクロ粒子に組み込んで、ロードされた生物分子のための可変放出プロフィルを達成することができる。１つの例では、疎水性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡをより親水性のキトサンとブレンドして、カチオンＰＬＧＡ粒子を形成することができる。他の適当なポリマーは、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（オキシブチレート）を含むが、それらに限定はされない。

他の別法として、分岐した両親媒性ポリアミン、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を、ＰＬＧＡ又は他の疎水性ポリマーとの組み合わせでキトサンの代わりに使用することができる（図９）。

キトサン粒子へのより疎水性のドメインの付加は、細胞膜を横切る輸送を促進することができる。他の例は、Liu et al.により述べられたとおり[Liu, et al., k. J. Controlled Release, 43:65-74, 1997]、ポリカチオンキトサンにポリアニオンアルギン酸ナトリウムを添加することにより多孔性粒子を形成することを含む。ポリマーの比を調節することにより、細孔のサイズを制御し、それ故粒子からのｄｓＲＮＡ／サイトカインの放出速度を制御することができる。

本発明は、送達ビヒクルとしてカチオンリポソームを使用することも意図する。カチオンリポソームは、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びペプチドのための良好な担体である[Honda, et al., J. Virol. Meth., 58: 41-58, 1996; Nastruzzi, et al., J. Controlled Release, 68: 237-249, 2000; Borgatti, et al., Biochemical Pharmacology, 64: 609-616, 2002; Sioud, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 312:1220-1225; 2003]。一般に、リポソームは、合理的な放出速度論と共にＲＮＡのためのより適切な保護及びより良好な安定化を与える。ファゴサイトーシス、表面電荷及び親水性に関する考慮はリポソームにそのまま適用可能である。リポソームを使用して、ｄｓＲＮＡ及びそその免疫原性代替物、例えば、ポリ（ＩＣ）又はポリ（ＩＣＬＣ）を、小胞(vesicle)中にカプセル化するか及び／又は表面に付着させることができる。脂質カチオン粒子のファゴサイトーシスは、リポソーム表面の疎水性のため親水性コロイドキトサン粒子の場合よりもより顕著でありうる。脂質粒子の適切な１〜５μmサイズを制御してファゴサイトーシスを高めることに特別の注意が払われるであろう。

１つの態様では、ファゴサイトーシスを介して内部ＦＡＤＤ経路を刺激するためにリポソーム担体が使用されるが、これに対してｄｓＲＮＡを表面ＴＬＲｓに暴露する表面担体として、大きなキトサンマイクロ粒子が使用される。多くの組み合わせをもくろむことができる。

中心にｄｓＲＮＡを、そして表面にタンパク質ＨＩＶ抗原を有するリポソーム様構造を使用してウイルス様粒子を創り出すことも可能である[Karpenko, et al., Vaccine, 21: 386-302, 2003]（図１０）。図１０は、（１）酵母ｄｓＲＮＡ、（２）スペルミジン−ポリグルシン(polyglucin)−グルタチオンコンジュゲート及び（３）ハイブリッドタンパク質ＴＢＩ−ＧＳＴを含む人工的ウイルス様粒子を示す。１つの態様では、表面にｄｓＲＮＡを、そして中心にタンパク質抗原を有する逆粒子を創り出す。

１つの態様では、交差シグナリング自然免疫経路は、ファゴサイトーシスを受けるマイクロ粒子中にカプセル化されたバクテリア又は真菌で達成される。データは、ＴＬＲ経路はグラム陽性菌に対する宿主防御に影響を与えるが、これに対してｉｍｄ（ＦＡＤＤ）経路は、グラム陰性菌及び真菌に対する活性を及ぼすことを示す。

他の態様では、交差シグナリング自然免疫経路は、ファゴサイトーシスを受けるマイクロ粒子にカプセル化された腫瘍抗原又は腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドにより達成される。

本発明の化合物及び方法の好ましい態様は、説明することを意図しており、限定することを意図しない。修飾(modifications)及び変異(variations)は、上記教示に照らして当業者によりなされうる。本発明を、ガスサンプル中のアセトンレベルを測定するという他の目的、例えば空気品質を監視するために使用することができることも、当業者には考えられうる。故に、特許請求の範囲により定められるとおりに記載されているその範囲内にある開示された特定の態様において変更(changes)がなされうることは理解されるべきである。

本発明のなお更なる観点は、本発明の免疫活性化組成物を使用して種々の疾患を予防又は処置する方法に関する。

1つの態様では、本発明の組成物は、感染性疾患の予防又は処置のために哺乳動物に投与される。感染性疾患の例は、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；インフルエンザウイルス（ＩＮＶ）；脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、パラインフルエンザウイルス；ライノウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；アプトウイルス(apthovirus)；コクサッキーウイルス；風疹ウイルス；ロタウイルス；デンクウイルス(Denque virus)；黄熱ウイルス；日本脳炎ウイルス；感染性気管支炎ウイルス；ブタ伝染性胃腸炎ウイルス；呼吸器合胞体ウイルス；パピローマウイルス；単純ヘルペスウイルス；水痘ウイルス(varicellovirus)、サイトメガロウイルス；痘瘡ウイルス；ワクシニアウイルス；スイポックスウイルス及びコロナウイルスにより引起される疾患を含むが、それらに限定はされない。

感染性疾患の更なる例は、微生物、例えば、Actinobacillus actinomycetemcomitans; Bacille Calmette-Gurin; Blastomyces dermatitidis; Bordetella pertussis; Campylobactor consisus; Campylobacter recta; Candida albicans; Capnocytophaga sp.; Chlamydia trachomatis; Eikenella corrodens; Entamoeba histolitica; Enterococcus sp.; Escherichia coli; Eubacterium sp.; Haemophilus influenzae; Lactobacillus acidophilus; Leishmania sp.; Listeria monocytogenes; Mycobacterium vaccae; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria meningitidis; Nocardia sp.; Pasteurella multocida; Plasmodium falciparum; Porphyromonas gingivalis; Prevotella intermedia; Pseudomonas aeruginosa; Rothia dentocarius; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Serratia marcescens; Shigella dysenteriae; Streptococcus mutants; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Treponema denticola; Trypanosoma cruzi; Vibrio cholera; 及びYersinia enterocoliticaにより引起される疾患を含むが、それらに限定はされない。

他の態様では、本発明の組成物は、ガンの処置のために哺乳動物に投与される。ガンの例は、乳ガン、結腸−直腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、皮膚ガン、骨ガン(osteocarcinoma)及び肝臓ガンを含むが、それらに限定はされない。

本発明は、更に、ＦＡＤＤアクチベーター及び薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、皮下に、非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、経皮的に、腹腔内に又は肺への吸入又はミストスプレー送達のどれかにより投与することができる。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）又はそれらの適当な混合物及び／又は植物油、固体マイクロ粒子又はリポソームを含有する溶媒又は分散媒質であることができる。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用、ディスパージョンの場合には必要な粒子サイズの維持及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗バクテニア剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により行うことができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいことがある。吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物において使用することにより、注射可能な組成物の長期の吸収をもたらすことができる。

水性溶液における非経口投与のためには、例えば、溶液は必要ならば適当に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は最初に十分な塩又はグルコースにより等張性とされる。これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内及び腹腔内投与に特に適当である。これに関連して、使用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。例えば、１用量(one dosage)を等張性ＮａＣｌ溶液１ml中に溶解させ、そして大量皮下注射流体(hypodermoclysis fluid)１０００mlに加えるか、又は提唱された注入部位に注射することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Science" 15^th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580）。用量のいくらかの変動は、処置される対象の条件に依存してやむを得ず行われるであろう。いずれにせよ、投与の責任者が、個々の対象について適当な服用量(dose)を決定する。更に、ヒト投与では、製剤は、FDA Office of Biologics標準により要求される、無菌性、発熱原性(pyrogenicity)、一般的安全性及び純度標準を満足する必要がある。

無菌注射液は、必要に応じて上記に列挙された種々の他の成分と共に適当な溶媒中に必要な量で活性化合物を加え、続いてろ過滅菌することにより製造される。一般に、ディスパージョンは、基本的分散媒体及び上記に列挙された成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に種々の滅菌された活性成分を加えることにより製造される。無菌の注射液の製造用の無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を、先に無菌ろ過されたそれらの溶液から生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。本発明のマイクロ粒子は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Chiron, Corp. Emeryville, CA）を使用して表皮に投与することもできる。Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔの送達技術は、ヘリウムガスジェット内で超音速に微細な粒子を加速することにより働き、そして医薬及びワクチンを苦痛なしに又は針を使用しないで、皮膚及び粘膜注射部位に送達する。

本明細書に開示された組成物は、中性又は塩形態で配合することができる。薬学的に許容されうる塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成された）を含み、該酸付加塩は、無機酸、例えば塩酸又はリン酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の如き有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の如き有機塩基から誘導することもできる。処方(formulation)されると、溶液は、投与処方(dosage formulation)に適合性の方式で且つ治療的に有効であるような量で投与されるであろう。配合物(formulations)は、注射液、薬物放出カプセル等の如き種々の投与形態で容易に投与することができる。

「薬学的に許容されうる」又は「薬理学的に許容されうる」という語句は、ヒトに投与されるときアレルギー反応又は同様な都合の悪い反応を生じない分子実体(molecular entities)及び組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の製造は、当該技術分野で周知されている。典型的には、このような組成物は、注射可能な液体溶液又は懸濁液として製造され、注射の前に液体に溶解又は懸濁させるのに適当な固体形態も製造されうる。

本明細書で使用された「治療的に有効な量」という用語は、器官又は組織における所望の治療効果又は予防効果を少なくとも部分的に達成するその量である。ＦＡＤＤ欠失関連疾患（例えば感染性疾患及びガン）又は状態の予防及び／又は治療処置をもたらすのに必要なＦＡＤＤアクチベーターの量は、それ自体固定されていない。有効量は、使用される組成物の本質及び形態、必要とされる保護の程度又は疾患の重篤性又は処置されるべき状態に必ず依存する。

本発明を下記の実施例により更に説明するが、該実施例は限定するものとみなすべきではない。本願全体にわたり引用されたすべての参考文献、特許及び公開された特許出願並びに図及び表は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＦＡＤＤ欠如繊維芽細胞はウイルス感染に対して感受性である。
ＦＡＤＤを欠いたマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）はウイルス感染に対して超感受性であるらしいと観察される[Balachandran, et al., J.Virol., 74:1513-1523, 2000]。この表現型を更に検査するために、ＩＦＮ感受性、原型ラブドウイルス水痘性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を使用するＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおけるウイルス複製の詳細な分析を行った。

簡単に言えば、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理のあるなしで、ＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）を感染させ、そして顕微鏡写真を感染の４８時間後に撮った。感染の後、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいてＶＳＶ複製が有意に増加した（＞１００倍）ことが観察され、これは付随的にその野生型対応物と比べて速い細胞溶解を受けた（図１１ａ）。

更に、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＭＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）予備処理のあるなしで、ＶＳＶ（m.o.i.＝５）を感染させ、そして顕微鏡写真を感染の４８時間後に撮った。Ｉ型（α／β）又はＩＩ型（γ）ＩＦＮによる１２時間のＭＥＦｓの処置は、正常な細胞における有意な抗ウイルス活性を発揮すると思われたが、予想されたように、これらの重要な抗ウイルスサイトカインは、２４時間までの間ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにおいてウイルス複製の開始を遅らせただけであり、その後、ウイルス複製は抑制されないで進行した（図１１ｂ−ｅ）（図１１ｃにおいて、感染後の指示された時間に、培地をＢＨＫ細胞に関する標準プラークアッセイにより子孫ウイルスの存在を検査した）。観察された感染に対する感受性は、ＶＳＶに限定されなかった。何故ならば、ＦＡＤＤを欠いた細胞は、インフルエンザウイルス（ＩＮＶ）及び脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を含む他のウイルス型にも感受性であったからである（図１２）。これらのデータは、ＦＡＤＤがウイルス感染に対する宿主防御において役割を発揮することを示すので、観察された抗ウイルス活性が規定カスパーゼ８依存性シグナリング経路により支配されているかどうかに関して更なる調査を行った[Muzio, et al., Cell, 85: 817-827, 1996]。しかしながら、カスパーゼ８を欠くＭＥＦｓは、コントロール細胞に比べてＶＳＶ感染に対する過剰な感受性を示さず、ＩＦＮの抗ウイルス効果に応答する能力を保持していた（図１１ｆ）。図１１ｆにおいて、ＩＦＮ予備処理は、カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＥＦｓの両方においてＶＳＶ複製を有意に阻害する。カスパーゼ−８＋／＋及び−／−ＭＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）予備処理のあるなしで、ＶＳＶ（m.o.i.＝５）を感染させた。感染後の指示された時間に、培地をＢＨＫ細胞に関する標準プラークアッセイにより子孫ウイルスの存在を検査した。図１１は、ＦＡＤＤがカスパーゼ−８非依存性経路をとおして抗ウイルス活性を発揮することを証明する。

実施例２：ＩＦＮシグナリングはＦＡＤＤの不存在下に欠如しない
Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮへの暴露は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをウイルス複製から完全に保護することはできなかったので、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路による効果的なＩＦＮシグナリングは、活性のために機能的ＦＡＤＤを必要としうることはもっともと思われた。ＩＦＮ媒介シグナリングにおけるＦＡＤＤの潜在的要求を分析するために、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮで処理し、そして重要なＩＦＮシグナルトランスデューサーＳＴＡＴ１の発現及び活性を測定した[Levy, et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3: 651-662, (2002)]。

しかしながら、Ｙ７０１のリン酸化もＩＦＮ媒介シグナリングも必要ではなく、ＳＴＡＴ１のその後の核トランスロケーションはＦＡＤＤ−／−細胞において害されないようである（図１３ａ−ｃ）。図１３ａでは、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、指示された時間ＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）で処理し、ＳＴＡＴ１ホスホ−トリオシン７０１特異的抗体(STAT1 phospho-tryosine 701-specific antibody)を使用するイムノブロッティングにより、ＳＴＡＴ１リン酸化状態を決定した。図１３ｂでは、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）により又はＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）なしで１時間処理し、そしてＳＴＡＴ１局在化をＧＦＰ蛍光顕微鏡法により決定した。図１３ｃでは、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５mg/ml）のあるなしで１8時間処理した。これらの細胞から調製された溶解物を、指示されたＩＦＮで誘発されたタンパク質についてイムノブロット分析に付した。

同様に、ＩＲＦ−１、ＰＫＲ及びＳＴＡＴ２を含む選ばれたＩ型及びＩＩ型ＩＦＮで誘発された遺伝子のＩＦＮに応答する発現は、ＦＡＤＤ−／−細胞では影響を受けなかったようである[Der, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 15623-15628, 1998]。最後に、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＳＲＥ）又はＩＩ型（ＧＡＳ）の制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ＩＦＮで処理されたＦＡＤＤ−／−細胞にトランスフェクションされると正常な活性を示した（図１０ｄ）。図１３ｄでは、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをインターフェロンで刺激される応答エレメント（ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ）又はインターフェロンガンマアクチベート配列（ＧＡＳ−Ｌｕｃ）の制御下にルシフェラーゼを発現するプラスミドでトランスフェクションした。２４時間後、細胞をＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）のあるなしで刺激し、そしてルシフェラーゼ活性を処理の１８時間後に測定した。これらの観察は、ＩＦＮシグナリング自体はＦＡＤＤの不存在下で弱められないことを示す。

実施例３：ＦＡＤＤの不存在下における細胞内ｄｓＲＮＡによるＩＦＮ−βの欠如した誘発
実施例１及び２における観察にもかかわらず、外因性ＩＦＮへの１２時間の暴露により最初に確立された抗ウイルス状態は、短命であり、多分ウイルス感染の後絶え間ない新規な合成を必要とすることはもっともと思われる（図１１ａ）。例えば、ＶＳＶ感染の後にＦＡＤＤ−／−細胞の培地への組換えＩＦＮ−βの絶え間ない補充は細胞を細胞溶解から保護することが認められた（図１３ｅ−１３ｆ）。図１３ｅにおいて、ＩＦＮで処理したＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させ、次いでＩＦＮ−β（５００U／ml）のあるなしで処理した。細胞を感染の４８時間後に写真に撮った。図１３ｆにおいて、ＩＦＮで処理したＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓをＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させ、次いでＩＦＮ−β（５００U／ml）のあるなしで処理した。細胞生存性及びウイルス子孫収率を感染の４８時間後に測定した。

ＩＦＮ産生が常に必要であることは、正常な細胞のＶＳＶ感染の後、分泌されたＩＦＮ−βの抗体媒介中和が、ウイルス感染に対する感受性を再び引起す（図１４ａ及び１４ｂ）ことを証明することにより更に強調された。図１４ａでは、ＦＡＤＤ＋／−細胞をＩＦＮα／β（５００U／ml）で処理し、又は未処理のままにした。次いでこれらの細胞をＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させ、そして中和性抗ＩＦＮ−β抗血清の存在下又は不存在下に更に４８時間インキュベーションした。感染の４８時間後に写真を撮った（倍率、２００倍）。図１４ｂでは、図１４ａと同じく処理されたＦＡＤＤ＋／−細胞をＶＳＶ子孫収率又はトリパンブルー排除による細胞生存性について検査した。

これらの分析は、ウイルス感染後のＩＦＮ−βの産生の欠如は、ウイルス感染に対するＦＡＤＤ−／−細胞の感受性を説明するかもしれないことを示した。この可能性を検査するために、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−細胞をＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクションし、次いでウイルス感染後のＩＦＮ産生の一次トリガーであると考えられるポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物、を投与した[Kerr, et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 299:59-67, 1982]。簡単に言えば、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、ヒトＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードするプラスミドでトランスフェクションした（ＩＦＮ−β−Ｌｕｃ）。２４時間後、これらの細胞を、ポリ（ＩＣ）のみ[５０μg/ml]、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]又はＬＰＳ（５ml／ml）で処理し、そしてルシフェラーゼ活性を処理後６又は２４時間目に測定した。データは、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）は、ＦＡＤＤ＋／−細胞においてＩＦＮ−βプロモーターの強い（＞１０倍）誘発をトリガーしたが、ＦＡＤＤを欠く細胞ではトリガーしなかったことを示す（図１５ａ）。

更に、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、ポリ（ＩＣ）のみ[５０μg/ml]、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]又はＬＰＳ（５mg／ml）で処理し、そして上清中のＩＦＮ−αを処理の６又は２４時間後にＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）により測定した。トランスフェクションされたｄｓＲＮＡ及びＶＳＶに応答するＩＦＮ産生の欠陥(defect)は、ＩＦＮ産生に特異的なＥＬＩＳＡの後のＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓにおいて確認された（図１５ｂ、そしてデータは示されていない）。

図１５ｃにおいて、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３Ｎｅｏ）又は完全長ｍＦＡＤをコードするｐｃＤＮＡ３Ｎｅｏによりトランスフェクションした。２４時間後に、細胞をポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６又は２４時間後に測定した。結果は、ＩＦＮ−βのポリ（ＩＣ）で誘発された活性化の回復は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにマウス（ｍ）ＦＡＤＤを一過性にトランスフェクションすることにより達成されうることを示す（図１５ｃ）。

更に、カスパーゼ−８＋／＋及びＰＫＲ−／−細胞をＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションした。２４時間後に、これらの細胞をポリ（ＩＣ） [リポフェクタミン２０００中の４mg/ml] でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６時間後に測定した。ポリ（ＩＣ）で誘発されたＩＦＮ−β誘発の欠如は、カスパーゼ−８欠如ＭＥＦｓ(caspase-8 deficient MEFs)において明らかではなかった（図１５ｄ）。ＩＦＮ−βの誘発はトランスフェクションされていない外因性ポリ（ＩＣ）のみを使用して強くは観察されなかったので、正常なＭＥＦｓにおいて観察されたＩＦＮ誘発は、殆ど確実に、細胞内ｄｓＲＮＡ認識成分が関与し、そしてＴＬＲ３非依存性であると結論することができる（図１５ａ−ｂ）。しかしながら、シグナリングは、ｄｓＲＮＡで活性化された分子ＰＫＲが関与しないらしく、何故ならば、このキナーゼを欠いたＭＥＦｓは、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡに応答してＩＦＮ−β誘発を保持していたからである（図１５ｅ−ｆ）。図１５ｅにおいて、ＰＫＲ＋／＋及びＰＫＲ−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションした。２４時間後、これらの細胞をポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６時間後に測定した。

図１５ｆでは、ＦＡＤＤのＲＮＡｉ媒介ノックダウンは、細胞内ｄｓＲＮＡシグナリング経路を無効にするが、ＰＫＲ又はＴＬＲ３はしなかった。ＨｅＬａ細胞をｍＦＡＤＤ、ｈＦＡＤＤ、ＰＫＲ又はＴＬＲ３からのｓｉＲＮＡ配列で処理し、そしてそれぞれの遺伝子産物のノックダウンを、イムノブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲにより確認した（データは示されていない）。次いで、これらの細胞をＩＦＮ−β−Ｌｕｃでトランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）（リポフェクタミン２０００中の４mg/ml）でトランスフェクションした。６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

更に、ＶＳＶで感染したＰＫＲ欠如マウスが、ＩＦＮ−βを誘発する強い能力を保持していた（図１５）。観察されたウイルス／ｄｓＲＮＡ媒介活性はＴＬＲ３シグナリングをとおして説明することはできなかった。例えば、我々は、ＭＥＦｓ、ＨｅＬａ及び２９３Ｔ細胞において殆どＴＬＲ３活性を見出さなかった（図１５ｆ−ｇ）。ＨｅＬａ細胞において、ＦＡＤＤのみのｉＲＮＡ媒介欠乏(iRNA-mediated depletion)が、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）に応答してＩＦＮ−βプロモーター活性の殆ど完全な妨害をもたらし、ＰＫＲ又はＴＬＲ３（又は同時に両方）はそうではなかった（図１５ｇ）。図１５ｇにおいて、ＨｅＬａ又はＴＬＲ３を、ＴＬＲ３をコードするプラスミドでトランスフェクションし、そして発現をフローサイトメトリーにより確認した（左）。次いでこれらの細胞を、ＩＦＮ−β−ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）のみ[５０μg/ml]で処理するか又はポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]でトランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を６時間後に測定した。

かくして、これらのデータは、真核細胞においてＴＬＲ３／ＰＫＲ非依存性ｄｓＲＮＡシグナリング経路を推論させるであろう。ＦＡＤＤ媒介抗ウイルス活性の性質を更に詳しく調べるために、ＩＦＮ−βプロモーター活性化に関与した頂点シグナリングカスケード(apical signaling cascades)の各々、即ち、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−1及びＩＲＦ３を個々に活性化するためのＶＳＶ又はポリ（ＩＣ）の能力を調べた[Agalioti, et al., Cell, 103: 667-678,2000; Thanos, et al., Cell, 83:1091-1100, 1995]。これらの３つの転写因子の各々に応答するレポーター構築物を使用して、非常に少ないＩＲＦ活性及び適度のＡＰ−１／ＮＦ−κＢ活性が、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡに応答して正常なＭＥＦｓにおいて検出された。結果は、多分、これらの細胞型をトランスフェクションすることにおける固有の困難及び個々のプロモーターの弱い活性による（データは示されていない）。しかしながら、ＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の強いシグナリングが、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）に応答して観察され、これは、ＦＡＤＤの不存在下に明らかに弱くなったように見えた（図１３ｆ）。かくして、ＦＡＤＤ媒介シグナリングは、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化に関与する。

実施例４：ＦＡＤＤの不存在下の正常なｔｏｌｌ受容体シグナリング
ＴＬＲ３は細胞外ｄｓＲＮＡの認識に関与しており、これはＩＲＡＫファミリーメンバー及びＴＲＡＦ６の活性化をとおしてＩＦＮ−βの誘発をもたらすことができる[Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-738, 2001]ことが最近示された。ＦＡＤＤがＴＬＲ媒介シグナリングにおいて重要な役割を果たしているかどうかを更に明らかにするために、ＦＡＤＤ＋／−及び−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−β−ルシフェラーゼレポーター構築物及びＴＬＲシグナリング経路の種々の成分（例えば、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−Ｍ、ＩＲＡＫ−１、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ／ＭＡＬ、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１及びＴＲＡＦ６）をコードするプラスミドでトランスフェクションし、その多くは一過性過剰発現の後にＩＦＮ−β遺伝子発現を誘発することが示された[Akira, J. Biol. Chem., 278:38105-38108, 2003]。しかしながら、ＩＦＮ−βのＴＬＲ媒介誘発の抑止は、ＦＡＤＤ欠如細胞では観察されなかった（図１６ａ）。図１６ａでは、指示されたＴＬＲシグナリング成分をコードするプラスミドを、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓにＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に共トランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの２４時間後に測定した。更に、ＴＬＲ３、ＴＲＩＦ及びＩＲＡＫ１過剰発現は、ＦＡＤＤ含有ＭＥＦｓ及びＦＡＤＤを欠いているＭＥＦｓの両方において、ＩＦＮ−βプロモーター活性の＞１０倍増加を刺激することができた（データは示されていない）。これらの結果は、ＴＲＩＦ欠如ＭＥＦｓは、ＦＡＤＤ−／−とは違って、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡに応答してＩＦＮ−βを誘発する能力を保持していたことを証明することにより立証された。

これらの発見を更に確認するために、ＩＦＮ−βのＮＦ−κＢ／ＡＰ−１活性化をモジュレーションすることを担当するＴＬＲ活性の重要な下流中間体[Wu et al., Bioessays, 25:1096-1105(2003)]、抗ウイルス免疫におけるＴＲＡＦ６の役割を調べた。従って、ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−繊維芽細胞を、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）で感染させた。しかしながら、ＦＡＤＤ−／−細胞と違って、ＩＦＮへの暴露は、野生型コントロール細胞と同様なＶＳＶ感染に対してＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓを有効に保護したことが見出された（図１６ｂ）（顕微鏡写真は感染の４８時間後に撮られた）。次に、細胞内ポリ（ＩＣ）のＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓにおけるＩＦＮ−βプロモーターを活性化する能力を調べた。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）で感染させた。細胞生存度を感染の４８時間後にトリパンブルー排除により決定した。この分析は、トランスフェクションされたポリ（ＩＣ）がＴＲＡＦ６の不存在下にＩＦＮ−βを活性化する能力を保持していたことを示し、これは、このアダプター分子が多分、ＦＡＤＤ媒介ｄｓＲＮＡ細胞内シグナリング(FADD-mediated dsRNA-intracellular signaling)において役割を演じないことを示す（図１６ｃ−ｄ）。

更に、他のＴＬＲ経路におけるＦＡＤＤの重要な役割は観察されなかった（データは示されていない）。ＴＬＲ3及びＩＲＡＫ１がＴＲＡＦ６−／−の不存在下にＩＦＮ−β誘発を媒介することができないことを証明することは、ＦＡＤＤがＴＬＲ３／ＴＲＡＦ６及びＴＲＩＦ経路とは独立に機能することを総合的に示すであろう（図１６ｅ）。図１６ｅは、ＩＦＮ予備処理が、ＴＲＡＦ６−／−ＭＥＦｓをＶＳＶから保護することを示す。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させた。この実験では、培地を、ＢＨＫ細胞に関する標準プラークアッセイによる感染の４８時間後の子孫ビリオン(progenyl virion)の存在について調べた。ＴＲＡＦ６の不存在下の正常な細胞内ｄｓＲＮＡシグナリング。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃで２４時間トランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]で６時間トランスフェクションし、その後ルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＬＲ３及びＩＲＡＫ−１はＩＦＮ−β遺伝子誘発のためにＴＲＡＦ６を必要とする。ＴＲＡＦ６＋／＋及びＴＲＡＦ６−／−ＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−１又はＴＲＡＦ６をコードするプラスミドでトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。

実施例５：哺乳動物ＩＭＤ様経路は抗ウイルス自然免疫を与える。
データは、ＦＡＤＤはウイルス感染に対する自然免疫において重要な役割を演じ、そしてＴＲＡＦ６媒介ＴＬＲ３経路から独立であることを示す。更に、ＦＡＤＤは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるバクテリア感染に応答する自然免疫に関与していることが最近報告された。[Leulier, et al., Curr.Biol., 12: 996-1000, 2002; Naitza, et al., Immunity, 17: 575-581, 2002]。これらの生物では、免疫不全（ｉｍｄ）遺伝子産物、哺乳動物デスドメイン含有キナーゼのＤｒｏｓｏｐｈｌａホモログ、ＲＩＰは、ｄＦＡＤＤと会合してＮＦ−κＢ関連経路の活性化及びその後の抗バクテリア遺伝子の誘発をトリガーする[Hoffmann, Nature, 426:33-38, 2003]。ＦＡＤＤが関与するＩＭＤ様経路が哺乳動物細胞中に存在するかどうかを決定するために、ＩＦＮで処理された又は未処理のＲＩＰ−／−ＭＥＦｓをＶＳＶ（ＭＯＩ＝５）で感染させた。図１７ａは、ＲＩＰ−／−細胞ではＶＳＶで誘発された細胞溶解を示すが、コントロールでは示さない。この実験では、ＶＳＶで誘発された細胞溶解は、ＦＡＤＤ−／−ＭＥＦｓと同様、ＩＦＮの存在下ですら観察された。

図１７ｂ及び１７ｃに示されたとおり、野生型ＭＥＦｓに比べてＩＦＮで処理されたＲＩＰ−／−ＭＥＦｓにおいて約１０〜５０倍多くのＶＳＶが発生し、インフルエンザウイルス又はＥＭＣＶによる感染の後、同様な結果が得られる。図１７ｂでは、ＦＡＤＤ＋／−及びＦＡＤＤ−／−ＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させた。感染後の指示された時間に、培地を子孫ビリオン産生について調べた。図１７ｃでは、ＲＩＰ＋／＋及び−／−ＥＦｓを、１８時間のＩＦＮα／β（５００U／ml）又はＩＦＮ−γ（５ng/ml）予備処理の存在下又は不存在下にＶＳＶ（m.o.i.＝５）で感染させた。感染後の指示された時間に、培地を子孫ビリオン産生について調べた。

更に、ＲＮＡｉを使用してＲＩＰ発現が抑止されたＲＩＰ欠如ＭＥＦｓ及びＨｅＬａ細胞は、ＩＦＮ−βプロモーターの細胞内ｄｓＲＮＡ媒介シグナリングに選択的に応答不能及び完全な応答不能を示した（図１７ｄ−ｅ）。図１４ｅでは、ＲＩＰ＋／＋及び−／−ＥＦｓ（左）又はＲＩＰがＲＮＡｉにより特異的にノックダウンされた（右）ＨｅＬａ細胞を、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃで２４時間トランスフェクションし、次いでポリ（ＩＣ）[リポフェクタミン２０００中の４mg/ml]で６時間トランスフェクションし、その後ルシフェラーゼ活性を測定した。図１７ｆにおいて、ＲＩＰ＋／＋及び−／−ＥＦｓを、ＩＦＮ−β−Ｌｕｃと共に、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−１又はＴＲＡＦ６をコードするプラスミドでトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。これらの結果は、ＴＬＲ３、ＩＲＡＫ−１、ＴＲＡＦ６及びＴＲＩＦは、ＲＩＰ−／−ＭＥＦｓにおける一過性の過剰発現の後、ＩＦＮ−βプロモーター活性を強く誘発することができることを示し、これは、細胞内及び細胞外ｄｓＲＮＡが様々なシグナリング経路を利用してＩＦＮ−βを誘発させるという更なる証拠を与える。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、ＩＫＫ−β／ＩＲＤ5及びＩＫＫ−γ／ＫｅｎｎｙからなるＩ−κＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を介したＮＦ−κＢ相同体Ｒｅｌｉｓｈ(NF-κB homologue Relish)の活性化をとおして抗バクテリア遺伝子発現の誘発を刺激するのにｉｍｄ及びｄＦＡＤＤが必要とされる。哺乳動物細胞において、ＩＦＮ−βの誘発は、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３の活性化も伴う。図１８ａにおいて、野生型、又はＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ＩＫＫ−γ及びＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓを、ＩＦＮα／β（１００Ｕｍ１２１）予備処理のあるなしでＶＳＶ（ＭＯＩ １／４ １０）で感染させた。結果は、ＩＦＮによる予備処理は、ウイルス感染に対するＩＫＫ−α、−β又は−γを欠いているＭＥＦｓを有効に保護することができたことを示す（図１８ａ）。この研究は、Ｔａｎｋ結合キナーゼ１（ＴＢＫ−１）／ＩＫＫ−δを欠いているＭＥＦｓを調べることにより補充された。何故ならば、この分子は、ＭＥＦｓにおいて一次ＩＲＦ−３キナーゼであると思われるからである。この実験は、ＦＡＤＤ−／−及びＲＩＰｋ１−／−繊維芽細胞と同様に、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ欠如細胞は、ＩＦＮによる予備処理の後ですらウイルス複製及び細胞溶解に対して保護されないことを示した（図１８ａ）。

ＦＡＤＤ−／−細胞と同様に、これらの結果は、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓにおけるＩ型ＩＦＮ誘発の欠如により説明されうる。ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡ分析は、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δの不存在下では、Ｉ型ＩＦＮのｄｓＲＮＡ応答誘発及び他の抗ウイルス遺伝子もひどく害されることを確認した（図１８ｂ−ｄ）。これらの結果は、ＦＡＤＤが主としてＩＲＦ−３のＴＢＫ−１活性化を通してその効果を媒介することができることを示す。従って、ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ及びＩＫＫ−１によるリン酸化の後に起こるＩＲＦ−３トランスロケーションは、トランスフェクションされたｄｓＲＮＡで処理した後のＦＡＤＤ−／−細胞において欠如していることが見出された（図１５ｅ及びｆ）。特に、Ｉｒｆ３−／−ＭＥＦｓは、Ｉ又はＩＩ型ＩＦＮへの暴露後のウイルス感染に対して完全には保護されなかった（図１８ｇ）。同様に、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ及びＲＮＡ干渉分析は、細胞内ｄｓＲＮＡの、ＩＲＦ３−／−ＭＥＦｓにおけるＩ型ＩＦＮ産生を誘発する能力の欠如を確認した（図１８ｈ〜ｊ）。

これらの結果は、ウイルスｄｓＲＮＡｓは、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１を「インネイテオソーム("innateosome")」複合体に動員してＩＲＦ−３のＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ媒介活性化を調節することができる細胞内受容体分子により認識されることを示唆する。ＦＡＤＤ又はＲＩＰ１の損失は、ＩＦＮ−β産生の欠如及びその結果としてのＩＲＦ−７の産生の遅れ及び抗ウイルス状態３の強化に必要なＩＦＮ−αファミリーのメンバーの産生の遅れをもたらすことが示された。ＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ欠如ＭＥＦｓは、ＦＡＤＤ欠如ＭＥＦｓ又はＲＩＰ１欠如ＭＥＦｓ単独よりも、ｄｓＲＮＡ刺激に応答するＩ型ＩＦＮｓの誘発のより深い欠如(profound defect)を示すが、これは、細胞内ｄｓＲＮＡで活性化された複合体はＦＡＤＤの不存在下にいくらかの活性を保持していること、又は別のＦＡＤＤ非依存性細胞内シグナリングカスケードがＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δに収斂することを示唆しているらしいことに注目すべきである。このＲＩＰ１／ＦＡＤＤ／ＴＢＫ−１（ＲＩＦＴ）経路は、ＴＬＲ３、ＰＫＲ、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１又はＴＲＡＦ６から殆ど独立しているようであり、そしてＤＥｘＤ／ＨヘリカーゼＲＩＧ−Ｉの如き別の細胞内のｄｓＲＮＡ活性化シグナルトランスデューサーの存在を示唆する他の発見と合致している。

実施例６：バクテリア感染に対する哺乳動物応答におけるＦＡＤＤの役割
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるｉｍｄ経路の役割が、グラム陽性菌感染に対する応答に関与することが報告され、そして抗ウイルス経路の存在はまだ決定されていない。哺乳動物細胞におけるＦＡＤＤ又はＲＩＰの損失により生じる細胞内バクテリア感染に対する自然応答がどうであるかを調べ、そして図１９に示す。簡単に言えば、ＦＡＤＤ＋／＋、ＦＡＤＤ−／−又はＲＩＰ−／−ＭＥＦｓを、ＩＦＮ−α／β又はＩＦＮ−γのあるなしで１８時間処理し、そして細胞内グラム陽性菌、Ｌｙｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの一夜培養物５μlで感染させ、そしてゲンタマイシン１０ig/mlを含有する培地中で更に２４時間インキュベーションし（図１９ａ及び１９ｂ）；あるいは、グラム陰性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの一夜培養物５０μlで感染させ、そしてゲンタマイシン１０ig/mlを含有する培地中で更に４８時間インキュベーションした（図１９ｃ）。有意義なことに、バクテリア感染への暴露の後ＦＡＤＤ及びＲＩＰ欠如繊維芽細胞において劇的な細胞死が起こることが観察された。この効果は、バクテリア複製の増加を伴っていた。このデータは、昆虫細胞と同様に、ＦＡＤＤ経路は、バクテリア感染に対する自然免疫において重要であることを示す。

実施例７：大きな表面積を有するキトサン粒子の予備製造
マイクロスプレーエアーガン(Micro Spray Air Gun)又はエレクトロスプレー(Electrospray)法を、キトサンマイクロ粒子予備製造のために使用した。マイクロスプレーエアーガン法では、キトサン溶液を、ガンについて可能な最小の寸法に乱流で分散させた。粒子のサイズは主として表面張力により制御され、そして〜２０〜１００ミクロンの範囲にあった。

エレクトロスプレーは、液体の静電噴霧の方法である。静電界は、流体を毛細管電極から受け入れ対極に向けて強制的に噴出させる。クーロン反発による小滴の第２段階分割(splitting)及び微粉砕は、微細な微小滴のプルーム(plume)を生成させる。表面フィルム形成を防止するために、改変されたエレクトロスプレー法をセットアップした。

架橋溶液（トリポリホスフェート、ＴＰＰ）の静止した表面へのキトサンのエレクトロスプレーは、キトサン溶液の極めて微細な且つ均質な粉砕により、マイクロ粒子の代わりに安定化されたキトサンの薄い表面フィルムを形成した。この望ましくない効果を阻止するために、架橋溶液の乱流再循環を考案した（図２０）。循環マイクロポンプは、フィルムの破壊に必須の受け取り電極板におけるＴＰＰ溶液のオープンループ循環を与えた。改変されたエレクトロスプレー装置を使用して、水及び２５%エタノール中の１%、１．５%及び２%キトサン溶液を粉砕した。２５Ｇステンレス鋼毛細管（ＥＦＤ）は、粉砕電極として作用し、１０%ＴＰＰ溶液１００mlを含有する１０インチステンレス鋼板は受け取り対極として使用された。架橋ＴＰＰ溶液の乱流攪拌を伴うエレクトロスプレーは、マイクロスプレーガンプルーム様式を使用して得られたマイクロ粒子よりも小さい粒子を創生した：サイズは〜５〜５０ミクロンの分布で生じた（図２１）。

改変されたエレクトロスプレー法により予備製造されたキトサン小滴は、およそミクロンサイズであり：エレクトロスプレープルームによる赤色レーザービームの有意な９０°散乱が観察され、これは光の波長に匹敵する小滴サイズを示している。乾燥粒子で観察されるより大きい見掛けのサイズは、その後の変換：ＴＰＰ溶液と接触すると、表面張力は、微小滴をＴＰＰの表面に極薄シートに広げる、により説明される。この格別の形状は顕微鏡で十分に見られた。凍結乾燥すると、マイクロシートは収縮してしわくちゃの紙に似た形状となり、そして再懸濁後に決して再び広がらない。マイクロ粒子を予備製造する上記した方法は、大きな表面積を有する広範囲のマイクロ粒子を生成する。より小さいサイズの粒子は、樹状細胞により飲み込まれうる。他方、これらの粒子の大きい表面積は、核酸及びタンパク質による外部飽和のための有意な利点を与える。

実施例８：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸をロードされたキトサン粒子
ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、ポリ（ＩＣ）は、合成のミスマッチな二本鎖ＲＮＡからなるインターフェロン（ＩＦＮ）誘発物質である。このポリマーは、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸の各一本鎖から作られる（図２２）。

ポリアニオンであるので、ポリ（ＩＣ）は、ポリカチオンキトサンにより強く吸着される。ポリ（ＩＣ）をロードされたキトサン粒子の２つの製造方法を使用した：バルクキトサン溶液への混合及びポリ（ＩＣ）溶液中の空の粒子のインキュベーションによる予備製造されたキトサン粒子のポリ（ＩＣ）による外部飽和。

１．ポリ（ＩＣ）による外部飽和
改変されたエレクトロスプレー法を使用して予備製造された粒子、普通は乾燥総計２０〜５０mgを、３．０mg/mlでＰＢＳ中に可溶化されたポリ（ＩＣ）(VWR International, Cat. #IC10270810)０．６ml中に入れた。室温で２時間の穏やかな振とうの後、粒子を、すべて１０００Ｇで２分間５回遠心し、各回上清を捨て、そして蒸留水１．５mlで置き換えた。洗浄された粒子の得られる懸濁液を一夜凍結乾燥した。

２．エチジウムホモ二量体を使用する溶液中のポリ（ＩＣ）の測定
溶液中のポリ（ＩＣ）の濃度を決定するために、エチジウム誘導体のインターカレーションによる２０〜２５倍の蛍光増強の効果を使用した。

エチジウムホモ二量体(ETDH; Sigma-Aldrich, Cat. #46043)は、そのキレート構造により（図２３）、ＤＮＡ、ＲＮＡと及び遊離ヌクレオチドとさえ、特異的複合体を形成することが知られている。結果として、それはポリ（ＩＣ）を測定するための最も適当な蛍光インターカレーション剤と考えられた。Ｂｉｏ−ＴｅｋＫＣ−４多機能プレートリーダーを使用して、標準透明９６ウエルプレート中のエチジウムホモ二量体（ＥＴＤＨ）でインターカレーションされたポリ（ＩＣ）を測定した（図２４）。測定を行うための条件は表１に示される。

粒子中のポリ（ＩＣ）の測定
ＫＣ−４リーダーを使用して固体キトサン粒子におけるポリ（ＩＣ）含有率の半定量的評価を行うことが可能であることが見出された。水溶液中のマイクロ粒子は、その小さなサイズのため、十分に透明であるとみなすことができ、そしてランダム散乱性物体とみなすことができる。ゆえに、ポリ（ＩＣ）の表面結合分子においてＥＴＤＨがインターカレーションし、そしてポリ（ＩＣ）の残りを含有する粒子の内側に更に拡散すると、ＥＴＤＨ蛍光の有意な部分がＫＣ−４リーダーにより集められることができる（図２５）。

粒子を溶液中に浸漬することによる、粒子のポリ（ＩＣ）による外部飽和は、キトサン溶液中にポリ（ＩＣ）を直接混合することよりもはるかに優れていることが見出された。これを図２６に示す。ＥＴＤＨの存在下のポリ（ＩＣ）粒子の時間依存性蛍光は、２つの異なる相：蛍光の速い（数秒）増強を伴う容易にアクセス可能な表面ポリ（ＩＣ）分子の即時のインターカレーション及び粒子の深部へのＥＴＤＨのゆっくりした浸透による蛍光の安定した増加、を証明した。最大表面ローディングを有する、即ち、蛍光の高められた速い増強を示す、粒子を得ることが必要と考えられた。

キトサン／ポリ（ＩＣ）粒子の製造のプロトコールについて、効率の下記の試験的順序が見出された。

エレクトロスプレーを使用して製造された最善の粒子におけるポリ（ＩＣ）の容易にアクセス可能な表面分子は、粒子１mg当たりポリ（ＩＣ）４．７μgを含んでいたが、これは直接混合によりマイクロガンを使用して製造された粒子の場合より〜１２倍高かった（それぞれ、図２６におけるグラフ７及び２）。

４．キトサン粒子からのポリ（ＩＣ）の低い放出
キトサン溶液へのポリ（ＩＣ）の直接混合により製造された粒子、１０mg乾燥重量をプラスチック試験管中のＰＢＳ１ml中に入れ、シールし、そしてシェーカー上で３７℃で９日間インキュベーションした。粒子を或る時点で１０００Ｇで５分間遠心し、上記したとおりのＥＴＤＨの存在下に蛍光アッセイのために、上清を採取し、そして新たなＰＢＳで置き換えた。観察された放出は、有意ではなく、２２７時間にわたり理論的最大値の０．５%未満で起こった（図２７）。キトサン粒子からのポリ（ＩＣ）の不十分な放出は、混合及び飽和製造法の両方で得られた粒子で見出された。粒子がファゴサイトーシスされるべき場合には、このことはあまり重要ではないことがある。

実施例９：ＯＶＡ及びポリ（ＩＣ）をロードされた多機能性キトサン粒子
オブアルブミン（ＯＶＡ）は、免疫学的実験でモデル抗原として使用することができる４５ｋＤａ糖タンパク質である。ＯＶＡ／ポリ（ＩＣ）をロードされたキトサン粒子の２つの製造方法を使用した：バルクキトサン溶液への混合及びＯＶＡ／ポリ（ＩＣ）によるマイクロ粒子の外部飽和。

１．ＯＶＡのみ又はＯＶＡとポリ（ＩＣ）との組み合わせによる外部飽和により製造されたキトサンマイクロ粒子。
エレクトロスプレーにより予備製造された粒子、全乾燥重量２０〜５０mgを、３０mg/mlＯＶＡ(Sigma-Aldrich, Cat. #A-5503)又は３０mg/mlＯＶＡ_２mg/mlポリ（ＩＣ）、１．５ml中に室温でロッカー上で２時間入れた。２時間の穏やかな振とうの後、粒子を各回１０００Ｇで５回遠心し、上清をすて、そして蒸留水１．５mlで置き換えた。かくして洗浄された粒子の得られる懸濁液を一晩凍結乾燥した。

２．ＯＶＡのビシンコニン酸アッセイ
タンパク質のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイは、２つの主要な工程に基づいている：
● 第１工程は、Ｃｕ^＋２をＣｕ^＋１に還元するビウレット反応である。
● 第２工程では、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）はビウレット錯体におけるペプチド基を置換して、Ｃｕ^＋１ とのビスキレート錯体を形成し、これは紫色であり、そして５６２nmで検出できる（図２８）。

商業的に入手可能なＢＣＡキット（例えば、Sigma-Aldrich, Cat. #BCA1）は、通常ＢＣＡ、酒石酸塩／重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ１１．２５）及び４%硫酸銅溶液を含有する。アッセイの直前に、標準アルカリ性ＢＣＡ溶液５０部をアッセイ系として使用されるべき４%硫酸銅溶液１部と混合する。

タンパク質は、溶液中及び不溶性物体中（緩衝剤中に懸濁させたマイクロ粒子；不溶性タンパク質含有フィルムのサンプル等）の両方においてＢＣＡアッセイで測定することができる。しかしながら、ヘテロ相システムは、ＢＣＡ溶液中のサンプルのより長い、そしてより高い温度での（溶液中のタンパク質での３７℃に対して６０℃）インキュベーションを必要とする。

３．溶液中の及び不溶性物体中のＯＶＡのアッセイ
アッセイ溶液ml当たり６０μgまでタンパク質をストレッチすることを行った線形応答の面積を決定するために、新鮮なＢＣＡアッセイ溶液をＯＶＡ標準により較正した（図２９）。

溶液中のＯＶＡを下記の如く測定した：
タンパク質溶液のアリコートを、必要な過剰のアッセイ溶液に加えて２以下の最終光学的吸光(final optical extinction)及びアッセイの線形応答を完全に保証した。分析物をロッカー中で３７℃で１時間インキュベーションした。すべての読みはタンパク質を含有しないブランクサンプルの読みに対して補正した。

マイクロ粒子中のＯＶＡを下記のとおりに測定した：
乾燥マイクロ粒子のサンプル（各々約１mg）を、分析天秤(Mettler-Toledo XS105)で０．０１mgの正確度で重量を秤り、そして線形応答及び許容されうる光学密度（＜２ｏ．ｕ．）を与えるように予備計算された対応する過剰のＢＣＡアッセイ溶液中に懸濁させた。試験管中にシールされたサンプルをロッカー中で３７℃で４時間又は水浴中で時々タンプリングしながら６０℃で１時間インキュベーションした。両方の場合に、インキュベーション時間を、タンパク質の分子による二価の銅の一価の銅への完全な還元を与えるように実験的に決定した。管を、５００ｇで５分間遠心して、粒子を分離し、そして透明な（clear）着色した溶液を５６２nmで分光光度計により読み取った。すべての読みは、タンパク質を含有しないブランク粒子で得られたサンプルの読みに対して補正した。

実施例１０：適度のローディングタンパク質及び核酸を有する多官能性マイクロ粒子
１.マイクロ粒子中のＯＶＡ含有率の評価
タンパク質を直接混合により粒子に加えると、粒子調製の異なる方法は、ＯＶＡの最終含有率に対して有意な効果はないようであると見出された。しかしながら、タンパク質が予備製造された粒子の外部飽和（浸漬(soaking)）によりロードされると、結果は異なっていた。外部飽和は、３〜５倍高い最終ＯＶＡ濃度を有するマイクロ粒子を造り出した。

改変されたエレクトロスプレー及びマイクロスプレーガンは、しわくちゃの紙の幾何学及び形状を示す非常に高い表面積を有する小さな粒子の予備製造を可能とする。粒子の小さなサイズ及び大きな表面積のマイクロ粒子は、放出速度よりもむしろ高い吸収容量に貢献した。

高い表面積は、溶液中のマイクロ粒子の外部飽和を介してＮＡ及びタンパク質が付着するための大きな外表面を与える。

２．マイクロ粒子からのオブアルブミンの時間放出を測定すること
ロードされた粒子のサンプル、各々１０．０mgの乾燥重量を、プラスチック試験管中のＰＢＳ１．０ml中に入れ、パラフィンでシールし、そして３７℃で１８日までシェーカー上でインキュベーションした。管を、１０００Ｇで５分間ある時点で遠心し；上清を上記したとおりのＢＣＡアッセイのために採取した。

タンパク質を混合することにより及びタンパク質溶液中に予備製造された粒子を浸漬することにより製造された粒子からのＯＶＡの放出プロフィルにおいて大きな差が見出された（図３０）。前者では、全体の放出は多日数で総ロードの２%を決して超えなかったが、後者では、放出は１５%〜３０%を達成し、そして最初の７〜１０時間で起こった。ＯＶＡの総含有率に対する効果と同様に、ＯＶＡ及びポリ（ＩＣ）を有する粒子の同時的飽和は、ＯＶＡの放出を見かけ上減少させた（図３０）。

実施例１１：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を高度にロードされたキトサン粒子
エレクトロスプレーを使用して製造された最善の粒子におけるポリ（ＩＣ）のアクセス可能な表面付着分子は、粒子１mg当たり４．７μgポリ（ＩＣ）を含有していた。粒子のサイズは〜５〜５０ミクロンに分布して生じており、そしてトリポリホスフェート（ＴＰＰ）を架橋剤として使用した。ゆえに、最も近い目標は粒子の収着容量(sorption capacity)を増加させるように設定された。

粒子の収着容量を高めるために、キトサン架橋剤を変えることが望ましいことが見出された。より軟質の粒子を造りだし、そして同時に核酸のホスフェート基に結合することに対してはるかに弱い競合者である有望なゲル化架橋剤として、硫酸ナトリウムＮａ_２ＳＯ_４（特記しない限り、蒸留水中１０%）が選ばれた［Berthold, et al., J. Controlled Release, 39: 17-25(1996)］。

ポリ（ＩＣ）をロードされたミクロより大きい(supra micro)（即ち、大きい）−及びサブミクロン（小さい）プロタサン粒子(Protasan particles)を製造した。ミクロより大きい粒子（２０〜７００ミクロン）は、ケモカイン又は薬物担体として使用されると思われ、又は細胞外ＴＬＲ−３免疫経路を活性化すると思われ；それらは細胞により呑み込まれるのを回避するであろう。

他方、抗原提示細胞により呑み込まれ、そして一次自然免疫応答の活性化のための中心である内部ＦＡＤＤ／ＲＩＰ／ＴＲＡＦ−２経路を介してプロセッシングされうるより小さな粒子（０．５〜１０um）により核酸及び抗原が担持されると、免疫感作が有効であることが知られる。

実施例１２：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を高度にロードされたミクロンより大きいプロタサン粒子
１００mlＮａ_２ＳＯ_４溶液ｐＨ５．５を含有する受け入れパンの上で層流モードにおいてマイクロエアーガンを使用する１%酢酸中のＰＲＯＴＡＳＡＮ ＵＰ ＣＬ ２１３(NovelMatrix, Norway, cat#420101)の２%溶液１０mlを噴霧して、より大きい粒子（１００〜２００ミクロンを得た。

プロタサンを製造し、そして、ｃＧＭＰのＵＳ ＦＤＡガイドラインに従って証明した（２１ＣＦＲ２１０，２１１）。

粒子を、繰り返し遠心／再懸濁手順を使用して蒸留水中で６回洗浄し、そして一夜凍結乾燥した。得られる粒子は、〜１０〜２００ミクロンの不規則でスポンジ状の断片を発生した（図３１Ａ）。

１.ポリ（ＩＣ）：可溶化及び測定
ポリ（ＩＣ）(Amersham, cat. #27-4729-01)５０mgを、製造者により推奨されたとおり、１%ＮａＣｌ３５ml中に一晩溶解した。最終溶液は、２６０nmにおける吸光度Ａ_２６０〜１４．０を有していたが、これはml当たり純粋な二本鎖ポリ（ＩＣ）７００μgに相当した。故に、Ａｍｅｒｓｈａｍ製剤中のポリ（ＩＣ）の総含有率は約４９〜５０%であり、すべての他の成分は緩衝性塩であつた。

粒子中のポリ（ＩＣ）の量は、システムに加えられたポリ（ＩＣ）と粒子沈殿後の水相に残っているポリ（ＩＣ）との差として計算された［Bivas-Benitz, et al., Int. J. Pharm, 266: 17-27(2003)］。溶液中のポリ（ＩＣ）の濃度を測定するために、ポリ（ＩＣ）ＵＶスペクトルの直接的読み取りを、製造に関与したポリ（ＩＣ）の非常に高い濃度により、蛍光法の代わりに使用した。

２．予備製造された粒子によるポリ（ＩＣ）の収着の測定
異なる実験におけるポリ（ＩＣ）５０〜７００ug/mlを含有する酢酸塩又はリン酸塩緩衝剤０．５〜５mlの容積中に、既知の重量の粒子を懸濁させた。懸濁液を強く５分間ボルテックスし、次いで中間レベルでボルテックスして保ち、次いで更に１５分間ロックした。その後、懸濁液を、７０００gで５分間遠心し、そして上清中のポリ（ＩＣ）の濃度を１cm石英セルを使用して分光光度計で測定した。２６０nm及び４００nmにおける吸光度の差を使用してポリ（ＩＣ）の濃度を決定し、ここで、どの１光学的単位も〜５０μg/mlポリ（ＩＣ）に相当していた(American Biosciences, specification for the Product#27-4732)。

３．ｐＨに依存するミクロンより大きいプロタサン粒子の収着容量
ポリ（ＩＣ）0.７mg/mlの溶液を、３つの異なる緩衝剤：１%酢酸塩緩衝剤ｐＨ４．５；１%酢酸塩緩衝剤ｐＨ５．５；ＰＢＳｐＨ７．４と１：１で混合した。各部分における乾燥プロタサン粒子、１．０＋−０．０４mgを、（ポリ（ＩＣ）：緩衝剤）混合溶液１．０ml容積中に懸濁させた。ボルテックス及び遠心後に、ポリ（ＩＣ）の吸着されなかった残りを上記のように測定した。すべての３つのサンプルは、乾燥空粒子mg当たりポリ（ＩＣ）０．７mgに等しいか又はそれを超える、プロタサン粒子の同様な収着容量を示した（図３２ａ）。けれどもサンプルの物理的状態は異なっていた。ｐＨ４．５のサンプルは、粒子の最もコンパクトな沈殿を示し、これに対してｐＨ５．５のサンプルは大きく且つ圧縮できないペレットを示し、そしてｐＨ７．４のサンプルは中間の圧縮を示した（図３２Ｂ）。粒子の最大収着容量は、後でｐＨ４．５で最も高いことが見出された（図３２Ｃ）。

上記発見の結果として、種々の粒子によるポリ（ＩＣ）の収着に関するすべてのその後の実験は、ｐＨ４．５で行われた。

架橋剤として硫酸ナトリウムを使用して予備製造されたプロタサン粒子へのポリ（ＩＣ）の収着に関する実験は、ｐＨ４．５の最大収着容量は、空粒子１mg当たりポリ（ＩＣ）２mgを超えたことを証明した。この結果は、ＴＰＰ架橋剤による結果に対して〜４００倍の改良を示した。

実施例１３：ポリ（ＩＣ）を高度にロードされたサブミクロンプロタサン粒子
希釈した溶液からのプロタサン／ポリ（ＩＣ）／架橋剤凝集物のゆっくりした沈殿を用いてサブミクロン粒子を製造した。

０．１%酢酸塩緩衝剤ｐＨ４．５中の２００μg/mlのポリ（ＩＣ）溶液２００mlを、室温で絶えず攪拌しながら０．１%酢酸塩緩衝剤中の２００μg/mlプロタサン溶液２００mlに１５分以内に滴下により加えた。得られる溶液を３０℃で１時間攪拌し、その後硫酸ナトリウムの１０%溶液４００mlを、１５分以内に滴下により加えた。組み合わせた溶液の最終８００mlを、３０℃で２時間攪拌し、次いで５０００Gでの遠心により沈殿させた。ペレットを上記したとおり蒸留水中で２回洗浄し、水中に再懸濁させ、次いで４０umＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを通してろ過し(BD Biosciences, cat.#352340)、次いで再び沈殿させ、そして最後に〜５mg/mlで水中に再懸濁させた。これらの粒子のサイズは１〜２０ミクロンの範囲に見出された（図３１Ｂ）。これらの粒子の収着容量は、１mg/mlであると思われた。

実施例１４：疎水性カチオンＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ＰＯＬＹ（ＩＣ）組み合わせ粒子
ＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ポリ（ＩＣ）粒子を製造するために、Bivas-Benita et al.のプロトコールの種々の改変を用いた［Bivas-Benita et al., Eur. Jour. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 58: 1-6(2004)］。実際に、ジクロロメタン中のＰＬＧＡの溶液及びアセトン中のＰＥＩの溶液を種々の割合で組み合わせ、超音波乳化、エアーガン及びエレクトロスプレー微粒化を使用してマイクロ粒子を得た。

１．超音波乳化
ＰＬＧＡ５００mgをジクロロメタン５ml中に溶解し、そしてアセトン５mlに溶解したＰＥＩ１００mgと組み合わせた（５：１最終ＰＬＧＡ：ＰＥＩ比）。一緒にした溶液を室温でＢｒａｎｓｏｎ−１５１０超音波処理浴中で絶えず超音波処理下に保たれた１０%ＮａＣｌ水溶液５０ml中に滴下により注いだ。塩化ナトリウムを導入して、有機相を分散させること及び洗浄過程期間中再懸濁することを促進させた。混合物を高められた温度（５０℃）で更に４時間後に超音波処理して、揮発性溶媒を除去した。得られるＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子を前記したように４回洗浄／沈降させ、そして凍結乾燥した。なかなかなくならない界面活性剤の排除により、洗浄パスの数を減少させることが可能であることが見出された。

２．ＮａＣｌ受け入れ水溶液に対するＰＬＧＡ／ＰＥＩ溶液のエアーガン及びエレクトロスプレー
ＣＨ_２ＣＬ_２／アセトン中の上記した５：１ＰＬＧＡ：ＰＥＩ溶液をマイクロエアーガンを使用して１０%ＮａＣｌに対して及びエレクトロスプレーを使用して乱流10%ＮａＣｌ溶液に対して噴霧した。集めたマイクロ粒子を４回洗浄／沈降させ、そして凍結乾燥した。

界面活性剤なしで得られた粒子によるポリ（ＩＣ）の収着を、ポリ（ＩＣ）溶液〜７０μg/mlにおいて上記した如く試験した。一般的収着容量は、ほぼエマルジョン技術と匹敵するオーダーに改良されることが見出され；ｐＨ４．５の酢酸塩緩衝剤は収着のために最も適当であることが再び見出された（図３３ａ及びｂ）。

エアーマイクロガンを使用して得られた粒子の収着容量は、エレクトロスプレーからの粒子よりも幾分高いことが見受けられたが、全体としての形状及びサイズ分布は、エレクトロスプレーの場合により良好であった。エアーガンは、１０ミクロンより大きいサイズの不規則な凝集体を実際に生成し（示されていない）、そしてエレクトロスプレーからの粒子はサイズ範囲３〜１０ミクロンのスフェロイドであった（データは示されていない）。

３．乾燥金属電極に対してエレクトロスプレーを使用して得られた粒子
乾燥金属電極（ステンレス鋼製パン）上に電気的に分散された粒子を受け取り、そしてその後それらを可溶化することが可能であることが見出された。粒子の収着容量を更に上昇させるために、ＰＬＧＡ：ＰＥＩ比を、２：１、即ち、前と同じく、同じ容積のＣＨ_２Ｃｌ_２及びアセトン中のＰＬＧＡ５００mg対ＰＥＩ２５０mgに増加させた。乾燥電極上に集められた粒子は、３〜７ミクロンのスフェロイドのように見えた（図３４ａ）。

乾燥電極に対してエレクトロスプレーし、その後付着物を蒸留水中に可溶化して製造されたＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子は、種々のエマルジョン法又は水溶液に対する分散に対してはるかに優れているように見えることを結論しても差し支えない。

４．ファゴサイトーシスの観察のための蛍光ＰＬＧＡ／ＰＥＩ／ＦＩＴＣ粒子
ポリ（ＩＣ）を有する粒子のファゴサイトーシスに関する実験の開始を容易にするために、蛍光標識の簡単化されたバージョンを導入した。９５%エタノール１ml中のＦＩＴＣ(Sigma-Aldrich, cat. #F-7250)２mgを標準的な組み合わせのＰＬＧＡ：ＰＥＩ＝２：１溶液に加えて、乾燥電極に対するエレクトロスプレーの上記したプロトコールに従って粒子を合成した。

粒子を超音波処理により蒸留水中に再懸濁させ、そして遊離ＦＩＴＣから４回洗浄した。第４回目の洗浄は、遊離ＦＩＴＣの痕跡がゼロであることを示した。強い黄色の得られるペレットを、一晩凍結乾燥し、そして上記した標準プロトコールを使用してポリ（ＩＣ）をチャージした。収着容量は、先に得られたＦＩＴＣなしの粒子の場合よりも低いこと：１００〜２００μg/mlに対して〜７０μg/ml、が見出された。粒子は、明るい緑色蛍光を示す、０．５〜５μmサイズの不規則で幾分スポンジ状のスフェロイドであった（図３５）。

５．ヒト樹状細胞におけるインターフェロンの誘発に関する予備的結果
約５０，０００の一次的なソーティングされたばかりの(primary freshly sorted)ＤＣ１又はＤＣ２サブセットヒト細胞を、ＰＬＧＡ−ＰＥＩ−ポリ（ＩＣ）粒子で処理し、そして培養上清を２４時間後に集め、そしてヒトＩＦＮ−α及びβについてＥＬＩＳＡに付した。β及びαインターフェロン両方の統計的に一貫したレベルが両サブセットについて見出された（図３６）。

実施例１５：非ウイルス病原体に対する交差シグナリング防御経路
交差シグナリングストラテジーは、バクテリア及びウイルス関連疾患との戦いにおいて有用でありうる。これらの可能性を評価し、そしてＴＬＲ／ＦＡＤＤ経路の刺激因子を有するマイクロ粒子は抗原特異的Ｔ細胞の交差プライミングを含む強力なアジュバント特性を発揮することを確認するために、ニワトリオブアルブミン（ＯＶＡ）のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＯＴ−１トランスジェニックマウスをモデルとして使用する。これらの動物における大多数のＣＤ８Ｔ細胞は、Ｋ^ｂ分子と会合しているオブアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を認識する単一のＶα２＋Ｖβ５＋ＴＣＲを発現する。これらの粒子は、ＯＶＡ遺伝子を発現するように修飾されることができ、又はタンパク質を直接ロードされることができる。ＣＦＳＥで標識された精製されたＣＤ８^＋Ｖα２細胞を動物に養子移行させる。３日後、ＯＶＡ含有粒子（遺伝子又はタンパク質）を動物に接種する（腹腔内）。この方法は、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞に対してｇｐ９６発現細胞からのＯＶＡの増加した交差提示を証明することが最近示された。このアプローチを使用することにより、自然免疫応答の刺激に関与するマイクロカプセル化ストラテジーは、適応的免疫応答の有効なモジュレーターであることが示されうる。

実施例１６：ポリ（ＩＣ）をロードされたＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサンマイクロ粒子は、細胞外ＴＬＲ３経路を活性化することにより２９３細胞におけるＩＦＮ−β産生を誘発することの証明。
ＴＬＲ３、外因性ｄｓＲＮＡのための受容体、を発現している又は発現していない２９３細胞を、ＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションし、そしてＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）又はプロタサン粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）に暴露した。粒子への暴露時間は３〜６時間であった。図３７ｂに示されたとおり、ｄｓＲＮＡを有する粒子のみが、ルシフェラーゼ遺伝子の細胞外ＴＬＲ３媒介活性化をトリガーすることができた。コントロールとして、ＴＬＲ３レポーターなしの２９３細胞を、ＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションし、そしてＰＬＧＡ／ＰＥＩ粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）又はプロタサン粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）に暴露した（図３７ａ）。有意なルシフェラーゼ活性は検出されなかったが、これはｄｓＲＮＡを有するマイクロ粒子のみがＴＬＲ３を介してＩＦＮ−β経路を活性化することができたことを示す。２９３細胞は、非常に弱い細胞内経路を有し、かくして、主としてＴＬＲ３経路を活性化する理由を有する（データは示されていない）。

コントロール：更なるコントロールとして、外因性ｄｓＲＮＡを、ＴＬＲ３を発現している又は発見していない２９３細胞に加えた。両タイプの細胞をＩＦＮ−βプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションし、そして外因性ｄｓＲＮＡで処理した。ＴＬＲ３を発現する細胞のみがｄｓＲＮＡにより活性化されて、ＩＦＮ−βプロモーターを転写的に活性化することができた。

実施例１７：ポリ（ＩＣ）をロードされたＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサンマイクロ粒子は、おそらく細胞外インネイテオソーム経路を活性化することによりＤＣ２サブセット細胞におけるＩＦＮα産生を誘発することの証明
末梢ヒト血液サンプルにおけるＤＣ２サブセットを、ＰＬＧＡ／ＰＥＩ又はプロタサン粒子（融合したｄｓＲＮＡを有する及び有していない）に暴露し、そして図３８に示されたとおり粒子への３〜６時間の暴露の後にインターフェロンα発現について監視した。ＤＣ２（プラズマサイトイドＤＣｓ(plasmacytoid DCs)はＴＬＲ３を欠き、それ故インターフェロンα誘発は別のｄｓＲＮＡシグナリング経路によりトリガーされる）は、おそらく「インネイテオソーム」を介する細胞内経路を利用する。

本発明の化合物及び方法の好ましい態様は、説明することを意図しており、限定を意図するものではない。改変及び変更は上記教示に照らして当業者によりなされうる。本発明は、例えば、空気品質を監視するために、ガスサンプル中のアセトンレベルを測定する他の目的に使用することができることも、当業者により考えられうる。故に、特許請求の範囲により規定された範囲内にある変更が、開示された特別な態様においてなされうることは理解されるべきである。

Claims (53)

1. ポリカチオンポリマーを含むマイクロ粒子；
   ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター；及び
   ＴＬＲ経路のモジュレーターを含み、
   該ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及び該ＴＬＲ経路のモジュレーターは、該マイクロ粒子と会合しており、そして、該マイクロ粒子は抗原提示細胞によりファゴサイトーシスされることができる、
   哺乳動物における自然免疫系をモジュレーションするための組成物。
2. 該ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターは、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ＦＡＤＤ依存性経路の成分、ＦＡＤＤ依存性経路の成分をコードするＤＮＡプラスミド、バクテリア及び真菌よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
3. ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターがＦＡＤＤをコードするｄｓＲＮＡである、請求項２に記載の組成物。
4. ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーターが、ＦＡＤＤ依存性経路を抑制することができるサイレンシングＲＮＡｉを表すｄｓＲＮＡである、請求項２に記載の組成物.
5. サイレンシングＲＮＡｉはＦＡＤＤ発現を抑制する、請求項４に記載の組成物.
6. 該ＴＬＲ経路のモジュレーターが、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物及びＴＬＲのためのリガンド、バクテリア及び真菌よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
7. 該ＦＡＤＤ依存性経路のモジュレーター及び該ＴＬＲ依存性経路のモジュレーターが同じｄｓＲＮＡ分子である、請求項１に記載の組成物。
8. 該マイクロ粒子が、抗原提示細胞に特異的に結合するターゲティング分子で更にコーティングされる、請求項１に記載の組成物。
9. 該ターゲティング分子が抗体である、請求項８に記載の組成物。
10. 該ターゲティング分子が熱ショックタンパク質ｇｐ９６である、請求項９に記載の組成物。
11. サイトカイン又は抗原を含有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）マトリックスを更に含み、該マイクロ粒子が該マトリックス中にカプセル化されている、請求項１に記載の組成物。
12. 該マイクロ粒子中にカプセル化されたサイトカインを更に含む、請求項１に記載の組成物。
13. 該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦよりなる群から選ばれる、請求項１２に記載の組成物。
14. 該マイクロ粒子は、サイトカインの所望の放出速度が達成されるように、１種以上の疎水性ポリマーを更に含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 該１種以上の疎水性ポリマーがＰＬＧＡ、ポリ（カプロラクトン）又はポリ（オキシブチレート）を含む、請求項１４に記載の組成物.
16. 該マイクロ粒子が両親媒性ポリマーを更に含む、請求項１３に記載の組成物.
17. 該両親媒性ポリマーがポリ（エチレン）イミン（ＰＥＩ）である、請求項１６に記載の組成物.
18. 該組成物が、腫瘍抗原又は腫瘍抗原をコードするＤＮＡを更に含み、該腫瘍抗原又は腫瘍抗原をコードするＤＮＡが該マイクロ粒子と会合している、請求項1に記載の組成物。
19. 該マイクロ粒子が約０．５μm〜約２０μmの範囲の直径を有する、請求項１に記載の組成物。
20. 該ポリカチオンポリマーがキトサンである、請求項１に記載の組成物。
21. 薬学的に許容されうる担体を更に含む、請求項１に記載の組成物。
22. 核酸及びタンパク質をロードされたファゴサイトーシス可能なキトサンマイクロ粒子を含む、哺乳動物の免疫系をモジュレーションするための組成物。
23. 該核酸が、ｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物又はＤＮＡ分子である、請求項２２に記載の組成物。
24. 該タンパク質がサイトカインである、請求項２２に記載の組成物。
25. 該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦよりなる群から選ばれる、請求項２４に記載の組成物。
26. 該タンパク質が抗原提示細胞に結合する抗体である、請求項２２に記載の組成物。
27. 該核酸がｄｓＲＮＡであり、該タンパク質がＴＬＲリガンドである、請求項２２に記載の組成物。
28. 該核酸がｄｓＲＮＡであり、該タンパク質がＦＡＤＤである、請求項２２に記載の組成物。
29. 該キトサン粒子が疎水性ポリマーを更に含む、請求項２２に記載の組成物。
30. 該疎水性ポリマーが、ＰＬＧＡ、ポリ（カプロラクトン）及びポリ（オキシブチレート）よりなる群から選ばれる、請求項２９に記載の組成物。
31. 該キトサン粒子がＰＥＩを更に含む、請求項２２に記載の組成物。
32. 薬学的に許容されうる担体を更に含む、請求項２２に記載の組成物。
33. 哺乳動物に有効量の請求項２２に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物におけるウイルス、バクテリア又は真菌感染を処置する方法。
34. 該ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス（ＩＮＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アプトウイルス(apthovirus)、コクサッキーウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、デンクウイルス(Denque virus)、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワリセロウイルス、サイトメガロウイルス、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、スイポックスウイルス（suipoxvirus）及びコロナウイルスにより引起される、請求項３３に記載の方法。
35. 該ウイルス感染がＨＩＶ、ＩＮＶ、ＥＭＣＶ又はＶＳＶにより引起される、請求項３４に記載の方法。
36. 哺乳動物に有効量の請求項２２に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物におけるガンを処置する方法。
37. 該ガンが、乳ガン、結腸−直腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、皮膚ガン、骨ガン又は肝臓ガンを含む、請求項３６に記載の方法。
38. ポリカチオンポリマーを含むマイクロ粒子、
    自然免疫応答ブースターとしてのｄｓＲＮＡ又はポリ（ＩＣ）、及び
    抗原を含み、
    該ｄｓＲＮＡ又はポリ（ＩＣ）及び該抗原は該マイクロ粒子と会合しており、該マイクロ粒子は抗原提示細胞によりファゴサイトーシスされることができる、哺乳動物における免疫応答をモジュレーションするための組成物。
39. サイトカインを更に含み、該サイトカインは該マイクロ粒子と会合している、請求項３８に記載の組成物。
40. 該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦよりなる群から選ばれる、請求項３９に記載の組成物。
41. 熱ショックタンパク質を更に含み、該熱ショックタンパク質は該マイクロ粒子と会合している、請求項３８に記載の組成物。
42. 該ｄｓＲＮＡ又はポリ（ＩＣ）及び該抗原が、表面付着、カプセル化又は表面付着とカプセル化との組み合わせにより該マイクロ粒子と会合している、請求項３８に記載の組成物。
43. 該免疫応答が自然免疫応答である、請求項３８に記載の組成物。
44. 該免疫応答が適応的免疫応答である、請求項３８に記載の組成物。
45. ポリカチオンポリマーを含むマイクロ粒子；
    ＩＲＦ３のＴＢＫ−１／ＩＫＫ−δ媒介活性化を調節するインネイテオソーム複合体(innateosome complex)の形成を誘発することができる免疫アクチベーター、及び
    ＴＬＲ経路のモジュレーターを含み、
    インネイテオソーム複合体のための該アクチベーター及びＴＬＲ経路の該モジュレーターが該マイクロ粒子と会合しており、該マイクロ粒子が抗原提示細胞によりファゴサイトーシスされることができる、
    哺乳動物における自然免疫応答をモジュレーションするための組成物。
46. 該免疫アクチベーターがｄｓＲＮＡである、請求項４５に記載の組成物。
47. 該ｄｓＲＮＡがウイルスｄｓＲＮＡである、請求項４６に記載の組成物。
48. （ａ）沈殿、ゲル化及び噴霧によりキトサンマイクロ粒子を製造すること、
    （ｂ）核酸、タンパク質又はその両方を含む溶液中で該キトサンマイクロ粒子をインキュベーションすること
    を含む、哺乳動物の免疫モジュレーションのための多機能性マイクロ粒子を製造する方法。
49. 工程（ｂ）の後、
    （ｃ）インキュベーション後にキトサンマイクロ粒子を洗浄し、そして
    （ｄ）洗浄したキトサンマイクロ粒子を乾燥する、
    工程を更に含む、請求項４８に記載の方法。
50. 該核酸がｄｓＲＮＡ、ポリ（ＩＣ）、ウイルスｄｓＲＮＡの合成模倣物及びＤＮＡよりなる群から選ばれ、該タンパク質が抗体、サイトカイン、ＴＬＲリガンド、ｇｐ９６及び腫瘍抗原よりなる群から選ばれる、請求項４８に記載の方法。
51. 該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１６、ＴＮＦα及びＭＩＦよりなる群から選ばれる、請求項５０に記載の方法。
52. 沈殿、ゲル化及び噴霧によりキトサンマイクロ粒子を製造する前に、キトサンを、核酸、タンパク質又はその両方と混合すること、
    を更に含む、請求項４８に記載の方法。
53. ＦＡＤＤ欠如細胞及び対応する野生型細胞をポリ（ＩＣ）で処理すること、
    ポリ（ＩＣ）処理されたＦＡＤＤ欠如細胞及びポリ（ＩＣ）処理された野生型細胞からＲＮＡｓを単離させること、
    単離されたＲＮＡｓを遺伝子アレイにハイブリダイゼーションさせること及び
    ポリ（ＩＣ）処理された野生型細胞と比べてポリ（ＩＣ）処理されたＦＡＤＤ欠如細胞において差次的に発現される遺伝子を同定すること、
    を含む、ＦＡＤＤシグナリング経路に関する抗ウイルス遺伝子を同定する方法。