JP2011078358A - Method for detecting norovirus - Google Patents
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Abstract
【課題】GI型とGII型とを同時に検出可能なノロウイルスの検出技術を提供することを課題とする。
【解決手段】ノロウイルスの公開されている塩基配列から、ORF1とORF2のジャンクション領域付近の塩基配列が特に保存されていることを見出し、この領域を増幅するプライマーセットを設計した。次いでこのプライマーセットを用いてノロウイルス臨床株についてRT-PCRを行い、得られた増幅産物の塩基配列をすべて決定した。そして、先の公開株と臨床株とを合わせてジャンクション領域付近の相同性検索を行なった結果、遺伝子型によらず高度に保存されている領域を見出し、本発明のPCR用プライマーセットを設計した。
【選択図】なしIt is an object of the present invention to provide a norovirus detection technique capable of simultaneously detecting GI type and GII type.
[MEANS FOR SOLVING PROBLEMS] From the published base sequences of Norovirus, it was found that the base sequences in the vicinity of the junction region of ORF1 and ORF2 were conserved, and a primer set for amplifying this region was designed. Subsequently, RT-PCR was performed on the Norovirus clinical strain using this primer set, and all the base sequences of the obtained amplification products were determined. And, as a result of conducting a homology search near the junction region by combining the previous public strain and clinical strain, we found a highly conserved region regardless of genotype, and designed the PCR primer set of the present invention .
[Selection figure] None
Description
本発明は、ノロウイルスの検出に用いるポリヌクレオチドに関する。本発明は、医療、公衆衛生、食品等の分野で有用である。 The present invention relates to a polynucleotide used for detection of norovirus. The present invention is useful in fields such as medical care, public health, and food.
ノロウイルスは、カリシウイルス科に属する約7700塩基のプラス1本鎖RNAウイルスであり、ゲノム上には3つのOpen Reading Frame (ORF) が存在する。ORF1はヘリカーゼやポリメラーゼを初めとする機能性蛋白質を、ORF2は構造蛋白質であるカプシド蛋白質を、ORF3は低分子量の塩基性蛋白質をコードしており、ORF1の3'末端から、ORF2の5'末端の領域の塩基配列の系統解析により、GIからGVまでの5つの遺伝子型に分類されているが、特にヒトへの感染が問題視されているのはGI及びGII型である。また、GII型はさらに数種の亜型に分類され、このうちGII.4型は感染力が強く、大規模な食中毒を起こすサブタイプとして報告されている。 Norovirus is a positive single-stranded RNA virus of approximately 7700 bases belonging to the Caliciviridae family, and there are three Open Reading Frames (ORFs) on the genome. ORF1 encodes functional proteins such as helicases and polymerases, ORF2 encodes a capsid protein, which is a structural protein, and ORF3 encodes a low molecular weight basic protein. According to the phylogenetic analysis of the base sequence of this region, it has been classified into five genotypes from GI to GV . In particular, types GI and GII are regarded as problematic for human infection. In addition, GII type is further classified into several subtypes, and GII.4 type is reported as a subtype that is highly infectious and causes large-scale food poisoning.
ノロウイルスを原因物質とする食中毒は近年急増しており、日本における平成19年の食中毒発生状況は事件数では総事件数1066件のうち294件、患者数では総患者数26282名のうち14545名と、カンピロバクター・ジェジュニ/コリ（645件、1941名）に次いで発生件数が多く、患者数では第1位となっている。ノロウイルスを原因とする食中毒は，以前は、牡蠣などの二枚貝が原因物質として報告されることがほとんどであったが、近年はヒトからヒトを介した2次感染によるものも増加している。さらに、大量調理施設衛生管理マニュアル (平成20年6月18日食安発第0618005号) の変更に伴い、調理従事者は10月から3月にはノロウイルスの検便検査項目がもうけられたため、ノロウイルス検出に関する需要はさらに高まっている。 Food poisoning caused by norovirus has increased rapidly in recent years, and the number of cases of food poisoning in Japan in 2007 was 294 out of 1066 total cases and 14545 out of 26282 patients. , Followed by Campylobacter jejuni / colli (645 cases, 1941), and the number of patients is the first. In the past, food poisoning caused by norovirus was mostly reported as a causative substance of bivalves such as oysters, but in recent years there has also been an increase in human-to-human secondary infections. In addition, due to changes in the Sanitation Management Manual for Large-scale Cooking Facilities (No. 0618005 issued on June 18, 2008), cooking workers were provided with stool inspection items for Norovirus from October to March. The demand for detection is further increasing.
以前は電子顕微鏡観察によるノロウイルス検出が主流であったが、近年は分子生物学的手法の発達により多数のノロウイルス株のゲノム全塩基配列が決定され、ウイルスゲノムが詳細に解析されたことにより、RT-PCR法による検出が主流となっている（例えば、特許文献1〜4）。 In the past, detection of norovirus by electron microscopy was the mainstream, but in recent years, with the development of molecular biological techniques, the genome base sequences of many Norovirus strains have been determined, and the viral genome has been analyzed in detail. -Detection by the PCR method has become mainstream (for example, Patent Documents 1 to 4).
RT-PCR法では、まず検体中のRNA遺伝子を鋳型として逆転写酵素によりcDNAを合成し、さらに、合成したcDNAを鋳型としてPCRを行う。PCRでは鋳型となるcDNAにプライマーをアニールさせ、DNAポリメラーゼによって目的のプライマー配列にはさまれるDNAを特異的に検出する。これにより、RNA遺伝子配列が分かっているあらゆるウイルスの高感度の検出が、原理上は可能であるといえる。 In the RT-PCR method, cDNA is first synthesized by reverse transcriptase using an RNA gene in a specimen as a template, and further PCR is performed using the synthesized cDNA as a template. In PCR, a primer is annealed to cDNA as a template, and DNA contained in the target primer sequence is specifically detected by DNA polymerase. Thus, it can be said that, in principle, highly sensitive detection of any virus whose RNA gene sequence is known is possible.
しかしながら、ノロウイルスは、遺伝子亜型が多数存在するために、選択するプライマーの塩基配列により検出結果が大きく異なることとなる。現在、ノロウイルスをすべて検出可能な万能なプライマーセットは存在しない。 However, since noroviruses have a large number of gene subtypes, the detection results vary greatly depending on the base sequence of the selected primer. Currently, there is no universal primer set that can detect all noroviruses.
また、ノロウイルス検出のためには、現在国立感染症研究所により推奨されているプライマーセットや市販のキットが存在するが、そのすべてがGI型とGII型とを別個に検出するものであり、GI型とGII型双方を含めてノロウイルスを検出するためには、検体当たりの手間が煩雑となっている。 In addition, there are primer sets and commercial kits currently recommended by the National Institute of Infectious Diseases for detecting norovirus, all of which detect GI type and GII type separately. In order to detect norovirus including both type II and GII type, labor per sample is complicated.
より検出率が高く、かつ簡便な、ノロウイルスの検査技術の開発が望まれている。 Development of a norovirus inspection technique with higher detection rate and simpleness is desired.
本発明者らは、ノロウイルスの遺伝子型を問わずRT-PCRにより検出可能なプライマーセットについて鋭意研究してきた。まず、ノロウイルス44株の公開されている塩基配列から、ORF1とORF2のジャンクション領域付近の塩基配列が特に保存されていることを見出し、この領域を増幅するプライマーセットを設計した。次いでこのプライマーセットを用いてノロウイルス臨床株150株についてRT-PCRを行い、88株から得られた増幅産物の塩基配列をすべて決定した。そして、先の44株と合わせて132株のジャンクション領域付近の相同性検索を行なった結果、遺伝子型によらず高度に保存されている領域を見出し、本発明を完成した。本発明は以下を提供する：
1）下記のいずれか一つのオリゴヌクレオチド（ただし、任意の位置のチミン（t）はウラシル（u）に置換されていてもよい）：
配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
2）下記のいずれか一つのオリゴヌクレオチドを含む、ノロウイルス検出用組成物又はキット（ただし、任意の位置のチミン（t）はウラシル（u）に置換されていてもよい）：
配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
3）下記の（a）から選択される少なくとも一つ、及び（b）から選択される少なくとも一つを含む、ノロウイルス検出用オリゴヌクレオチドセット（ただし、任意の位置のチミン（t）はウラシル（u）に置換されていてもよい）：
（a）配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b）配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
4）PCR用である、上記3）に記載のオリゴヌクレオチドセット。
5）上記3）に記載のオリゴヌクレオチドセットを含む、ノロウイルス検出用キット。
6）試料中の核酸を鋳型に、請求項3に記載のオリゴヌクレオチドセットをプライマーとしてポリメラーゼPCRを行う工程を含む、ノロウイルスの検出方法。
7）下記の（a'）から選択される少なくとも一つ、及び（b'）から選択される少なくとも一つを含む、ノロウイルス検出用オリゴヌクレオチドセット（ただし、任意の位置のチミン（t）はウラシル（u）に置換されていてもよい：
（a'）配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b'）配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
8）下記の（a"）から選択される少なくとも一つ、及び（b"）から選択される少なくとも一つを含む、上記7）に記載のオリゴヌクレオチドセット：
（a"）配列番号：159の塩基配列の5059〜5078の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5059〜5078の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b"）配列番号：159の塩基配列の5091〜5118の範囲から選択される連続した20〜27塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5091〜5118の範囲から選択される連続した20〜27塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
9）下記から選択される少なくとも一つの塩基配列を用いる、ノロウイルス検出用オリゴヌクレオチドセットの設計方法（ただし、任意の位置のチミン（t）はウラシル（u）に置換されていてもよい）：
配列番号：159の塩基配列の5033〜5085の範囲の塩基配列、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5085の範囲の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列、及び
それらの相補体。
The present inventors have intensively studied a primer set that can be detected by RT-PCR regardless of the genotype of Norovirus. First, it was found from the public nucleotide sequences of Norovirus 44 strain that the nucleotide sequences in the vicinity of the junction region of ORF1 and ORF2 were conserved, and a primer set for amplifying this region was designed. Next, RT-PCR was performed on 150 Norovirus clinical strains using this primer set, and the base sequences of the amplification products obtained from 88 strains were all determined. As a result of homology search in the vicinity of the junction region of 132 strains together with the previous 44 strains, a highly conserved region was found regardless of the genotype, and the present invention was completed. The present invention provides the following:
1) Any one of the following oligonucleotides (however, thymine (t) at any position may be substituted with uracil (u)):
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
2) Norovirus detection composition or kit containing any one of the following oligonucleotides (however, thymine (t) at any position may be replaced with uracil (u)):
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
3) Norovirus detection oligonucleotide set comprising at least one selected from the following (a) and at least one selected from (b) (however, thymine (t) at any position is uracil (u ) May be substituted):
(A) an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and a complement thereof;
(B) an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
4) The oligonucleotide set according to 3) above, which is for PCR.
5) A norovirus detection kit comprising the oligonucleotide set described in 3) above.
6) A method for detecting norovirus, comprising a step of performing polymerase PCR using a nucleic acid in a sample as a template and the oligonucleotide set according to claim 3 as a primer.
7) An oligonucleotide set for detecting norovirus comprising at least one selected from the following (a ′) and at least one selected from (b ′) (however, thymine (t) at any position is uracil) (U) may be substituted:
(A ′) an oligonucleotide having a continuous base sequence of 14 to 28 bases selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159,
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a continuous base sequence of 14 to 28 bases selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement;
(B ′) an oligonucleotide consisting of a continuous base sequence of 14 to 28 bases long selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159;
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a continuous base sequence of 14 to 28 bases long selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement.
8) The oligonucleotide set according to 7) above, comprising at least one selected from the following (a ") and at least one selected from (b"):
(A ") an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence of 5059 to 5078 of SEQ ID NO: 159,
An oligonucleotide having a base sequence in which one or several bases are replaced in the base sequence of 5059 to 5078 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and a complement thereof;
(B ") an oligonucleotide having a continuous base sequence of 20 to 27 bases selected from the range of 5091 to 5118 of the base sequence of SEQ ID NO: 159,
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a continuous base sequence of 20 to 27 bases selected from the range 5091 to 5118 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement.
9) Method for designing an oligonucleotide set for detecting norovirus using at least one base sequence selected from the following (however, thymine (t) at any position may be substituted with uracil (u)):
A nucleotide sequence ranging from 5033 to 5085 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 159,
A base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence in the range of 5033 to 5085 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and a complement thereof.
本発明は、ノロウイルスの検出に用いることができる新規なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、対にして、PCRのためのオリゴヌクレオチドセット（プライマーセット）として使用することができる。本発明により提供されるオリゴヌクレオチドセットは、ノロウイルスに感染した疑いのある患者の糞便試料等から、GI型及びGII型のノロウイルスを同時に検出することができる。 The present invention provides a novel oligonucleotide that can be used for detection of norovirus. The oligonucleotides of the present invention can be paired and used as an oligonucleotide set (primer set) for PCR. The oligonucleotide set provided by the present invention can simultaneously detect GI type and GII type noroviruses from stool samples of patients suspected of being infected with norovirus.
本発明で「オリゴヌクレオチド」というときは、特に記載した場合を除き、DNA及びRNA（示された塩基配列において、チミン（t）がウラシル（u）に置換される。）のいずれでもあり、長さは5〜100塩基長でありうる。本発明で、あるオリゴヌクレオチドに関して「相補体」というときは、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをいう。本発明で、ある塩基配列に関して「相補体」というときは、その塩基配列に相補的な塩基配列をいう。なお、PCR用のオリゴヌクレオチドセットに関する本発明おいて、セットの一方のオリゴヌクレオチド又は塩基配列の選択にしたがって、他方のオリゴヌクレオチド又は塩基配列の選択が、ウイルス検出上、すなわち標的配列の増幅上、有効なものに制限されうることは、当業者には自明である。例えば、セットの一方のオリゴヌクレオチドとして「相補体」を選択した場合、他方のオリゴヌクレオチドは、それとの組み合わせにおいて、標的配列を増幅するために有効なものを選択すべきことは当業者には自明である。 In the present invention, “oligonucleotide” refers to DNA and RNA (in the indicated base sequence, thymine (t) is replaced with uracil (u)), unless otherwise specified, and is long. The length can be 5-100 bases long. In the present invention, the term “complement” for a certain oligonucleotide means an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the oligonucleotide. In the present invention, a “complement” with respect to a certain base sequence means a base sequence complementary to the base sequence. In the present invention relating to the oligonucleotide set for PCR, according to the selection of one oligonucleotide or base sequence of the set, the selection of the other oligonucleotide or base sequence is for virus detection, that is, for amplification of the target sequence, It will be apparent to those skilled in the art that they can be limited to those that are effective. For example, it is obvious to those skilled in the art that when “complement” is selected as one of the oligonucleotides of the set, the other oligonucleotide should be selected in combination with it to be effective for amplifying the target sequence. It is.
本発明のオリゴヌクレオチドは、下記の（a'）又は（b'）である：
（a'）配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の14〜28塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b'）配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される連続した、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
The oligonucleotide of the present invention is the following (a ′) or (b ′):
(A ′) a length that can function as a continuous primer or probe selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases, more preferably 16 to 27 bases) , More preferably 18-27 bases long) oligonucleotide consisting of a base sequence of 14-28 bases long,
A length capable of functioning as a continuous primer or probe selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases long, more preferably 16 to 27 bases long, still more preferably Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence of 18 to 27 bases long) and their complements;
(B ′) a length capable of functioning as a primer or probe selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases long, more preferably 16 to 27 bases long, An oligonucleotide having a base sequence of preferably 18 to 27 bases),
A length that can function as a continuous primer or probe selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases long, more preferably 16 to 27 bases long, still more preferably 18-27 bases in length) Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted, and their complements.
配列表の配列番号：159には、代表的なGII型株（ID AB220921）のゲノムのRNA配列が示されている。
本明細書で塩基配列に関し、「一又は数個」というときは、その数は、好ましくは1〜9個であり、より好ましくは1〜4個であり、さらに好ましくは1〜3個である。置換は、GII株の配列において、GI株とは異なる箇所を、GI株に一致させるように行うことができる。
In the sequence listing, SEQ ID NO: 159 shows the RNA sequence of the genome of a representative GII strain (ID AB220921).
In the present specification, regarding the nucleotide sequence, when “one or several” is referred to, the number is preferably 1 to 9, more preferably 1 to 4, and further preferably 1 to 3. . The substitution can be performed so that a portion different from the GI strain in the sequence of the GII strain matches the GI strain.
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい例は、下記の（a"）又は（b"）である：
（a"）配列番号：159の塩基配列の5048〜5067の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5048〜5067の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b"）配列番号：159の塩基配列の5081〜5107の範囲から選択される連続した20〜27塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5081〜5107の範囲から選択される連続した20〜27塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
Preferred examples of the oligonucleotide of the present invention are the following (a ") or (b"):
(A ") an oligonucleotide consisting of a base sequence of 5048-5067 of the base sequence of SEQ ID NO: 159,
An oligonucleotide having a base sequence in which one or several bases are replaced in the base sequence of 5048-5067 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and a complement thereof;
(B ") an oligonucleotide having a continuous base sequence of 20 to 27 bases selected from the range of 5081 to 5107 of the base sequence of SEQ ID NO: 159;
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence of 20 to 27 bases in length selected from the range 5081 to 5107 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement.
本発明のオリゴヌクレオチドのより好ましい例は、配列表の配列番号：1〜4に示されている。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ノロウイルス検出用組成物、又はノロウイルス検出用キットを構成することができる。組成物は、本発明のオリゴヌクレオチド以外に、緩衝剤、dNTP、鋳型（cDNA）、ポリメラーゼ（Ex Taq）等を含んでよい。キットは、このような組成物の他、操作手順を記載したもの、試料の前処理のための液、試料のDNase処理のための液、RT反応液等を含んでもよい。
More preferred examples of the oligonucleotide of the present invention are shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing.
The oligonucleotide of the present invention can constitute a composition for detecting norovirus or a kit for detecting norovirus. The composition may contain a buffer, dNTP, template (cDNA), polymerase (Ex Taq) and the like in addition to the oligonucleotide of the present invention. In addition to such a composition, the kit may contain a description of operating procedures, a solution for pretreatment of a sample, a solution for DNase treatment of a sample, an RT reaction solution, and the like.
本発明のオリゴヌクレオチドは、適切に組み合わされ、オリゴヌクレオチドセットを構成することができる。オリゴヌクレオチドセットは、PCRのためのプライマーとして有用である。 The oligonucleotides of the present invention can be appropriately combined to constitute an oligonucleotide set. The oligonucleotide set is useful as a primer for PCR.
本発明のオリゴヌクレオチドセットの例は、上記の（a'）から選択される少なくとも一つ、及び（b'）から選択される少なくとも一つを含む。本発明のオリゴヌクレオチドセットのより好ましい例は、上記の（a"）から選択される少なくとも一つ、及び（b"）から選択される少なくとも一つを含む。 Examples of the oligonucleotide set of the present invention include at least one selected from the above (a ′) and at least one selected from (b ′). More preferable examples of the oligonucleotide set of the present invention include at least one selected from the above (a ") and at least one selected from (b").
本発明において、特に好ましいオリゴヌクレオチドセットの例は、下記のものである：
Forward 5'TGGGAGGGCGATCGCAATCT 3'（配列番号：1）、
Reverse 5'TCGACGCCATCTTCATTCAC 3'（配列番号：2）。
Examples of particularly preferred oligonucleotide sets in the present invention are:
Forward 5'TGG GAG GG C GATCGCAATCT 3 '(SEQ ID NO: 1),
Reverse 5'T C GACGCCATC T TCATT C AC 3 '(SEQ ID NO: 2).
このセットは、GII株のゲノム間で特に保存された領域に基づいて設計された。Fプライマーに関しては、5'、3' 側に1塩基ずれるとプライマー配列と完全一致する株が27株減る（図2のa参照）。しかしながら、Rプライマーのバリエーションとしては、5'側に1〜7塩基付加することが可能である（図2のb参照）。 This set was designed based on regions that were specifically conserved among the genomes of GII strains. With regard to F primer, if one base is shifted to the 5 ′ or 3 ′ side, 27 strains that completely match the primer sequence are reduced (see a in FIG. 2). However, as a variation of the R primer, it is possible to add 1 to 7 bases on the 5 ′ side (see b in FIG. 2).
上記のプライマーセットにおいては、下線で示した箇所の配列は、GI株のゲノム配列とは一致しない。しかしながら、予想に反して、GI型ノロウイルスもこのプライマーにより検出可能である。一方で、GI株に対しては、下記のセットがより有効であり得る：
Forward 5'TGGACAGGAGATCGCAATCT 3'（配列番号：3）
Reverse 5'TAGACGCCATCATCATTTAC 3'（配列番号：4）。
In the primer set described above, the sequence indicated by the underline does not match the genome sequence of the GI strain. However, contrary to expectations, GI type norovirus can also be detected with this primer. On the other hand, the following set may be more effective for GI strains:
Forward 5'TGG ACA GG A GATCGCAATCT 3 '(SEQ ID NO: 3)
Reverse 5'T A GACGCCATC A TCATT T AC 3 '( SEQ ID NO: 4).
本発明においては、上述したプライマーセットを混合して用いることもできる。したがって、本発明のノロウイルス検出用オリゴヌクレオチドセットは、上記の（a'）、（a"）、及び下記の（a）から選択される少なくとも一つ、並びに上記の（b'）、（b"）、及び下記の（b）から選択される少なくとも一つを含むが、上記の（a'）、（a"）、及び下記の（a）から選択される二つ、並びに／又は上記の（b'）、（b"）、及び下記の（b）から選択される二つを含んでもよい：
（a）配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b）配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
In the present invention, the above-described primer set can be mixed and used. Therefore, the oligonucleotide set for detecting norovirus of the present invention comprises at least one selected from the above (a ′), (a ″) and the following (a), and the above (b ′), (b ″) ), And at least one selected from the following (b), but selected from the above (a ′), (a ″) and the following (a), and / or the above ( b ′), (b ″), and two selected from (b) below may be included:
(A) an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and a complement thereof;
(B) an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
本発明のオリゴヌクレオチドセットは、（a'）、（a"）及び（a）から選択される二つと、（b'）、（b"）及び（b）から選択される一つを含むことがあり、また、上記の（a'）、（a"）及び（a）から選択される一つと（b'）、（b"）及び（b）から選択される二つを含むことがある。 The oligonucleotide set of the present invention comprises two selected from (a ′), (a ″) and (a) and one selected from (b ′), (b ″) and (b) And may include one selected from the above (a '), (a ") and (a) and two selected from (b'), (b") and (b) .
本発明のオリゴヌクレオチドは、既存の自動合成装置を用いて適宜合成することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、標識化物（例えば、蛍光色素、ビオチン）で修飾することができる。 The oligonucleotide of the present invention can be appropriately synthesized using an existing automatic synthesizer. The oligonucleotide of the present invention can be modified with a label (for example, fluorescent dye, biotin).
本発明でいうPCR Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）には、RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）が含まれる。 The PCR polymerase chain reaction (polymerase chain reaction) referred to in the present invention includes RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction).
本発明のオリゴヌクレオチドセットを用いてPCR法によりノロウイルスの検出を行う際には、ノロウイルスのゲノムRNAを鋳型とするRT-PCR法をとることとなる。RT-PCR法は、通常、試料からのRNAの抽出工程、RT反応工程、PCR工程（PCR反応工程、電気泳動工程、電気泳動ゲル染色工程、染色されたバンドの確認工程を含む。）を含む。 When the norovirus is detected by the PCR method using the oligonucleotide set of the present invention, the RT-PCR method using the norovirus genomic RNA as a template is employed. The RT-PCR method usually includes an RNA extraction step from a sample, an RT reaction step, and a PCR step (including a PCR reaction step, an electrophoresis step, an electrophoresis gel staining step, and a confirmation step for a stained band). .
本発明を用いてノロウイルスの検出を行う際、試料として、感染が疑われる患者の糞便、及び貝類（カキ、アサリ、シジミ、平貝、ウチムラサキ貝等）を含む食品を用いることができる。なお、食品を試料とする場合、ウイルス量が少ないので、PCR工程で陰性と判断されることが多いが、そのような場合には、PCR工程の産物をさらにNested PCR法に供することができる。 When detecting norovirus using the present invention, foods containing feces of patients suspected of infection and shellfish (oysters, clams, swordfish, flat shellfish, oyster clams, etc.) can be used as samples. When food is used as a sample, the amount of virus is small, so it is often judged negative in the PCR process. In such a case, the product of the PCR process can be further subjected to a nested PCR method.
試料からのRNA の抽出方法は、特に限定されず、当業者であれば市販のキット等を利用して、必要に応じ、キャリアーRNAの添加やDNase処理工程を追加して、適宜実施することができる。 The method for extracting RNA from the sample is not particularly limited, and those skilled in the art can use a commercially available kit or the like and add a carrier RNA or add a DNase treatment step as necessary, and appropriately perform it. it can.
RT反応のための方法もまた特に限定されず、当業者であれば市販のキット等を利用して、適宜実施することができる。
PCR反応は、従来法においては、各試料毎に2つの反応チューブを用意し、GI株由来核酸増幅と、GII株由来核酸増幅とを別々に実施する必要があった。しかしながら、本発明のオリゴヌクレオチドセットを用いることにより、GI株由来核酸とGII株由来核酸とを同時に増幅することができる。
A method for the RT reaction is also not particularly limited, and can be appropriately performed by those skilled in the art using a commercially available kit or the like.
In the conventional method, it was necessary to prepare two reaction tubes for each sample and perform GI strain-derived nucleic acid amplification and GII strain-derived nucleic acid amplification separately in the conventional method. However, by using the oligonucleotide set of the present invention, the GI strain-derived nucleic acid and the GII strain-derived nucleic acid can be amplified simultaneously.
PCR工程の結果、陽性と判定される場合には、確認のために、さらにハイブリダイゼーション工程、遺伝子配列確認工程を実施してもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーション法のためのプローブとしても用いることができる。本発明でいうハイブリダイゼーション法は、PCR産物の確認のためのマイクロプレートハイブリダイゼーション法を含む。
If the result of the PCR step is positive, a hybridization step and a gene sequence confirmation step may be further performed for confirmation.
The oligonucleotides of the invention can also be used as probes for hybridization methods. The hybridization method referred to in the present invention includes a microplate hybridization method for confirmation of PCR products.
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、リアルタイムPCR法によるノロウイルスの定量的検出において、プライマーとして用いることができる。
本発明はまた、ノロウイルス検出用オリゴヌクレオチドセットの設計方法も提供する。本発明の設計方法においては、下記から選択される少なくとも一つの塩基配列（ただし、任意の位置のチミン（t）はウラシル（u）に置換されていてもよい）に基づいて、少なくとも一対の増幅用プライマーとして設計される：
配列番号：159の塩基配列の5033〜5085の範囲の塩基配列、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5085の範囲の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列、及び
それらの相補体。
The oligonucleotide of the present invention can also be used as a primer in quantitative detection of norovirus by real-time PCR.
The present invention also provides a method for designing an oligonucleotide set for detecting norovirus. In the design method of the present invention, at least one pair of amplifications based on at least one base sequence selected from the following (however, thymine (t) at any position may be substituted with uracil (u)) Designed as a primer for:
A nucleotide sequence ranging from 5033 to 5085 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 159,
A base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence in the range of 5033 to 5085 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and a complement thereof.
本発明のオリゴヌクレオチドセットの設計方法は、好ましくは、下記の（a'）から選択される少なくとも一つ、及び（b'）から選択される少なくとも一つの塩基配列を用いる、ものである：
（a'）配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の14〜28塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b'）配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される連続した、プライマー又はプローブとして機能可能な長さ（好ましくは14〜28塩基長、より好ましくは16〜27塩基長、さらに好ましくは18〜27塩基長）の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。
The method for designing an oligonucleotide set of the present invention preferably uses at least one base sequence selected from the following (a ′) and at least one base sequence selected from (b ′):
(A ′) a length that can function as a continuous primer or probe selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases, more preferably 16 to 27 bases) , More preferably 18-27 bases long) oligonucleotide consisting of a base sequence of 14-28 bases long,
A length capable of functioning as a continuous primer or probe selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases long, more preferably 16 to 27 bases long, still more preferably Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence of 18 to 27 bases long) and their complements;
(B ′) a length capable of functioning as a primer or probe selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases long, more preferably 16 to 27 bases long, An oligonucleotide having a base sequence of preferably 18 to 27 bases),
A length that can function as a continuous primer or probe selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159 (preferably 14 to 28 bases long, more preferably 16 to 27 bases long, still more preferably 18-27 bases in length) Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted, and their complements.
1．材料及び方法
［データベース］
カリシウイルス科に属するウイルスのうち、ヒトに感染するnorovirus、norwalk virus、norwalk-like virus、Chiba virus、Camberwell virus、Snow Mountain virus、Murine Norovirus及びHawaii calicivoirusの全塩基配列情報は、米国遺伝子情報研究機関 (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) より入手した入手した塩基配列の名称、及びGenBank登録番号を下表に示す。
1． Materials and Methods [Database]
Among the viruses belonging to the family Caliciviridae, the complete nucleotide sequence information of norovirus, norwalk virus, norwalk-like virus, Chiba virus, Camberwell virus, Snow Mountain virus, Murine Norovirus and Hawaii calicivoirus that infects humans is the National Institute of Genetic Information Research. The names of base sequences obtained from (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and the GenBank registration numbers are shown in the table below.
［糞便試料］
ノロウイルス患者由来の糞便上清試料は、1997年から2007年に福岡市で発生したノロウイルス患者由来150検体 (GI型 27検体、GII型117検体、GI/GII型6検体) を福岡市保健環境研究所より分与を受けた。試料中のノロウイルスは、ノロウイルス検査法(食安監発第1105001号) のRT-PCR、ハイブリダイゼーションに従い、遺伝子型が確認されている。検体から検出されたノロウイルス遺伝子型を下表に示す。
[Fecal samples]
Fecal supernatant samples from Norovirus patients were 150 samples from Norovirus patients (GI type 27 samples, GII type 117 samples, GI / GII type 6 samples) that occurred in Fukuoka City from 1997 to 2007. I received a share from the office. The norovirus in the sample has been genotyped according to RT-PCR and hybridization of the Norovirus test method (Food Safety Co., Ltd. No. 1105001). The following table shows the norovirus genotypes detected from the specimens.
［塩基配列の相同性検索］
塩基配列は ClustalW (1.83) により相同性検索を行った. また、neighbor-joining 法により系統樹を作製した. 系統樹の作製にはNJplot (Perriere and Gouy, 1996) を使用した。
[Homology search for nucleotide sequences]
The base sequence was homologous by ClustalW (1.83). A phylogenetic tree was prepared by the neighbor-joining method. NJplot (Perriere and Gouy, 1996) was used for the generation of the phylogenetic tree.
［RT-PCR法による糞便上清中のノロウイルスの検出］
糞便上清からQIAmp Viral RNA mini kit (QIAGEN K.K., Tokyo, Japan) を用い付属の説明書に従い、ノロウイルスRNAを調製した。調製したRNAはDNase I amplification grade (Invitrogen Co., Carlsbad, CA., USA) により外来性のDNAを消化後、SuperScriptIII first strand cDNA synthesis kit (Invitrogen Co.) を用いてcDNAの合成を行なった。
[Detection of norovirus in fecal supernatant by RT-PCR]
Norovirus RNA was prepared from the stool supernatant using the QIAmp Viral RNA mini kit (QIAGEN KK, Tokyo, Japan) according to the attached instructions. The prepared RNA was digested with exogenous DNA using DNase I amplification grade (Invitrogen Co., Carlsbad, CA., USA), and then cDNA was synthesized using SuperScriptIII first strand cDNA synthesis kit (Invitrogen Co.).
PCR反応は全量15 μlの反応液中で行った。0.3 μl一本鎖cDNA、0.08 Units EX Taq DNA polymerase (TAKARA BIO Inc., Shiga, Japan)、200 nM dNTP、1x Buffer for Ex Taq DNA polymeraseの混合液を0.2 mlマイクロチューブに調製し、遺伝子増幅装置 PCR ExpressTM (Thermo Bio Analysis Co., Waltham, MA, USA) を用いて，初期熱変性95℃、3分間後、熱変性95℃で20秒間、アニーリング55℃で25秒間、伸長反応72℃で15秒間からなる35サイクルの反応を行った。 The PCR reaction was performed in a total volume of 15 μl of reaction solution. Prepare a mixture of 0.3 μl single-stranded cDNA, 0.08 Units EX Taq DNA polymerase (TAKARA BIO Inc., Shiga, Japan), 200 nM dNTP, and 1x Buffer for Ex Taq DNA polymerase in a 0.2 ml microtube. Using PCR Express ™ (Thermo Bio Analysis Co., Waltham, MA, USA), initial heat denaturation at 95 ° C for 3 minutes, heat denaturation at 95 ° C for 20 seconds, annealing at 55 ° C for 25 seconds, and extension reaction at 72 ° C. 35 cycles of reaction consisting of 15 seconds were performed.
RT-PCR産物の増幅はアガロースゲル電気泳動により確認した。1.5%アガロースゲルをTAE 緩衝液(40 mM Tris-acetate，1 mM EDTA，pH 8.0) を用いて調製した。PCR反応液10μl と1 μlローディング緩衝液 (30% Glycerol，50 mM EDTA，0.25% Bromo phenol blue，0.25% Xylene cyanol FF，pH 7.0) を混合した後、アガロースゲルの試料溝にチャージし、TAE 緩衝液中、100 V、約40分間室温で電気泳動を行った。泳動終了後、アガロースゲルを暗所で1 μg/ ml のエチジウムブロマイド溶液に10 分間浸して染色し、紫外線照射装置 TFP-35M (VILBER LOURMAT) により紫外線を照射し、DNA鎖にインターカレートしたエチジウムブロマイド分子を発色させることによって増幅産物を検出した。また、PCR産物の塩基配列解析は (株) バイオマトリックス研究所へ依頼した。 Amplification of the RT-PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis. A 1.5% agarose gel was prepared using TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0). Mix 10 μl of PCR reaction solution and 1 μl loading buffer (30% Glycerol, 50 mM EDTA, 0.25% Bromophenol blue, 0.25% Xylene cyanol FF, pH 7.0), charge to sample groove of agarose gel, and buffer with TAE Electrophoresis was performed in liquid at 100 V for about 40 minutes at room temperature. After electrophoresis is completed, the agarose gel is stained in 1 μg / ml ethidium bromide solution for 10 minutes in the dark, and then irradiated with UV light using the UV irradiation device TFP-35M (VILBER LOURMAT). Amplification products were detected by developing bromide molecules. In addition, the base sequence analysis of the PCR product was requested to Biomatrix Laboratory.
［既存の検出法との比較］
本願で設計したプライマーによる検出と以下2法による検出率の比較を行った。
1）推奨プライマーセットを用いた方法
国立感染症研究所がノロウイルス1次スクリーニングに推奨する、COG1F / G1SKR及びCOG2F / G2SKRプライマーを用い、食安監発第1105001号に従い、RT-PCRを行った。
[Comparison with existing detection methods]
The detection rate by the primer designed in this application and the detection rate by the following two methods were compared.
1) Method using recommended primer set RT-PCR was performed according to Food Safety Supervision No. 1105001 using COG1F / G1SKR and COG2F / G2SKR primers recommended by the National Institute of Infectious Diseases for primary screening of norovirus.
2）検出キットを用いた方法
ノロウイルス検出キットTRCRtest Noro1、TRCRtest Noro2 (東ソー株式会社)を用い、キットに添付の説明書に従い検出をおこなった。ただし、検出器はMx 3000P QPCR system (Stratagene Co. Ltd., La Jolla, CA, USA) を用いた。
2) Method using detection kit Using norovirus detection kits TRCRtest Noro1 and TRCRtest Noro2 (Tosoh Corporation), detection was performed according to the instructions attached to the kit. However, the detector used was Mx 3000P QPCR system (Stratagene Co. Ltd., La Jolla, CA, USA).
新規プライマーによる検出及び上記2法による検出には、同時期に調製したcDNAもしくはRNAを使用した。
2．結果及び考察
［高検出率プライマーの設計］
全塩基配列の相同性検索に用いたノロウイルス44株の相同性検索により設計したプライマーセット（下表）を用いて、ノロウイルス患者由来の糞便上清試料よりRT-PCRを行った。
CDNA or RNA prepared at the same time was used for detection by the new primer and detection by the above two methods.
2． Results and Discussion [Design of high detection rate primer]
RT-PCR was performed from a stool supernatant sample derived from a norovirus patient using the primer set (table below) designed by homology search of Norovirus 44 strain used for homology search of all nucleotide sequences.
RT-PCRにおいては、基本的には、d1F-d1R というように、上表の同じ番号のFとRの組み合わせで増幅を試みたが、それぞれの増幅率は低く、種々のプライマーを組み合わせた。その結果、88株から増幅産物が得られた。 In RT-PCR, amplification was basically attempted with a combination of F and R of the same number in the above table, such as d1F-d1R, but each amplification rate was low, and various primers were combined. As a result, amplification products were obtained from 88 strains.
次に88株からの増幅産物の塩基配列を決定した。データベース由来44株と新規に塩基配列を決定した88株、計132株について、さらに相同性検索を行った結果を図1に示す。ORF1とORF2のジャンクション領域では、遺伝子型の違いに関わらず、高度に保存された配列を確認した。この領域はGII内で特に保存されていたことから、GII型ノロウイルスに検出に特化した高率スクリーニング用プライマー、NvdetectF及びNVdetectRを設計した。なお図１の配列は、配列表において、順に、配列番号:27〜156として掲載されている。 Next, the base sequences of the amplification products from 88 strains were determined. FIG. 1 shows the results of further homology searches for 44 strains derived from the database and 88 strains whose base sequences were newly determined, a total of 132 strains. In the junction region of ORF1 and ORF2, highly conserved sequences were confirmed regardless of genotype differences. Since this region was particularly conserved in GII, high-rate screening primers, NvdetectF and NVdetectR, designed specifically for detection in GII norovirus were designed. The sequences in FIG. 1 are listed as SEQ ID NOs: 27 to 156 in order in the sequence listing.
NVdetectプライマーの塩基配列、及びノロウイルス全ゲノム配列 (GenBank ID AB220921による) における位置は、以下の通りである：
NVdetectF 5' TGGGAGGGCGATCGCAATCT 3' (5048 - 5067 nt) （配列番号：1）；
NVdetectR 5' TCGACGCCATCTTCATTCAC 3' (5081 - 5100 nt) （配列番号：2）。
増幅されるPCR産物は, 53bpであり、TM値は、NVdetectFが61.4℃、NVdetectRが55.2℃である。
The nucleotide sequence of the NVdetect primer and the position in the norovirus whole genome sequence (according to GenBank ID AB220921) are as follows:
NVdetectF 5 'TGGGAGGGCGATCGCAATCT 3' (5048-5067 nt) (SEQ ID NO: 1);
NVdetectR 5 ′ TCGACGCCATCTTCATTCAC 3 ′ (5081-5100 nt) (SEQ ID NO: 2).
The amplified PCR product is 53 bp, and the TM values are 61.4 ° C for NVdetectF and 55.2 ° C for NVdetectR.
なお、既存の推奨プライマーセットの塩基配列を以下に示す：
COG1F: CGYTGGATGCGNTTYCATGA （配列番号：5）；
G1SKR: CCAACCCARCCATTRTACA （配列番号：6）；
COG2F: CARGARBGNATGTTYAGRTGGATGAG （配列番号：7）；
G2SKR: CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT （配列番号：8）。
The base sequence of the existing recommended primer set is shown below:
COG1F: CGYTGGATGCGNTTYCATGA (SEQ ID NO: 5);
G1SKR: CCAACCCARCCATTRTACA (SEQ ID NO: 6);
COG2F: CARGARBGNATGTTYAGRTGGATGAG (SEQ ID NO: 7);
G2SKR: CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT (SEQ ID NO: 8).
データベース上の全塩基配列既知ノロウイルス44株のうち、GII型ノロウイルス36株と相同性を比較した結果、考えうる最大のミスマッチ数は、forwardが0塩基、reverseが1塩基であった。また、新たに塩基配列を解析した88株のうち、GII型ノロウイルス72株と相同性を比較した結果、考えうる最大のミスマッチ数は、GIIに対して、forwardが1塩基、reverseが3塩基であり (図2) 、既存のGII用プライマーセット(COG2F-G2SKR) と比較すると、GIIに対する配列のミスマッチ数は変わらない結果であった。しかし、COG2F-G2SKRプライマーが、縮重プライマーであるのに対し、今回設計したNVdetectプライマーは、特殊塩基を含まないため、より高感度、正確な検出が可能であることが期待された。 As a result of comparing the homology with the GII type Norovirus 36 strain among the 44 Norovirus strains whose base sequences are already known in the database, the maximum possible mismatch number was 0 bases for forward and 1 base for reverse. As a result of comparing homology with GII type Norovirus 72 strains among 88 strains newly analyzed for nucleotide sequences, the maximum number of possible mismatches is 1 base for forward and 3 bases for reverse. Yes (Fig. 2), compared with the existing primer set for GII (COG2F-G2SKR), the number of sequence mismatches with GII did not change. However, the COG2F-G2SKR primer is a degenerate primer, whereas the NVdetect primer designed this time does not contain a special base, so it was expected that more sensitive and accurate detection would be possible.
［検出プライマーの性能評価］
新規に設計したNVdetectプライマーを用いて、福岡市より分与を受けたノロウイルス患者由来の糞便上清132サンプルを対象に、RT-PCRを行い、目的領域を含むDNA断片を131株から増幅した。PCR産物の電気泳動結果を図3に示す。増幅した131株中、16株は、COG1F / G1SKR及びCOG2F / G2SKRプライマーで増幅できなかった株であったため、今回設計したプライマーは、既存の推奨プライマーセットよりも検出率が高い結果となった。
[Performance evaluation of detection primer]
Using the newly designed NVdetect primer, RT-PCR was performed on 132 fecal supernatant samples from Norovirus patients who were distributed by Fukuoka City, and DNA fragments containing the target region were amplified from 131 strains. The electrophoresis result of the PCR product is shown in FIG. Of the 131 amplified strains, 16 strains were strains that could not be amplified with COG1F / G1SKR and COG2F / G2SKR primers, so the primers designed this time had a higher detection rate than the existing recommended primer set.
NVdetectプライマーは、GII株内で特に保存された領域で設計したため、GI株内では完全に配列が一致するものはみられなかった。特に、forwardプライマーのプライミングサイトにおいて、5'側から4、5及び6番目の塩基は、GIとプライマーの配列が完全に違っていた。しかしながら、今回の実験では、GI型ノロウイルスもNVdetectプライマーにより検出されたことから、今後、NVdetectプライマーを用いて、多種のノロウイルス及びほかのウイルスに対する特異性の検討を行う必要があると考えられた。 Since the NVdetect primer was designed in a region that was particularly conserved in the GII strain, no perfect match was found in the GI strain. In particular, at the priming site of the forward primer, the 4th, 5th and 6th bases from the 5 ′ side were completely different in GI and primer sequences. However, since GI type norovirus was also detected by the NVdetect primer in this experiment, it was thought that it was necessary to investigate specificity for various noroviruses and other viruses using the NVdetect primer in the future.
［既存の検出法との比較］
本願で設計したプライマー、既存の推奨プライマーセット、及び既存の検出キット（配列不明）による検出率を下表に示す。
[Comparison with existing detection methods]
The detection rate by the primer designed by this application, the existing recommended primer set, and the existing detection kit (sequence unknown) is shown in the following table.
ノロウイルスGI型、GII型及びGI/GII型（双方が検出された検体）に対する検出率は、推奨プライマーセットに関しては、COG1F/G1SKR [GI, 23/27 (85.2%); GI/GII, 5/6 (83.3%); Total, 28/33 (84.8%)]，COG2F/G2SKR [GII, 103/117 (88%); GI/GII, 6/6 (100%); Total, 109/123 (88.6%)] であり、プライマーセット全体では132/150 (88.0%) であった。また、検出キットに関しては、TRCRtest noro1 [GI, 10/21 (45.7%): GI/GII, 1/3 (33.3%): Total, 11/24 (45.8%) ]、TRCRtest noro2 [GII, 35/77 (43.4%); GI/GII, 0/1 (0%); Total, 35/78 (44.9%)]であり、それぞれの遺伝子型検出用2種合計では46/101 (45.5%) であった。 The detection rates for Norovirus GI, GII and GI / GII (both detected specimens) are as follows for the recommended primer set: COG1F / G1SKR [GI, 23/27 (85.2%); GI / GII, 5 / 6 (83.3%); Total, 28/33 (84.8%)], COG2F / G2SKR [GII, 103/117 (88%); GI / GII, 6/6 (100%); Total, 109/123 (88.6 %)], And the total primer set was 132/150 (88.0%). For detection kits, TRCRtest noro1 [GI, 10/21 (45.7%): GI / GII, 1/3 (33.3%): Total, 11/24 (45.8%)], TRCRtest noro2 [GII, 35 / 77 (43.4%); GI / GII, 0/1 (0%); Total, 35/78 (44.9%)], and 46/101 (45.5%) for each of the two genotype detection types. It was.
一方、本論文で設計したNVdetectプライマーセット用いた検出では、GI, 18/18 (100%); GII, 108/109 (99.0%); GI/GII, 5/5 (100%)であり、全体では131/132 (99.2%) であり、既存法と比べ高い検出率を達成した。さらに、NVdetect プライマーセットは遺伝子型によらず1組のプライマーセットで検出が可能であるため、検出の簡易化にも有効であることが示された。 On the other hand, in the detection using the NVdetect primer set designed in this paper, GI, 18/18 (100%); GII, 108/109 (99.0%); GI / GII, 5/5 (100%) In 131/132 (99.2%), the detection rate was higher than that of the existing method. Furthermore, since the NVdetect primer set can be detected with one primer set regardless of the genotype, it was shown to be effective for simplification of detection.
Claims (9)
配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。 Any one of the following oligonucleotides (however, thymine (t) at any position may be substituted with uracil (u)):
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。 Norovirus detection composition or kit containing any one of the following oligonucleotides (however, thymine (t) at any position may be substituted with uracil (u)):
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
（a）配列番号：1の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b）配列番号：2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。 Norovirus detection oligonucleotide set comprising at least one selected from (a) below and at least one selected from (b) (however, thymine (t) at any position is uracil (u)) May be substituted):
(A) an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1,
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and a complement thereof;
(B) an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a complement thereof.
（a'）配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5074の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b'）配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5077〜5112の範囲から選択される連続した14〜28塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。 Norovirus detection oligonucleotide set comprising at least one selected from the following (a ′) and at least one selected from (b ′) (wherein thymine (t) at any position is uracil (u ) May be substituted):
(A ′) an oligonucleotide having a continuous base sequence of 14 to 28 bases selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159,
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a continuous base sequence of 14 to 28 bases selected from the range of 5033 to 5074 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement;
(B ′) an oligonucleotide consisting of a continuous base sequence of 14 to 28 bases long selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159;
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a continuous base sequence of 14 to 28 bases long selected from the range of 5077 to 5112 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement.
（a"）配列番号：159の塩基配列の5048〜5067の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5048〜5067の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体；
（b"）配列番号：159の塩基配列の5081〜5107の範囲から選択される連続した20〜27塩基長の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号：159の塩基配列の5081〜5107の範囲から選択される連続した20〜27塩基長の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
それらの相補体。 The oligonucleotide set according to claim 7, comprising at least one selected from the following (a ") and at least one selected from (b"):
(A ") an oligonucleotide consisting of a base sequence of 5048-5067 of the base sequence of SEQ ID NO: 159,
An oligonucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted in the nucleotide sequence 5048-5067 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 159, and a complement thereof;
(B ") an oligonucleotide having a continuous base sequence of 20 to 27 bases selected from the range of 5081 to 5107 of the base sequence of SEQ ID NO: 159,
Oligonucleotides consisting of a base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence of 20 to 27 bases in length selected from the range 5081 to 5107 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and their Complement.
配列番号：159の塩基配列の5033〜5085の範囲の塩基配列、
配列番号：159の塩基配列の5033〜5085の範囲の塩基配列において、一又は数個の塩基が置換されている塩基配列、及び
それらの相補体。 Method for designing oligonucleotide set for detecting norovirus using at least one base sequence selected from the following (however, thymine (t) at any position may be replaced with uracil (u)):
A nucleotide sequence ranging from 5033 to 5085 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 159,
A base sequence in which one or several bases are substituted in a base sequence in the range of 5033 to 5085 of the base sequence of SEQ ID NO: 159, and a complement thereof.
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