JP2011155860A - Method for selecting individual of plant of genus capsicum having resistance to bacterial wilt disease, using dna marker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ピーマンをはじめとするカプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座と連鎖するDNAマーカーを増幅するためのプライマーセット、当該プライマーセットを用いた青枯病抵抗性のカプシカム属植物個体の選抜方法に関する。 The present invention relates to a primer set for amplifying a DNA marker linked to a bacterial wilt resistance locus of Capsicum genus plants such as peppers, and an individual of the Capsicum genus plant resistant to bacterial wilt using the primer set. It relates to the selection method.
青枯病は、Ralstonia solanacearumによって引き起こされる土壌病害であり、ピーマンやトウガラシなどのカプシカム属植物を萎凋枯死させる。青枯病は、一度発生すると永年にわたって発生し続け、防除がきわめて困難であり、早急な対策が求められている。青枯病に対する防除対策としては、青枯病に対する抵抗性品種の導入がまず挙げられ、これまでピーマンやトウガラシについて、その抵抗性程度に差はあるものの種々の青枯病抵抗性品種及び系統が報告されている（非特許文献１、２）。しかしながら、ピーマンやトウガラシなどにおける青枯病抵抗性は、複数の量的な遺伝形質（QTL：Quantitative trait loci）によって支配されていると考えられ（非特許文献３）、抵抗性個体の安定した選抜が難しく、優れた青枯病抵抗性品種は未だ育成されてない。そのため、現在のところ、抵抗性を有する台木を用いて青枯病を回避しているが、この方法では苗の接ぎ木および育苗に多くの労力とコストを要するという問題がある。
Bacterial wilt is a soil disease caused by Ralstonia solanacearum and kills Capsicum plants such as peppers and peppers. Bacterial wilt once occurs for many years, is extremely difficult to control, and urgent measures are required. As control measures against bacterial wilt, introduction of resistant varieties against bacterial wilt was first mentioned. Various resistance varieties and strains of green wilt and pepper have differed in the degree of resistance. It has been reported (
従来の病原菌接種検定による抵抗性個体の選抜方法では、多大な労力と時間を必要とするため非効率的である上に、接種時の温度などの環境や植物の生育ステージなどに左右されるため検定精度が低い。従って、育苗段階で青枯病抵抗性個体を安定的かつ効率的に選抜する方法の開発が望まれる。一方、DNA情報を形質マーカーとする選抜方法は、従来の病原菌接種検定による抵抗性個体の選抜方法とは異なって、植物個体が目的とする形質を発現する前の生育段階における選抜が可能であるので労力や時間の省略化につながり、しかも環境や生育ステージによってDNA情報は変化しないので安定である。しかしながら、カプシカム属植物について青枯病抵抗性個体を効率的に識別し、選抜する手段となる有効なDNAマーカーについては未だ開発されていない。 The conventional method for selecting resistant individuals by inoculation tests for pathogens is inefficient because it requires a lot of labor and time, and also depends on the environment such as the temperature at the time of inoculation and the stage of plant growth. Test accuracy is low. Accordingly, development of a method for stably and efficiently selecting bacterial wilt resistant individuals at the seedling stage is desired. On the other hand, the selection method using DNA information as a trait marker is different from the conventional method for selecting resistant individuals by inoculation tests for pathogenic bacteria, and enables selection at the growth stage before the plant individual expresses the desired trait. As a result, labor and time can be saved, and DNA information does not change depending on the environment and growth stage, so it is stable. However, an effective DNA marker has not yet been developed as a means to efficiently identify and select bacterial wilt resistant individuals for Capsicum plants.
本発明の課題は、カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座と連鎖し、青枯病抵抗性個体の識別・選抜に有効なDNAマーカーを見出し、これを利用して育苗段階早期に青枯病抵抗性を有するカプシカム属植物個体を安定的かつ効率的に識別・選抜する手段を提供することにある。 An object of the present invention is to find a DNA marker that is linked to a bacterial wilt resistance locus of a Capsicum genus plant and is effective for identifying and selecting a bacterial wilt resistant individual, and using this DNA wilt at an early stage of seedling raising An object of the present invention is to provide a means for stably and efficiently identifying and selecting Capsicum plants having disease resistance.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、（i) ピーマンの青枯病罹病性系統と青枯病抵抗性系統との間で多型性を示すDNAマーカー(AFLP、RAPD、SSR)を選抜し、(ii)青枯病罹病性系統と青枯病抵抗性系統との交配後代集団を解析集団として上記DNAマーカーの多型分布を調査して連鎖地図を作成し、（iii)交配後代集団の本病原菌に対する表現型の分離パターンを調査してQTL解析を行った。その結果、17個のSSRマーカー（Rs1〜Rs11、Rs13〜Rs18）が、青枯病抵抗性QTLと連鎖することを見出すとともに、該DNAマーカーを用いることにより育種過程で青枯病抵抗性を有するカプシカム属植物個体を効率的に選抜できることを確認し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have obtained (i) a DNA marker (AFLP, which shows polymorphism between the bacterial wilt susceptibility line and bacterial wilt resistant line of peppers). RAPD, SSR) were selected, and (ii) a polymorphism distribution of the above DNA marker was investigated using a progeny of mating of bacterial susceptibility and bacterial wilt resistant strains as an analysis population, and a linkage map was created. (Iii) QTL analysis was conducted by examining the phenotypic segregation pattern of this progeny population against this pathogen. As a result, 17 SSR markers (Rs1 to Rs11, Rs13 to Rs18) were found to be linked to bacterial wilt resistant QTL, and have resistance to bacterial wilt during breeding by using the DNA marker. It was confirmed that Capsicum plants can be selected efficiently, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１） 以下の（A）〜(Q)のいずれかに記載のカプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖するDNAマーカー増幅用プライマーセット。
（A） 配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs1増幅用プライマーセット
（B） 配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs2増幅用プライマーセット
（C） 配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs3増幅用プライマーセット
（D） 配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs4増幅用プライマーセット
（E） 配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs5増幅用プライマーセット
（F） 配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs6増幅用プライマーセット
（G） 配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs7増幅用プライマーセット
（H) 配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs8増幅用プライマーセット
（I） 配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs9増幅用プライマーセット
（J）配列番号１９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs10増幅用プライマーセット
（K）配列番号２１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs11増幅用プライマーセット
（L）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs13増幅用プライマーセット
（M）配列番号２５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs14増幅用プライマーセット
（N）配列番号２７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs15増幅用プライマーセット
（O）配列番号２９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs16増幅用プライマーセット
（P）配列番号３１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs17増幅用プライマーセット
（Q）配列番号３３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs18増幅用プライマーセット
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A primer set for amplifying a DNA marker linked to a bacterial wilt resistance locus of a Capsicum plant according to any of (A) to (Q) below.
(A) Primer set for amplification of DNA marker Rs1 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (B) including the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 Primer set for amplification of DNA marker Rs2 composed of an oligonucleotide and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (C) An oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 6 Primer set for amplification of DNA marker Rs3 composed of oligonucleotide (D) For amplification of DNA marker Rs4 composed of oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 Primer set (E) Oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 And a primer set for amplifying DNA marker Rs5 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 (F) An oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 DNA marker Rs6 amplification primer set comprising: (G) DNA marker Rs7 amplification primer set comprising an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 (H) DNA marker Rs8 amplification primer set comprising an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 (I) comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 An oligonucleotide comprising the oligonucleotide and the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 Primer set for amplification of DNA marker Rs9 composed of nucleotides (J) Primer for amplification of DNA marker Rs10 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 DNA marker Rs11 amplification primer set (L) consisting of an oligonucleotide containing the base sequence shown in set (K) SEQ ID NO: 21 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 (L) The base sequence shown in SEQ ID NO: 23 A DNA marker Rs13 amplification primer set (M) composed of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 DNA markers composed of oligonucleotides containing Rs14 amplification primer set (N) DNA marker Rs15 amplification primer set (O) consisting of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 A DNA marker Rs16 amplification primer set (P) composed of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 DNA marker Rs17 amplification primer set (Q) composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown (Q) composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 Primer set for amplification of DNA marker Rs18
（２） カプシカム属植物がピーマンである、（１）に記載のプライマーセット。
（３） カプシカム属植物から抽出した核酸を鋳型とし、（１）に記載のプライマーセットの１種または複数種を用いてPCRを行い、該PCRにより得られた増幅断片長を解析して、青枯病抵抗性を有するカプシカム属植物個体を選抜する方法。
（４） （１）に記載のプライマーセットを含む、青枯病抵抗性を有するカプシカム属植物個体の選抜用キット。
(2) The primer set according to (1), wherein the Capsicum plant is peppers.
(3) Using a nucleic acid extracted from a Capsicum plant as a template, performing PCR using one or more of the primer sets described in (1), analyzing the length of the amplified fragment obtained by the PCR, A method for selecting Capsicum plants having blight resistance.
(4) A kit for selecting Capsicum plants having resistance to bacterial wilt, comprising the primer set according to (1).
本発明によれば、カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座と連鎖するDNAマーカーを増幅するためのプライマーセットが提供される。本発明のプライマーセットを用いることにより、温度などの環境条件や植物の生育ステージに左右されることなく、青枯病抵抗性を有するカプシカム属植物個体を育苗段階で早期にかつ効率よく選抜を行うことができる。従って、本発明は、青枯病抵抗性を有するカプシカム植物の育種に際し、育種効率の向上、労力や時間の軽減、コストの削減、栽培面積の削減に有用である。 According to the present invention, a primer set for amplifying a DNA marker linked to a bacterial wilt resistance locus of Capsicum is provided. By using the primer set of the present invention, Capsicum genus plants having resistance to bacterial wilt can be selected early and efficiently at the seedling stage, regardless of environmental conditions such as temperature and the growth stage of the plant. be able to. Therefore, the present invention is useful for improving the efficiency of breeding, reducing labor and time, reducing costs, and reducing the cultivation area when breeding capsicum plants having resistance to bacterial wilt.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖するDNAマーカー
カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを取得するための手順を説明する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. A DNA marker linked to the bacterial wilt resistance locus of Capsicum plants The procedure for obtaining a DNA marker linked to the bacterial wilt resistance locus of Capsicum plants will be described.
まず、カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座の推定のために用いる解析集団として、カプシカム属の青枯病罹病性系統と青枯病抵抗性系統を交配して得られるF1系統を葯培養して抵抗性の程度に差のある倍加半数体（doubled haploid、以下DHという）系統を育成する。カプシカム属の青枯病罹病性系統としては、例えば、宮崎県総合農業試験場が葯培養によって育成したベルタイプのピーマンである「K9-11」を用いることができる。カプシカム属の青枯病抵抗性系統としては、例えば、トウガラシ野生種LS2341を宮崎県総合農業試験場において青枯病接種検定後に選抜自殖した後代系統である「MZC-180」を用いることができる。「MZC-180」はCapsicum annuum L.に属し、強度青枯病抵抗性を有する系統であり、その病害抵抗性形質は他カプシカム属の品種及び系統とは異なり非常に強い抵抗性である。ここで、育成するDH集団は、規模が大きいほうが好ましく、150系統以上の集団を用いることが好ましい。 First, as an analysis group used to estimate the bacterial wilt resistance locus of Capsicum spp., The F1 strain obtained by crossing the Capsicum spp. Then, a doubled haploid (hereinafter referred to as DH) line having a difference in resistance is bred. For example, “K9-11”, which is a bell-type bell pepper cultivated by anther culture at Miyazaki Prefectural Agricultural Experiment Station, can be used as the strain susceptible to bacterial wilt of the genus Capsicum. As the bacterial wilt resistance line of Capsicum, for example, “MZC-180” which is a progeny line in which capsicum wild species LS2341 is selected and bred after inoculation test against bacterial wilt at the Miyazaki Prefectural Agricultural Experiment Station can be used. “MZC-180” belongs to Capsicum annuum L. and is a strain having strong resistance to bacterial wilt, and its disease resistance traits are very strong, unlike varieties and strains of other capsicum species. Here, the DH population to be cultivated preferably has a large scale, and it is preferable to use a population of 150 lines or more.
次に、青枯病罹病性系統と青枯病抵抗性系統との間で多型を示すDNAマーカーを検索する。当該DNAマーカーとしては、増幅断片長多型（AFLP）マーカー、ランダム増幅多型（RAPD）マーカー、単純反復配列（SSR）マーカーを挙げることができる。 Next, a DNA marker showing a polymorphism between bacterial wilt susceptibility lines and bacterial wilt resistant lines is searched. Examples of the DNA marker include an amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker, a random amplification polymorphism (RAPD) marker, and a simple repeat sequence (SSR) marker.
AFLPマーカーとは、AFLP法によって得られるDNAマーカーをいい、抽出したDNAを制限酵素（例えばMseI，EcoRI）で消化した断片に、DNAリガーゼを用いてアダプターを結合させたオリゴヌクレオチドを鋳型として用い、いわゆる前選択合成オリゴヌクレオチドを用いたPCRを行い、次いで、この増幅断片を鋳型にして、いわゆる選択合成オリゴヌクレオチドを組み合わせてPCRを行うことによって得られる。これらの用いる制限酵素や合成オリゴヌクレオチドの種類を変えることにより、容易にかつ数多くのDNAマーカーを得ることができる。 The AFLP marker refers to a DNA marker obtained by the AFLP method. The extracted DNA is digested with a restriction enzyme (for example, MseI, EcoRI), and an oligonucleotide in which an adapter is bound using DNA ligase as a template. PCR is performed using a so-called pre-selected synthetic oligonucleotide, and then PCR is performed using this amplified fragment as a template and combining so-called selective synthetic oligonucleotides. Many DNA markers can be easily obtained by changing the types of restriction enzymes and synthetic oligonucleotides used.
RAPDマーカーとは、RAPD法によって得られるDNAマーカーをいい、抽出したDNAを任意の10〜12塩基の配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRすることによって得られる。これらの用いる合成オリゴヌクレオチドの種類を変えることにより、容易にかつ数多くのDNAマーカーを得ることができる。 The RAPD marker refers to a DNA marker obtained by the RAPD method, and can be obtained by PCR of the extracted DNA using a synthetic oligonucleotide having an arbitrary 10 to 12 base sequence. By changing the type of these synthetic oligonucleotides used, many DNA markers can be obtained easily.
SSRマーカーとは、ゲノム上に広く散在している数塩基の繰り返し配列からなる反復配列を利用して得られるDNAマーカーをいい、抽出したDNAを特定の20〜30塩基程度の配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRすることによって得られる。このSSRマーカーは、一度に得られるDNAマーカー数は少ないものの、多型性に富み、且つゲノム上の位置情報が明確であるため、動植物において種々のDNAマーカーとして利用されている。 An SSR marker is a DNA marker obtained by using a repetitive sequence consisting of several bases widely scattered on the genome, and the extracted DNA is a synthetic oligo having a specific sequence of about 20-30 bases. It is obtained by PCR using nucleotides. Although the number of DNA markers obtained at one time is small, this SSR marker is rich in polymorphism and has clear location information on the genome, and thus is used as various DNA markers in animals and plants.
上記DNAマーカー解析により、青枯病罹病性系統「K9-11」と青枯病抵抗性系統「MZC-180」の増幅産物を比較することにより、「K9-11」と「MZC-180」との間で多型検索を行い、「K9-11」と「MZC-180」にそれぞれ特異的に存在し、かつ上記で育成した「K9-11」と「MZC-180」の交配後代集団（DH集団）でその有無の分離が認められる増幅産物を、選抜用マーカーの候補として選択する。 By comparing the amplified products of bacterial susceptibility strain "K9-11" and bacterial wilt resistant strain "MZC-180" by the above DNA marker analysis, "K9-11" and "MZC-180" Polymorphism search between the K9-11 and MZC-180, respectively, and the progeny of hybrids (DH9-11 and MZC-180) that were bred above (DH) An amplification product in which the presence / absence is recognized in the group) is selected as a candidate for a selection marker.
次に、前記のDH集団を用いて青枯病菌接種検定を行い、その表現型（青枯病発病指数）の分離パターンと、候補DNAマーカーの多型分布を調査して連鎖地図を作製する。DNAマーカーによる連鎖地図は、例えばMAPMAKER Ver. 3.0［Lander, E., P. Green, J. Abrahamson, A. Barlow, M. Daley, S. Lincoln and L. Newburg (1987) MAPMAKER: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1:174-181.］で作製することができる。 Next, the bacterial wilt inoculation test is performed using the DH population, and the linkage pattern is prepared by examining the separation pattern of the phenotype (bacterial wilt pathogenesis index) and the polymorphism distribution of candidate DNA markers. For example, MAPMAKER Ver. 3.0 [Lander, E., P. Green, J. Abrahamson, A. Barlow, M. Daley, S. Lincoln and L. Newburg (1987) MAPMAKER: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1: 174-181.].
連鎖地図を作製した後、青枯病抵抗性遺伝子座と強く連鎖するDNAマーカーを詳細に特定するために、DH集団における青枯病接種検定結果とDNAマーカーが示す多型との関連についてQTL解析を行う。QTL解析は、例えばMAPMAKER/QTL Ver. 1.1［Lincoln, S. E., M. J. Daily and E. S. Lander (1993) Mapping genes controlling quantitative traits using MAPMAKER/QTL version 1.1: a tutorial and reference manual, 2nd edn. Whitehead Institute Technical Report. Cambridge, Massachusetts.］で行うことができる。特定した領域に存在するDNAマーカーの中から、青枯病抵抗性個体の選抜に有効なDNAマーカーとして最適なものを選定する。その結果、本発明においては、カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖し、青枯病抵抗性個体の選抜に有効なDNAマーカーとして17個のSSRマーカー(Rs1〜Rs11、Rs13〜Rs18）を選定することができた。 After creating a linkage map, in order to identify in detail the DNA markers strongly linked to the bacterial wilt resistance locus, QTL analysis on the association between the bacterial wilt inoculation test results in the DH population and the polymorphisms indicated by the DNA markers I do. For example, MAPMAKER / QTL Ver. 1.1 [Lincoln, SE, MJ Daily and ES Lander (1993) Mapping genes controlling quantitative traits using MAPMAKER / QTL version 1.1: a tutorial and reference manual, 2nd edn.Whitehead Institute Technical Report. Cambridge, Massachusetts.]. From among the DNA markers present in the identified region, an optimal DNA marker that is effective for selection of bacterial wilt resistant individuals is selected. As a result, in the present invention, 17 SSR markers (Rs1 to Rs11, Rs13 to Rs18) are linked to the bacterial wilt resistance locus of Capsicum plants as DNA markers effective for selection of bacterial wilt resistant individuals. ) Could be selected.
２．カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖するDNAマーカー増幅用プライマーセット
上記のSSRマーカー(Rs1〜Rs11、Rs13〜Rs18）は、カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座と連鎖しているため、青枯病抵抗性形質の検出に利用することができる。本発明によれば、この検出を容易に行うために、当該SSRマーカー(Rs1〜Rs11、Rs13〜Rs18）を特異的に増幅できるプライマーセットが提供される。
2. Primer set for amplification of DNA marker linked to bacterial wilt resistance locus of Capsicum sp. The above SSR markers (Rs1-Rs11, Rs13-Rs18) are linked to the bacterial wilt resistance locus of Capsicum. Therefore, it can be used to detect bacterial wilt resistance traits. According to the present invention, a primer set capable of specifically amplifying the SSR markers (Rs1 to Rs11, Rs13 to Rs18) is provided to facilitate this detection.
本発明のプライマーセットは、カプシカム属植物の青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを特異的に増幅することのできるオリゴヌクレオチドのペアから構成される下記の17組のプライマーセットである。本発明のプライマーセットを用いたPCR増幅産物を指標としてカプシカム属植物が青枯病抵抗性を有するか否かの識別、および青枯病抵抗性を有するカプシカム属植物個体の選抜を行うことできる。
（A） 配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs1増幅用プライマーセット
5'-caaatcttaccctaccgtaag-3' (配列番号１)
5'-ggttctaaacgagttagtgaaac-3' (配列番号２)
（B） 配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs2増幅用プライマーセット
5'-ctcacaccttacaatcttttggtatg-3' (配列番号３)
5'-ctctctgtctctgtctctgtc-3' (配列番号４)
（C） 配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs3増幅用プライマーセット
5'-atcaaatggctaacaatcattccg-3' (配列番号５)
5'-gtttgaagcaatgggtttaacaagcagg-3' (配列番号６)
（D） 配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs4増幅用プライマーセット
5'-acctcaacagcatccaatgttacaa-3' (配列番号７)
5'-gtttgcatatcagcagaagccataattgg-3' (配列番号８)
（E） 配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs5増幅用プライマーセット
5'-gcagaagccataattggctg-3' (配列番号９)
5'-ggagttaactcaaaggttgc-3' (配列番号１０)
（F） 配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs6増幅用プライマーセット
5'-tgagggtattttcgtcatttcac-3' (配列番号１１)
5'-gaaagcggaaaacattaagagtca-3' (配列番号１２)
（G） 配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs7増幅用プライマーセット
5'-tctttgtccctgctgctgta-3' (配列番号１３)
5'-accccaaaacacaaccaaaa-3' (配列番号１４)
（H) 配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs8増幅用プライマーセット
5'- acgaggcccaagctgttatgtc -3' (配列番号１５)
5'- ttgtcccgactctccattgacc -3' (配列番号１６)
（I） 配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs9増幅用プライマーセット
5'-tgctttcaaaacaatttgcatgg -3' (配列番号１７)
5'-gcgtctaatgcaaaacacacattac -3' (配列番号１８)
（J）配列番号１９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs10増幅用プライマーセット
5'-ataatgcatgctaaatccggttcc -3' (配列番号１９)
5'-gtttagctgttctcgaagccgaactcta -3' (配列番号２０)
（K）配列番号２１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs11増幅用プライマーセット
5'-ctaggcaatttgaaggccaa -3' (配列番号２１)
5'-gggtgatggaagtatggtgg -3' (配列番号２２)
（L）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs13増幅用プライマーセット
5'-agtcatcaacttcgcgttattgtc-3' (配列番号２３)
5'-gtttctgctgtttggccatatcc-3' (配列番号２４)
（M）配列番号２５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs14増幅用プライマーセット
5'-gtggtgcttcattctctacct-3' (配列番号２５)
5'-ccaacagatgtgtcagttatttgct-3' (配列番号２６)
（N）配列番号２７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs15増幅用プライマーセット
5'-atgatatctgaacgatgtgtcggg-3' (配列番号２７)
5'-gtttaattcaatgcgatggaaagagcc-3' (配列番号２８)
（O）配列番号２９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs16増幅用プライマーセット
5'-gatagtatctatgattgacgagac-3' (配列番号２９)
5'-cttgtgacggaatgtaacaacac-3' (配列番号３０)
（P）配列番号３１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs17増幅用プライマーセット
5'-gtgttgcagggcattccttga-3' (配列番号３１)
5'-ttcactggagggatgtccca-3' (配列番号３２)
（Q）配列番号３３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs18増幅用プライマーセット
5'-aagaagggggagatgatgacga-3' (配列番号３３)
5'-tcctcaagccatgatagagaagca-3' (配列番号３４)
The primer set of the present invention is the following 17 primer sets composed of a pair of oligonucleotides capable of specifically amplifying a DNA marker linked to the bacterial wilt resistance locus of Capsicum. Using the PCR amplification product using the primer set of the present invention as an index, it is possible to identify whether a Capsicum genus plant has bacterial wilt resistance or to select an individual Capsicum genus having bacterial wilt resistance.
(A) Primer set for amplifying a DNA marker Rs1 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
5'-caaatcttaccctaccgtaag-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-ggttctaaacgagttagtgaaac-3 '(SEQ ID NO: 2)
(B) A primer set for amplifying a DNA marker Rs2 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
5'-ctcacaccttacaatcttttggtatg-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-ctctctgtctctgtctctgtc-3 '(SEQ ID NO: 4)
(C) A primer set for amplifying a DNA marker Rs3, comprising an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 6
5'-atcaaatggctaacaatcattccg-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-gtttgaagcaatgggtttaacaagcagg-3 '(SEQ ID NO: 6)
(D) A primer set for amplifying a DNA marker Rs4 comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 8
5'-acctcaacagcatccaatgttacaa-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-gtttgcatatcagcagaagccataattgg-3 '(SEQ ID NO: 8)
(E) A primer set for amplifying a DNA marker Rs5, comprising an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 10
5'-gcagaagccataattggctg-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-ggagttaactcaaaggttgc-3 '(SEQ ID NO: 10)
(F) A primer set for amplifying a DNA marker Rs6, comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 12
5'-tgagggtattttcgtcatttcac-3 '(SEQ ID NO: 11)
5'-gaaagcggaaaacattaagagtca-3 '(SEQ ID NO: 12)
(G) A primer set for amplifying a DNA marker Rs7, comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 14
5'-tctttgtccctgctgctgta-3 '(SEQ ID NO: 13)
5'-accccaaaacacaaccaaaa-3 '(SEQ ID NO: 14)
(H) A primer set for amplifying a DNA marker Rs8, which comprises an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 16
5'-acgaggcccaagctgttatgtc-3 '(SEQ ID NO: 15)
5'-ttgtcccgactctccattgacc-3 '(SEQ ID NO: 16)
(I) DNA marker Rs9 amplification primer set comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 18
5'-tgctttcaaaacaatttgcatgg -3 '(SEQ ID NO: 17)
5'-gcgtctaatgcaaaacacacattac-3 '(SEQ ID NO: 18)
(J) A primer set for amplifying a DNA marker Rs10 comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 20
5'-ataatgcatgctaaatccggttcc-3 '(SEQ ID NO: 19)
5'-gtttagctgttctcgaagccgaactcta-3 '(SEQ ID NO: 20)
(K) A primer set for amplifying a DNA marker Rs11 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 22
5'-ctaggcaatttgaaggccaa-3 '(SEQ ID NO: 21)
5'-gggtgatggaagtatggtgg -3 '(SEQ ID NO: 22)
(L) A primer set for amplifying a DNA marker Rs13, comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 24
5'-agtcatcaacttcgcgttattgtc-3 '(SEQ ID NO: 23)
5'-gtttctgctgtttggccatatcc-3 '(SEQ ID NO: 24)
(M) A primer set for amplifying a DNA marker Rs14, which comprises an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 26
5'-gtggtgcttcattctctacct-3 '(SEQ ID NO: 25)
5'-ccaacagatgtgtcagttatttgct-3 '(SEQ ID NO: 26)
(N) A primer set for amplifying a DNA marker Rs15, which comprises an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 28
5'-atgatatctgaacgatgtgtcggg-3 '(SEQ ID NO: 27)
5'-gtttaattcaatgcgatggaaagagcc-3 '(SEQ ID NO: 28)
(O) Primer set for amplification of DNA marker Rs16, comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 30
5'-gatagtatctatgattgacgagac-3 '(SEQ ID NO: 29)
5'-cttgtgacggaatgtaacaacac-3 '(SEQ ID NO: 30)
(P) A primer set for amplifying a DNA marker Rs17 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 32
5'-gtgttgcagggcattccttga-3 '(SEQ ID NO: 31)
5'-ttcactggagggatgtccca-3 '(SEQ ID NO: 32)
(Q) DNA marker Rs18 amplification primer set comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34
5'-aagaagggggagatgatgacga-3 '(SEQ ID NO: 33)
5'-tcctcaagccatgatagagaagca-3 '(SEQ ID NO: 34)
上記プライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、配列番号1〜３４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと実質的に同一の機能を有する限り、配列番号1〜３４に示す塩基配列において1〜数個（例えば、５個、好ましくは３個、より好ましくは１個）の塩基が欠失、付加、置換した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。 As long as each oligonucleotide of the primer set has substantially the same function as the oligonucleotide consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 34, 1 to several (for example, It may be an oligonucleotide having a base sequence in which 5 (preferably 3, and more preferably 1) bases have been deleted, added or substituted.
上記プライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置（例えば、Applied Biosystems社製Model 394など)を利用して合成することが可能である。 Each oligonucleotide of the above primer set is prepared by a method known in the art as an oligonucleotide synthesis method, for example, a phosphotriethyl method, a phosphodiester method, etc., and a DNA automatic synthesizer usually used (for example, Model manufactured by Applied Biosystems). 394).
また、上記オリゴヌクレオチドは、これらをプライマーとするPCR増幅産物の検出を容易にするために、標識物質をつけたオリゴヌクレオチドであってもよい。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる蛍光物質（FITC、ROC等）、放射性同位体、化学発光物質（例えば、DNP）、ビオチン、DIG（ジゴキシゲニン）等を用いることができる。 Further, the oligonucleotide may be an oligonucleotide to which a labeling substance is attached in order to facilitate detection of PCR amplification products using these as primers. As the labeling substance, fluorescent substances well known in the art (FITC, ROC, etc.), radioisotopes, chemiluminescent substances (for example, DNP), biotin, DIG (digoxigenin) and the like can be used.
３．青枯病抵抗性カプシカム属植物個体の選抜方法
本発明の青枯病抵抗性カプシカム属植物個体の選抜方法は、カプシカム属植物個体から抽出した核酸を鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてPCRを行い、該PCRにより得られた増幅断片長を解析することにより行う。
3. Method for selecting plant genus Capsicum resistant to bacterial wilt disease The method for selecting plant genus Capsicum resistant to bacterial wilt disease of the present invention is performed by using the nucleic acid extracted from an individual plant belonging to the genus Capsicum as a template and PCR using the above primer set. The analysis is performed by analyzing the length of the amplified fragment obtained by the PCR.
本発明において「カプシカム属植物」とは、ナス科（Solanaceae）カプシカム属（Capsicum)に属する植物で、代表的な種としては、Capsicum annuum、Capsicum Chinese、Capsicum baccatum、Capsicum frutescens等を挙げることができる。なお、カプシカム属の中で、我が国において最も生産流通が多い種は、Capsicum annuumであり、それに属する野菜としては、ピーマン、シシトウガラシ、パプリカ等である。 In the present invention, the “capsicum plant” refers to a plant belonging to the genus Capsicum ( Solanaceae ), and typical species include Capsicum annuum , Capsicum Chinese , Capsicum baccatum , Capsicum frutescens, and the like. . Of the Capsicum species, Capsicum annuum is the most commonly produced species in Japan, and vegetables belonging to it include pepper, pepper, and paprika.
上記プライマーセットは、識別・選抜すべき被検植物の種類や数によって、全てを用いる必要はなく、プライマーセットの1種または複数種を適宜組み合わせて用いてもよい。 It is not necessary to use all the primer sets depending on the type and number of test plants to be identified and selected, and one or more primer sets may be used in appropriate combination.
具体的手順を例示すると以下のようになる。まず、被検植物となるカプシカム属植物個体からDNAを抽出する。DNA抽出に用いる植物体の組織は特に限定されず、葉、果実、種子、根、茎など、いずれの組織であってもよいが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの組織は、核酸抽出の効率を良く行うことができるように液体窒素を用いて粉砕しておくことが好ましい。 A specific procedure is exemplified as follows. First, DNA is extracted from an individual plant belonging to the genus Capsicum as a test plant. The tissue of the plant used for DNA extraction is not particularly limited and may be any tissue such as leaves, fruits, seeds, roots, stems, etc., but preferably leaves are used. Furthermore, these tissues are preferably pulverized with liquid nitrogen so that nucleic acid extraction can be efficiently performed.
DNAの抽出は、公知の方法で行うことができ、好ましくはCTBA法［Murrayら、Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)］が用いられる。具体的には、以下のような手順で行う。まずカプシカム属植物個体の葉などの組織を液体窒素中で磨砕する。該磨砕物に臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）溶液を添加してインキュベートした後、クロロホルム−イソアミルアルコールを加えてよく混和する。遠心分離により水層を分離・回収し、これにイソプロピルアルコールを加えてよく混和する。遠心分離により沈殿部を回収後、例えばEDTA等含有の緩衝液を加えて溶解し、RNase処理する。処理後、フェノール、フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール、クロロホルム−イソアミルアルコールの順序で溶媒を置換する。置換処理後、エタノールを加えてよく混和し、遠心分離によりゲノムDNAを得ることができる。抽出には市販のキット（例えば、QIAGEN社の「DNeasy」等）を利用して行うこともできる。なお、DNA抽出量としては、DNAマーカーの解析が可能な量が抽出されていればよい。PCRに供する場合には、例えば、1反応あたり1ng以上である。 Extraction of DNA can be performed by a known method, preferably the CTBA method [Murray et al., Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)]. Specifically, the procedure is as follows. First, tissue such as leaves of Capsicum plants is ground in liquid nitrogen. After cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) solution is added to the ground product and incubated, chloroform-isoamyl alcohol is added and mixed well. Isolate and collect the aqueous layer by centrifugation, add isopropyl alcohol and mix well. After recovering the precipitate by centrifugation, a buffer solution containing, for example, EDTA is added and dissolved, followed by RNase treatment. After the treatment, the solvent is replaced in the order of phenol, phenol, chloroform-isoamyl alcohol, and chloroform-isoamyl alcohol. After the replacement treatment, ethanol can be added and mixed well, and genomic DNA can be obtained by centrifugation. The extraction can also be performed using a commercially available kit (for example, “DNeasy” manufactured by QIAGEN). As the amount of DNA extracted, it is sufficient that an amount capable of analyzing the DNA marker is extracted. When subjected to PCR, for example, it is 1 ng or more per reaction.
次いで、抽出したDNAを鋳型とし、本発明のプライマーセットの１種または複数種を用いて、PCR増幅を行う。PCR増幅は前述のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、鋳型DNAの変性、プライマーへの鋳型へのアニーリング、および耐熱性酵素（Taqポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、目的とする青枯病抵抗性遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを含む断片を増幅させる。PCR反応液の組成、PCR反応条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、上記のプライマーセットを用いたPCRにおいて高感度でPCR増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択および設定することができる。プライマーのＴｍに基づいて適当なPCR反応条件を選択する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、最初に94℃で2分間の変性反応、次に94℃で1分間、45℃で1分間、72℃で3分間を1サイクルとして30サイクル、最後に72℃で5分間の伸長反応により実施することができる。このようなPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。PCR装置は、例えば、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製)、GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems社製）などが使用できる。 Next, PCR amplification is performed using the extracted DNA as a template and one or more of the primer sets of the present invention. PCR amplification is not particularly limited except that the above primer set is used, and may be performed according to a conventional method. Specifically, the target bacterial wilt resistance gene is repeated by repeating a cycle that includes denaturation of template DNA, annealing of the primer to the template, and primer extension using a thermostable enzyme (Taq polymerase). Amplify a fragment containing a DNA marker linked to the locus. The composition of the PCR reaction solution and the PCR reaction conditions (temperature cycle, number of cycles, etc.) should be determined by a person skilled in the art based on preliminary experiments, etc. under conditions such that a PCR amplification product can be obtained with high sensitivity in PCR using the above primer set. Can be selected and set appropriately. Methods for selecting appropriate PCR reaction conditions based on the Tm of the primer are well known in the art, for example, first a denaturation reaction at 94 ° C. for 2 minutes, then 94 ° C. for 1 minute, 45 ° C. For 1 minute, 72 ° C. for 3 minutes as 30 cycles, and finally 72 ° C. for 5 minutes by extension reaction. Such a series of PCR operations can be performed using a commercially available PCR kit or PCR apparatus according to the operating instructions. For example, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems), GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems), or the like can be used as the PCR apparatus.
PCR増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動、DNAハイブリダイゼーションやリアルタイムPCR等の方法を用いて確認する。例えば、アガロースゲル電気泳動では、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を単一のバンドとして検出し、バンドの位置に基づいて、「青枯病抵抗性型」か否かを判定する。 Detection of PCR amplification products is confirmed using methods such as conventional electrophoresis such as agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis, DNA hybridization and real-time PCR. For example, in agarose gel electrophoresis, staining is performed with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band. Determine.
上記プライマーセットはキット化することもできる。本発明のキットは、上記の17組のプライマーセットを含むものであればよく、識別・選抜すべき被検植物の種類や数によって、これらのプライマーセットの中から適当なセットを適宜選択して用いればよい。本発明のキットには、必要に応じて、DNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬、反応の陽性コントロールとなるPCR増幅領域を含むDNA溶液、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書などを含んでいてもよい。 The primer set can also be made into a kit. The kit of the present invention only needs to contain the above 17 primer sets, and an appropriate set is appropriately selected from these primer sets depending on the type and number of test plants to be identified and selected. Use it. If necessary, the kit of the present invention includes DNA extraction reagents, PCR reagents such as PCR buffers and DNA polymerase, DNA solutions containing PCR amplification regions that serve as positive controls for reactions, stains, and electrophoresis. It may contain detection reagents such as gels, instructions and the like.
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１）DNAマーカーを用いたピーマン連鎖地図の作成
(1) 解析材料となる倍加半数体系統（DH)の育成
青枯病罹病性系統「K9-11」と、強度の青枯病抵抗性を有するトウガラシ野生種LS2341の自殖後代から青枯病菌接種試験により選抜した青枯病抵抗性系統「MZC-180」とを交配して得られたF1系統を葯培養し、抵抗性の程度に差のある倍加半数体（DH:doubled haploid）184系統を育成した。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but these examples do not limit the present invention.
(Example 1) Creation of a bell pepper linkage map using a DNA marker
(1) Breeding of doubling haploid strains (DH) as analytical materials Bacterial wilt disease strain “K9-11” and the wild red pepper LS2341 resistant to bacterial wilt disease from the inbred progeny of bacterial wilt F1 strains obtained by crossing with the bacterial wilt resistant strain “MZC-180” selected by the inoculation test were cultivated, and 184 doubled haploid (DH) 184 strains with different degrees of resistance Nurtured.
(2) DNA抽出
上記各系統植物からのDNA抽出・精製は市販のDNA抽出・精製キット（DNeasy Plant mini Kit；キアゲン社製）を用い、具体的な操作はキアゲン社の推奨するプロトコルに従って行った。まず、植物の新鮮な上位葉1枚程度（約0.1 g）を液体窒素で冷やしておいた乳鉢上でパウダー状になるまで粉砕し、当該粉砕サンプルにプロトコルに従ってAP1 Buffer（同キット添付）とRNase A を添加し、65℃で10分間インキュベートした。次いで、AP2 Buffer（同キット添付）を加え、氷上で5 分間静置した後、遠心分離した。得られた上清をQIA shredder spin columnを用いて遠心分離し、溶出したろ液をAP3/E Buffer（同キット添付）と混和した。この混和液をDNeasy spin culumnに加えて遠心分離し、溶出液を除去した後、カラムにAW Buffer（同キット添付）を加え遠心分離することでリンスした。さらにもう1回AW Bufferを加え、遠心分離を行い、DNAの吸着したメンブレンからエタノールを完全に取り除いた。このメンブレンにAE Buffer（同キット添付）を加え5分以上静置した後、遠心分離し、DNAを抽出した。さらにもう1回この操作を繰り返した。得られたDNA抽出液の濃度は約400 ng/μLであった。得られたDNA抽出液をTEバッファー（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0）で25 ng/μLに希釈したDNA溶液を、鋳型DNAとして試験に用いた。
(2) DNA extraction DNA extraction / purification from the above-mentioned plants was performed using a commercially available DNA extraction / purification kit (DNeasy Plant mini Kit; manufactured by Qiagen), and the specific operation was performed according to the recommended protocol of Qiagen. . First, pulverize about 1 fresh upper leaf (about 0.1 g) of the plant in a mortar that has been cooled with liquid nitrogen until it becomes powdery, then add AP1 Buffer (attached to the kit) and RNase according to the protocol. A was added and incubated at 65 ° C. for 10 minutes. Next, AP2 Buffer (attached to the same kit) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes and then centrifuged. The obtained supernatant was centrifuged using a QIA shredder spin column, and the eluted filtrate was mixed with AP3 / E Buffer (attached to the same kit). The mixture was added to DNeasy spin culumn and centrifuged, and the eluate was removed. Then, AW Buffer (attached to the same kit) was added to the column, followed by centrifuging. Further, AW Buffer was added once more, and centrifugation was performed to completely remove ethanol from the membrane adsorbed with DNA. AE Buffer (attached to the same kit) was added to the membrane, allowed to stand for 5 minutes or longer, and then centrifuged to extract DNA. This operation was repeated once more. The concentration of the obtained DNA extract was about 400 ng / μL. A DNA solution obtained by diluting the obtained DNA extract with TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) to 25 ng / μL was used as a template DNA for the test.
（3） DNAマーカー解析
DH集団184系統を用いた連鎖解析によって連鎖地図を作製することを目的として、「K9-11」と「MZC-180」との間で多型のあるDNAマーカーを検索した。
(3) DNA marker analysis
DNA markers with polymorphisms were searched between “K9-11” and “MZC-180” for the purpose of creating a linkage map by linkage analysis using 184 DH populations.
DNAマーカーには、増幅断片長多型（AFLP）マーカー、ランダム増幅多型（RAPD）マーカー、単純反復配列（SSR）マーカーを用いた。
（3-1）AFLPマーカー解析
上記(2)で抽出したDNAを鋳型として、AFLP／HEGS法［Kawasaki, S. and Y. Murakami (2000) Genome Analysis of Lotus japonicus. J. Plant Res. 113:497-506.］を行った。まず、抽出したDNAに制限酵素Pst IとMse I、又はXba IとMse Iを加え、37℃で12時間制限酵素処理を行った。次に、制限酵素処理断片にPst IアダプターとMse Iアダプター、又はXba IアダプターとMse Iアダプターを加えて室温で4時間DNAリガーゼによるライゲーション反応を行った後、Pst I又はXba IとMse Iアダプターの部分塩基配列とそれに隣接する制限酵素の切断面の塩基配列とで構成されるPst I又はXba IとMse I前選択プライマーを用いてPCR（反応条件：94℃で１分間の前処理後、94℃で30秒間(熱変性)、56℃で1分間（アニーリング）、72℃で1分間（伸長）からなる反応を１サイクルとして計20サイクル）を行った。その後、Pst I又はXba IとMse I前選択プライマーの3'末端側にさらに任意の3塩基を付加した塩基配列を有するPst I又はXba I選択プライマー（各31種類）、Mse I選択プライマー（16種類）を用い、合計992（31x16x2）通りの選択PCR（反応条件：94℃で30秒間(熱変性)、68℃（-0.7℃/1サイクル）で30秒間（アニーリング）、72℃で１分間（伸長）からなる反応を１サイクルとして計17サイクル、その後、94℃で30秒間(熱変性)、56℃で30秒間（アニーリング）、72℃で１分間（伸長）からなる反応を１サイクルとして計23サイクル）を行った。なお、各段階におけるPCR反応は、DNAサーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700；Perkin-Elmer社）を使用し、Kawasaki, S. and Y. Murakami (2000)の手法に従って行った。得られたPCR増幅産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(日本エイドー社製４連式電気泳動装置を使用）後、SYBR Green I希釈溶液に30分間浸し、FUJI FILM社製フルオロイメージアナライザー（FLA5100）で撮影を行うことによって検出した。
As the DNA marker, an amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker, a random amplification polymorphism (RAPD) marker, and a simple repeat sequence (SSR) marker were used.
(3-1) AFLP marker analysis Using the DNA extracted in (2) above as a template, AFLP / HEGS method [Kawasaki, S. and Y. Murakami (2000) Genome Analysis of Lotus japonicus. J. Plant Res. 113: 497 -506.]. First, restriction enzymes Pst I and Mse I, or Xba I and Mse I were added to the extracted DNA, and restriction enzyme treatment was performed at 37 ° C. for 12 hours. Next, after adding Pst I adapter and Mse I adapter or Xba I adapter and Mse I adapter to the restriction enzyme-treated fragment and performing ligation reaction with DNA ligase at room temperature for 4 hours, Pst I or Xba I and Mse I adapter PCR using Pst I or Xba I and Mse I preselection primer composed of the partial base sequence of and the base sequence of the cleavage surface of the restriction enzyme adjacent thereto (reaction condition: after pretreatment at 94 ° C. for 1 minute, A reaction consisting of 94 ° C. for 30 seconds (thermal denaturation), 56 ° C. for 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 1 minute (extension) was performed for 20 cycles in total. After that, Pst I or Xba I selection primer (31 types each) having a base sequence in which any 3 bases are further added to the 3 ′ end side of the Pst I or Xba I and Mse I preselection primers, and the Mse I selection primer (16 992 (31x16x2) selection PCR (reaction conditions: 94 ° C for 30 seconds (thermal denaturation), 68 ° C (-0.7 ° C / 1 cycle) for 30 seconds (annealing), 72 ° C for 1 minute The reaction consisting of (extension) is a total of 17 cycles, and then the reaction consisting of 94 ° C for 30 seconds (thermal denaturation), 56 ° C for 30 seconds (annealing), and 72 ° C for 1 minute (extension) Total 23 cycles). The PCR reaction at each stage was performed using a DNA thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700; Perkin-Elmer) according to the method of Kawasaki, S. and Y. Murakami (2000). The obtained PCR amplification product was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (using a quadruple electrophoresis apparatus manufactured by Nihon Aido Co., Ltd.), then immersed in a diluted solution of SYBR Green I for 30 minutes, and a fluoro image analyzer (FLA5100) manufactured by FUJI FILM. It was detected by taking a picture.
（3-2）RAPDマーカー解析
上記(2)で抽出したDNAを鋳型として、任意の10〜12塩基の配列を持つプライマー（RAPDプライマー）を用いてRAPD法［Williams, J. G. K., A. R. Kubelik, K. J. Livak, J. A. Rafalski and S. V. Tingey (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genomic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535.］を行った。RAPDプライマーとして、オペロン社と和光純薬社から市販されている10塩基からなる計1,470種類[オペロン社：OPA（1〜20）〜OPZ（1〜20）, OPAA（1〜20）〜OPAZ（1〜20）, OPBA（1〜20）〜OPBH（1〜20）の計1200種類、和光純薬社：C(60種類), D(60種類), E(E-1,E-2,E-3の36種類)、その他A＋B+F+G(114種類)の計270種類]を用いた。
(3-2) RAPD marker analysis RAPD method [Williams, JGK, AR Kubelik, KJ Livak] using the DNA extracted in (2) above as a template and a primer (RAPD primer) with an arbitrary sequence of 10-12 bases , JA Rafalski and SV Tingey (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genomic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535.]. As RAPD primers, a total of 1,470 10 bases commercially available from Operon and Wako Pure Chemical Industries [Operon: OPA (1-20)-OPZ (1-20), OPAA (1-20)-OPAZ ( 1 to 20), OPBA (1 to 20) to OPBH (1 to 20), 1200 types in total, Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: C (60 types), D (60 types), E (E-1, E-2, 36 types of E-3) and 270 types of A + B + F + G (114 types)] were used.
DNA抽出液2μL（10ng/μL）、10×緩衝液（100mM Tris-HCl，500mM KCl，15mM MgCl2，タカラバイオ社）2μL、2.5mM dNTPs 2μL（タカラバイオ社）、20μM ランダムプライマー 1μL（オペロンバイオテクノロジー社）、5uints/μL Taqポリメラーゼ（rTaq；タカラバイオ社）0.4μL、蒸留水12.6μLを含む反応液を調製し、DNAサーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700；Perkin-Elmer社）を用いてPCR反応を行った（反応条件：95℃で１分間の前処理後、94℃で1分間(熱変性）、35℃で2分間（アニーリング）、72℃で3分間（伸長）からなる反応を1サイクルとして計40サイクルを行い、最後に72℃で5分間伸長反応する）。得られたPCR増幅産物は、アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色して検出した。
（3-3）SSRマーカー解析
SSRマーカーとして、(i) 新たに作製したゲノム由来SSRマーカー、(ii)データベース（Pepper Gene Index(CaGI2.0：13,003配列、http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/)に掲載のEST由来SSRマーカー、(iii)同データベースに掲載のEST配列情報を利用してread2Marker［read2Marker: H. Fukuoka et al., Bio Techniques 39:472-476 (2005)］によりSSRを検索し、新たにプライマーを設計したEST由来SSRマーカー、および（iv)文献（Yi G, Lee JM, Lee S, Choi D, Kim BD. (2006) Exploitation of pepper EST-SSRs and an SSR-based linkage map. Theor Appl Genet. 2006 Dec;114(1):113-30.；Lee, J.M., Nahm, S.H., Kim, Y.M., and Kim, B.D. (2004) Characterization and molecular genetic mapping of microsatellite loci in pepper. Theor. Appl. Genet. 108: 619-627）に報告されるSSRマーカーを用いた。
(3-3) SSR marker analysis
As SSR markers, (i) newly created genome-derived SSR markers, (ii) databases (Pepper Gene Index (CaGI2.0: 13,003 sequence, http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/) EST-derived SSR marker, (iii) SSR is searched by read2Marker [read2Marker: H. Fukuoka et al., Bio Techniques 39: 472-476 (2005)] using EST sequence information published in the same database, and newly EST-derived SSR markers with designed primers, and (iv) Literature (Yi G, Lee JM, Lee S, Choi D, Kim BD. (2006) Exploitation of pepper EST-SSRs and an SSR-based linkage map.
ゲノム由来SSRマーカーの作製は、Nunome et al., Plant Mol. Biol. Rep. 24, 305-312（2006）に従って行った。まず、青枯病罹病性系統「K9-11」の新鮮な上位葉を用いてCTAB法にて抽出したゲノムDNAを制限酵素Alu I, Hae III, およびRsa Iで完全消化後、DNAリガーゼを用いてDNA断片の両末端にアダプター配列を付加した。得られたDNA断片をビオチンで標識し、Dynabeads M-280 Streptavidin（DYNAL社製）により濃縮して回収した。回収したDNA断片を鋳型として、アダプター上に設計されたプライマーを用いてPCR反応を行った。 Genome-derived SSR markers were prepared according to Nunome et al., Plant Mol. Biol. Rep. 24, 305-312 (2006). First, genomic DNA extracted by the CTAB method using fresh upper leaves of bacterial susceptibility strain K9-11 was completely digested with restriction enzymes Alu I, Hae III, and Rsa I, and then DNA ligase was used. Thus, adapter sequences were added to both ends of the DNA fragment. The obtained DNA fragment was labeled with biotin, concentrated and recovered with Dynabeads M-280 Streptavidin (manufactured by DYNAL). Using the recovered DNA fragment as a template, a PCR reaction was performed using primers designed on the adapter.
PCR反応終了後、増幅断片は平滑末端の3’端Ａテール付加を行い、LigaFast Rapid DNA ligation system (Promega社製)によりプラスミドベクターに挿入し、次いでコンピテントセル（ElectroMAx DH10B：Invitrogen）への形質転換を行った。ランダムシーケンシングにより、得られたライブラリーの評価を行った後、ABI社製のApplied Biosystems 3730 DNA Analyzerにより大量シーケンシングを行った。得られたシーケンス情報を大量配列データの自動解析ツール［read2Marker: Fukuoka et al. , Biotechniques (2005)］を用いてSSRプライマーを作製した。 After completion of the PCR reaction, the amplified fragment is blunt-ended with a 3′-end A tail, inserted into a plasmid vector using the LigaFast Rapid DNA ligation system (Promega), and then transformed into competent cells (ElectroMAx DH10B: Invitrogen). Made a conversion. After the obtained library was evaluated by random sequencing, large-scale sequencing was performed using Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer manufactured by ABI. SSR primers were prepared from the obtained sequence information using an automatic analysis tool [read2Marker: Fukuoka et al., Biotechniques (2005)].
一方、EST由来SSRマーカーは、TIGRのPepper Gene Index(CaGI2.0：13,003配列、http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/)からSSRをread2Marker［read2Marker: Fukuoka et al. , Biotechniques (2005)］で検索し、プライマー設計したものか、あるいは、データベースに記載のものをそのまま用いた。 On the other hand, the EST-derived SSR marker was obtained by reading SSR from TIGR's Pepper Gene Index (CaGI2.0: 13,003 sequence, http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/) [read2Marker: Fukuoka et al., Biotechniques ( 2005)] and the primer design or the one described in the database was used as it was.
前記(2)で抽出したDNAを鋳型として、上記の各SSRマーカープライマーを用いてPCRを行った。PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700；Perkin-Elmer社）を使用し、10μLの反応液量で行った。反応液組成は、DNA抽出液1μL（10ng/μL）、10×緩衝液（100mM Tris-HCl，500mM KCl，15 mM MgCl2，タカラバイオ社）1μL、2.5mM dNTPs 1μL（タカラバイオ社）、20μMプライマー、5 uints/μL Taqポリメラーゼ（rTaq；タカラバイオ社）0.1μL、蒸留水5.9μLを含むように調製した。反応条件は、はじめに95℃で1分間の熱変性を行い、次いで94℃で1分（熱変性），55℃で1分（アニーリング），72℃で２分（伸長）を1サイクルとして計35サイクルで反応させ、最後に伸長反応を72℃で7分行った。
Using the DNA extracted in (2) as a template, PCR was performed using each of the above SSR marker primers. The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700; Perkin-Elmer) in a reaction volume of 10 μL. The composition of the reaction solution is 1 μL of DNA extract (10 ng / μL), 10 × buffer (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , Takara Bio) 1 μL, 2.5 mM
得られたPCR増幅産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(日本エイドー社製４連式電気泳動装置を使用）後、SYBR Green I希釈溶液に30分間浸し、FUJI FILM社製フルオロイメージアナライザー（FLA5100）で撮影を行うことによって検出した。 The obtained PCR amplification product was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (using a quadruple electrophoresis apparatus manufactured by Nihon Aido Co., Ltd.), then immersed in a diluted solution of SYBR Green I for 30 minutes, and a fluoro image analyzer (FLA5100) manufactured by FUJI FILM. It was detected by taking a picture.
(4) マーカーによる多型解析と連鎖地図の作成
上記で解析されたPCR増幅産物（バンド）について、「K9-11」と「MZC-180」の両親間で多型検索を行い、それぞれに特異的に存在し、かつDH集団184系統でその有無の分離が認められるマーカーを選択した。その結果、682個のAFLPマーカー、147個のRAPDマーカー、371個のSSRマーカーの計1200個のDNAマーカーが利用可能なマーカーであると判断された。
(4) Polymorphism analysis by marker and creation of linkage map Polymorphism search is performed between the parents of “K9-11” and “MZC-180” for the PCR amplification products (bands) analyzed above, and each is unique. Selected from the DH populations of 184 strains, which were separated from each other. As a result, a total of 1200 DNA markers including 682 AFLP markers, 147 RAPD markers, and 371 SSR markers were determined to be usable markers.
次に、DH集団184系統を用い、上記DNAマーカー座における遺伝子型の分離状況を調査した。この結果をもとに、MAPMAKER Ver. 3.0を用いて連鎖解析を行い、連鎖地図を作成した。解析の設定はMinimum LOD:3.0、組換え価：25cMとした。得られた高密度連鎖地図は、総連鎖群長が1504.4 cMで、15連鎖群（LG1〜LG15)から構成され、上記1200個のDNAマーカーが網羅的に座乗していた（図１Ａ〜Ｄ）。 Next, using 184 DH populations, the genotype segregation status at the DNA marker locus was investigated. Based on this result, linkage analysis was performed using MAPMAKER Ver. 3.0 to create a linkage map. The analysis settings were Minimum LOD: 3.0 and recombination value: 25 cM. The obtained high-density linkage map had a total linkage group length of 1504.4 cM, was composed of 15 linkage groups (LG1 to LG15), and the 1200 DNA markers were comprehensively seated (FIGS. 1A to 1D). ).
（実施例２）青枯病抵抗性評価
青枯病抵抗性分離系統であるDH集団184系統を用いて、青枯病菌接種検定による青枯病抵抗性の評価を行った。青枯病菌は、2-d菌株を用い、PS液体培地（ショ糖加用ジャガイモ煎汁液体培地）で30℃、48時間振とう培養し、菌濃度：2.0×108個/mlに調製したものを用いた。接種検定は、土壌病害検定装置で行い、検定植物の株元の両側をカッターナイフで断根し（断根かん注接種法、尾崎克己・木村俊彦 (1989). ナス属植物の青枯病抵抗性検定法. 中国農研報 4:103-117.）、その両側に調製した菌液を片側あたり10ml灌注した。接種後は、ハウス内温度及び地温が30℃以上になるように管理した。抵抗性の評価は、発病度合いを5段階評価（0：外部病徴が認められない、1：1〜2 葉が萎凋、2：3〜5 葉が萎凋、3：大部分の葉が萎凋、4：枯死）とし、2週間後の発病指数［Σ（発病評点×個体数）／全個体数］を求め、青枯病抵抗性評価結果とした。
(Example 2) Bacterial wilt resistance evaluation Using DH population 184 lines which are bacterial wilt resistant isolates, bacterial wilt resistance was evaluated by bacterial wilt bacteria inoculation test. The bacterial wilt fungus was cultivated at 30 ° C. for 48 hours in a PS liquid medium (potato squeezed potato broth liquid medium) using the 2-d strain, and the bacterial concentration was adjusted to 2.0 × 10 8 cells / ml. A thing was used. The inoculation test is carried out with a soil disease test device, and both sides of the plant stock of the test plant are rooted with a cutter knife (root inoculation method, Katsumi Ozaki, Toshihiko Kimura (1989). Method. Chinese Agricultural Research Bulletin 4: 103-117.), 10 ml per side of the bacterial solution prepared on both sides was irrigated. After inoculation, the temperature in the house and the ground temperature were controlled to be 30 ° C or higher. Resistance assessment is based on a five-point scale (0: no external symptom is observed, 1: 1-2 leaves are wilt, 2: 3-5 leaves are wilt, 3: most leaves are wilt, 4: withering), and the disease index [Σ (onset score x number of individuals) / total number of individuals] after 2 weeks was determined and used as the bacterial blight resistance evaluation result.
上記の青枯病菌接種検定による発病指数の度数分布を図２〜図４に示した。図２は、2006年に実施した青枯病菌接種検定によるもので、Ａは強接種検定(菌濃度: 2.0×108個/ml)８回の発病指数平均、Ｂは弱接種検定(菌濃度: 2.0×106 個/ml) ５回の発病指数平均を示している。図３は、2007年に実施した青枯病菌接種検定によるもので、強接種検定(菌濃度: 2.0×108個/ml)６回の発病指数平均を示している。図４は、2006年および2007年に実施した青枯病菌接種検定によるもので、強接種検定(菌濃度: 2.0×108 個/ml)14回の発病指数平均を示している。 The frequency distribution of the disease index according to the bacterial wilt inoculation test described above is shown in FIGS. Fig. 2 shows the results of the bacterial wilt inoculation test conducted in 2006. A is the strong inoculation test (bacterial concentration: 2.0 x 10 8 cells / ml). : 2.0 × 10 6 cells / ml) The average of 5 disease index is shown. FIG. 3 is based on the bacterial wilt inoculation test carried out in 2007, and shows the average of the disease index of 6 times of the strong inoculation test (bacterial concentration: 2.0 × 10 8 cells / ml). FIG. 4 is based on bacterial wilt inoculation tests conducted in 2006 and 2007, and shows the average disease index of 14 strong inoculation tests (bacterial concentration: 2.0 × 10 8 cells / ml).
（実施例３）QTL解析
実施例１のDNAマーカーを用いて作製した連鎖地図と実施例２のDH集団184系統の青枯病抵抗性評価結果を用いて、MAPMAKER/QTL Ver. 1.1でQTL(量的形質遺伝子座)解析を行い、青枯病抵抗性に関与している遺伝子が存在するゲノム中の領域を推定した。その結果、３つの連鎖群（LG2,4,8）上に青枯病抵抗性に対して強い寄与率を示すQTL(LOD>2.0)が認められ、このQTL領域には17個のSSRマーカーが座乗していた（図５Ａ〜Ｃ）。
(Example 3) QTL analysis Using the linkage map prepared using the DNA marker of Example 1 and the bacterial blight resistance evaluation results of the DH population of 184 lines of Example 2, QTL (MAPMAKER / QTL Ver. 1.1 Quantitative trait loci) were analyzed, and the region in the genome where genes involved in bacterial wilt resistance exist was estimated. As a result, QTL (LOD> 2.0) showing a strong contribution to bacterial wilt resistance was recognized on the three linkage groups (LG2, 4, 8), and 17 SSR markers were found in this QTL region. He was sitting (Figs. 5A-C).
同定された青枯病抵抗性に連鎖したSSRマーカー、および該マーカーを増幅するためのプライマーを下記表１にまとめる。 The identified SSR markers linked to bacterial wilt resistance and primers for amplifying the markers are summarized in Table 1 below.
（実施例４）SSRマーカーを用いた青枯病抵抗性判定
青枯病抵抗性分離系統であるDH集団184系統から抽出したDNAを鋳型とし、Rs1とRs2にそれぞれ対応するプライマーを用いてPCRを行った。PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700；Perkin-Elmer社）を使用し、10μLの反応液量で行った。反応液組成は、DNA抽出液1μL（10ng/μL）、10×緩衝液（100mM Tris-HCl，500mM KCl，15 mM MgCl2，タカラバイオ社）1μL、2.5mM dNTPs 1μL（タカラバイオ社）、20μMプライマー、5 uints/μL Taqポリメラーゼ（rTaq；タカラバイオ社）0.1μL、蒸留水5.9μLを含むように調製した。反応条件は、はじめに95℃で1分間の熱変性を行い、次いで94℃で1分（熱変性），55℃で1分（アニーリング），72℃で２分（伸長）を1サイクルとして計35サイクルで反応させ、最後に伸長反応を72℃で7分行った。
(Example 4) Determination of resistance to bacterial wilt using SSR markers Using DNA extracted from 184 DH populations that are resistant to bacterial wilt as a template, PCR was performed using primers corresponding to Rs1 and Rs2, respectively. went. The PCR reaction was performed using a DNA thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700; Perkin-Elmer) in a reaction volume of 10 μL. The composition of the reaction solution is 1 μL of DNA extract (10 ng / μL), 10 × buffer (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , Takara Bio) 1 μL, 2.5 mM
得られたPCR増幅産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(日本エイドー社製４連式電気泳動装置を使用）後、SYBR Green I希釈溶液に30分間浸し、FUJI FILM社製フルオロイメージアナライザー（FLA5100）で撮影を行うことによって検出した。PCR増幅産物のポリアクリロアミド電気泳動パターンを図６に示す。「K9-11」(K)と「MZC-180」（L)の間で多型が認められるバンド（図右に示している矢印）の有無を指標に、各分離系統が「K9-11」型を示すのか、「MZC-180」型と示すのかを区別でき、青枯病抵抗性を判定できる。 The obtained PCR amplification product was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (using a quadruple electrophoresis apparatus manufactured by Nihon Aido Co., Ltd.), then immersed in a diluted solution of SYBR Green I for 30 minutes, and a fluoro image analyzer (FLA5100) manufactured by FUJI FILM. It was detected by taking a picture. The polyacrylamide electrophoresis pattern of the PCR amplification product is shown in FIG. Each separated line is identified as “K9-11” using the presence or absence of a band (arrow shown on the right) where polymorphism is observed between “K9-11” (K) and “MZC-180” (L). It can be distinguished whether it indicates a type or “MZC-180” type, and resistance to bacterial wilt can be determined.
（実施例５）SSRマーカーの有効性検証
前記SSRマーカー（Rs1〜Rs11、Rs13〜Rs18）座におけるマーカー型と発病指数との関係を図７から図１２に示す。上段は各DNAマーカー座において、「K9-11型」を示す系統、下段は各DNAマーカー座において、「MZC-180型」を示す系統の度数分布を示す。
(Example 5) Verification of effectiveness of SSR marker FIGS. 7 to 12 show the relationship between the marker type and disease index at the SSR marker (Rs1 to Rs11, Rs13 to Rs18) loci. The upper row shows the frequency distribution of the strain showing “K9-11 type” at each DNA marker locus, and the lower row shows the frequency distribution of the strain showing “MZC-180 type” at each DNA marker locus.
また、QTL近傍の複数DNAマーカー座におけるマーカー遺伝子型と発病指数との関係を図１３に示す。図１３Ａは、LG 2 上のRs3及びRs4、LG 4 上のRs6及びRs9、 LG 8上のRs10及びRs16座上のQTL最近傍DNAマーカー座において「MZC-180型」を示す系統の度数分布、図１３Ｂは、同座において「K9-11型」を示す系統の度数分布を示す。 Further, FIG. 13 shows the relationship between the marker genotype and disease index at multiple DNA marker loci near the QTL. FIG. 13A shows the frequency distribution of strains showing “MZC-180 type” at the QTL nearest DNA marker loci on Rs3 and Rs4 on LG2, Rs6 and Rs9 on LG4, Rs10 and Rs16 on LG8, FIG. 13B shows the frequency distribution of the system showing “K9-11 type” in the same locus.
図７〜１２の結果に示されるように、各DNAマーカー座において「K9-11型」を示す系統の度数は発病指数が高いところに多く分布し、「MZC-180型」を示す系統の度数は発病指数が低いところに多く分布することが認められた。また、図１３に示されるように、複数DNAマーカー座におけるマーカー遺伝子型と発病指数との関係では上記の傾向がより顕著に認められた。 As shown in the results of FIGS. 7 to 12, the frequency of strains showing “K9-11 type” at each DNA marker locus is widely distributed in places where the disease index is high, and the frequency of strains showing “MZC-180 type” is high. Was found to be distributed in many places with low disease index. Moreover, as shown in FIG. 13, the above-mentioned tendency was recognized more remarkably in the relationship between the marker genotype and the disease index at multiple DNA marker loci.
以上の結果から、本発明において同定したDNAマーカー（SSRマーカー）は、青枯病抵抗性カプシカム属植物個体選抜用DNAマーカーとして有効であることが示された。 From the above results, it was shown that the DNA marker (SSR marker) identified in the present invention is effective as a DNA marker for selecting bacterial wilt-resistant Capsicum plants.
本発明は、育種分野において、青枯病抵抗性のカプシカム属植物の育苗段階早期での選抜を可能とし、青枯病抵抗性品種の育成の効率化に有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY In the breeding field, the present invention makes it possible to select bacterial genus Capsicum resistant to bacterial wilt at an early stage of the seedling raising stage, and is useful for improving the efficiency of breeding of bacterial varieties resistant to bacterial wilt.
Claims (4)
（A） 配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs1増幅用プライマーセット
（B） 配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs2増幅用プライマーセット
（C） 配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs3増幅用プライマーセット
（D） 配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs4増幅用プライマーセット
（E） 配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs5増幅用プライマーセット
（F） 配列番号１１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs6増幅用プライマーセット
（G） 配列番号１３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs7増幅用プライマーセット
（H) 配列番号１５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs8増幅用プライマーセット
（I） 配列番号１７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号１８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs9増幅用プライマーセット
（J）配列番号１９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs10増幅用プライマーセット
（K）配列番号２１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs11増幅用プライマーセット
（L）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs13増幅用プライマーセット
（M）配列番号２５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs14増幅用プライマーセット
（N）配列番号２７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号２８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs15増幅用プライマーセット
（O）配列番号２９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs16増幅用プライマーセット
（P）配列番号３１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs17増幅用プライマーセット
（Q）配列番号３３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号３４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成されるDNAマーカーRs18増幅用プライマーセット A primer set for amplifying a DNA marker linked to a bacterial wilt resistance locus of a Capsicum plant according to any one of the following (A) to (Q).
(A) Primer set for amplification of DNA marker Rs1 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (B) including the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 Primer set for amplification of DNA marker Rs2 composed of an oligonucleotide and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (C) An oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 6 Primer set for amplification of DNA marker Rs3 composed of oligonucleotide (D) For amplification of DNA marker Rs4 composed of oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 Primer set (E) Oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 And a primer set for amplifying DNA marker Rs5 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 (F) An oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 DNA marker Rs6 amplification primer set comprising: (G) DNA marker Rs7 amplification primer set comprising an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 (H) DNA marker Rs8 amplification primer set comprising an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 (I) comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 An oligonucleotide comprising the oligonucleotide and the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 Primer set for amplification of DNA marker Rs9 composed of nucleotides (J) Primer for amplification of DNA marker Rs10 composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 DNA marker Rs11 amplification primer set (L) consisting of an oligonucleotide containing the base sequence shown in set (K) SEQ ID NO: 21 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 (L) The base sequence shown in SEQ ID NO: 23 A DNA marker Rs13 amplification primer set (M) composed of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 DNA markers composed of oligonucleotides containing Rs14 amplification primer set (N) DNA marker Rs15 amplification primer set (O) consisting of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 A DNA marker Rs16 amplification primer set (P) composed of an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 DNA marker Rs17 amplification primer set (Q) composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown (Q) composed of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 Primer set for amplification of DNA marker Rs18
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN112322770A (en) * | 2020-11-24 | 2021-02-05 | 西北农林科技大学 | Molecular marker for identifying branch type of capsicum and application thereof |
| CN116083627A (en) * | 2022-12-23 | 2023-05-09 | 湖南农业大学 | Molecular marker linked with green traits of hypocotyl of capsicum, mutant gene, parting primer and application thereof |
-
2010
- 2010-01-29 JP JP2010018375A patent/JP2011155860A/en active Pending
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