JP2010538652A - Ｂ型肝炎プレｓ２核酸 - Google Patents

Abstract

本発明は、中Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、およびこのベクターの発現産物を含む組成物（これは、中ＨＢＶ表面タンパク質、または中ＨＢＶ表面タンパク質と小ＨＢＶ表面タンパク質との混合物を含みうる）に関する。本発明の組成物は、中ＨＢＶ表面タンパク質を又は小および中ＨＢＶ表面タンパク質を一定の比で発現させるのに、あるいは中または小ＨＢＶ表面タンパク質への抗体の結合を測定するのに、あるいは抗中または抗小ＨＢＶ表面タンパク質抗体の質を測定するのに、あるいは抗中または抗小ＨＢＶ表面タンパク質抗体を含有するキットの質を測定するのに有用でありうる。

Description

本発明はＢ型肝炎ウイルス核酸、Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質を含む組成物ならびにそれらに関連した方法およびキットに関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は世界中で２０億人以上に感染していると推定されている。それは、軽度の無症状感染から慢性で活発な劇症肝炎まで、種々の病態をヒトにおいて引き起こす。４億人を超える人々、特に小児および高齢者が、ＨＢＶに慢性感染している。Ｂ型肝炎ウイルスはエイズウイルスより１００倍強い感染力を有するが、それはワクチン接種で予防可能である。したがって、ＨＢＶに対抗するための焦点はワクチン接種を含む。ワクチンは、Ｂ型肝炎に既に感染している人々には無効である。しかし、該ウイルスが十分早期に検出されれば、慢性感染者に対する種々の治療の選択肢が利用可能である。したがって、診断アッセイは、十分に早期の検出のためにＨＢＶウイルスの標的抗原を特定することに焦点が合わされている。

ＨＢＶゲノムは約３２００塩基対長の環状部分的二本鎖ＤＮＡ配列であり、いくつかのウイルスタンパク質をコードしている。ＨＢＶエンベロープは３つのグリコシル化タンパク質（大、中および小ＨＢＶ表面タンパク質、すなわち、それぞれＬＨＢ、ＭＨＢおよびＳＨＢ）よりなり、それらは同一遺伝子によりコードされているが、３つの異なる開始部位から産生され、同一終結部位を共有する。エンベロープタンパク質遺伝子のそれらの３つの異なる領域、すなわち、プレＳ１、プレＳ２およびＳは、それぞれＬＨＢ、ＭＨＢおよびＳＨＢをコードしている（図１および図２を参照されたい）。これらの３つのタンパク質は、異なる比率で発現され、ＨＢＶビリオンの外カプシドを形成するよう、そしてまた、不完全ウイルス粒子を形成するよう集合する。ＨＢＶ表面抗原アッセイは、発現産物の両方の形態、すなわち、ビリオンおよび粒子を検出する。

該ＨＢＶタンパク質の領域はＨＢＶ粒子表面上に露出しており、免疫監視の標的でありうる。しかし、ＨＢＶは、複製における逆転写酵素（ＲＴ）に対するその必須の依存性およびＲＴの不十分なプルーフリーディング能のため、高い突然変異率を示す。したがって、ＨＢＶは、ＳＨＢを含むエンベロープタンパク質における突然変異により、免疫監視およびワクチン接種法を逃れうる。さらに、ＨＢＶ検出の幾つかの方法は、抗ＳＨＢ抗体を使用することによりエンベロープタンパク質内のエピトープをモニターすることに依存したものであるため、高度に突然変異したＨＢＶは検出をも逃れうる。したがって、ＨＢＶを検出するための方法および組成物が当技術分野において依然として必要とされている。

本発明は、ＭＨＢをコードする核酸分子またはそれと実質的に同一の核酸分子であって、その核酸配列が、配列番号４、５または６を含むプレＳ２開始配列を含む、核酸分子を提供する。該核酸分子の配列は配列番号７または８を含みうる。該核酸分子は更に、ＳＨＢをコードするヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含みうる。

また、本発明は、核酸分子を含むベクター、および該ベクターを含む宿主細胞を提供する。

さらに、本発明は、１×１０^−１２〜１×１０^−２ｇｍｓの濃度で組換えＭＨＢを含む組成物を提供する。該組成物は更に、組換えＳＨＢを含み、これは、１×１０^−１２〜１×１０^−２ｇｍｓの濃度でありうる。該組成物中のＭＨＢ対ＳＨＢの比は１：１０００〜１０００：１でありうる。

また、本発明は、該ベクター、該宿主細胞または該組成物を含むキットを提供する。

さらに、本発明は、ＭＨＢへの又はＳＨＢとＭＨＢとの混合物への抗体の結合を測定する方法を提供する。該方法は、候補抗体を該組成物と接触させ、ＭＨＢへの又はＳＨＢとＭＨＢとの混合物への該抗体の結合を測定することを含みうる。

また、本発明は、候補抗体を準備し、ＭＨＢへの又はＳＨＢとＭＨＢとの混合物への該抗体の結合を測定することを含みうる、ＭＨＢに対する又はＳＨＢとＭＨＢとの混合物に対する抗体の質を測定する方法を提供する。該抗体の質は、結合のレベルを所定の値と比較することにより測定されうる。

さらに、本発明は、候補キットを準備し、ＭＨＢへの又はＳＨＢとＭＨＢとの混合物への結合を測定することを含みうる、ＭＨＢに対する又はＳＨＢとＭＨＢとの混合物とに対する抗体を含むキットの質を測定する方法を提供する。該キットの質は、結合のレベルを所定の値と比較することにより測定されうる。

詳細な説明
抗体に基づくアプローチを用いる臨床サンプル中のＨＢＶの適当な検出および定量は、組換えＳＨＢと組換えＭＨＢとの最適な混合物を含む陽性タンパク質対照または校正用物質に基づくものでありうる。ＨＢＶ表面タンパク質ＭＨＢおよびＳＨＢを発現させるために非コザックプレＳ２開始部位および野生型コザックＳ開始部位を使用する発現系は最適未満のＭＨＢを与える。本発明者らは、非コザック配列から部分的コザック配列へのプレＳ２開始部位の改変が、ＨＢＶ表面タンパク質ＭＨＢおよびＳＨＢの混合物を、これらの２つのタンパク質間の抗原性の比の改善を伴って発現しうる核酸を与えるという発見をなした。驚くべきことに、突然変異により誘導された部分的コザックプレＳ２開始部位を使用するＨＢＶ表面タンパク質発現は、臨床サンプル中に見られるＳＨＢ対ＭＨＢ抗原の比を、より正確に反映するようである。そのような修飾配列を使用して発現されたＭＨＢは、抗ＨＢＶタンパク質抗体の反応性を試験するための陽性対照として既知濃度または比で、単独で、またはＳＨＢと共に使用されうる。

１．定義
本明細書中で用いる用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであるに過ぎず、限定的なものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形表現は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形の対象物を含む。

本明細書における数的範囲の記載に関しては、同程度の精度を伴うその間に介在する各数字が明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲の場合には、６および９に加えて、７および８の数字が想定され、６．０〜７．０の範囲の場合には、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０の数字が明示的に想定される。

ａ．抗体
本明細書中で用いる「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＦの抗体またはそれらのフラグメントもしくは誘導体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、ジアボディ、二重特異性抗体、二官能性抗体ならびにそれらの誘導体を意味しうる。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体またはそれらの混合物でありうる。抗体はまた、キメラ抗体でありうる。抗体は、当技術分野で公知の１以上の化学的部分、ペプチド部分またはポリペプチド部分の結合により誘導体化されうる。抗体は化学的部分にコンジュゲート化されうる。

ｂ．結合
ポリペプチドおよび固体支持体に言及するために本明細書中で用いる「結合」または「固定化」は、該ポリペプチドおよび該固体支持体の間の結合が、結合、洗浄、分析および除去の条件下で安定であるために十分なものであることを意味しうる。該結合は共有結合または非共有結合でありうる。共有結合は該ポリペプチドと該固体支持体との間で直接的に形成されることが可能であり、あるいは架橋剤により、または固体支持体もしくはプローブもしくはその両方の分子上に特異的反応性基を含有させることにより形成されうる。非共有結合は静電性、親水性および疎水性相互作用の１以上でありうる。非共有結合に含まれるのは、該支持体への例えばストレプトアビジンのような分子の共有結合、および該ストレプトアビジンへのビオチン化ポリペプチドの非共有結合である。固定化は共有的相互作用と非共有的相互作用との組合せを含みうる。

ｃ．コード配列
本明細書中で用いる「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に配置された場合にｍＲＮＡへと転写される又はポリペプチドへと翻訳されるポリヌクレオチド配列を意味しうる。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定されうる。コード配列はｍＲＮＡまたは組換えポリペプチド配列を含みうる。

ｄ．相補体
核酸に言及するために本明細書中で用いる「相補体」または「相補性」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味しうる。

ｅ．エピトープ
本明細書中で用いる「エピトープ」または「抗原」はポリペプチドの抗原決定基を意味しうる。エピトープは、該エピトープに特有の空間的コンホメーションにおける３アミノ酸を含みうる。エピトープは少なくとも４〜１０アミノ酸を含みうる。空間的コンホメーションの検査方法は当技術分野で公知であり、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。

ｆ．遺伝子
本明細書中で用いる「遺伝子」は、転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域および／もしくは非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）を含む天然（例えば、ゲノム）または合成遺伝子でありうる。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でありうる。遺伝子はまた、コード領域に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（例えば、エキソンおよびｍｉＲＮＡ）であることが可能であり、これは、場合によっては、それに連結された５’−または３’−非翻訳配列を含む。遺伝子はまた、コード領域および／またはそれに連結された５’−もしくは３’−非翻訳配列の全部または一部を含むインビトロで産生された増幅核酸分子でありうる。

ｇ．宿主細胞
本明細書中で用いる「宿主細胞」は、天然に存在する細胞、またはベクターを含有し該ベクターの複製を支持しうる形質転換された細胞でありうる。宿主細胞は、培養細胞、外植片、インビボの細胞などでありうる。宿主細胞は原核生物細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または真核生物細胞、例えば酵母、昆虫、両生類または哺乳類細胞、例えばＣＯＳ−７、ＣＨＯおよびＨｅＬａでありうる。

ｈ．同一
２以上のポリペプチド配列の文脈において本明細書中で用いる「同一」または「同一性」は、それらの配列が、特定された領域にわたって同一である特定された割合（％）の残基を有することを意味しうる。該割合は、２つの配列を最適に整列させ、特定された領域にわたってそれらの２つの配列を比較し、同一残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、特定された領域における位置の総数で割り算し、その結果に１００を掛け算して、配列同一性の割合（％）を得ることにより計算されうる。それらの２つの配列が、異なる長さのものである場合、または該整列（アライメント）が１以上の食い違った末端を与え、特定された比較領域が単一の配列のみを含む場合には、単一配列の残基を該計算の分母には含め分子には含めない。

ｉ．標識
本明細書中で用いる「標識」または「検出可能な標識」は、それが結合している分子の直接的または間接的な定量的または相対的測定を可能にするシグナルを生成しうる部分を意味しうる。該標識は固体、例えばマイクロタイタープレート、粒子、微粒子または顕微鏡スライド；酵素；酵素基質；酵素インヒビター；補酵素；酵素前駆体；アポ酵素；蛍光物質；色素；化学発光性化合物；発光性物質；着色物質；磁性物質；または金属粒子、例えば金コロイド；放射性物質、例えば^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓまたは^１４Ｃ；リン酸化フェノール誘導体、例えばニトロフェニルホスファート、ルシフェリン誘導体またはジオキセタン誘導体などでありうる。該酵素は、デヒドロゲナーゼ；オキシドレダクターゼ、例えばレダクターゼまたはオキシダーゼ；官能基、例えばアミノ、カルボキシル、メチル、アシルまたはホスファート基の転移を触媒するトランスフェラーゼ；エステル、グリコシド、エーテルまたはペプチド結合のような結合を加水分解しうるヒドロラーゼ；リアーゼ；イソメラーゼ；またはリガーゼでありうる。該酵素は別の酵素にコンジュゲート化されることも可能である。

該酵素は酵素サイクリングにより検出されうる。例えば、検出可能な標識がアルカリホスファターゼである場合、測定は、ウンベリフェロン誘導体のような適当な基質から生じた蛍光または発光を観察することにより行われうる。該ウンベリフェロン誘導体は４−メチル−ウンベリフェリルホスファートを含みうる。

該蛍光標識および化学発光標識は、フルオレセインイソチオシアナート；ローダミン誘導体、例えばローダミンＢイソチオシアナートまたはテトラメチルローダミンイソチオシアナート；ダンシルクロリド（５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロリド）、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン（４−フェニルスピロ［フラン−２（３Ｈ），１’−（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３，３’−ジオン）；フィコビリンタンパク質、例えばフィコシアニンおよびフィソエリトリン；アクリジニウム塩；ルミノール化合物、例えばルミフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリン；イミダゾール；シュウ酸エステル；ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）またはサマリウム（Ｓｍ）のような希土類元素のキレート化合物；あるいはクマリン誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリンでありうる。

該標識は、ハプテン、例えばアダマンチン、フルオレセインイソチオシアナートまたはカルバゾールであることも可能である。該ハプテンは、多価抗体または（ストレプ）アビジン含有部分と接触した場合に、凝集物の形成を可能にしうる。該ハプテンは、それが固体基体に結合している分子の容易な結合をも可能にしうる。

該標識は、検出可能な標識に結合した分子のレベルを定量することにより、例えば、電極の使用；色、光もしくは吸光度の分光光度測定；または目視検査により検出されうる。

ｊ．核酸
本明細書中で用いる「核酸分子」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味しうる。一本鎖の記載は相補鎖の配列をも定める。したがって、核酸分子は、記載されている一本鎖の相補鎖をも含む。与えられている核酸と同じ目的で、核酸分子の多数の変異体が使用されうる。したがって、核酸分子は、実質的に同一の核酸分子およびその相補体をも含む。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズしうるプローブを与える。したがって、核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブをも含む。

核酸分子は一本鎖または二本鎖であることが可能であり、あるいは二本鎖および一本鎖配列の両方の一部分を含有しうる。核酸分子はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッド（この場合、該核酸分子は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有しうる）でありうる。核酸分子は化学合成法または組換え法により得られうる。

核酸分子は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するが、少なくとも１つの異なる結合、例えばホスホルアミジット、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートまたはＯ−メチルホスホロアミジット結合を有しうる核酸分子類似体ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合も含まれうる。他の類似核酸分子には、正のバックボーン、非イオン性バックボーンおよび非リボースバックボーン、例えば、米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているものが含まれる。１以上の非天然または修飾ヌクレオチドを含有する核酸分子も核酸の定義の１つに含まれる。該修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、該核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置しうる。ヌクレオチド類似体の代表例は、糖修飾またはバックボーン修飾リボヌクレオチドから選択されうる。しかし、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、５位において修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位において修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンのような非天然核酸塩基を天然核酸塩基の代わりに含有するリボヌクレオチドも適していることに注目すべきである。２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮ（ここで、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）から選ばれる基により置換されうる。修飾ヌクレオチドは、例えばＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔら，Ｎａｔｕｒｅ（２００５年１０月３０日）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８（２００４）および米国特許公開第２００５０１０７３２５号（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりにヒドロキシプロリノール結合によりコレステロールに結合したヌクレオチドをも含む。修飾ヌクレオチドおよび核酸分子には、米国特許第２００２０１１５０８０号（これを参照により本明細書に組み入れる）に記載されているロック化（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）も含まれうる。追加的な修飾ヌクレオチドおよび核酸分子は米国特許公開第２００５０１８２００５号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。リボース−リン酸バックボーンの修飾は種々の理由により（例えば、生理的環境中のそのような分子の安定性および半減期を増加させるため、または細胞膜を通る拡散を増強するため、またはバイオチップ上のプローブとして）行われうる。天然に存在する核酸および類似体の混合物が製造されうる。あるいは、異なる核酸分子類似体の混合物、および天然に存在する核酸および類似体の混合物が製造されうる。

ｋ．オープンリーディングフレーム
本明細書中で用いる「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を意味しうる。ＯＲＦはコード配列の一部分またはコード配列全体を表しうる。

ｌ．機能的に連結
本明細書中で用いる「機能的に連結（された）」は、遺伝子の発現が、それが空間的に連結されているプロモーターの制御下にあることを意味しうる。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’側（上流）または３’（下流）に位置しうる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、該プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じでありうる。当技術分野で公知のとおり、この距離における変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく適合化されうる。該プロモーターはＴ７、ＴＰ１、ラクターゼまたはメタロチオニンプロモーターを含みうる。

ｍ．ペプチド
本明細書中で用いる「ペプチド」または「ポリペプチド」はアミノ酸の連結配列を意味することが可能であり、天然物、合成物または天然物と合成物との組合せ若しくは修飾体でありうる。

ｎ．プロモーター
本明細書中で用いる「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与、活性化または増強しうる合成由来または天然由来分子を意味しうる。プロモーターは、発現を更に増強するための並びに／又はその空間的および／もしくは時間的発現を改変するための１以上の特異的転写調節配列を含みうる。プロモーターは、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置しうる遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素をも含みうる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含む起源に由来しうる。プロモーターは、構成的に、あるいは発現が生じる細胞、組織もしくは器官に関して又は発現が生じる発生段階に関して示差的に、あるいは外部刺激、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオンまたは誘導物質に応答して、遺伝子成分の発現を調節しうる。プロモーターの代表例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。

ｏ．組換えポリペプチド
本明細書中で用いる「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は少なくとも、その起源または操作により、それに天然で又はライブラリーの形態において付随しているポリヌクレオチドの全部または一部を伴っていない、あるいはそれが天然で連結されているもの以外のポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、半合成または合成由来のポリペプチドを意味しうる。該組換えポリペプチドは、必ずしも、示されているＨＢＶ核酸配列から翻訳されなくてもよい。該組換えポリペプチドはまた、化学合成または組換え発現系の発現を含む任意の方法で製造されることが可能であり、あるいはＨＢＶから単離されることが可能である。

ｐ．選択マーカー
本明細書中で用いる「選択マーカー」なる語は、遺伝的構築物でトランスフェクトまたは形質転換された細胞の特定および／または選択を促進するために、それが発現される宿主細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を意味しうる。選択マーカーの代表例には、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、細菌カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ゼオシン耐性遺伝子、抗生物質アウレオバシジンＡに対する耐性を付与するＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード化遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。

ｑ．固体支持体
本明細書中で用いる「固体支持体」または「固相」は、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、微粒子、例えばラテックス粒子などでありうる。固体支持体は決定的なものではなく、当業者により選択されうる。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップおよびヒツジ赤血球の全てが適例である。固体支持体上にペプチドを固定化するための適当な方法には、イオン性、疎水性、共有結合相互作用などが含まれる。固体支持体はまた、不溶性である任意の物質であることが可能であり、あるいは後続の反応により不溶性にされうる。固体支持体は、捕捉試薬を誘引し固定化するその固有の能力に関して選択されうる。あるいは、固体支持体は、捕捉試薬を誘引し固定化する能力を有する追加的受容体を保有しうる。該追加的受容体には、捕捉試薬自体とは逆に荷電した、または捕捉試薬にコンジュゲート化された荷電物質とは逆に荷電した荷電物質が含まれうる。さらにもう１つの代替手段として、該受容体分子は、特異的結合反応により捕捉試薬を固体化する能力を有する、固体支持体上に固定化（結合）された任意の特異的結合メンバーでありうる。該受容体分子は、アッセイの実施前またはアッセイの実施中に、固体支持体物質への捕捉試薬の間接的結合を可能にする。したがって、固体支持体は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン（ケイ素）表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者に公知の他の形態でありうる。

固体支持体は、結合抗原に対する適当な表面アフィニティおよび検出抗体による接近を可能にするのに十分な多孔度を有する任意の適当な多孔性物質を含みうることも想定され、本発明の範囲内である。微孔性構造体が一般に好ましいが、水和状態のゲル構造を有する物質も使用されうる。そのような有用な固体支持体には以下のものが含まれる：天然重合体炭水化物およびその合成修飾、架橋または置換誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル（特に硝酸およびカルボン酸とのもの）、混合セルロースエステルならびにセルロースエーテル；窒素を含有する天然重合体、例えばタンパク質、および誘導体、例えば架橋または修飾ゼラチン；天然炭化水素重合体、例えばラテックスおよびゴム；適度に多孔性の構造を伴って製造されうる合成重合体、例えばビニル重合体、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリビニルアセタートおよびその部分的に加水分解された誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリラート、前記縮合重合体の共重合体および三元共重合体、例えばポリエステル、ポリアミドおよび他の重合体、例えばポリウレタンまたはポリエポキシド；多孔性無機物質、例えばアルカリ土類金属およびマグネシウムのスルファートまたはカルボナート、例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリおよびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのシリカート；ならびにアルミニウムまたはケイ素オキシドまたはヒドラート、例えばクレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの物質は前記重合体物質と共にフィルターとして使用されうる）；ならびに前記クラスの混合物または共重合体、例えば、既存天然重合体上で合成重合体の重合を開始させることにより得られるグラフト共重合体。これらの物質の全ては、例えばフィルム、シートまたはプレートのような適当な形状で使用されることが可能であり、あるいはそれらは例えば紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは織物のような適当な不活性担体上にコーティングされ又はそれらに結合もしくは積層されうる。

ニトロセルロースの多孔性構造体は、モノクローナル抗体を含む多種多様な試薬に対する優れた吸収および吸着特性を有する。ナイロンも類似特性を有し、同様に好適である。前記のそのような多孔性固体支持体は、好ましくは、約０．０１〜５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態であると想定される。その細孔径は広い範囲内の様々な値であることが可能であり、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に約０．１５〜１５ミクロンである。そのような支持体の表面は、該支持体への該抗原または抗体の共有結合をもたらす化学的方法により活性化されうる。しかし、一般には、十分には理解されていない疎水性力による多孔性物質への吸着により、該抗原または抗体の不可逆的結合が得られる。適当な固体支持体はまた、米国特許出願第２２７，２７２号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

ｒ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書中で用いる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複雑な混合物において、第１核酸配列（例えば、プローブ）が第２核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味しうる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況によって様々となるであろう。ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度、ｐＨにおいて特異的配列に関する融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるよう選択されうる。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（一定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度における）温度である（Ｔｍにおいては、標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡時に占拠される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、例えばナトリウムイオン（または他の塩）濃度約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド以上）に関しては少なくとも約６０℃である条件でありうる。ストリンジェントな条件は例えばホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成されうる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍でありうる。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のものを含む：５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびにそれに伴う、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中、６５℃での洗浄。

中等度のストリンジェンシーの条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の予備洗浄、５０℃または６５℃、５×ＳＳＣにおける一晩のハイブリダイゼーション、およびそれに続く、０．１％ ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれでの６５℃で２０分間の２回の洗浄を意味しうる。

低いストリンジェンシーの条件は５０〜５５℃での２〜５×ＳＳＣの溶液中の洗浄を意味しうる。低いストリンジェンシーの条件は、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０〜５５℃での洗浄、または２．５×デンハルト液、０．１％ ＳＤＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含有しうる５×ＳＳＰＥ（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）中、５０℃でそれぞれ４時間および１２時間の予備洗浄およびハイブリダイゼーションをも含みうる。

ｓ．実質的に同一
本明細書中で用いる「実質的に同一」は、第１配列と第２配列とが８〜１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸にわたって少なくとも５０％〜９９％同一であることを意味しうる。

ｔ．変異体
核酸に関して本明細書中で用いる「変異体」は、（ｉ）言及されているヌクレオチド配列の一部分、（ｉｉ）言及されているヌクレオチド配列の相補体またはその一部分、（ｉｉｉ）言及されている核酸と実質的に同一である核酸またはその相補体、あるいは（ｉｖ）言及されている核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、その相補体またはそれと実質的に同一の配列を意味しうる。ポリペプチドに関して本明細書中で用いる「変異体」は、（ｉ）言及されているポリペプチドの一部分、あるいは（ｉｉ）言及されているタンパク質と実質的に同一であるタンパク質を意味しうる。変異体はまた、例えばタンパク質分解、リン酸化または他の翻訳後修飾により異なってプロセシングされたポリペプチドでありうる。

ｕ．ベクター
本明細書中で用いる「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味しうる。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体でありうる。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターでありうる。ベクターは、自己複製性染色体外ベクター、または宿主ゲノム内に組込まれるベクターでありうる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。以下のベクターが例示される。細菌性：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ） ｐＢｓ、ファジスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３ ３、ｐＫＫ２３３ ３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。

２．ＨＢＶ核酸
本発明は、ＨＢＶのゲノムに由来しうるＨＢＶ関連核酸およびその変異体を提供する。該核酸はまた、組換え体でありうる。該核酸は、ＨＢＶ表面タンパク質またはその変異体をコードしうるオープンリーディングフレームを含みうる。

ａ．プレＳ２領域
該核酸はプレＳ２領域を含みうる。プレＳ２領域は、表１に記載されている配列を含みうる中ＨＢＶ表面タンパク質（ＭＨＢ）をコードしうる。

プレＳ２領域は、表２に記載されている配列を含みうる。遺伝暗号における縮重により、該核酸の配列は、表２に記載されている配列とは異なりうるが、表１に記載されているのと同じアミノ酸配列をコードしている。

（１）プレＳ２開始配列
プレＳ２領域は、ＭＨＢの翻訳が開始される起点となりうるプレＳ２開始配列を含みうる。該プレＳ２開始配列は配列５’−ＣＴＴＡＴＧＣＡＧ−３’（配列番号３）を含みうる。該プレＳ２開始配列は改変されることが可能であり、これは、該核酸から発現される小ＨＢＶ表面タンパク質（ＳＨＢ）に対するＭＨＢの比に影響を及ぼしうる。該プレＳ２開始配列は部分的コザック配列またはコザック配列をも含みうる。

（ａ）コザック配列
コザック配列は、突然変異プレＳ２開始配列からの翻訳を増強する能力を有しうる。翻訳の増強は、プレＳ２領域から産生されるＭＨＢのレベルを増加させうる。増加したＭＨＢレベルは、該核酸中に含有されるＳ領域から翻訳されるＳＨＢのレベルと相関しうる。あるいは、理論により束縛されるものではないが、臨床由来物質において見られるものをより厳密に反映する粒子集合またはタンパク質フォールディングにより、ＭＨＢの翻訳の増強はＳＨＢとＭＨＢとの生成タンパク質混合物の抗原性に影響を及ぼしうる。

コザック配列は、５’−ＲＮＮＡＴＧＧ−３’（配列番号４）（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである）でありうるコンセンサス配列を含みうる。コザック配列は配列５’−ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１６）または５’−ＲＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１７）をも含みうる。

（ｂ）部分的コザック配列
部分的コザック配列は、プレＳ２開始配列からの翻訳を増強する能力を有しうる。翻訳の増強は、プレＳ２領域から産生されるＭＨＢのレベルを増加させうる。増加したＭＨＢレベルは、該核酸中に含有されるＳ領域から翻訳されるＳＨＢのレベルと相関しうる。あるいは、臨床由来物質において見られるものをより厳密に反映する粒子集合またはタンパク質フォールディングにより、ＭＨＢの翻訳の増強はＳＨＢとＭＨＢとの生成タンパク質混合物の抗原性に影響を及ぼしうる。

部分的コザック配列は配列５’−ＧＮＮＡＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１８）または５’−ＡＮＮＡＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１９）を含みうる。部分的コザック配列は配列５’−ＧＡＧＡＴＧＣＡＧ−３’（配列番号５）または５’−ＡＡＧＡＴＧＣＡＧ−３’（配列番号６）をも含みうる。部分的コザック配列を含むプレＳ２領域の配列は、表３に記載されている配列を含みうる。

ｂ．Ｓ領域
該核酸はＳ領域を含むことも可能であり、これは小ＨＢＶ表面タンパク質（ＳＨＢ）をコードすることが可能であり、このＳＨＢは、表４に記載されている配列を含みうる。

Ｓ領域は、表５に記載されている配列をも含みうる。

（１）Ｓ開始配列
Ｓ領域は、ＳＨＢの翻訳が開始される起点となりうるＳ開始配列を含みうる。該Ｓ開始配列は配列５’−ＡＡＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１１）を含むことが可能であり、本明細書に記載されているコザック配列を含むことが可能である。

（ａ）突然変異Ｓ開始配列
該Ｓ開始配列は突然変異Ｓ開始配列を含みうる。該突然変異Ｓ開始配列は、コザック配列でも部分的コザック配列でもなくてもよい配列をも含みうる。突然変異Ｓ開始配列は、プレＳ２開始配列または突然変異プレＳ２開始配列からのＭＨＢの翻訳に影響を及ぼさない可能性がある。突然変異Ｓ開始配列はＭＨＢの抗原性にも影響を及ぼさない可能性がある。突然変異Ｓ開始配列は、メチオニンから任意の他のアミノ酸（これはロイシンでありうる）への突然変異をコードする核酸を含みうる。突然変異Ｓ開始配列は配列５’−ＡＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号１２）または５’−ＡＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１３）を含みうる。

突然変異Ｓ開始配列を含むプレＳ２領域は、表６に記載されている配列を含みうる。

ｃ．プレＳ１領域
該核酸はプレＳ１領域を含むことも可能であり、これは大ＨＢＶ表面タンパク質（ＬＨＢ）をコードしうる。ＬＨＢは約３８９アミノ酸長であることが可能であり、ＨＢＶエンベロープの一部分を形成することが可能でありうる。

プレＳ１領域は、ＬＨＢの翻訳が開始される起点となりうる開始配列を含みうる。プレＳ１配列は、表７に記載されている配列を含みうる。

３．ＨＢＶポリペプチド
本発明は、ＨＢＶ関連核酸によりコードされうるポリペプチドを提供する。該ポリペプチドはＨＢＶタンパク質またはその変異体でありうる。該ＨＢＶタンパク質はＨＢＶ表面タンパク質であることが可能であり、組換え体でありうる。該ポリペプチドは標識を含みうる。

ａ．中Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（ＭＨＢ）
該ＨＢＶタンパク質は、約２８１アミノ酸長でありうるＭＨＢでありうる。ＭＨＢは、Ｓ領域によりコードされる小ＨＢＶ表面タンパク質の２２６アミノ酸を含有することが可能であり、プレＳ２領域によりコードされる追加的な５５アミノ酸を含有することが可能である。ＭＨＢはグリコシル化されうる。ＭＨＢは、ＨＢＶエンベロープの一部を形成する能力を有することが可能であり、これはＭＨＢをＨＢＶ粒子の表面上に露出させうる。

ＭＨＢは、抗原性でありうる又は免疫監視の標的でありうるＭＨＢエピトープを含みうる。ＭＨＢは、１×１０^−１２〜１×１０^−２ｇｍｓでありうる検出可能な濃度で存在しうる。ＭＨＢは、１１６−３４（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１０１２２）でありうるモノクローナル抗体のような抗ＭＨＢ抗体で検出可能でありうる。

ｂ．小Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＳＨＢ）
ＨＢＶタンパク質はまた、約２２６アミノ酸長でありうるＳＨＢでありうる。ＳＨＢはグリコシル化されることも可能である。ＳＨＢは、ＨＢＶエンベロープの一部を形成する能力を有することが可能であり、これはＳＨＢをＨＢＶ粒子の表面上に露出させうる。ＳＨＢは、抗原性でありうる又は免疫監視の標的でありうるＳＨＢエピトープを含みうる。

ＳＨＢエピトープは、米国特許第５，９２５，５１２号または第７，１４１，２４２号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている「ａ」決定基の一部でありうる。「ａ」決定基は、部分的に重複していても全く重複していなくてもよい少なくとも５つのエピトープを含みうる。

ＳＨＢエピトープは、ＳＨＢの抗原性に影響を及ぼしうる突然変異体でありうる。突然変異ＳＨＢエピトープは、あるヒト集団において、より頻繁に見られうる。例えば、突然変異ＳＨＢエピトープは、モノクローナル抗ａ抗体療法を受けている肝移植患者において、あるいはＨＢＶに対してワクチン接種されたイタリアまたは日本の患者において、より頻繁に見られうる。突然変異ＳＨＢエピトープは、ＳＨＢの１２２位における２アミノ酸の挿入、例えばＮＴまたはＲＡ、ＳＨＢの１２３位におけるＲＧＡアミノ酸挿入、あるいはＳＨＢの１２４位におけるＮＳＴＧＰＣＴＴアミノ酸挿入、あるいはＴ１２３Ａ、Ｇ１４５ＲもしくはＰ１２０Ｇ突然変異またはそれらの組合せ［米国特許第５，９２５，５１２号または第７，１４１，２４２号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているもの］でありうる。

ＳＨＢエピトープの抗原性は軽減されることが可能であり、これは、突然変異ＳＨＢエピトープを含むＨＢＶが免疫監視を逃れることを可能にしうる。ＳＨＢは、１×１０^−１２ｇｍｓでありうる検出可能な濃度で存在しうる。ＳＨＢは、Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ５３、Ｈ４０、Ｈ３５または類似抗体でありうる抗ＳＨＢ抗体により検出可能でありうる。

４．ＨＢＶ組成物
本発明は、ＨＢＶタンパク質を含みうる及びＨＢＶ関連核酸をも含みうるＨＢＶ組成物を提供する。該ＨＢＶ組成物はＭＨＢおよびＳＨＢを１：１０００〜１０００：１の比で含むことも可能である。該組成物は、ＨＢＶタンパク質への抗体の結合もしくは質、またはＨＢＶタンパク質に対する抗体を含む若しくはＨＢＶタンパク質を含むキットの質を測定するために使用されうる。

５．ベクター
本発明は、ＨＢＶ関連核酸を含みうるベクターを提供する。該核酸は、該核酸によりコードされるポリペプチドを発現させる能力を有しうるプロモーターに機能的に連結されうる。該ベクターは選択マーカーをも含みうる。

該ベクターは、ＨＢＶ関連核酸とインフレームで翻訳されることが可能でありうる融合配列をも含みうる。該融合配列は、例えばベータ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇａｌ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはＣＭＰ−ＫＤＯシンターゼ（ＣＫＳ）［１９８６年１０月１日付け公開の欧州特許公開第０１９６０５６号、１９８９年９月１３日付け公開の欧州特許公開第０３３１９６１号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている］のような融合タンパク質の部分をコードしうる。

１．宿主細胞
本発明は、該ベクターを含みうる宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、該ベクターによりコードされるポリペプチドを発現する能力を有しうる。該ベクターは一過性にトランスフェクトされることが可能であり、あるいは安定にトランスフェクトされることが可能であり、あるいは該宿主細胞内に組込まれることが可能である。一過性トランスフェクションは、該宿主細胞内で複製されず該宿主細胞内にほとんど組込まれないベクターによるものでありうる。

安定なトランスフェクションまたは組込みは、宿主細胞ゲノム内に組込まれうる又は宿主細胞内で自律的に複製されうるベクターを導入することによるものでありうる。安定なトランスフェクションまたは組込みは、該ベクター上に位置する又は該ベクターと共にトランスフェクトされた選択マーカーの使用、およびそれに続く、該マーカーを発現する宿主細胞の選択により選択されうる。安定な組込みにおいては、ベクターの組込みの部位は宿主細胞ゲノム内でランダムに生じることが可能であり、あるいは宿主細胞ゲノム内の内在性遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムに対する相同性の領域を含むベクターの使用により標的化されることが可能である。構築物を内在性遺伝子座に標的化する場合、該転写および翻訳調節領域の全部または一部は該内在性遺伝子座により提供されうる。

該ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄ．Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８３）（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに、トランスフェクション、形質転換またはエレクトロポレーションにより宿主細胞内に導入されうる。

７．ポリペプチドの製造
本発明は該ポリペプチドの製造方法を提供する。該ポリペプチドは合成可能であり、あるいはそれは宿主細胞内で発現されうる。宿主細胞からの発現は、該ポリペプチドの発現を可能にする適当な条件下で該宿主細胞を培養することによるものでありうる。発現は、該宿主細胞において機能的な発現シグナルを含有しうるベクターからのものでありうる。発現は、該核酸に機能的に連結された調節可能なプロモーターの活性を誘導することによっても達成されうる。発現はまた、ＨＢＶ関連核酸および融合配列を含みうるベクターからのものでありうる。

ＨＢＶポリペプチドと融合タンパク質の一部分とを含みうる発現ポリペプチドは、細胞溶解された細胞から、または培地から単離されることが可能であり、該発現ポリペプチドの意図される用途に必要な程度にまで精製されうる。精製は、当技術分野で公知の技術によるものであることが可能であり、塩分画、イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーまたは遠心分離を含みうる。該発現ポリペプチドは診断試薬として使用されうる。該発現ポリペプチドは、ＨＢＶを単離し検出するためにも有用でありうる。

８．キット
本発明は、試薬、例えばＨＢＶ関連核酸、該ベクター、該宿主細胞、該ＨＢＶ組成物、候補抗体またはそれらの組合せを含みうるキットを提供する。例えば、該キットは、該ベクター、該ベクターによりコードされるＨＢＶタンパク質の発現を誘導しうる物質、および陽性対照として使用される既知濃度のＨＢＶタンパク質を含むＨＢＶ組成物を含むことが可能であり、ＨＢＶポリペプチドを発現させるために使用されうる。該キットは、該ベクターでの形質転換に適した宿主細胞をも含みうる。該キットは、該ベクターからのＨＢＶタンパク質の発現の確認において使用するための、ＨＢＶタンパク質を検出しうる抗体をも含みうる。

該キットは、ＨＢＶタンパク質への候補抗体の結合または質を測定するためにも使用されうる。該キットは、該ＨＢＶ組成物と、該候補抗体の結合を比較するために使用されうる、該ＨＢＶタンパク質に結合しうる対照抗ＨＢＶ抗体とを含みうる。該キットは、該発現ＨＢＶタンパク質の単離において使用するための、該ＨＢＶタンパク質に融合したタンパク質断片に結合しうる固体基体をも含みうる。

該キットは、該ＨＢＶタンパク質への対照抗ＨＢＶ抗体または候補抗体の結合を測定するために使用されうる標識を含みうる及び抗ＨＢＶ抗体に結合しうる検出抗体をも含みうる。該キットは、標識にシグナルを生成させうる検出試薬をも含みうる。

該キットは、該ベクターを該宿主細胞内に形質転換しＨＢＶタンパク質の発現を該ベクターから誘導しタンパク質−タンパク質相互作用を促進もしくは阻害し又はシグナルの生成において該標識を誘導もしくは遮断するために必要な例えばバッファーおよび塩のような追加的試薬をも含みうる。該キットは更に、例えばバイアルまたはボトルのような１以上の容器を含むことが可能であり、各容器は別々の試薬を含有しうる。該キットはまた、書面の説明を含むことが可能であり、これは、本明細書に記載されている方法またはアッセイの実施を説明したものでありうる。

９．抗体の結合の測定
本発明は、ＨＢＶポリペプチドへの候補抗体の結合のレベルを測定することを含みうる、抗体の結合の測定方法を提供する。該方法は、（１）該ＨＢＶ組成物を固相上に提示させ、候補抗体を含有する試験サンプルを該ＨＢＶ組成物と反応させ、標識に結合した抗ヒト抗体で、該ＨＢＶ組成物に結合した候補抗体を検出すること、または（２）抗ヒト抗体を固相に結合させ、候補抗体を含むサンプルを結合候補抗体と反応させ、ついで、標識を含むＨＢＶ組成物を加えて、該サンプル中に存在する候補抗体を検出することを含む一般的形態によるものでありうる。どちらの形態においても、該アッセイの意図される目的に応じて、該抗ヒト抗体試薬は全ての抗体クラスを認識しうるか、あるいは特定のクラスまたはサブクラスの抗体に特異的でありうる。これらのアッセイ形態および他の公知形態は本発明の範囲内であると意図され、当業者によく知られている。

抗体結合の測定はまた、（ａ）候補抗体を含有する疑いのある試験サンプルを該ＨＢＶ組成物と接触させ、（ｂ）該複合体の存在、ひいては該試験サンプル中に存在する候補抗体の存在を検出することを含みうる。候補抗体の測定は、（ａ）候補抗体を含有する疑いのある試験サンプルを該ＨＢＶ組成物と、抗体／抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、（ｂ）生じた抗体／抗原複合体にコンジュゲートを、該コンジュゲートが該結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加え［ここで、該コンジュゲートは、標識に結合した（該ＨＢＶ組成物に対する）抗体を含む］、（ｃ）該標識により生成されたシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうる該候補抗体の存在を検出することをも含みうる。該ＨＢＶ組成物に結合する対照または校正用物質も使用されうる。

抗体結合の測定は更に、（ａ）候補抗体を含有する疑いのある試験サンプルを、該候補抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／抗体複合体の形成を可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、（ｂ）生じた抗抗体／抗体複合体に該ＨＢＶ組成物を、該ＨＢＶ組成物が該抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、（ｃ）生じた抗抗体／抗体／ＨＢＶ組成物複合体にコンジュゲートを、該コンジュゲートが該結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加え［ここで、該コンジュゲートは、標識に結合したモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含むＨＢＶ組成物を含み、該モノクローナルまたはポリクローナル抗体は該ＨＢＶ組成物に対するものである］、（ｄ）該標識により生成されたシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうる該候補抗体の存在を検出することをも含みうる。該抗抗体に対する抗体を含む対照または校正用物質も使用されうる。

抗体の測定はまた、米国特許第５，９２５，５１２号または第７，１４１，２４２号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている方法によるものでありうる。

ａ．候補抗体
候補抗体はＨＢＶタンパク質への結合能を有しうる。該ＨＢＶタンパク質は、野生型ＨＢＶタンパク質、または突然変異ＨＢＶタンパク質でありうる変異ＨＢＶタンパク質でありうる。

該候補抗体は、野生型ＨＢＶタンパク質と変異ＨＢＶタンパク質とを、または２つの異なるＨＢＶ変異タンパク質を識別する能力を有しうる。該候補抗体は、いずれかのＨＢＶタンパク質への結合能をも有しうる。該候補抗体は１１６−３４、Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ５３、Ｈ４０またはＨ３５モノクローナル抗ＨＢＶタンパク質抗体または類似エピトープ認識の抗体でありうる。

該候補抗体はまた、ＨＢＶタンパク質エピトープ、例えばＭＨＢエピトープ、突然変異ＭＨＢエピトープ、ＳＨＢエピトープまたは突然変異ＳＨＢエピトープへの結合能を有しうる。該候補抗体は、第１ＨＢＶタンパク質エピトープと第２ＨＢＶタンパク質エピトープとを識別する能力を有しうる。該候補抗体はまた、第２ＨＢＶタンパク質エピトープより高いアビディティで第１ＨＢＶタンパク質エピトープに結合する能力を有しうる。

第１および第２ＨＢＶタンパク質エピトープはＨＢＶタンパク質内の異なる相対位置に存在しうる。第１および第２ＨＢＶタンパク質エピトープはまた、それぞれ第１および第２ＨＢＶタンパク質内の同じ相対位置における変異体でありうる。例えば、該変異体は野生型ＳＨＢエピトープおよび突然変異ＳＨＢエピトープでありうる。該変異体はまた、２つの異なる突然変異ＳＨＢエピトープでありうる。

該候補抗体はＭＨＢエピトープへの結合能を有しうるが、ＳＨＢエピトープへの結合能を有し得ない。該候補抗体はまたは、ＳＨＢエピトープに対するものより高いアビディティでＭＨＢエピトープに対して結合する能力を有しうる。

ｂ．検出系
該標識は、半自動化または全自動化免疫分析装置により使用されるよう適合化された固相を含みうる検出系を用いて検出されうる。サンプルおよび試薬が該系内に挿入されたら、該検出系は、使用者の介入を伴わずに、サンプルおよび試薬（これは抗体、標識、バッファーなどを含みうる）を反応容器へ運搬し、インキュベーションを行い、場合によっては、未結合標識ポリペプチドを結合標識ポリペプチドから洗い落としうる。そのような系は、該サンプルおよび試薬を該系内に挿入した後、使用者の介入を伴うことなく４８時間以内に少なくとも８、１６，６４または１２８アッセイを該系が行いうることにより、手動の又はそれほど自動化されていない系から区別されうる。該系は、サンプルが該系内にローディングされたら、人間による計算または入力の必要性を伴うことなく、サンプル中のポリペプチドの濃度または量を自動的に計算することも可能でありうる。

該検出系はカートリッジ形態または試験片アッセイをも含みうる。該検出系は、使い捨て可能な装置内への単位用量で負荷（ローディング）可能なアッセイ試薬を提供し、該単位用量は、該ポリペプチドを検出するためにアッセイするのに必要な全ての試薬を含有しうる。そのような使い捨て可能な装置は、ナイロン、ニトロセルロースまたは他の適当な物質を含みうる使い捨て可能な膜様構造体を含みうるプラスチックハウジングを含みうる。該サンプルは予備加工され、または該使い捨て装置のローディング領域上に直接的にローディングされうる。ついで、場合によっては、該サンプルは、該膜様構造体を通って、該膜上に含有される複数の領域を経由して流動しうる。該膜様構造体は更に、界面活性剤または側方流動補助物質を含むことが可能であり、また、過剰な流体を採集するための及び／又は該膜を通る側方流動を促進するための吸収剤を含有しうる。該検出系は、１、２、４、８、１０または１２アッセイを行うのに十分な試薬を各パックが含みうる多パック系を含みうる。

該検出系はまた、マイクロリットル範囲（例えば、４μＬ、１２μＬまたは５０μＬ未満）のサンプルを分析するよう設計されたマイクロフルイディック（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）装置を含みうる。該マイクロフルイディック装置は、該サンプルまたはアッセイ試薬またはそれらの両方がマイクロフルイディック装置内で輸送されるのを補助するための流動補助剤、推進装置（これは膨張性ゲル、ワックスおよび気体を含みうる）、ナノバルビング（ｎａｎｏｖａｌｖｉｎｇ）などを含みうる。

勿論、言うまでもなく、本明細書における典型的な形態の全て、および本発明のいずれのアッセイまたはキットも、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号に記載されている、そして例えばＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭおよびＱｕａｎｔｕｍ ＩＩ形態ならびに他の形態（これらに限定されるものではない）を含むＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）により市販されている自動化および半自動化系（微粒子を含む固相が存在するものを含む）における使用に適合化または最適化されうる。

また、本発明のアッセイおよびキットは、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイ系を含むケア現場（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）アッセイ系に適合化または最適化されうる。免疫センサーおよびその製造および操作方法（１回使用用試験装置におけるもの）が、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号ならびに公開されている米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、第２００４００１８５７７号、第２００５００５４０７８号および第２００６０１６０１６４号（それに関するこれらの教示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

１０．抗体の質の測定
抗体の質を試験し、ＭＨＢまたはＳＨＢのようなＨＢＶタンパク質でありうるその標的にそれが結合する能力を実証することが望ましいかもしれない。本発明は抗体の質の測定方法を提供する。試験抗体は、既に知られている抗ＨＢＶ抗体の新たに製造されたロット、既に知られている抗ＨＢＶ抗体の古いロット、または候補抗ＨＢＶ抗体からのものでありうる。

該試験抗体は、ＭＨＢまたはＳＨＢを含む組成物への該抗体の結合に関して試験されうる。該組成物中のＭＨＢまたはＳＨＢは、該試験抗体の結合に関する対照として使用するために既知濃度で存在しうる。該組成物への該試験抗体の結合を測定することが可能であり、結合のレベルを所定の値と比較することが可能である。所定の値は１×１０^−１２〜１×１０^−６ＭのＫｄでありうる。該所定値はまた、該組成物への対照抗体の結合のレベルでありうる。

該所定値と比較した該試験抗体の結合のレベルは該試験抗体の質を示しうる。該所定値を超える結合のレベルは、該試験抗体がＨＢＶタンパク質の検出において有用でありうることを示しうる。該所定値未満のレベルは、該試験抗体が、不十分な質のものであり、ＨＢＶタンパク質の検出における使用にそれほど望ましくないことを示しうる。該抗体の質を測定するための該方法は、抗ＨＢＶ抗体を含むキットの質の判定において有用でありうる。

外カプシドを形成するよう集合したＨＢＶエンベロープタンパク質構成成分であるＬＨＢ、ＭＨＢおよびＳＨＢの混合物を含むＨＢＶビリオンの概要図である。これらのタンパク質の同様の集合は不完全粒子を形成する（示されていない）。 ＨＢＶ プレＳ１オープンリーディングフレームならびにそのプレＳ２およびＳ領域の概要図を示す。図２はまた、プレＳ１核酸によりコードされるＨＢＶ表面タンパク質（ＬＨＢ、ＭＨＢおよびＳＨＢ）の概要図を示す。 プレＳ１オープンリーディングフレーム突然変異体およびそれらの生じるタンパク質発現の概要図である。 種々の抗ＨＢＶ表面タンパク質抗体を使用する、天然に存在するＨＢＶ表面抗原ＡｄＡおよび陽性対照のエピトープマッピングを示す。 種々の抗ＨＢＶ表面タンパク質抗体を使用して測定された、突然変異プレＳ２配列から産生されたプレＳ２コード化タンパク質の抗原性を示す。 Ａｕｓｚｙｍｅ ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌまたはＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＨＢｓＡｇ市販Ａｂｂｏｔｔ診断イムノアッセイを使用する平均サンプル対カットオフ（Ｓ／ＣＯ）の結果を示す。

本発明は、以下の非限定的な実施例により例示される複数の態様を有する。

プレＳ２核酸の構築
Ａｂｂｏｔｔ所有のプラスミド（Ｃｏｌｅｍａｎら，１９９９．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．５９：１９−２４）からのＭＨＢまたはＳＨＢ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してｐｃＤＮＡ３．１＋プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に導入して、ＭＨＢおよびＳＨＢプラスミドを得た。

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を該製造業者の説明に従い使用して、コザックＧＡＧ、コザックＡＡＧおよびＭ１Ｌ突然変異体（図３）を作製した。コザックＧＡＧプライマー（５’−ｇｇＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＴｇ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＡｇ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣｇＣ−３’（配列番号２０）および５’−ｇＣｇ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＡｇ ｇＡｇ ＡＴｇ ＣＡｇ Ｔｇｇ ＡＡＴ ＴＣＣ−３’（配列番号２１））およびＡＡＧプライマー（５’−ｇｇＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＴｇ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＡｇ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣｇＣ−３’（配列番号２２）および５’−ｇＣｇ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＡｇ ＡＡｇ ＡＴｇ ＣＡｇ Ｔｇｇ ＡＡＴ ＴＣＣ−３’（配列番号２３））を使用して、該ＭＨＢ鋳型内に突然変異を施した。Ｍ１Ｌプライマー（５’−ｇＴｇ ＡＴｇ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＡｇ ＴＴＣ ｇＴＣ ＡＣＡ ｇｇ−３’（配列番号２４）および５’−ＣＣＴ ｇＴｇ Ａｃｇ ＡＡＣ ＴＴｇ ｇＡｇ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣ−３’（配列番号２５））を使用して、コザックＧＡＧ突然変異を含有するＭＨＢ鋳型内にＭ１Ｌ突然変異を施した。

該突然変異の存在およびＭＨＢまたはＳＨＢ配列を確認するために、全てのプラスミドを配列決定した。

プレＳ２核酸を使用するＭＨＢおよびＳＨＢの発現
ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×抗生物質−抗真菌物質（ＡｂＡｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補足されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で、５％ ＣＯ_２中、３７℃で培養した。一過性トランスフェクションのために、該細胞を３５０，０００細胞／３５ｍｍウェルの密度で２ｍＬの抗生物質−抗真菌物質非含有ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ内にプレーティングした。翌日、４μｇのプラスミドを２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈し、穏やかに混合した。１２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、穏やかに混合し、５分間インキュベートした。該希釈ＤＮＡを該希釈Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と混合し、２０分間インキュベートし、該細胞に加えた。３７℃で４〜６時間のインキュベーションの後、該細胞を２ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／ＡｂＡｍで洗浄し、追加的な２ｍＬの培地を加えた。トランスフェクションの３日後、該細胞培養上清を集めた。

抗ＨＢＶ抗体を使用するＭＨＢおよびＳＨＢの検出
野生型タンパク質および突然変異タンパク質を、以下のプラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞において産生させた：ＭＨＢ、ＭＨＢ−コザックＧＡＧ、ＭＨＢ−ＭｌＬおよび野生型ＳＨＢ。トランスフェクションの３日後、該細胞培養上清を集め、アッセイ試験のために正常ヒト血漿中で１：１０希釈した。

Ａｕｓｚｙｍｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌアッセイおよびビーズアッセイ：
アッセイ方法ＣをＡｕｓｚｙｍｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）パッケージインサートに従い用いて、サンプルおよびアッセイ陽性／陰性対照を使用した。Ｈ５３、Ｈ５７、Ｈ１６６および１１６−３４モノクローナル抗体を含む捕捉試薬としての抗体のパネルを使用して、追加的なビーズアッセイを行った。ヤギ抗ＨＢｓコンジュゲートを検出試薬として使用した。データは、１〜３個の独立したトランスフェクションからの合計２〜９回の重複実験を表している。

ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＨＢｓアッセイ：
Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ＨＢｓＡｇ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）パッケージインサートに従い、サンプルおよびアッセイ陽性／陰性対照を使用した。データは、１〜３個の独立したトランスフェクションからの合計２〜９回の重複実験を表している。

図４に示すとおり、天然に存在するＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）サンプルＡｄＡおよびＡｕｓｚｙｍｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌキット陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｌ）のエピトープマッピングはＳＨＢ領域（Ｈ５３、Ｈ５７およびＨ１６６）およびプレＳ２（１１６−３４）への抗体の結合を示した。プレＳ２（１１６−３４抗体シグナル）に対するＳＨＢ（Ｈ１６６抗体シグナル）の比はこれらのサンプルに関して１．２４〜１．９５の範囲であった。対照としての、Ａｕｓｚｙｍｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌキット陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｌ）のサンプル、希釈剤、未トランスフェクト化細胞およびＨＢｓＡｇインサートを含有しないプラスミドでのトランスフェクション体は該抗体に対する反応性を示さなかった（データ非表示）。予想どおり、ＳＨＢタンパク質の発現はＳＨＢ領域に対する抗体（Ｈ５３、Ｈ５７およびＨ１６６）のみの結合を示した。ＭＨＢプラスミドでのトランスフェクションにより産生された組換えＨＢｓＡｇは、６８．０９の比で、プレＳ２エピトープ反応性における有意な減少を示した。

天然に存在するＨＢｓＡｇサンプルと同等のレベルにまでプレＳ２反応性を増加させる試みにおいて、プレＳ２開始部位に部分的コザック配列を導入するためにコザック配列突然変異体ＭＨＢ−コザックＧＡＧおよびＭＨＢ−コザックＡＡＧを作製した。これらのサンプルを使用してトランスフェクションを行ったところ、図５に示すとおり、発現されたタンパク質は、ＳＨＢ抗体検出（Ｈ５３、Ｈ５７およびＨ１６６）と比べて、１１６−３４プレＳ２抗体に対する改善されたシグナルを示したが、全体的な抗原性は初期トランスフェクションの約２５％に低下した。プレＳ２に対するＳＨＢの比はこれらのタンパク質に関しては４．４７〜８．６５の範囲であり、これは、天然に存在するサンプルの比に近づいている。

プレＳ２タンパク質のみを産生させるための、ＭＨＢ−コザックＧＡＧプラスミドにおけるＳ開始部位におけるノックアウト突然変異（Ｍ１Ｌ）の導入は、図５に示すとおり、全体的な抗原性における、より一層低い減少を引き起こした。この減少は細胞内抗原保持または分解によるものであろう。

Ａｂｂｏｔｔの市販のＨＢｓＡｇイムノアッセイ（Ａｕｓｚｙｍｅ ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌおよびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＨＢｓＡｇ）は該野生型および突然変異タンパク質の全てを検出した（図６）。天然に存在するサンプルＡｄＡおよび適当なキット陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｌ）も検出された。ｐｃＤＮＡ（ＭＨＢ配列を含有しないプラスミド）、未トランスフェクト化細胞（ＵＴＦ）、希釈剤（血漿）および適当なキット陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｌ）を含む陰性対照はこれらのアッセイによっては検出されなかった。これらのデータは、適当な免疫試薬形態が、Ｍ１Ｌ突然変異体を含む全ての突然変異体を検出しうることを示唆している。

Claims (19)

1. 中（ｍｉｄｄｌｅ）Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（ＭＨＢ）をコードする核酸分子またはそれと実質的に同一の核酸分子であって、該分子のヌクレオチド配列が、配列番号４を含むプレＳ２開始配列を含む、核酸分子。
2. 該ＭＨＢが、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を有する、請求項１記載の核酸分子。
3. 該プレＳ２開始配列が配列番号５を含む、請求項１記載の核酸分子。
4. 該核酸分子のヌクレオチド配列が配列番号７を含む、請求項３記載の核酸分子。
5. 該プレＳ２開始配列が配列番号６を含む、請求項１記載の核酸分子。
6. 該核酸分子のヌクレオチド配列が配列番号８を含む、請求項５記載の核酸分子。
7. 該核酸分子が、小（ｓｍａｌｌ）Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（ＳＨＢ）をコードするヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１記載の核酸分子。
8. 請求項１記載の核酸分子を含んでなるベクター。
9. 請求項８記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
10. 組換えＭＨＢを１×１０^−１２〜１×１０^−２ｇｍｓの濃度で含んでなる組成物。
11. 該組成物が組換えＳＨＢを更に含む、請求項１０記載の組成物。
12. 該ＳＨＢが１×１０^−１２〜１×１０^−２ｇｍｓの濃度で存在する、請求項１１記載の組成物。
13. ＭＨＢ対ＳＨＢの比が１：１０００〜１０００：１である、請求項１１記載の組成物。
14. 請求項８記載のベクターを含んでなるキット。
15. 請求項９記載の宿主細胞を含んでなるキット。
16. 請求項１０記載の組成物を含んでなるキット。
17. （ａ）候補抗体を請求項１０記載の組成物と接触させ、
    （ｂ）ＭＨＢへの該抗体の結合を測定することを含んでなる、ＭＨＢへの抗体の結合の測定方法。
18. （ａ）候補抗体を準備し、
    （ｂ）請求項１７記載の方法に従い、ＭＨＢへの該抗体の結合を測定することを含んでなる、ＭＨＢに対する抗体の質の測定方法であって、該抗体の質が、結合のレベルを所定の値と比較することにより測定される方法。
19. （ａ）候補抗体を準備し、
    （ｂ）請求項１７記載の方法に従い、ＭＨＢへの該抗体の結合を測定することを含んでなる、ＭＨＢに対する抗体を含むキットの質の測定方法であって、該キットの質が、結合のレベルを所定の値と比較することにより測定される方法。

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