JP2010535472A - ヒトインターロイキン−２受容体ガンマ鎖遺伝子からのｄｎａ標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型及びその使用 - Google Patents
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Abstract
2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、変異型が、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型。X連鎖重症複合型免疫不全の予防及び治療のための該変異型及び派生生成物の使用。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、サイトカイン受容体共通ガンマ鎖遺伝子又はガンマC (γC)遺伝子とも命名されるヒトインターロイキン-2受容体ガンマ鎖(IL2RG)遺伝子からのDNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型、該変異型をコードするベクター、該ベクターにより改変された細胞、動物又は植物、並びにエクスビボでのゲノム療法(遺伝子細胞療法)、及びゲノム工学のための該メガヌクレアーゼ変異型及びその派生生成物の使用に関する。
重症複合型免疫不全(SCID)は、リンパ球Bの機能的欠陥を常に伴うリンパ球T成熟の欠陥を原因とする(Cavazzana-Calvoら, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585〜602; Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。全体的な発生率は、75000の出生のうちの1と見積もられる。未処置のSCIDの患者は、多重日和見微生物感染を受けやすく、通常、1年を超えて生存しない。SCIDは、家族性のドナーからの同種造血幹細胞移植により処置され得る。ドナーとの組織適合性は、広く変動し得る。SCIDの形態の1つであるアデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症の場合、患者は、組換えアデノシンデアミナーゼ酵素の注射により処置され得る。
ADA遺伝子は、SCID患者において変異していることが示されてから(Giblettら, Lancet, 1972, 2, 1067〜1069)、SCIDに関与するいくつかのその他の遺伝子が同定されている(Cavazzana-Calvoら, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585〜602; Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。SCIDには4つの主な原因がある：(i) SCIDの最も頻度が高い形態であるSCID-X1 (X連鎖SCID又はX-SCID)は、IL2RG遺伝子の変異により引き起こされ、成熟Tリンパ球及びNK細胞の不在をもたらす。IL2RGは、少なくとも5つのインターロイキン受容体複合体の共通成分であるγCタンパク質をコードする(Noguchiら, Cell, 1993, 73, 147〜157)。これらの受容体は、JAK3キナーゼを介していくつかの標的を活性化し(Macchiら, Nature, 1995, 377, 65〜68)、その不活性化は、γC不活性化と同じ症候群をもたらす；(ii) ADA遺伝子内の変異は、リンパ球前駆体にとって致死的であるプリン代謝に欠陥をもたらし、これが次いで、B、T及びNK細胞のある程度の(quasi)不在をもたらす；(iii) V(D)J組換えは、免疫グロブリン及びTリンパ球受容体(TCR)の成熟における必須の工程である。このプロセスに関与する3つの遺伝子である組換え活性化遺伝子1及び2 (RAG1及びRAG2)並びにアルテミスでの変異は、成熟T及びBリンパ球の不在をもたらす；そして(iv) CD45のようなT細胞特異的シグナル伝達に関与するその他の遺伝子での変異も、症例の少数ではあるが報告されている(Cavazzana-Calvoら, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585〜602; Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。
それらの遺伝子ベースが同定されたときから、異なるSCIDの形態は、2つの主な理由から遺伝子治療アプローチの典型となっている(Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。
まず、全ての血液疾患と同様に、エクスビボ治療が構想できる。造血幹細胞(HSC)は、骨髄から回収でき、2〜3回の細胞分裂の間、その多能性の特性を維持する。よって、これらをインビトロで治療して、患者に再注入でき、そこでこれらは骨髄を再生する。
まず、全ての血液疾患と同様に、エクスビボ治療が構想できる。造血幹細胞(HSC)は、骨髄から回収でき、2〜3回の細胞分裂の間、その多能性の特性を維持する。よって、これらをインビトロで治療して、患者に再注入でき、そこでこれらは骨髄を再生する。
次に、リンパ球の成熟がSCID患者では損なわれているので、修正された細胞が選択的利点を有する。よって、少数の修正された細胞は、機能的免疫系を回復できる。この仮説は、(i) SCID患者での変異の復帰に伴う免疫機能の部分的な回復(Hirschhornら, Nat. Genet., 1996, 13, 290〜295; Stephanら, N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1563〜1567; Boussoら, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 2000, 97, 274〜278; Wadaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8697〜8702; Nishikomoriら, Blood, 2004, 103, 4565〜4572)、(ii) SCID-X1欠損症の造血幹細胞でのインビトロ修正(Candottiら, Blood, 1996, 87, 3097〜3102; Cavazzana-Calvoら, Blood, 1996, Blood, 88, 3901〜3909; Taylorら, Blood, 1996, 87, 3103〜3107; Hacein-Beyら, Blood, 1998, 92, 4090〜4097)、(iii) SCID-X1(Soudaisら, Blood, 2000, 95, 3071〜3077; Tsaiら, Blood, 2002, 100, 72〜79)、JAK-3 (Buntingら, Nat. Med., 1998, 4, 58〜64; Buntingら, Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353〜2364)及びRAG2 (Yatesら, Blood, 2002, 100, 3942〜3949)欠損症の動物モデルでのインビボ修正、並びに(iv) 遺伝子治療臨床試験の結果により(Cavazzana-Calvoら, Science, 2000, 288, 669〜672; Aiutiら, Nat. Med., 2002, 8, 423〜425; Gasparら, Lancet, 2004, 364, 2181〜2187)、何度か確認された。
90年代から、いくつかの遺伝子治療臨床試験が、非常に有用な情報の大部分を形成してきた。これらの研究は全て、変異遺伝子を、ウイルスベクターを用いてゲノムに導入された機能的遺伝子で補完することに基づいている。SCID-X1 (γC欠損症)についての臨床試験は、遺伝子治療により処置された10名の患者のうち9名において、機能的又は部分的に機能的な免疫系の回復をもたらした(Cavazzana-Calvoら, Science, 2000, 288, 669〜672)。その他に成功した臨床試験は、4名のSCID-X1患者(Gasparら, Lancet, 2004, 364, 2181〜2187)及び4名のADA患者(Aiutiら, Science, 2002, 296, 2410〜2413)で行われ、遺伝子治療アプローチの利点を確認した。しかし、最初の試験は、このアプローチに付随する危険性も示した。のちに、3名の患者は、急性白血病を非常によく模倣するモノクローナルリンパ球増殖を発現した。これらのリンパ球増殖は、挿入突然変異誘発による細胞性腫瘍遺伝子の活性化を伴う。全ての3つの症例において、増殖する細胞は、同じ遺伝子座へのレトロウイルスベクターの挿入を特徴とし、LMO2遺伝子の過剰発現をもたらす(Hacein-Beyら, Science, 2003, 302, 415〜419; Fischerら, N. Engl. J. Med., 2004, 350, 2526〜2527)。
よって、これらの結果は、遺伝病の治療における「ゲノム療法」の非凡な可能性と、組込み型レトロウイルスの限界の両方を示した(Kohnら, Nat. Rev. Cancer, 2003, 3, 477〜488)。新規なエレクトロポレーション法の開発にもかかわらず(AMAXA GmbHからのNucleofector (登録商標)技術；PCT/EP01/07348、PCT/DE02/01489及びPCT/DE02/01483)、ウイルスベクターは、HSCにおいて、最も有望な結果を現在のところ与えている。MoMLV (モロニーマウス白血病ウイルス)に由来するレトロウイルスは、臨床試験を含んで(上記を参照)、HSCを効率的に形質導入するために用いられている。しかし、伝統的なレトロウイルスベクターは、循環細胞のみを形質導入し、HSCをモロニーベクターで形質導入することは、それらの刺激と、成長因子を用いる有糸分裂の誘発とを必要とし、よって、エクスビボでそれらの多能性特性を大きく損なう。対照的に、HIV-1に由来するレンチウイルスベクターは、非有糸核分裂細胞を効率的に形質導入でき、HSC形質導入によく適合される(Loganら, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 429〜436)。このようなベクターを用いるフラップDNAの挿入は、核への侵入を強く刺激し、そのことにより、HSC形質導入の割合も刺激する(Sirvenら, Blood, 2000, 96, 4103〜4110; Zennouら, Cell, 2000, 101, 173〜185)。しかし、レンチウイルスベクターも組み込み型であり、モロニーベクターと同様の危険性の可能性がある。ゲノムへの挿入の後に、ウイルスLTRプロモーター及びエンハンサーは、隣接遺伝子の発現を刺激できる(上記を参照)。LTR3'からのU3領域のエンハンサー及びプロモーターの欠失は、選択肢であり得る。レトロ転写の後に、この欠失は、LTR5'に重複され、「デルタU3」又は「自己不活性化」と呼ばれるこれらのベクターは、隣接遺伝子の活性化に起因する挿入突然変異誘発の危険性を回避できる。しかし、これらは、挿入による遺伝子不活性化又は転写読み過しの危険性をなくすわけではない。
標的相同組換えは、現在のアプローチにより生じる問題点を回避する別の代替法である。現在の遺伝子治療ストラテジーは、補完アプローチに基づき、ここでは、無作為に挿入されたが機能的な遺伝子の過剰コピーが、変異された内因性コピーの機能を提供する。対照的に、相同組換えは、その場(in situ)での変異の正確な修正を可能にする(図1A)。相同組換え(HR)は、DNA二本鎖破断(break) (DSB)及びその他のDNA損傷の修復に関与する、非常に保存されたDNA維持経路である(Rothstein, Methods Enzymol., 1983, 101, 202〜211; Paquesら, Microbiol Mol Biol Rev, 1999, 63, 349〜404; Sungら, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2006, 7, 739〜750)が、減数分裂における対立遺伝子の減数分裂性再集合(Roeder, Genes Dev., 1997, 11, 2600〜2621)、酵母における交配型の相互交換(Haber, Annu. Rev. Genet., 1998, 32, 561〜599)、及びクラスIイントロン及びインテインの新規な対立遺伝子への「ホーミング」のような多くの生物学的現象の根底をなす。HRは、内因性配列間の遺伝子情報の交換を通常、促進するが、遺伝子ターゲティング実験において、これは、内因性染色体配列と外因性DNA構築物との交換を促進するために用いられる。基本的に、標的配列と相同性を有するDNAを、細胞の核に導入し、内因性相同組換え装置が、次の工程を提供する(図1A)。
相同遺伝子ターゲティングストラテジーは、内因性遺伝子をノックアウトする(Capecchi, M.R., Science, 1989, 244, 1288〜1292, Smithies, O., Nature Medicine, 2001, 7, 1083〜1086)か、又は染色体に外因性配列をノックインするために用いられている。これは、遺伝子修正、原則的に、単一遺伝子疾患に関連する変異の修正のためにも用いることができる。しかし、この使用は、プロセスの低い効率(トランスフェクションされた細胞の10-6〜10-9)のために、実際は困難である。
過去10年間に、この効率を増大させるためにいくつかの方法が開発されている。例えば、キメラ形成法(De Semirら. J. Gene Med., 2003, 5, 625〜-639)及び小型フラグメント相同置換(Small Fragment Homologous Replacement) (Gonczら, Gene Ther, 2001, 8, 961〜965; Brusciaら, Gene Ther., 2002, 9, 683〜685; Sangiuoloら, BMC Med. Genet., 2002, 3, 8; De Semir, D.及びJ.M. Aran, Oligonucleotides, 2003, 13, 261〜269)はともに、CFTR変異を修正することを試みるために用いられ、種々のレベルで成功している。
組換えの効率を増大するための別のストラテジーは、メガヌクレアーゼを用いて、標的遺伝子座にDNA二本鎖破断を送達することである。メガヌクレアーゼは、定義によると、大きい配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Thierry, A.およびB. Dujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625〜5631)。これらは生細胞においてユニーク部位を切断でき、それにより遺伝子ターゲティングを、切断部位の近傍において1000倍以上に増大させる(Puchtaら, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034〜5040 ; Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106; Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973; Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, 93, 5055〜5060; Sargentら, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267〜277; Cohen-Tannoudjiら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444〜1448; Donoho,ら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070〜4078; Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101)。このようなメガヌクレアーゼを用いて、遺伝性単一遺伝子疾患の原因である変異を修正できた。
遺伝子欠陥を修正するための最も正確な様式は、遺伝子の非変異コピーを有する修復マトリクスを用いることであり、これは、変異の復帰をもたらす。しかし、遺伝子修正の効率は、変異とDSBとの間の距離が大きくなるほど減少し、200 bpの距離で5倍減少する。よって、所定のメガヌクレアーゼは、そのDNA標的の近傍にある変異のみを修正するために用いることができる(図1A)。
「エキソンノックイン」とよばれる代替が、図1Bに示される。この場合、遺伝子の5'部分を切断するメガヌクレアーゼを用いて、有害変異の上流に機能的エキソン配列をノックインできる。この方法は、導入遺伝子をその通常の場所に配置するが、エキソン重複ももたらし、長い範囲に対するこの影響は評価されていないままである。さらに、天然のシス作用性要素が切断の下流のイントロン内に配置される場合、それらの近傍の環境は改変され、それらの正しい機能も探索される必要があるだろう。しかし、この方法は、非常に有利である。単一のメガヌクレアーゼを、メガヌクレアーゼ切断部位の下流の多くの異なる変異に用いることができるだろう。
しかし、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」ともよばれる数百の天然メガヌクレアーゼが同定されているが(Chevalier, B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)、切断可能な配列のレパートリーは、ゲノムの複雑さに取り組むためには非常に限定されており、選択した遺伝子中には、通常、切断可能部位がない。例えば、ヒトSCID遺伝子中には、既知の天然メガヌクレアーゼのための切断部位がない。理論的には、選択された特異性を有する人工の配列特異的エンドヌクレアーゼを作製することにより、この制限が緩和できる。よって、仕立てられた特異性を有するメガヌクレアーゼの作製は、精力的に検討されている。
最近、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)と、クラスIIS制限エンドヌクレアーゼであるFokIの触媒ドメインとの融合体を用いて、機能的配列特異的エンドヌクレアーゼが作製された (Smithら, Nucleic Acids Res., 1999, 27, 674〜681; Bibikovaら, Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 289〜297; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764; Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763〜; Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651; Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446)。このようなヌクレアーゼは、最近、リンパ系列からのヒト細胞におけるILR2G遺伝子を工学的に改変するために用いることができた(Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651)。
Cys2-His2型のジンクフィンガータンパク質(ZFP)の結合特異性は、これらが単純(フィンガーあたり実質的に4残基により駆動される特異性)でモジュール性の(modular)システムを示すので、操作するのが容易である(Paboら, Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, 313〜340; Jamiesonら, Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 361〜368)。Paboの実験室からの研究は、ほとんどのG/ANNG/ANNG/ANN配列に結合できる新規な人工ZFPの大きいレパートリーをもたらした(Rebar, E.J.及びC.O. Pabo, Science, 1994, 263, 671〜673; Kim, J.S.及びC.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1998, 95, 2812〜2817, 、Klug Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalan M.及びA. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660及びBarbas Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalan M.及びA. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)。
にもかかわらず、ZFPは、特に、治療用途のような非常に高レベルの特異性を必要とする用途について制限があるかもしれない。融合体でのFokIヌクレアーゼ活性は二量体として作用するが、最近、2つの単量体の1つのみがDNAに結合するか、又は2つの単量体が2つの離れたDNA配列に結合したときに、これがDNAを切断できることが示された(Cattoら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1711〜1720)。よって、特異性は、哺乳動物細胞(Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763)及びショウジョウバエ(Drosophila) (Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764〜)における毒性により示されるように、非常に退化している。
野生では、メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼにより実質的に代表される。ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)は、数百のタンパク質ファミリーを含む天然のメガヌクレアーゼの広範なファミリーである(Chevalier, B. S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。これらのタンパク質は、「ホーミング」とよばれるプロセスにより伝播される可動性遺伝要素によりコードされる。エンドヌクレアーゼは、可動性要素が存在しない同族の対立遺伝子を切断することにより、受容側遺伝子座に可動性DNAを重複させる相同組換え事象を刺激する。効率及び特異性の点でのそれらの例外的な切断特性に鑑みて、これらは、新規で特異性が高いエンドヌクレアーゼを導くために理想的な足場であり得る。
HEは、4つの主要なファミリーに属する。触媒中心に含まれる保存されたペプチドモチーフにちなんで命名されたLAGLIDADGファミリーは、最も普及しており、最もよく特徴付けられている群である。現在、7つの構造が入手可能である。このファミリーからのほとんどのタンパク質が単量体であり、2つのLAGLIDADGモチーフを示すが、いくつかは1つのモチーフのみを有するものの、二量体を形成してパリンドローム又は偽パリンドローム標的配列を切断する。
ファミリーのメンバーのうち、LAGLIDADGペプチドが唯一の保存領域であるが、これらのタンパク質は、非常によく似た構造を有する(図2A)。触媒コアは、I-CreI(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316)、I-MsoI (Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)及びI-CeuI (Spiegelら, Structure, 2006, 14, 869〜880)のようなホモ二量体について完全な2回回転対称の、そしてI-SceI (Moureら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 685〜69)、I-DmoI (Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜1136)又はI-AniI (Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜2888)のような単量体について偽対称を有する2つのDNA結合ドメインで挟まれる。両方の単量体又は両方のドメイン(単量体タンパク質について)は、二価カチオンの周りに組織された触媒コアに貢献する。触媒コアのすぐ上に、2つのLAGLIDADGペプチドが、二量体形成界面において必須の役割も演じる。DNA結合は、DNA主溝の上に位置する2つの典型的なサドル形αββαββα折り畳みに依存する。他のドメインは、例えばPI-PfuI (Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901)及びPI-SceI (Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜770)のようなインテインにおいて見出すことができ、このタンパク質スプライシングドメインはDNA結合にも関与する。
N-末端I-DmoIドメインをI-CreI単量体と融合させることによる機能的キメラメガヌクレアーゼの作製(Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Epinatら, Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2952〜62; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を証明する。
そのうえ、異なるグループが、I-CreI (Seligmanら, Genetics, 1997, 147, 1653〜1664; Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31〜41; 国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Rosenら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 4791〜4800; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)、I-SceI (Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484)、PI-SceI (Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008)及びI-MsoI (Ashworthら, Nature, 2006, 441, 656〜659)の特異性を局所的に変更するために半合理的(semi-rational)アプローチを用いている。
さらに、局所的に特異性が変更された数百のI-CreI誘導体が、半合理的アプローチとハイスループットスクリーニングとを組み合わせることにより工学的に作製された：
- I-CreIの残基Q44、R68及びR70又はQ44、R68、D75及びI77を変異させ、DNA標的(5NNN DNA標的)の±3〜5位での特異性が変更された変異型のコレクションを、スクリーニングにより同定した(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。
- I-CreIの残基Q44、R68及びR70又はQ44、R68、D75及びI77を変異させ、DNA標的(5NNN DNA標的)の±3〜5位での特異性が変更された変異型のコレクションを、スクリーニングにより同定した(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。
- I-CreIの残基K28、N30及びQ38、N30、Y33及びQ38又はK28、Y33、Q38及びS40を変異させ、DNA標的(10NNN DNA標的)の±8〜10位での特異性が変更された変異型のコレクションを、スクリーニングにより同定した(Smithら, Nucleic Acids Res.,2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。
図2Bに示すように、2つの異なる変異型を組み合わせて、それぞれの変異型DNA標的配列の異なる半分の融合により得られるキメラ標的を切断できる機能的へテロ二量体エンドヌクレアーゼを組み立てた(Arnouldら, 上記; 国際PCT出願WO 2006/097854およびWO 2007/034262)。
さらに、I-CreIの残基28〜40及び44〜77は、ホーミングエンドヌクレアーゼハーフサイト(half-site)の別個の部分に結合できる、2つの分離可能な機能的サブドメインを形成することが示された(Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。
さらに、I-CreIの残基28〜40及び44〜77は、ホーミングエンドヌクレアーゼハーフサイト(half-site)の別個の部分に結合できる、2つの分離可能な機能的サブドメインを形成することが示された(Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。
図2Cに示すように、I-CreIの2つのサブドメインからの変異を同じ単量体内で組み合わせることにより、それぞれのサブドメインが結合する±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドを含むパリンドロームの組み合わせたDNA標的配列を切断できる新規なキメラ分子(ホモ二量体)の設計が可能になった(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。
2つの前の工程の組み合わせにより、4つの異なるサブドメインを含む、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。異なるサブドメインは、図2Dに示すように、別々に改変でき、組み合わせて、選択された特異性を有する完全に再設計されたメガヌクレアーゼ変異型(ヘテロ二量体又は単鎖分子)を得ることができる。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対を、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新しい分子(「ハーフメガヌクレアーゼ」)に組み合わせる。次いで、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせは、興味対象の標的を切断するヘテロ二量体種をもたらすことができる。4組の変異を、モデル標的配列又はヒトRAG1及びXPC遺伝子からの配列を切断するヘテロ二量体エンドヌクレアーゼに組み立てることが、Smithら(Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)及びArnouldら(J. Mol. Biol., 2007, 371, 49〜65)にそれぞれ記載されている。
これらの変異型は、真性の(genuine)染色体配列を切断するために用いることができ、遺伝子治療を含むいくつかの分野において、新しい展望のための道を切り開く。
しかし、塩基対±1及び±2はタンパク質といずれの接触も示さないが、これらの位置が、特に塩基対±1について、満足な情報が欠けているわけではなく(Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、さらなる基質特異性の原因であり得ることが示されている(Argastら, J. Mol. Biol., 1998, 280, 345〜353; Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalier, B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。ランダム突然変異を誘発した切断可能なI-CreI標的のインビトロ選択(Argastら, 上記)は、タンパク質結合及び切断活性に対するこれらの4つの塩基対の重要性を明らかにした。活性部位で見出される規則正しい水分子のネットワークが、DNA標的の位置決めに重要であることが示唆されている(Chevalierら, Biochemistry, 2004, 43, 14015〜14026)。さらに、I-CreI結合の際にこの領域に出現する広範なコンホメーション変化は、4つの中央のヌクレオチドが、おそらく配列依存性のコンホメーション嗜好性により、基質特異性に貢献しうることを示唆する(Chevalierら, 2003, 上記)。
しかし、塩基対±1及び±2はタンパク質といずれの接触も示さないが、これらの位置が、特に塩基対±1について、満足な情報が欠けているわけではなく(Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、さらなる基質特異性の原因であり得ることが示されている(Argastら, J. Mol. Biol., 1998, 280, 345〜353; Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalier, B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。ランダム突然変異を誘発した切断可能なI-CreI標的のインビトロ選択(Argastら, 上記)は、タンパク質結合及び切断活性に対するこれらの4つの塩基対の重要性を明らかにした。活性部位で見出される規則正しい水分子のネットワークが、DNA標的の位置決めに重要であることが示唆されている(Chevalierら, Biochemistry, 2004, 43, 14015〜14026)。さらに、I-CreI結合の際にこの領域に出現する広範なコンホメーション変化は、4つの中央のヌクレオチドが、おそらく配列依存性のコンホメーション嗜好性により、基質特異性に貢献しうることを示唆する(Chevalierら, 2003, 上記)。
つまり、gtacである4つの中央ヌクレオチドを有するパリンドローム配列を切断するホモ二量体として10NNN及び5NNN DNA標的に対して同定される変異体が、4つの中央ヌクレオチド中に変化を含有する標的を切断する新しいエンドヌクレアーゼの設計を可能にするかどうか、明らかでなかった。
本発明者らは、I-CreI変異型により切断できるヒトIL2RG遺伝子中の一連のDNA標的を同定した(表I及び図3)。図2Dに示すコンビナトリアルアプローチを用いて、I-CreIタンパク質のDNA結合ドメインを完全に再設計し、そのことにより、完全に工学的に改変された(engineered)特異性を有する新規なメガヌクレアーゼを工学的に作製し、I-CreI C1221 22 bpパリンドローム部位とは、4つの中央ヌクレオチドのうち3つ(-2位、-1位、+1位)を含む15ヌクレオチドが異なるヒトIL2RG遺伝子からの1つのDNA標的(IL2RG3)を切断した(図4)。
組み合わせた変異型は、それぞれヌクレオチド10NNN及び5NNNに指向して最初は同定され、標的の4つの中央ヌクレオチドの、工学的に作製されたメガヌクレアーゼの活性に対する強い影響が観察されたが、特異性における重大な変化を有する機能的メガヌクレアーゼが選択された。さらに、工学的に作製されたタンパク質の活性は、I-CreIタンパク質の活性と比較して、ランダム突然変異誘発及び／若しくは部位特異的突然変異誘発並びにスクリーニングにより著しく改良できた。
ヒトIL2RG遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できるI-CreI変異型は、X連鎖重症複合型免疫不全(SCID-X1)のゲノム療法及びIL2RG遺伝子座でのゲノム工学のために用いることができる。
例えば、IL2RG3と命名されるDNA標的は、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4に位置する(図3)。遺伝子修正は、切断部位の近傍の変異を修正するために用いることができるだろう(図1A)。遺伝子修正の効率は、DSBへの距離が増大すると減少するので(Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101)、このストラテジーは、切断部位の500 bp以内に位置する変異について最も有効であろう。このストラテジーは、エキソン4での変異を修正するために用いることができる。或いは、IL2RG3配列を切断するメガヌクレアーゼを用いて、IL2RG遺伝子座にて機能的IL2RG遺伝子を回復するであろうエキソン配列をノックインできるだろう(図1B)。このストラテジーは、切断部位の下流に位置するいずれの変異についても用いることができるだろう。
例えば、IL2RG3と命名されるDNA標的は、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4に位置する(図3)。遺伝子修正は、切断部位の近傍の変異を修正するために用いることができるだろう(図1A)。遺伝子修正の効率は、DSBへの距離が増大すると減少するので(Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101)、このストラテジーは、切断部位の500 bp以内に位置する変異について最も有効であろう。このストラテジーは、エキソン4での変異を修正するために用いることができる。或いは、IL2RG3配列を切断するメガヌクレアーゼを用いて、IL2RG遺伝子座にて機能的IL2RG遺伝子を回復するであろうエキソン配列をノックインできるだろう(図1B)。このストラテジーは、切断部位の下流に位置するいずれの変異についても用いることができるだろう。
本発明は、2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有するI-CreI変異型に関し、これはヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断できる。
本発明による変異型の切断活性は、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2007, 371, 49〜65に記載されるようないずれの公知のインビトロ又はインビボ切断アッセイにより測定できる。例えば、本発明の変異型の切断活性は、直列反復組換えアッセイ(direct repeat recombination assay)により、酵母又は哺乳動物細胞内で、レポーターベクターを用いて測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた介在配列内に、レポーター遺伝子の2つの切断された非機能的コピー(直列反復)と、(非パリンドロームの)ゲノムDNA標的配列とを含む。通常、ゲノムDNA標的配列は、それぞれの(パリンドローム又は偽パリンドローム)の親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の1つの異なる半分を含む。ヘテロ二量体変異型の発現は、ゲノムDNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼをもたらす。この切断は、直列反復同士の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子(例えばLacZ)をもたらし、その発現を、適切なアッセイによりモニターできる。変異型による切断の特異性は、親のI-CreIホモ二量体メガヌクレアーゼにより切断される2つのパリンドローム配列のものと、(非パリンドロームの) DNA標的配列の切断を比較することによるか、又はそれらの天然の標的に対する野生型I-CreI若しくはI-SceI活性との比較により評価できる。
定義
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ヌクレオチドは、次のように表す：1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ヌクレオチドは、次のように表す：1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
- 「メガヌクレアーゼ」により、12〜45 bpの2本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、各ドメインが単量体上にある二量体酵素、又は単一ポリペプチド上に2つのドメインを含む単量体酵素のいずれかである。
- 「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用し、かつDNA標的の他方の半分と相互作用する同じメガヌクレアーゼの他方のドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能的メガヌクレアーゼを形成できる領域を意図する。
- 「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用し、かつDNA標的の他方の半分と相互作用する同じメガヌクレアーゼの他方のドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能的メガヌクレアーゼを形成できる領域を意図する。
- 「メガヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、野生型メガヌクレアーゼ(天然のメガヌクレアーゼ)のアミノ酸配列における少なくとも1つの残基の、別のアミノ酸での置き換えにより得られるメガヌクレアーゼを意図する。
- 「機能的変異型」により、DNA標的配列、好ましくは、親のメガヌクレアーゼにより切断されない新しい標的を切断できる変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか、又は直接若しくは間接的に該DNA標的と相互作用する位置にてアミノ酸変動を有する。
- 「機能的変異型」により、DNA標的配列、好ましくは、親のメガヌクレアーゼにより切断されない新しい標的を切断できる変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか、又は直接若しくは間接的に該DNA標的と相互作用する位置にてアミノ酸変動を有する。
- 「I-CreI」により、配列表内の配列番号1の配列に相当するpdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型I-CreIを意図する。
- 「新規な特異性を有するI-CreI変異型」により、親のメガヌクレアーゼのものとは異なる切断標的のパターンを有する変異型を意図する。等価で、同様に用いられる用語「新規な特異性」「改変された特異性」「新規な切断特異性」「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異型の特異性のことである。
- 「新規な特異性を有するI-CreI変異型」により、親のメガヌクレアーゼのものとは異なる切断標的のパターンを有する変異型を意図する。等価で、同様に用いられる用語「新規な特異性」「改変された特異性」「新規な切断特異性」「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異型の特異性のことである。
- 「I-CreI部位」により、I-CreIにより切断される22〜24 bpの2本鎖DNA配列を意図する。I-CreI部位は、野生型(天然)非パリンドロームI-CreIホーミング部位と、C1221ともよばれる(図4)配列5'- t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12 (配列番号2)のような派生パリンドローム配列を含む。
- 「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれた4つのベータ鎖(β1β2β3β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。
- 「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれた4つのベータ鎖(β1β2β3β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。
- 「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの別個の部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
- 「単鎖メガヌクレアーゼ」「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」により、ペプチドスペーサーで連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含むメガヌクレアーゼを意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、それぞれの親のメガヌクレアーゼ標的配列の1つの異なる半分を含むキメラDNA標的配列を切断できる。
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象の部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、I-CreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、又は変異型、又はI-CreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼにより認識されかつ切断される20〜24 bpの2本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでメガヌクレアーゼにより2本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNAの場所、好ましくはゲノムの場所のことをいう。DNA標的は、C1221について上で示したように、2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'の配列により定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて、+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型によるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象の部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、I-CreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、又は変異型、又はI-CreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼにより認識されかつ切断される20〜24 bpの2本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでメガヌクレアーゼにより2本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNAの場所、好ましくはゲノムの場所のことをいう。DNA標的は、C1221について上で示したように、2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'の配列により定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて、+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型によるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
- 「DNA標的ハーフサイト」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフサイト」により、それぞれのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の部分を意図する。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
- 「ヒトIL2RG遺伝子」により、染色体X上に位置する正常IL2RG遺伝子(野生型IL2RG) (Xq13.1; Gene ID: 3561)と、変異IL2RG遺伝子(変異体IL2RG; IL2RG対立遺伝子)、特にSCID-X1の原因である変異体を意図する。ヒトIL2RG遺伝子(4145 bp)は、アクセッション番号GenBank NC_000023.9の配列の逆相補鎖上の70243984位〜70248128位に相当する。これは、8つのエキソン(エキソン1: 1位〜129位; エキソン2: 504位〜657位; エキソン3: 866位〜1050位; エキソン4: 1259位〜1398位; エキソン5: 2164位〜2326位; エキソン6: 2859位〜2955位; エキソン7: 3208位〜3277位; エキソン8: 3633位〜4145位)を含む。15位(エキソン1)から3818位(エキソン8)までのORFは、5'及び3'末端でそれぞれ短い非翻訳領域と長い非翻訳領域とで挟まれている。野生型IL2RG遺伝子配列は、配列表の配列番号3に相当する。mRNA配列は、GenBank NM_000206 (配列番号112)に相当し、ガンマC受容体アミノ酸配列はGenBank NP_000197 (配列番号113)に相当する。成熟タンパク質(347アミノ酸)は、22アミノ酸のN-末端シグナルペプチドを含む369アミノ酸前駆体に由来する。
- 「IL2RG遺伝子からのDNA標的配列」、「ゲノムDNA標的配列」、「ゲノムDNA切断部位」、「ゲノムDNA標的」又は「ゲノム標的」により、メガヌクレアーゼ変異型又は単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体により認識され切断される霊長類(サル)のIL2RG遺伝子座、例えばヒトIL2RG遺伝子座の20〜24 bpの配列を意図する。
- 「ベクター」により、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を意図する。
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
- 「ベクター」により、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を意図する。
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得るそれぞれの配列中の位置の比較により決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、その分子同士は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算することができ、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む。
- 「個体」は、哺乳動物、及びその他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」及び「哺乳類」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)、並びにその他、例えばウシ、ブタ及びウマを含む。
- 「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列内の1つ又は複数のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。上記の変異は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造／安定性にも影響し得る。
本発明による変異型は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。好ましくは、ヘテロ二量体の両方の単量体が、26位〜40位及び／又は44位〜77位で変異される。より好ましくは、両方の単量体が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位の両方に異なる置換を有する。
上記の変異型の好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の上記の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
上記の変異型の好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の上記の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の上記の置換は、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、これは、DNA標的配列と接触するか又はDNA主鎖(backbone)若しくはヌクレオチド塩基と直接又は水分子を介して相互作用する他のアミノ酸残基の位置にて、1つ又は複数の変異を含む。これらの残基は、当該技術において公知である(Juricaら, Molecular Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。特に、付加的な置換は、例えば最終C-末端ループ中の(137位〜143位; Prietoら, Nucleic Acids Res., Epub 2007年4月22日)、リン酸主鎖と接触する位置にて導入され得る。好ましくは、上記の残基は、上記のDNA切断部位の結合及び切断に関与する。より好ましくは、上記の残基は、I-CreIの138位、139位、142位又は143位にある。それぞれの変異が138位と139位の残基の対及び142位と143位の残基の対から選択される残基の異なる対の中にあることを条件として、2つの残基を1つの変異型内で変異させ得る。導入される変異は、最終C-末端ループのアミノ酸の、I-CreI部位のリン酸主鎖との相互作用を改変する。好ましくは、138位又は139位の残基を疎水性アミノ酸により置換して、DNA切断部位のリン酸主鎖との水素結合の形成を回避する。例えば、138位の残基がアラニンにより置換されるか、又は139位の残基がメチオニンにより置換される。142位又は143位の残基を、有利には、小さいアミノ酸、例えばグリシンにより置換して、これらのアミノ酸残基の側鎖のサイズを低減させる。より好ましくは、最終C-末端ループ中の上記の置換は、I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、これは、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の付加的な変異を含む。
変異される付加的な残基は、I-CreI配列全体、特にI-CreIのC-末端半分(80位〜163位)にあり得る。両方のI-CreI単量体を変異させるのが有利である。それぞれの単量体中の変異は、同じ又は異なることができる。例えば、変異型は、以下の位置の1つ又は複数の付加的な置換を含む：2位、4位、7位、8位、19位、24位、26位、31位、34位、39位、43位、50位、52位、54位、57位、59位、60位、64位、71位、79位、80位、82位、87位、89位、96位、98位、100位、103位、105位、107位、111位、117位、121位、122位、127位、129位、132位、135位、139位、140位、143位、147位、153位、154位、156位、157位、159位、160位、162位及び163位。上記の置換は、N2D、K4E、K7E、E8G、G19S、I24V、I24T、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、F43I、Q50R、R52C、F54L、K57R、V59A、D60G、V64A、G71R、S79G、E80K、E80G、K82R、F87L、T89A、K96R、K98R、K100R、N103Y、N103D、V105A、K107R、K107E、Q111R、E117G、E117K、K121R、F122Y、T127N、V129A、I132V、I132T、L135Q、K139R、T140A、T143I、T147A、D153G、S154G、S156R、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択されるのが有利である。変異型は、C-末端に付加的な残基を含むこともできる。例えば、グリシン(G)及び／又はプロリン(P)残基を、I-CreIの164位及び165位にそれぞれ挿入できる。好ましくは、変異型は、G19S、I24V、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む。
変異される付加的な残基は、I-CreI配列全体、特にI-CreIのC-末端半分(80位〜163位)にあり得る。両方のI-CreI単量体を変異させるのが有利である。それぞれの単量体中の変異は、同じ又は異なることができる。例えば、変異型は、以下の位置の1つ又は複数の付加的な置換を含む：2位、4位、7位、8位、19位、24位、26位、31位、34位、39位、43位、50位、52位、54位、57位、59位、60位、64位、71位、79位、80位、82位、87位、89位、96位、98位、100位、103位、105位、107位、111位、117位、121位、122位、127位、129位、132位、135位、139位、140位、143位、147位、153位、154位、156位、157位、159位、160位、162位及び163位。上記の置換は、N2D、K4E、K7E、E8G、G19S、I24V、I24T、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、F43I、Q50R、R52C、F54L、K57R、V59A、D60G、V64A、G71R、S79G、E80K、E80G、K82R、F87L、T89A、K96R、K98R、K100R、N103Y、N103D、V105A、K107R、K107E、Q111R、E117G、E117K、K121R、F122Y、T127N、V129A、I132V、I132T、L135Q、K139R、T140A、T143I、T147A、D153G、S154G、S156R、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択されるのが有利である。変異型は、C-末端に付加的な残基を含むこともできる。例えば、グリシン(G)及び／又はプロリン(P)残基を、I-CreIの164位及び165位にそれぞれ挿入できる。好ましくは、変異型は、G19S、I24V、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む。
上記の変異型のより好ましい実施形態によると、上記の付加的な変異は、機能的ホモ二量体の形成をさらに損なう。より好ましくは、上記の変異はG19S変異である。有利には、G19S変異を、ヘテロ二量体I-CreI変異型の2つの単量体のうちの一方に導入することにより、切断活性が増強され、切断特異性が増強されたメガヌクレアーゼを得る。さらに、切断特異性をさらに増強するために、他方の単量体は、機能的ホモ二量体の形成を損なうか又はヘテロ二量体の形成に好ましい、別個の変異を有し得る。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、上記の置換は、元の(initial)アミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L及びWからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである。
本発明の変異型は、野生型I-CreI (配列番号1)、又は配列番号1と少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有するI-CreI足場タンパク質、例えばI-CreI配列の2位のアラニンの挿入、及びC-末端でのAADの挿入(164位〜166位)を有する足場I-CreI N75 (配列番号4; 167アミノ酸)から導き得る。
本発明の変異型は、配列のNH2末端及び／又はCOOH末端に挿入された1つ又は複数の残基を含み得る。例えば、変異型は、C-末端に挿入されたAAD又はGPD配列を有し得る。特に、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)を、NH2末端及び／又はCOOH末端に導入できる。このタグは、上記の変異型の検出及び／又は精製のために有用である。変異型は、核局在化シグナル(NLS)も含み得る。上記のNLSは、変異型を細胞の核に移入するために有用である。NLSは、変異型の最初のメチオニンの直後又はN-末端タグの直後に挿入できる。
本発明による変異型は、パリンドローム又は偽パリンドロームDNA標的配列を切断できるホモ二量体であり得る。
或いは、上記の変異型は、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる置換を有する第1及び第2単量体の会合により得られるヘテロ二量体であって、ヒトIL2RG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できるヘテロ二量体である。
或いは、上記の変異型は、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる置換を有する第1及び第2単量体の会合により得られるヘテロ二量体であって、ヒトIL2RG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できるヘテロ二量体である。
本発明によるヘテロ二量体変異型のそれぞれの単量体(第1単量体及び第2単量体)は、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、70位、75位、77位の11残基と、上記のような変異された付加的な残基の文字コードで命名され得る。例えば、KNSSRE/LRNNI+80K又は28K30N32S33S38R40E / 44L68R70N75N77I + 80Kは、I-CreI K28, N30, S32, S33, R38, E40/ L44, R68, N70, N75, I77及びK80のことである。I-CreIは、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D及びIを有する(KNSYQS/QRRDI)。よって、KNSSRE/LRNNI+80Kは、I-CreIとは、少なくとも以下の置換が異なる：Y33S, Q38R, S40E, Q44L, R70N, D75N及びE80K。
上記の変異型により切断されるDNA標的配列は、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン又はイントロン内にあってよい。
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、上記のDNA標的配列は、配列番号5〜9及び116〜119の配列からなる群より選択される(図3及び表I)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン1に位置するIL2RG7標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：Y33T、S40Q、Q44N、R68Y、R70S、D75Y及びI77Q (又はKNSTQQ/NYSYQ; 第1単量体)、及びK28S、Q38R、S40K、Q44D、R68N、R70S及びD75N (又はSNSYRK/DNSNI; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン3に位置するIL2RG13標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：N30H、S32T、Y33C、Q38R、R70D、D75N及びI77R (又はKHTCRS/QRDNR; 第1単量体)、及びS32D、Q38Y、R70S、D75H 及びI77Y (又はKNDYYS/QRSHY; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン3に位置するIL2RG14標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：N30R、S32A、Y33N、S40E、Q44Y、R70S及びD75Q (又はKRANQE/YRSQI; 第1単量体)、及びY33C、Q38A、Q44N、R70S、D75Y及びI77N (又はKNSCAS/NRSYN; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RGのイントロン4に位置するIL2RG4標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：Y33T、S40Q、Q44R、R68Y、R70S、D75E及びI77Y (又はKNSTQQ/RYSEY; 第1単量体)、及びS32T、Q44D、R68Y、R70S、D75S及びI77R (又はKNTYQS/DYSSR; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4に位置するIL2RG3標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：
- 28位にK、30位にN、32位にS、33位にH又はR、38位にQ、40位にY又はS、44位にK又はR、68位にY、70位にS、75位にD又はE及び77位にT又はVを有する第1単量体。好ましくは、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基は、KNSRQY、KNSHQS、KNSRQS、KNSHQY及びKNSRQYからなる群より選択され、44位、68位、70位、75位及び77位の残基は、RYSDT、KYSEV又はRYSEVからなる群より選択される。より好ましくは、第1単量体は、KNSRQY/RYSDT、KNSHQS/KYSEV、KNSRQS/RYSDT、KNSHQY/RYSDT、KNSHQY/KYSEV、KNSRQY/RYSEV及びKNSHQY/RYSEVからなる群より選択される。第1単量体は、有利には、G19S、F54L、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異と、ついには、N2D、K4E、K7E、E8G、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、G71R、E80G、K82R、T89A、Q111R、E117G、K121R、T127N、I132T、K139R、T143I、T147A、S154G、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択される第2付加的変異含む。このような第1単量体の例は、表VI (m10 : Y33R、S40Y、Q44R、R68Y、R70S、I77T及びI132V又はKNSRQY/RYSDT + 132V、配列番号40に対応)、表VII (配列番号67〜72)、表VIII (.3R_1〜.3R_11、配列番号73〜83に相当)、表IX (.3R_12〜.3R_28、配列番号84〜100に相当)及び表XIV (.3R_25a、.3R_25b及び.3R_25c、配列番号140〜142に相当)に示される。好ましい第1単量体は、それぞれ配列番号89、99、100、140及び142に相当する3R_17、.3R_27、3R_28、.3R_25a及び3R_25cである。
- 28位にK、30位にN、32位にS、33位にH又はR、38位にQ、40位にY又はS、44位にK又はR、68位にY、70位にS、75位にD又はE及び77位にT又はVを有する第1単量体。好ましくは、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基は、KNSRQY、KNSHQS、KNSRQS、KNSHQY及びKNSRQYからなる群より選択され、44位、68位、70位、75位及び77位の残基は、RYSDT、KYSEV又はRYSEVからなる群より選択される。より好ましくは、第1単量体は、KNSRQY/RYSDT、KNSHQS/KYSEV、KNSRQS/RYSDT、KNSHQY/RYSDT、KNSHQY/KYSEV、KNSRQY/RYSEV及びKNSHQY/RYSEVからなる群より選択される。第1単量体は、有利には、G19S、F54L、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異と、ついには、N2D、K4E、K7E、E8G、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、G71R、E80G、K82R、T89A、Q111R、E117G、K121R、T127N、I132T、K139R、T143I、T147A、S154G、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択される第2付加的変異含む。このような第1単量体の例は、表VI (m10 : Y33R、S40Y、Q44R、R68Y、R70S、I77T及びI132V又はKNSRQY/RYSDT + 132V、配列番号40に対応)、表VII (配列番号67〜72)、表VIII (.3R_1〜.3R_11、配列番号73〜83に相当)、表IX (.3R_12〜.3R_28、配列番号84〜100に相当)及び表XIV (.3R_25a、.3R_25b及び.3R_25c、配列番号140〜142に相当)に示される。好ましい第1単量体は、それぞれ配列番号89、99、100、140及び142に相当する3R_17、.3R_27、3R_28、.3R_25a及び3R_25cである。
- 28位にK、30位にR又はN、32位にS、G又はT、33位にY、N、A、V、S又はH、38位にQ、40位にS、44位にA、T又はR、68位にR又はY、70位にS、75位にE及び77位にRを有する第2単量体。好ましくは、28位、30位、32位、33位、38位及び40位の残基が、KRTYQS、KRSYQS、KRSNQS、KRSAQS、KRSVQS、KRSSQS及びKNGHQSからなる群より選択され、44位、68位、70位、75位及び77位の残基が、AYSER、TRSER、TYSER及びRYSETからなる群より選択される。より好ましくは、第2単量体は、KRTYQS/AYSER、KRSYQS/TRSER、KRSNQS/TYSER、KRSAQS/ TRSER、KRSVQS/TRSER、KRSSQS/RYSET及びKNGHQS/ TRSERからなる群より選択される。第2単量体は、有利には、G19S、I24V、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの第1付加的変異と、ついには、I24T、Q31R、K34R、F43L、F43I、Q50R、R52C、K57R、V59A、D60G、V64A、K82R、K96R、K98R、K100R、N103Y、N103D、K107R、K107E、Q111R、E117K、F122Y、V129A、L135Q、T140A、D153G及びS156Rからなる群より選択される第2付加的変異とを含む。このような第2単量体の例は、表VI (M1: N30R、S32T、Q44A、R68Y、R70S、D75E及びI77R、又はKRTYQS/AYSER、配列番号45に相当)、表X (.4_R0〜4_R3、配列番号101〜104に相当)、表XI (.4_R4〜.4_R6及び4_R8〜.4_R11、配列番号105〜107及び108〜111に相当)、表XIII (配列番号128〜139)、表XV (配列番号143〜148)、表XVI (配列番号156〜162)及び表XVII (配列番号163〜165)に示す。好ましい第2単量体は、.4_R2、4_R5、4_R9、4_R11、M1_24V及びそれぞれ配列番号103、106、109、111、128及び143〜148に相当する表XVのその誘導変異体である。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン5に位置するIL2RG12標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：Y33S、Q38R、S40E、Q44L、R70N、D75N及びE80K (又は KNSSRE/LRNNI+E80K;第1単量体)と、N30D、Y33R、Q38T、Q44A、R68Y、R70S、D75Y及びI77K (又はKDSRTS/AYSYK; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン6に位置するIL2RG5標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：Y33R、Q38N、S40Q、Q44Y、R70S及びI77V (KNSRNQ/YRSDV; 第1単量体)と、Y33T、Q38A、R68Y、R70S、D75R及びI77Q (又はKNSTAS/QYSRQ; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン6に位置するIL2RG15標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：N30S、Y33C、R40A、Q44A、R68Y、R70S、D75Y及びI77K (又はKSSCQA/AYSYI; 第1単量体)と、S32T、Q38W、Q44A、R68Y、R70S、D75Y及びI77K (又はKNTYWS/AYSYK; 第2単量体)。
より好ましくは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン6に位置するIL2RG6標的を切断するために(図3及び表I)、I-CreI変異型の単量体は、第1及び第2のI-CreI単量体についてそれぞれ、少なくとも以下の置換を有する：S32R、Y33D、Q44D、R68N、R70S及びD75N (又はKNRDQS/DNSNI; 第1単量体)と、Y33T、Q38A、Q44A、R68Y、R70S、D75Y、I77K (又はKNSTAS/AYSYK; 第2単量体)。
上記のように定義されるヘテロ二量体変異型は、上記のアミノ酸置換のみを有し得る。この場合、記載していない位置は変異されておらず、よって、野生型I-CreI (配列番号1)又はI-CreI N75足場(配列番号4)の配列にそれぞれ相当する。表IのIL2RG DNA標的を切断するこのようなへテロ二量体I-CreI変異型の例は、以下の配列の対に相当する第1及び第2単量体からなる変異型を含む：配列番号38と43 (IL2RG7標的を切断する); 配列番号 39と44 (IL2RG4標的を切断する); IL2RG3標的を切断する配列番号40 (m10と命名)と配列番号45 (M1と命名); 配列番号41と配列番号46 (IL2RG5標的を切断する); 配列番号42と配列番号47 (IL2RG6標的を切断する); 配列番号120と121 (IL2RG13)、配列番号122と123 (IL2RG14)、配列番号124と125 (IL2RG12)及び配列番号126と127 (IL2RG15)。
或いは、ヘテロ二量体変異型は、上記で定義されるアミノ酸置換を含むI-CreI配列からなることができる。後者の場合、記載していない位置は、付加的な変異、例えば上記で定義される1つ又は複数の付加的変異を含み得る。
特に、ヘテロ二量体変異型の1つ又は両方の単量体は、有利には、IL2RG標的についての変異型の切断活性を増大させる付加的な置換を含む。
例えば、配列番号67〜100、140〜142の単量体及び配列番号101〜111、128〜139、143〜148及び156〜165の単量体は、IL2RG3標的についての切断活性を増大させる付加的な置換を有する。
例えば、配列番号67〜100、140〜142の単量体及び配列番号101〜111、128〜139、143〜148及び156〜165の単量体は、IL2RG3標的についての切断活性を増大させる付加的な置換を有する。
IL2RG3標的を切断する好ましいヘテロ二量体変異型は、以下のとおりである：
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (.3R_17、配列番号89に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R (.4R_5、配列番号106に相当する)、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R (.4R_9、配列番号109に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V (M1_24V、配列番号128に相当する; 第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+80G+132V+139R (.3R_27、配列番号99に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R (.4R_9、配列番号109に相当する)又はKRTYQS/AYSER +19S+59A+82R+111R+140A (.4R_11、配列番号111に相当する; 第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+132V+139R (.3R_28、配列番号100に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+111R (.4R_2、配列番号103に相当する)、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R (.4R_5、配列番号106に相当する)、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R (.4R_9、配列番号109に相当する)、KRTYQS/AYSER +19S+59A+82R+111R+140A (.4R_11、配列番号111に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V (M1_24V、配列番号128に相当する; 第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (.3R_17、配列番号89に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R (.4R_5、配列番号106に相当する)、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R (.4R_9、配列番号109に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V (M1_24V、配列番号128に相当する; 第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+80G+132V+139R (.3R_27、配列番号99に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R (.4R_9、配列番号109に相当する)又はKRTYQS/AYSER +19S+59A+82R+111R+140A (.4R_11、配列番号111に相当する; 第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+132V+139R (.3R_28、配列番号100に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+111R (.4R_2、配列番号103に相当する)、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R (.4R_5、配列番号106に相当する)、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R (.4R_9、配列番号109に相当する)、KRTYQS/AYSER +19S+59A+82R+111R+140A (.4R_11、配列番号111に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V (M1_24V、配列番号128に相当する; 第2単量体)、
- KNSHQY/RYSEV+19S+132V (.3_R25、配列番号97に相当する)又はKNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V+139R (.3R_25a、配列番号140に相当する)又はKNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V (.3R_25c、配列番号142に相当する; 第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V (M1_24V、配列番号128に相当する; 第2単量体)。
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (.3R_17、配列番号89に相当する; 第1単量体)又はKNSHQY/RYSEV+19S+132V (.3_R25、配列番号97に相当する)と、KRTYQS/AYSER+24V+132V (配列番号143に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+80K (配列番号144に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+54L (配列番号145に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+87L (配列番号146に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+105A (配列番号147に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+105A+132V (配列番号148に相当する)。
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (.3R_17、配列番号89に相当する; 第1単量体)又はKNSHQY/RYSEV+19S+132V (.3_R25、配列番号97に相当する)と、KRTYQS/AYSER+24V+132V (配列番号143に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+80K (配列番号144に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+54L (配列番号145に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+87L (配列番号146に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+105A (配列番号147に相当する)又はKRTYQS/AYSER+24V+105A+132V (配列番号148に相当する)。
本発明は、上記で定義される配列と少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95% (96%、97%、98%、99 %)の同一性を有するI-CreI変異型であって、IL2RG遺伝子からのDNA標的を切断できる変異型を含む。
ヘテロ二量体変異型は、有利には、2つのI-CreI単量体間に分子間相互作用をつくる第1及び第2単量体の残基に対応する興味対象の少なくとも1対の変異を有する偏性(obligate)ヘテロ二量体変異型であり、ここで、上記の対の第1変異は第1単量体中にあり、上記の対の第2変異は第2単量体中にあり、上記の変異の対は各単量体からの機能的ホモ二量体の形成を妨げ、ヒトIL2RG遺伝子からのゲノムDNA標的を切断できる機能的ヘテロ二量体の形成を可能にする。
偏性ヘテロ二量体を形成するために、単量体は、第1及び第2単量体のそれぞれについて、以下の変異の対の少なくとも1つを有することが有利である：
a) 8位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び7位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)；第1単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも1つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
b) 61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び96位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)；第1単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも1つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
c) 97位のロイシンの芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンでの置換(第1単量体)、及び54位のフェニルアラニンの小さいアミノ酸、好ましくはグリシンでの置換(第2単量体)；第1単量体は、54位のフェニルアラニンのトリプトファンによる置換をさらに含むことができ、第2単量体は、58位のロイシン又は57位のリジンのメチオニンによる置換をさらに含み得る、
d) 137位のアスパラギン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び51位のアルギニンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)。
a) 8位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び7位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)；第1単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも1つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
b) 61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び96位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)；第1単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも1つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
c) 97位のロイシンの芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンでの置換(第1単量体)、及び54位のフェニルアラニンの小さいアミノ酸、好ましくはグリシンでの置換(第2単量体)；第1単量体は、54位のフェニルアラニンのトリプトファンによる置換をさらに含むことができ、第2単量体は、58位のロイシン又は57位のリジンのメチオニンによる置換をさらに含み得る、
d) 137位のアスパラギン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第1単量体)、及び51位のアルギニンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第2単量体)。
例えば、第1単量体は変異D137Rを、第2単量体は変異R51Dを有し得る。偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、有利には、上記のa)、b)、c)又はd)で定義される変異の少なくとも2対を含む。変異の対のうちの1つは、有利にはc)又はd)で定義されるとおりである。好ましくは、一方の単量体は、7位及び96位のリジン残基の酸性アミノ酸(アスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E))、好ましくはグルタミン(K7E及びK96E)による置換を含み、他方の単量体は、8位及び61位のグルタミン酸残基の塩基性アミノ酸(アルギニン(R)又はリジン(K)；例えばE8K及びE61R)による置換を含む。より好ましくは、偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、上記のa)、b)及びc)で定義される変異の3対を含む。偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、有利には、(i) E8R、E8K又はE8H、E61R、E61K又はE61H及びL97F、L97W又はL97Y; (ii) K7R、E8R、E61R、K96R及びL97F、或いは(iii) K7R、E8R、F54W、E61R、K96R及びL97Fと、(iv) K7E又はK7D、F54G又はF54A及びK96D又はK96E; (v) K7E、F54G、L58M及びK96E、或いは(vi) K7E、F54G、K57M及びK96Eの変異を少なくとも有する第2単量体(B)とからなる。例えば、第1単量体は、変異K7R、E8R又はE8K、E61R、K96R及びL97F、或いはK7R、E8R又はE8K、F54W、E61R、K96R及びL97Fを有し、第2単量体は、変異K7E、F54G、L58M及びK96E又はK7E、F54G、K57M及びK96Eを有し得る。偏性ヘテロ二量体は、上記で定義される少なくとも1つのNLS及び／又は1つのタグを有し得る。上記のNLS及び／又はタグは、第1及び／又は第2単量体にあり得る。
本発明の主題は、上記で定義されるI-CreI変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼ(融合タンパク質)でもある。単鎖メガヌクレアーゼは、2つのI-CreI単量体、2つのI-CreIコアドメイン(I-CreIの6位〜94位)、又はこれら両方の組み合わせを含み得る。好ましくは、2つの単量体/コアドメイン又はこれら両方の組み合わせは、ペプチドリンカーにより連結される。
本発明の主題は、上記で定義される変異型又は単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントでもある。上記のポリヌクレオチドは、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体の変異型の1つの単量体、又は単鎖キメラメガヌクレアーゼの2つのドメイン/単量体をコードし得る。
本発明の主題は、本発明による変異型又は単鎖メガヌクレアーゼの発現のための組換えベクターでもある。組換えベクターは、上記で定義される変異型又は単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む。好ましい実施形態において、上記のベクターは、それぞれがヘテロ二量体変異型の単量体の一方をコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む。
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自律複製できるもの(エピソームベクター)及び／又は連結された核酸の発現を可能にするもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；エス・セレビシエ(S. cerevisiae)についてTRP1、URA3及びLEU2；大腸菌(E. coli)においてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
好ましくは、上記のベクターは、本発明の変異型／単鎖メガヌクレアーゼをコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該変異型の生成又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、変異型がヘテロ二量体である場合、各単量体をコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動し得る1つのベクターに含まれる。適切なプロモーターは、組織特異的及び／又は誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加により誘導される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度の増加により誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)タンパク質A及びB、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティング構築物を含む。
好ましくは、変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列は、配列番号3の250位〜449位、991位〜1190位、1116位〜1305位、1546位〜1745位、1597位〜1796位、2108位〜2307位、2860位〜3059位、2879位〜3078位又は3041位〜3240位を含むヒトIL2RG遺伝子のフラグメントである。
好ましくは、変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列は、配列番号3の250位〜449位、991位〜1190位、1116位〜1305位、1546位〜1745位、1597位〜1796位、2108位〜2307位、2860位〜3059位、2879位〜3078位又は3041位〜3240位を含むヒトIL2RG遺伝子のフラグメントである。
或いは、I-CreI変異型/単鎖メガヌクレアーゼをコードするベクターと、ターゲティング構築物を含むベクターとは、異なるベクターである。
より好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は：
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)に記載の配列で挟まれたか又はa)に記載の配列に含まれる、導入される配列と
を含む。
より好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は：
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)に記載の配列で挟まれたか又はa)に記載の配列に含まれる、導入される配列と
を含む。
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpを超える、より好ましくは200 bpを超える相同配列が用いられる。よって、ターゲティングDNA構築物は、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。実際に、共有されるDNA相同性は、破断の部位の上流及び下流に接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、2つの腕の間に位置するべきである。導入される配列は、好ましくは、ゲノム療法のために、興味対象の遺伝子の変異を修復する配列である(遺伝子修正又は機能的遺伝子の回復)。或いは、これは、特定の配列を改変するため、興味対象の遺伝子を減弱若しくは活性化するため、興味対象の遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は削除するため、興味対象の部位に変異を導入するため、或いは外因性遺伝子又はその一部分を導入するために用いられる配列を含む、ある特定の様式で染色体DNAを変更させるために用いられる任意のその他の配列であり得る。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学(動物モデル/ヒト組換え株化細胞)のために用いられる。ターゲティング構築物は、2つの相同腕の間にポジティブ選択マーカーと、ついには、第1の相同腕の上流又は第2の相同腕の下流にネガティブ選択マーカーとを含むのが有利である。マーカーは、標的部位にて相同組換えにより興味対象の配列が挿入された細胞の選択を可能にする。
例えば、図18は、IL2RG遺伝子からの標的、該標的を切断できる変異型、及びそれぞれの標的部位にて切断を修復するための最小マトリクスを示す。
IL2RG遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる(図1A)。ターゲティング構築物は、切断を修復するための標的部位に接する少なくとも200 bpの相同配列(最小修復マトリクス)を有し、変異を修復するための変異の領域に相当する野生型IL2RG鎖の部分をコードする配列を含むIL2RG遺伝子フラグメントを含む(図1A)。結果として、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含むか、又は最小修復マトリクスからなる。これは、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。好ましくは、変異型の切断部位が変異と重複する場合、修復マトリクスは、IL2RG遺伝子に上記の切断を誘導するために用いられる変異型により切断されない改変切断部位と、ヒトIL2RG鎖のオープンリーディングフレームを変更しない野生型ヒトIL2RG鎖をコードする配列を含む。
IL2RG遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる(図1A)。ターゲティング構築物は、切断を修復するための標的部位に接する少なくとも200 bpの相同配列(最小修復マトリクス)を有し、変異を修復するための変異の領域に相当する野生型IL2RG鎖の部分をコードする配列を含むIL2RG遺伝子フラグメントを含む(図1A)。結果として、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含むか、又は最小修復マトリクスからなる。これは、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。好ましくは、変異型の切断部位が変異と重複する場合、修復マトリクスは、IL2RG遺伝子に上記の切断を誘導するために用いられる変異型により切断されない改変切断部位と、ヒトIL2RG鎖のオープンリーディングフレームを変更しない野生型ヒトIL2RG鎖をコードする配列を含む。
例えば、図19に示すように、SCID-X1の原因であるIL2RG遺伝子内のいくつかの変異を修正するために、変異型／ターゲティング構築物の以下の組み合わせを用いることができる：
- C62TER (エキソン2)
* Y33T、S40Q、Q44N、R68Y、R70S、D75Y及びI77Q (又はKNSTQQ/NYSYQ; 第1単量体)、並びにK28S、Q38R、S40K、Q44D、R68N、R70S及びD75N (又はSNSYRK/DNSNI; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン1に位置するIL2RG7標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも250位〜449位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(351位)と変異部位(574位)との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号38と配列番号43とで形成されるヘテロ二量体である。
- C62TER (エキソン2)
* Y33T、S40Q、Q44N、R68Y、R70S、D75Y及びI77Q (又はKNSTQQ/NYSYQ; 第1単量体)、並びにK28S、Q38R、S40K、Q44D、R68N、R70S及びD75N (又はSNSYRK/DNSNI; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン1に位置するIL2RG7標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも250位〜449位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(351位)と変異部位(574位)との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号38と配列番号43とで形成されるヘテロ二量体である。
- K98TER、G114D、C115R (エキソン3)、ヌル変異(イントロン3)
* N30H、S32T、Y33C、Q38R、R70D、D75N及びI77R (又はKHTCRS/QRDNR; 第1単量体)、並びにS32D、Q38Y、R70S、D75H及びI77Y (又はKNDYYS/QRSHY; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン3に位置するIL2RG13標的を切断する (図3及び表I))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも991位〜1190位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(1092位)と変異部位(888位(K98TER)、937位(G114D)、939位(C115R)又は1051位(ヌル変異))との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号120と配列番号121とで形成されるヘテロ二量体である。
* N30H、S32T、Y33C、Q38R、R70D、D75N及びI77R (又はKHTCRS/QRDNR; 第1単量体)、並びにS32D、Q38Y、R70S、D75H及びI77Y (又はKNDYYS/QRSHY; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン3に位置するIL2RG13標的を切断する (図3及び表I))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも991位〜1190位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(1092位)と変異部位(888位(K98TER)、937位(G114D)、939位(C115R)又は1051位(ヌル変異))との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号120と配列番号121とで形成されるヘテロ二量体である。
* N30R、S32A、Y33N、S40E、Q44Y、R70S及びD75Q (又はKRANQE/YRSQI; 第1単量体)、並びにY33C、Q38A、Q44N、R70S、D75Y及びI77N (又はKNSCAS/NRSYN; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン3に位置するIL2RG14標的を切断する(図3及び表I))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも1116位〜1305位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(1217位)と変異部位(888位(K98TER)、937位(G114D)、939 (C115R)位又は1051位(ヌル変異)) との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号122と配列番号123とで形成されるヘテロ二量体である。
- I153N (エキソン4)
* Y33T、S40Q、Q44R、R68Y、R70S、D75E及びI77Y (又はKNSTQQ/RYSEY; 第1単量体)、並びにS32T、Q44D、R68Y、R70S、D75S及びI77R (又はKNTYQS/DYSSR; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RGのイントロン4に位置するIL2RG4標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも1546位〜1745位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(1647位)と変異部位(1262位)との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号39と配列番号44とで形成されるヘテロ二量体である。
* Y33T、S40Q、Q44R、R68Y、R70S、D75E及びI77Y (又はKNSTQQ/RYSEY; 第1単量体)、並びにS32T、Q44D、R68Y、R70S、D75S及びI77R (又はKNTYQS/DYSSR; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RGのイントロン4に位置するIL2RG4標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも1546位〜1745位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(1647位)と変異部位(1262位)との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号39と配列番号44とで形成されるヘテロ二量体である。
* Y33R、S40Y、Q44R、R68Y、R70S、I77T及びI132V (又はKNSRQY/RYSNT+I132V; 第1単量体)と、N30R、S32T、Q44A、R68Y、R70S、D75E及びI77R (又はKRTYQS/AYSER; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4に位置するIL2RG3標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも1597位〜1796位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(1698位)と変異部位(1262位)との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号40 (m10)と配列番号45 (M1)とで形成されるヘテロ二量体、並びにIL2RG3標的についての切断活性を増大させる付加的な置換を有する単量体で形成される誘導へテロ二量体：配列番号67〜100、140〜142 (第1単量体)と、配列番号101〜111、128〜139及び143〜148 (M1に由来する第2単量体)。好ましいヘテロ二量体は、配列番号89と、配列番号106、109、128のいずれか; 配列番号99と配列番号109又は111; 配列番号100と、配列番号103、106、109、111及び128のいずれか; 配列番号140又は142と配列番号128である。
- R222Cと、Q 235の前のQHW挿入(エキソン5)
* Y33S、Q38R、S40E、Q44L、R70N、D75N及びE80K (又はKNSSRE/LRNNI+E80K; 第1単量体)、並びにN30D、Y33R、Q38T、Q44A、R68Y、R70S、D75Y及びI77K (又はKDSRTS/AYSYK; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン5に位置するIL2RG12標的を切断する(図3及び表I))と、DNA二本鎖破断及び変異の両方の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも2108位〜2307位を含むターゲティング構築物。このターゲティング構築物は、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(2209位)と変異部位(2233位(R222C)又は2271位(QHW挿入))との間の全ての配列を含む。変異型の例は、配列番号124と配列番号125とで形成されるヘテロ二量体である。
* Y33S、Q38R、S40E、Q44L、R70N、D75N及びE80K (又はKNSSRE/LRNNI+E80K; 第1単量体)、並びにN30D、Y33R、Q38T、Q44A、R68Y、R70S、D75Y及びI77K (又はKDSRTS/AYSYK; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン5に位置するIL2RG12標的を切断する(図3及び表I))と、DNA二本鎖破断及び変異の両方の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも2108位〜2307位を含むターゲティング構築物。このターゲティング構築物は、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(2209位)と変異部位(2233位(R222C)又は2271位(QHW挿入))との間の全ての配列を含む。変異型の例は、配列番号124と配列番号125とで形成されるヘテロ二量体である。
- R285Q (エキソン6)、R289TER、L293Q及びS308TER (エキソン7)
* Y33R、Q38N、S40Q、Q44Y、R70S及びI77V (又は KNSRNQ/YRSDV; 第1単量体)、並びにY33T、Q38A、R68Y、R70S、D75R及びI77Q (又はKNSTAS/QYSRQ; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン6に位置するIL2RG5標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも2860位〜3059位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(2961位)と変異部位(2955位(R285Q)、3218位(R289TER)、3231位(L293Q)又は3276位(S308TER)) との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号41と配列番号46とで形成されるヘテロ二量体である。
* Y33R、Q38N、S40Q、Q44Y、R70S及びI77V (又は KNSRNQ/YRSDV; 第1単量体)、並びにY33T、Q38A、R68Y、R70S、D75R及びI77Q (又はKNSTAS/QYSRQ; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン6に位置するIL2RG5標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも2860位〜3059位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(2961位)と変異部位(2955位(R285Q)、3218位(R289TER)、3231位(L293Q)又は3276位(S308TER)) との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号41と配列番号46とで形成されるヘテロ二量体である。
* S32R、Y33D、Q44D、R68N、R70S及びD75N (又はKNRDQS/DNSNI; 第1単量体)、並びにY33T、Q38A、Q44A、R68Y、R70S、D75Y、I77K (又はKNSTAS/AYSYK; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン6に位置するIL2RG6標的を切断する(図3及び18))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも3041位〜3240位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(3142位)と変異部位(2955位(R285Q)、3218位(R289TER)、3231位(L293Q)又は3276位(S308TER))との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。変異型の例は、配列番号42と配列番号47とで形成されるヘテロ二量体である。
* Y33R、Q38N、S40Q、Q44Y、R70S及びI77V (KNSRNQ/YRSDV; 第1単量体)、並びにY33T、Q38A、R68Y、R70S、D75R及びI77Q (又はKNSTAS/QYSRQ; 第2単量体) (これは、ヒトIL2RG遺伝子のエキソン6に位置するIL2RG5標的を切断する(図3及び表I))と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのヒトIL2RG遺伝子の少なくとも2879位〜3078位、及び変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(2980位)と変異部位(3218位(R289TER)、3231位(L293Q)又は3276位(S308TER)) との間の全ての配列を含むターゲティング構築物。このターゲティング構築物は、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位(2980位)と2955位(R285Q)の変異部位との間の全ての配列を含む。変異型の例は、配列番号126と配列番号127とで形成されるヘテロ二量体である。
或いは、機能的遺伝子を回復するために(図1B)、遺伝子の切断は、変異の上流で生じる。好ましくは、上記の変異は、遺伝子の配列内で最初のわかっている変異であり、そのことにより、遺伝子の全ての下流の変異が同時に修正される。ターゲティング構築物は、フレーム内で融合され(cDNAでのように)、かつ3'での転写を停止するためのポリアデニル化部位を有する切断部位の下流のエキソンを含む。導入される配列(エキソンノックイン構築物)は、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソンの配列で挟まれており、そのことにより、機能的タンパク質をコードできるmRNAへの工学的操作遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)の転写を可能にする(図1B)。例えば、エキソンノックイン構築物は、上記で定義される最小修復マトリクスからの、切断部位の上流及び下流の配列により挟まれる。よって、切断は、好ましくは、上記の変異型を用いてイントロン1 (IL2RG7標的)で生じる。IL2RG7標的を切断する変異型は、フレーム内で融合され(cDNAでのように)、かつ3'での転写を停止するためのポリアデニル化部位を有するエキソン1〜8を含むターゲティング構築物とともに用いることができ、切断部位の下流の配列により終結される。或いは、切断は、上記の変異型を用いてイントロン4 (IL2RG3又はIL2RG4標的)で生じる。IL2RG3又はIL2RG4を切断する変異型は、フレーム内で融合され(cDNAでのように)、かつ3'での転写を停止するためのポリアデニル化部位を有し、切断部位を取り囲むエキソン及びイントロンの配列で挟まれたエキソン5〜8を含むターゲティング構築物とともに用いることができ、そのことにより機能的タンパク質をコードできるmRNAへの工学的操作遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)の転写を可能にする(図1B)。
ノックイン動物/細胞を作製するために、ターゲティングDNA構築物は、以下のものを含む：切断を修復するための標的部位に接する少なくとも200 bpの相同配列を有するヒトIL2RG遺伝子フラグメントと、興味対象の外因性遺伝子の配列と、ついには、ネオマイシン遺伝子のような選択マーカー。
配列の挿入のために、DNA相同性は、破断の部位のすぐ上流及び下流の領域に一般的に位置する(破断に隣接する配列；最小修復マトリクス)。しかし、挿入が、切断部位に接するORF配列の欠失を伴う場合、共有されるDNA相同性は、欠失の領域の上流及び下流の領域に位置する。
ヒトIL2RG遺伝子内の改変は、ヒトゲノム療法又はヒト組換え株化細胞の作製を目的として、ヒト細胞に導入される。しかし、これらは、内因性IL2RG遺伝子が欠失され(ノックアウト)、正常若しくは変異ヒトIL2RG遺伝子がゲノムのいずれかの位置(トランスジェニック)又は特異的に内因性IL2RG遺伝子座(ノックイン)に導入されたヒト化細胞に、SCID-X1の動物モデルを作製するか又はメガヌクレアーゼ誘発相同組換えによる変異の修正を研究することを目的として、導入することもできる。
本発明の主題は、上記で定義されるターゲティングDNA構築物でもある。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ(変異型又は単鎖誘導キメラメガヌクレアーゼ)及び／又は上記で定義される、上記のメガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの発現ベクターを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれるか、又は本発明によるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれる。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれるか、又は本発明によるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれる。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ及び／又は1つの発現ベクターの、必要とする個体におけるX連鎖重症複合型免疫不全(SCID-X1)を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用でもある。
メガヌクレアーゼの使用は、(a) ドナー／個体の体組織に、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むIL2RG遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位と該メガヌクレアーゼとを接触させることにより二本鎖切断を誘導し、(b) 上記で定義されるように、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと(2) ターゲティングDNAと染色体DNAの間の組換えによりIL2RG遺伝子を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを前記体組織に導入する工程を少なくとも含み得る。ターゲティングDNAは、興味対象部位へのターゲティングDNAの導入に適する条件下で体組織に導入される。
本発明によると、上記の二本鎖切断は、疾患の個体からの体細胞(造血幹細胞)へメガヌクレアーゼを導入し、次いで、改変された細胞を疾患の個体に移植して戻すことによりエクスビボで誘発してよい。ターゲティング構築物は、ヒトIL2RG遺伝子を欠失させる配列と、ついには、興味対象の外因性遺伝子の配列を含み得る(遺伝子置き換え)。
本発明の主題は、必要とする個体において、X連鎖重症複合型免疫不全(SCID-X1)を予防、改善又は治癒するための方法でもあり、該方法は、前記個体に、任意の手段により上記で定義される組成物を投与する工程を少なくとも含む。
本発明の主題は、さらに、上記で定義されるメガヌクレアーゼ、好ましくは発現ベクターに含まれる1つ又は2つのポリヌクレオチドの、非治療目的でのIL2RG遺伝子のゲノム工学のための使用である。IL2RG遺伝子は、ヒト内因性IL2RG遺伝子(ヒトIL2RG遺伝子遺伝子座; ヒト組換え細胞作製)、又は動物、例えばマウスに挿入された導入遺伝子(SCID-X1の動物モデル)であり得る。
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、ゲノムDNA標的配列を含むIL2RG遺伝子の興味対象部位内に2本鎖破断を誘発することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘発するためである。
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、ゲノムDNA標的配列を含むIL2RG遺伝子の興味対象部位内に2本鎖破断を誘発することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘発するためである。
本発明によると、上記の二本鎖破断は、ヒトIL2RG遺伝子内の特定の配列を修復するため、ヒトIL2RG遺伝子内の特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的ヒトIL2RG遺伝子を回復するため、ヒトIL2RG遺伝子を減弱若しくは活性化するため、ヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、ヒトIL2RG遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させるため、染色体腕を転座させるため、或いはDNAを修復されないままにして分解させるためである。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記の変異型、ポリヌクレオチド、又はベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物と組み合わせる。
本発明によるメガヌクレアーゼの使用の第1の実施形態において、これは、少なくとも以下の工程を含む：1)二本鎖破断を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより導入し；2)標的遺伝子座と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する。上記のメガヌクレアーゼは、細胞に直接、又は該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、用いられる細胞におけるその発現に適切な発現ベクターにより提供され得る。このストラテジーは、DNA配列を標的部位に導入して、例えば、タンパク質生産、遺伝子機能研究、薬剤の開発(薬剤のスクリーニング)のために、又はSCID-X1モデル(疾患、及びメガヌクレアーゼ誘発相同性組換えによる変異の修正の研究)として用いることができるノックイン若しくはトランスジェニック動物又は組換えヒト株化細胞を作製するために用いられる。
本発明によるメガヌクレアーゼの使用の第2の実施形態において、これは、以下の工程を少なくとも含む：1) 二本鎖破断を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより導入し；2)該破断されたゲノム遺伝子座を、切断部位を取り囲む領域と相同性を有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に維持する。
本発明によるメガヌクレアーゼの使用の第3の実施形態において、これは、以下の工程を少なくとも含む：二本鎖破断を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位にて、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより導入し；2)該破断されたゲノム遺伝子座を、非相同末端結合による二本鎖破断の修復のために適切な条件下に維持する。
本発明の主題は、正常／変異ヒトIL2RG遺伝子を含むヒト化マウスに由来する改変マウス(ノックインマウス)を作製する方法でもあり、該方法は少なくとも以下の工程を含む：
(a) 上記のヒト化マウスの多能性前駆細胞又は胚に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、同時に又は連続的に、
(b) 工程(a)のマウス前駆細胞又は胚に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入することにより、相同組換えにより興味対象部位が修復されたゲノム改変マウス前駆細胞又は胚を作製し、
(c) 工程(b)のゲノム改変マウス前駆細胞又は胚を、キメラマウスに発達させ、
(d) 工程(c)のキメラマウスからトランスジェニックマウスを誘導する。
(a) 上記のヒト化マウスの多能性前駆細胞又は胚に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、同時に又は連続的に、
(b) 工程(a)のマウス前駆細胞又は胚に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入することにより、相同組換えにより興味対象部位が修復されたゲノム改変マウス前駆細胞又は胚を作製し、
(c) 工程(b)のゲノム改変マウス前駆細胞又は胚を、キメラマウスに発達させ、
(d) 工程(c)のキメラマウスからトランスジェニックマウスを誘導する。
好ましくは、工程(c)は、工程(b)で作製されたゲノム改変前駆細胞を、キメラマウスを作製するように、胚盤胞へ導入することを含む。
本発明の主題は、少なくとも以下の：
(a) ヒト細胞に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、同時に又は連続的に、
(b) 工程(a)の細胞に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより興味対象部位が修復された組換えヒト細胞を作製し、
(c) 任意の適切な手段により、工程(b)の組換えヒト細胞を単離する
工程を含む、組換えヒト細胞を作製する方法でもある。
(a) ヒト細胞に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断部位を含むヒトIL2RG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、同時に又は連続的に、
(b) 工程(a)の細胞に、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含むターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより興味対象部位が修復された組換えヒト細胞を作製し、
(c) 任意の適切な手段により、工程(b)の組換えヒト細胞を単離する
工程を含む、組換えヒト細胞を作製する方法でもある。
ターゲティングDNAは、細胞内に、ターゲティングDNAを興味対象部位に導入するのに適する条件下で導入される。
好ましい実施形態において、上記のターゲティングDNA構築物は、ベクターに挿入される。
好ましい実施形態において、上記のターゲティングDNA構築物は、ベクターに挿入される。
改変される細胞は、興味対象のいずれの細胞であってもよい。ノックイン／トランスジェニックマウスを作製するために、細胞は、当該技術において公知の胚由来幹(ES)細胞のような多能性前駆細胞である。組換えヒト株化細胞を作製するために、細胞は、有利には、PerC6 (Fallauxら, Hum. Gene Ther. 9, 1909〜1917, 1998)又はHEK293 (ATCC # CRL-1573)細胞であり得る。上記のメガヌクレアーゼは、細胞に直接提供できるか、又は該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、用いられる細胞内でのその発現に適する発現ベクターにより提供できる。
興味対象の異種タンパク質を発現するヒト組換え株化細胞／トランスジェニック動物を作製するために、ターゲティングDNAは、興味対象の生成物(タンパク質又はRNA)をコードする配列と、ついには、上記で定義される、切断部位の上流と下流の配列で挟まれたマーカー遺伝子とを含み、そのことにより、相同組換えにより、ヒトIL2RG遺伝子内に興味対象の外因性配列が組み込まれたゲノム改変細胞(ヒト細胞)が作製される。
興味対象の配列は、ある興味対象のタンパク質／ペプチドをコードする任意の遺伝子であってよく、限定されないが、レポーター遺伝子、受容体、シグナル分子、転写因子、医薬活性タンパク質及びペプチド、疾患原因遺伝子産物及び毒素を含む。配列は、例えばsiRNAを含む興味対象のRNA分子をコードしてもよい。
外因性配列の発現は、内因性ヒトIL2RGプロモーター又は異種プロモーター、好ましくは上記で定義される構成性若しくは誘導性の遍在性又は組織特異的プロモーターにより駆動され得る。さらに、興味対象の配列の発現は、条件的であり得る。発現は、部位特異的リコンビナーゼ(Cre、FLP・・・)により誘発され得る。
よって、興味対象の配列は、興味対象の遺伝子に機能的に連結された異種プロモーターと、限定されないが(選択)マーカー遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、ポリアデニル化シグナル、スプライス受容配列、イントロン、タンパク質検出のためのタグ及びエンハンサーを含む1つ又は複数の機能的配列とを含み得る適切なカセット内に挿入される。
SCID-X1の動物モデルを作製するために、ターゲティングDNAは、切断部位の上流及び下流の配列で挟まれた、正しい／変異ヒトIL2RG遺伝子配列を含み、そのことにより、IL2RG遺伝子内の変異が修正された動物、又はヒトにおいてSCID-X1を引き起こす変異IL2RG遺伝子が挿入された動物が作製され、そのことによりメガヌクレアーゼ誘発相同組換えによる遺伝子修正が研究される。
メガヌクレアーゼは、ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物のいずれかとして用い得る。これは、特定の種類の細胞に適切な当該技術において公知の任意の簡便な手段により、単独で、又は少なくとも適切なビヒクル若しくはキャリアのいずれか及び／又はターゲティングDNAとともに、マウス細胞に導入される。
本発明による使用の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ(ポリペプチド)は、以下のものと組み合わされる：
- リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI)；このような場合、上記の組み合わせは投与され、よって、標的体細胞に導入される。
- 膜移送ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52〜56)；このような場合、変異型/単鎖メガヌクレアーゼの配列は、膜移送ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
- リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI)；このような場合、上記の組み合わせは投与され、よって、標的体細胞に導入される。
- 膜移送ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52〜56)；このような場合、変異型/単鎖メガヌクレアーゼの配列は、膜移送ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
本発明による使用の別の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド)及び／又はターゲティングDNAは、ベクターに挿入される。ターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入できる(例えば注入、直接摂取、発射衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞内で安定的又は一過的に発現させ得る。真核細胞における発現の方法は、当該技術において公知である(Current Protocols in Human Genetics: 12章 「Vectors For Gene Therapy」及び13章「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照)。所望により、組換えタンパク質中に、核局在化シグナルを組み込んで、核内でそれが発現されることを確実にすることが好ましい。
一旦細胞内に入ると、メガヌクレアーゼと存在するならばターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターとは、細胞質から核内の作用部位まで、細胞により移入又は移送される。
治療目的のために、メガヌクレアーゼと医薬的に許容される賦形剤とは、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与された量が生理的に重要である場合に、「治療有効量」で投与されるという。作用剤は、その存在が、レシピエントの生理機能に検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に重要である。この関係において、作用剤は、その存在が、標的疾患の1つ又は複数の症状の重篤度を低減させ、損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に重要である。
本発明による使用のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、本質的に非免疫原性であり、すなわち、ほとんど又は全く有害免疫応答を生じない。この種の有害免疫反応を緩和又は排除するための種々の方法を、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、N-ホルミルメチオニンを実質的に含まない。望ましくない免疫反応を回避するその他の様式は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」) (好ましくは500〜20,000ダルトンの平均分子量(MW)のもの)とコンジュゲートさせることである。Davisら(US 4,179,337)により記載されるPEG又はPPGとのコンジュゲート形成は、例えば抗ウイルス活性を有する、非免疫原性で、生理活性で水溶性のエンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供できる。ポリエチレン--ポリプロピレングリコール共重合体を用いる同様の方法が、Saiferらにより記載される(US 5,006,333)。
本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変された原核又は真核宿主細胞にも関する。
本発明は、細胞の全て又は一部分が上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことである。
本発明は、細胞の全て又は一部分が上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことである。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ変異型の、別のメガヌクレアーゼを作製するための足場としての使用でもある。例えば、新規なメガヌクレアーゼを作製する目的で、さらなる回の突然変異誘発及び選択／スクリーニングを上記の変異型に対して行うことができる。
本発明によるメガヌクレアーゼの異なる使用及び上記のメガヌクレアーゼを用いる方法は、I-CreI変異型、該変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼ、上記で定義される、該変異型若しくは単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用を含む。
本発明によるI-CreI変異型は、少なくとも以下の工程を含む、ヒトIL2RG遺伝子からのゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製するための(グローバルコンビナトリアル)法により得ることができる：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(f) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトIL2RG遺伝子からの上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
(i) 工程(g)及び(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトIL2RG遺伝子からの上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
上記の工程(c)、(d)、(e)又は(f)の1つは省略できる。例えば、工程(c)を省略する場合、工程(d)は、-10位〜-8位及び-5位〜-3位の両方のヌクレオチドトリプレットが上記のゲノム標的の-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットでそれぞれ置き換えられ、+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位及び-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列でそれぞれ置き換えられた変異I-CreI部位を用いて行われる。
工程(g)及び(h)における変異の(分子内)組み合わせは、公知のオーバーラップPCR法に従って、2つのサブドメインのそれぞれを含むオーバーラップフラグメントを増幅することにより行うことができる。
工程(i)の変異型の(分子間)組み合わせは、工程(g)からの1つの変異型を、工程(h)からの1つの変異型と同時発現させて、ヘテロ二量体の形成を可能にすることにより行われる。例えば、宿主細胞を、上記の変異型をコードする1つ又は2つの組換え発現ベクターにより改変できる。次いで、国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に以前に記載されたように、細胞を変異型の発現を可能にする条件下で培養することにより、ヘテロ二量体が宿主細胞内で形成される。
工程(c)、(d)、(e)、(f)及び／又は(j)の選択及び／又はスクリーニングは、国際PCT出願WO 2004/067736、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458, Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962及びChamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178に記載されるように、切断アッセイを用いることにより、インビトロ又はインビボで行うことができる。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程(c)、(d)、(e)、(f)及び／又は(j)は、インビボで、上記の変異型により作製された変異DNA標的配列内の二本鎖破断が、ポジティブ選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又はネガティブ選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を、該DNA二本鎖破断の組換え媒介修復により導く条件下で行われる。
工程(a)、(b)、(g)、(h)及び(i)は、上記で定義される、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置、変異体の結合及び／又は切断特性を改良する位置、或いは機能的ホモ二量体の形成を妨げるか若しくは損なうか、又はヘテロ二量体の形成に好ましい位置での、付加的な変異の導入をさらに含み得る。
当業者に公知の標準的な突然変異誘発法、例えばPCRを用いることにより、変異型又は変異型のプールに対して部位特異的突然変異誘発及び／又はランダム突然変異誘発により付加的な変異を導入してよい。部位特異的突然変異誘発は、上記で定義されるような変異部位を含むオーバーラップフラグメントを、公知のオーバーラップPCR法に従って増幅することにより有利に行うことができる。さらに、多部位特異的突然変異誘発を、変異型又は変異型のプールに対して行うことが有利であろう。
特に、ランダム突然変異誘発は、変異型全体又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端半分(80位〜163位)に導入して、興味対象の遺伝子からのDNA標的に対する変異体の結合及び／又は切断特性を改良できる。変異体の結合及び／又は切断特性を改良する位置、例えば19位、54位、80位、87位、105位及び／又は132位での部位特異的突然変異誘発を、ランダム突然変異誘発と組み合わせることもできる。突然変異誘発は、当該技術において公知である標準的な突然変異誘発法に従って、ランダム／部位特異的突然変異誘発ライブラリーを変異型のプールに対して作製することにより行うことができる。
好ましくは、突然変異誘発は、工程(i)で形成されるか又は工程(j)で得られるヘテロ二量体の一方の単量体に対して、有利には、単量体のプールに対して、好ましくは工程(i)又は(j)のへテロ二量体の両方の単量体に対して行われる。
好ましくは、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2007, 371, 49〜65の図4に記載される方法に従って、少なくとも2回の選択／スクリーニングを行う。1回目において、ヘテロ二量体の一方の単量体(図4の単量体Y)に突然変異を誘発し、他方の単量体(図4の単量体X)と同時発現させてヘテロ二量体を形成し、改良単量体Y+を、興味対象遺伝子からの標的に対して選択する。2回目において、他方の単量体(単量体X)に突然変異を誘発し、改良単量体Y+と同時発現させてヘテロ二量体を形成し、興味対象遺伝子からの標的に対して選択して、改良された活性を有するメガヌクレアーゼ(X+ Y+)を得る。突然変異誘発は、上記で定義される、単量体又は単量体のプールに対するランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発であり得る。両方の型の突然変異誘発は、組み合わせることが有利である。1つ又は両方の単量体に対してさらなる回の選択／スクリーニングを行って、変異型の切断活性を改良できる。
本発明による方法により得ることができる改良されたメガヌクレアーゼの切断活性は、元のメガヌクレアーゼのものとの比較により、レポーターベクターを用いて、酵母又は哺乳動物細胞での直列反復組換えアッセイにより測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた介在配列内に、レポーター遺伝子の2つの切断された非機能的コピー(直列反復)と、ゲノムDNA標的配列とを含む。メガヌクレアーゼの発現が、ゲノムDNA標的配列の切断をもたらす。この切断は、直列反復同士の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子(例えばLacZ)をもたらし、この発現は、適切なアッセイによりモニターできる。元のメガヌクレアーゼと比較して、より強いシグナルが、改良されたメガヌクレアーゼを用いて観察される。或いは、そのゲノムDNA標的に対する改良されたメガヌクレアーゼの活性は、同じゲノム遺伝子座にて、哺乳動物細胞での染色体アッセイ(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2007, 371, 49〜65)を用いて、I-CreI部位に対するI-CreIのものと比較できる。
さらに、工程(g)又は(h)で得られるホモ二量体組み合わせ変異型を、選択／スクリーニング工程に供して、少なくとも-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが該ゲノム標的の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドと同一であり、+3位〜+11位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は-11位〜-3位(工程(h)の組み合わせ変異型)が該ゲノム標的の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドの逆相補配列と同一である偽パリンドローム配列を切断できるものを同定することが有利である。
好ましくは、工程(g)又は工程(h) の組み合わせ変異型の組(又は両方の組)は、さらなる選択／スクリーニング工程を受けて、(i) -2位〜+2位のヌクレオチド(4つの中央塩基)が該ゲノム標的の-2位〜+2位に存在するヌクレオチドと同一であり、(ii) -11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドと同一であり、(iii) +3位〜+11位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は-11位〜-3位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドの逆相補配列と同一である偽パリンドローム配列を切断できる変異型を同定する。このさらなるスクリーニング工程は、興味対象のゲノム標的を切断できるヘテロ二量体を単離する可能性を増大させる(工程(j))。
或いは、本発明によるI-CreI変異型は、少なくとも以下の工程を含む、興味対象のゲノム(哺乳類(ヒト)又は植物のような真核生物、或いはウイルスのような微生物)からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製するための逐次的コンビナトリアル方法により得ることができる：
(a1) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内、好ましくは44位、68位、70位、75位及び／又は77位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b1)工程(a1)の第1シリーズから、少なくとも、I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-5位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられており、好ましくは、I-CreI部位の+3位〜+7位及び+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+7位及び+11位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-11位及び-7位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+7位及び+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(c1) 工程(b1)で得られた変異型から、I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内、好ましくは28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(a1) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内、好ましくは44位、68位、70位、75位及び／又は77位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b1)工程(a1)の第1シリーズから、少なくとも、I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-5位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられており、好ましくは、I-CreI部位の+3位〜+7位及び+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+7位及び+11位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-11位及び-7位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+7位及び+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(c1) 工程(b1)で得られた変異型から、I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内、好ましくは28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(d1) 工程(c1)から、少なくとも、I-CreI部位の+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+5位及び+8位〜+10位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+5位及び+8位〜+10位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられており、好ましくは、I-CreI部位の+3位〜+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+11位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-11位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+3位〜+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e1) 工程(d1)で得られた変異型を、少なくとも、I-CreI部位の-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、少なくとも、+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる、26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型と組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し；好ましくは、26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型は、I-CreI部位の-11位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-11位〜-3位のヌクレオチドで置き換えられ、+3位〜+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-11位〜-3位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断でき、
(f1) 興味対象のゲノムDNA標的を切断できる工程(e1)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
(e1) 工程(d1)で得られた変異型を、少なくとも、I-CreI部位の-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、少なくとも、+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる、26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型と組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し；好ましくは、26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型は、I-CreI部位の-11位〜-3位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-11位〜-3位のヌクレオチドで置き換えられ、+3位〜+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の-11位〜-3位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断でき、
(f1) 興味対象のゲノムDNA標的を切断できる工程(e1)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする。
或いは、逐次的コンビナトリアル法の工程(a1)〜(c1)は、以下の工程(a'1)〜(c'1)で置き換えることができる：
(a'1) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの機能的サブドメイン内、好ましくは28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b'1) 工程(a1)の第1シリーズから、少なくとも、I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-10位〜-8位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられ、好ましくは、I-CreI部位の+6位〜+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+6位〜+11位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-11位〜-6位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+6位〜+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(c'1) 工程(b'1)で得られた変異型から、I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの機能的サブドメイン内、好ましくは44位、68位、70位、75位及び／又は77位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築する。
(a'1) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの機能的サブドメイン内、好ましくは28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b'1) 工程(a1)の第1シリーズから、少なくとも、I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-10位〜-8位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられ、好ましくは、I-CreI部位の+6位〜+11位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+6位〜+11位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-11位〜-6位のヌクレオチドが、該ゲノム標的の+6位〜+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(c'1) 工程(b'1)で得られた変異型から、I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの機能的サブドメイン内、好ましくは44位、68位、70位、75位及び／又は77位に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築する。
工程(d1)で得られる変異型は、工程(f1)で得られるヘテロ二量体の2つの単量体のうちの1つ(第1単量体)を形成する。工程(f1)で得られるヘテロ二量体の他方の単量体(第2単量体)を形成する変異型を工学的に作製するために、逐次的コンビナトリアル法は、以下の工程を含む：
- 上記で定義される工程(a1)又は(a'1)、(c1)又は(c'1)及び(f1)、
- 工程(b1)又は(b'1)及び(d1)、ここで、変異I-CreI部位は、少なくとも、-5位〜-3位(工程b1)、-10位〜-8位(工程b'1)又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位(工程d1)にて、ゲノム標的の-5位〜-3位(工程b1)、-10位〜-8位(工程b'1)又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドで置き換えられたヌクレオチドを有し、少なくとも、+3位〜+5位(工程b1)、+8位〜+10位(工程b'1)又は+3位〜+5位及び+8位〜+10位(工程d1)のヌクレオチドが、ゲノム標的の-5位〜-3位(工程b1)、-10位〜-8位(工程b'1)又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられ、好ましくは、変異I-CreI部位は、-11位及び-7位〜-3位(工程b1)、-11位〜-6位(工程b'1)又は-11位〜-3位(工程d1)にて、ゲノム標的の-11位及び-7位〜-3位(工程b1)、-11位〜-6位(工程b'1)又は-11位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドで置き換えられたヌクレオチドを有し、+3位〜+7位及び+11位(工程b1)、+6位〜+11位(工程b'1)又は+3位〜+11位(工程d1)のヌクレオチドが、ゲノム標的の-11位及び-7位〜-3位(工程b1)、-11位〜-6位(工程b'1)又は-11位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられており、
- 上記で定義される工程(a1)又は(a'1)、(c1)又は(c'1)及び(f1)、
- 工程(b1)又は(b'1)及び(d1)、ここで、変異I-CreI部位は、少なくとも、-5位〜-3位(工程b1)、-10位〜-8位(工程b'1)又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位(工程d1)にて、ゲノム標的の-5位〜-3位(工程b1)、-10位〜-8位(工程b'1)又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドで置き換えられたヌクレオチドを有し、少なくとも、+3位〜+5位(工程b1)、+8位〜+10位(工程b'1)又は+3位〜+5位及び+8位〜+10位(工程d1)のヌクレオチドが、ゲノム標的の-5位〜-3位(工程b1)、-10位〜-8位(工程b'1)又は-10位〜-8位及び-5位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられ、好ましくは、変異I-CreI部位は、-11位及び-7位〜-3位(工程b1)、-11位〜-6位(工程b'1)又は-11位〜-3位(工程d1)にて、ゲノム標的の-11位及び-7位〜-3位(工程b1)、-11位〜-6位(工程b'1)又は-11位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドで置き換えられたヌクレオチドを有し、+3位〜+7位及び+11位(工程b1)、+6位〜+11位(工程b'1)又は+3位〜+11位(工程d1)のヌクレオチドが、ゲノム標的の-11位及び-7位〜-3位(工程b1)、-11位〜-6位(工程b'1)又は-11位〜-3位(工程d1)に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられており、
- 工程(e1)、ここで、ヘテロ二量体は、工程(d1)で得られた変異型を、他方の単量体を形成するI-CreI変異型、すなわち少なくとも、I-CreI部位の+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドが、ゲノム標的の+3位〜+5位及び+8位〜+10位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、少なくとも、-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、ゲノム標的の+3位〜+5位及び+8位〜+10位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる、26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型と組み合わせることにより形成される；好ましくは、他方の単量体を形成するI-CreI変異型は、I-CreI部位の+3位〜+11位のヌクレオチドが、ゲノム標的の+3位〜+11位に存在するヌクレオチドで置き換えられ、-11位〜-3位のヌクレオチドが、ゲノム標的の+3位〜+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる。
好ましくは、工程(d1)で得られた変異型は、さらなる選択／スクリーニング工程を受けて、(i) -2位〜+2位のヌクレオチド(4つの中央塩基)が、ゲノム標的の-2位〜+2位に存在するヌクレオチドと同一であり、(ii) -11位〜-3位又は+3位〜+11位のヌクレオチドが、ゲノム標的の-11位〜-3位又は+3位〜+11位に存在するヌクレオチドと同一であり、(iii) +3位〜+11位又は-11位〜-3位のヌクレオチドが、ゲノム標的の-11位〜-3位又は+3位〜+11位に存在するヌクレオチドの逆相補配列と同一である偽パリンドローム配列を切断できるものが同定される。このさらなるスクリーニング工程は、興味対象のゲノム標的を切断できるヘテロ二量体を単離する可能性を増大させる(工程(f1))。
工程(a1)、(a'1)、(c1)、(c'1)におけるI-CreI変異型のシリーズは、国際PCT出願WO 2004/067736、WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156 ; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149に以前に記載されるようにして、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位(第1サブドメイン)又は44位、68位、70位、75及び／又は77位(第2サブドメイン)にアミノ酸変動を有するコンビナトリアルライブラリーを構築することにより作製される。
工程(b1)、(b'1)、(d1)及び／又は工程(e1)の前のさらなる工程における選択及び／又はスクリーニングは、他方のコンビナトリアル法について上述したように、切断アッセイを用いてインビトロ又はインビボで行うことができる。
工程(e1)のI-CreI変異型の(分子間)組み合わせは、他方のコンビナトリアル法について上述したように、2つの変異型を同時発現させることにより行われる。
工程(e1)のI-CreI変異型の(分子間)組み合わせは、他方のコンビナトリアル法について上述したように、2つの変異型を同時発現させることにより行われる。
工程(a1)、(a'1)、(c1)、(c'1)の変異型のシリーズ、又は工程(b1)、(b'1)、(d1)、工程(e1)の前のさらなる工程及び工程(f1)で得られる変異型に、付加的な変異を導入できる。これらの変異は、他方のコンビナトリアル法について上記で定義されるように、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置、変異型の結合及び／又は切断特性を改良する位置、或いは機能的ホモ二量体の形成を妨げるか若しくは損なうか、又はヘテロ二量体の形成に好ましい位置に導入できる。好ましくは、変異型の結合及び／又は切断特性を改良する変異は、工程(d1)で得られる変異型に対する部位特異的又はランダム突然変異誘発により導入される(第1スクリーニングの後、又は上記のさらなるスクリーニングの後)。
本発明の主題は、本発明に従う、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的を切断できる変異型を工学的に作製するために有用なI-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型でもある。特に、本発明は、表II及びVの変異型を含む、上記で定義されるI-CreI変異型を工学的に作製する方法の工程(c)〜(f)で定義されるI-CreI変異型を包含する。本発明は、配列番号40、45、48〜111、115、120〜148及び156〜162 (表II、III、V、VII、VIII、IX、XI、XIII、XIV、XV、XVI及びXVIIの組み合わせ変異型を含む)を含むI-CreI変異型を工学的に作製する方法の工程(g)及び(h)で定義されるI-CreI変異型も包含する。
興味対象の遺伝子からのDNA標的を切断できる単鎖キメラメガヌクレアーゼは、当該技術において公知の方法により、本発明による変異型から導かれる(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法はいずれも、本発明で定義される変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼを構築するために用いることができる。
本発明で定義される変異型をコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に知られる任意の方法により調製できる。例えば、これらは、cDNA鋳型から、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。好ましくは、上記のcDNAのコドンは、所望の発現系における上記のタンパク質の発現に好ましいように選択される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の技術により得て、宿主細胞に導入できる。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の技術により得て、宿主細胞に導入できる。
本発明で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義されるポリペプチドを発現させることにより生成される。好ましくは、該ポリペプチドは、ポリペプチドの発現又は同時発現に適する条件下で、1つの発現ベクター又は2つの発現ベクター(変異型のみの場合)により改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物／植物で、発現又は同時発現(変異型のみの場合)され、変異型又は単鎖誘導体は、宿主細胞培養又はトランスジェニック動物／植物から回収される。
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は、文献に充分に説明されている。例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Mullisら、米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson及びM. Simon編, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ, 特に第154巻及び第155巻(Wuら編)並びに第185巻「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, 第I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編, 1986); 並びにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型及びそれらの使用を説明する実施例、並びに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴をさらに含む。添付の図面において：
- 図1は、メガヌクレアーゼ誘発組換えによる機能的遺伝子の回復のための2つの異なるストラテジーを説明する。A. 遺伝子修正。変異は既知の遺伝子内で生じる。メガヌクレアーゼによる切断及び修復マトリクスを用いる組換えの際に、有害変異が修正される。B. エキソン配列ノックイン。変異は既知の遺伝子内で生じる。変異mRNA転写産物は、遺伝子の下に強調する。修復マトリクスにおいて、切断部位の下流に位置するエキソンは、フレーム内で(cDNAでのように) 3'の転写を停止するポリアデニル化部位と融合される。イントロン及びエキソン配列は、相同領域として用いることができる。エキソン配列ノックインは、機能的タンパク質をコードできるmRNAに転写される工学的操作遺伝子をもたらす。
- 図1は、メガヌクレアーゼ誘発組換えによる機能的遺伝子の回復のための2つの異なるストラテジーを説明する。A. 遺伝子修正。変異は既知の遺伝子内で生じる。メガヌクレアーゼによる切断及び修復マトリクスを用いる組換えの際に、有害変異が修正される。B. エキソン配列ノックイン。変異は既知の遺伝子内で生じる。変異mRNA転写産物は、遺伝子の下に強調する。修復マトリクスにおいて、切断部位の下流に位置するエキソンは、フレーム内で(cDNAでのように) 3'の転写を停止するポリアデニル化部位と融合される。イントロン及びエキソン配列は、相同領域として用いることができる。エキソン配列ノックインは、機能的タンパク質をコードできるmRNAに転写される工学的操作遺伝子をもたらす。
- 図2は、ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール性の構造と、カスタムメガヌクレアーゼ設計のためのコンビナトリアルアプローチを説明する。A. そのDNA標的と結合したI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼの3次元構造。触媒コアは、DNA主溝の上にサドル形の相互作用界面を形成する2つのαββαββ折り畳みで囲まれる。B. 非パリンドロームのキメラ標的を切断するヘテロ二量体又は単鎖融合分子を得るためのI-CreI標的配列に由来する異なる結合配列(右上及び左下)。
C. より小さい独立サブユニット、すなわち単一単量体又はαββαββ折り畳み内のサブユニット(右上及び左下)の同定により、同じ単量体内の変異の組み合わせにより、新規なキメラ分子の設計(右下)が可能になる。このような分子は、パリンドロームキメラ標的(右上)を切断する。
D. 2つの前の工程の組み合わせにより、4つの異なるサブドメインを含む、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。局所的に特性が改変されたI-CreI誘導体の大きいコレクションが作製される。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対を、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新しいホモ二量体タンパク質に組み合わせる(同じ単量体内の変異の組み合わせにより；「ハーフメガヌクレアーゼ」) 。次いで、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせは、興味対象の標的を切断するヘテロ二量体種をもたらし得る(カスタムメガヌクレアーゼ)。つまり、それぞれのサブドメインについての少数の新しく切断するものを同定することにより、特異性が完全に再設計された非常に多数の新規なエンドヌクレアーゼの設計が可能になる。
C. より小さい独立サブユニット、すなわち単一単量体又はαββαββ折り畳み内のサブユニット(右上及び左下)の同定により、同じ単量体内の変異の組み合わせにより、新規なキメラ分子の設計(右下)が可能になる。このような分子は、パリンドロームキメラ標的(右上)を切断する。
D. 2つの前の工程の組み合わせにより、4つの異なるサブドメインを含む、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。局所的に特性が改変されたI-CreI誘導体の大きいコレクションが作製される。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対を、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新しいホモ二量体タンパク質に組み合わせる(同じ単量体内の変異の組み合わせにより；「ハーフメガヌクレアーゼ」) 。次いで、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせは、興味対象の標的を切断するヘテロ二量体種をもたらし得る(カスタムメガヌクレアーゼ)。つまり、それぞれのサブドメインについての少数の新しく切断するものを同定することにより、特異性が完全に再設計された非常に多数の新規なエンドヌクレアーゼの設計が可能になる。
- 図3は、ヒトIL2RG遺伝子 (アクセッション番号NC_000023; 配列番号3)を表す。エキソン配列を箱で囲み、それらの接合部を示す。ORFは、灰色の箱で示す。IL2RG3標的配列及びその他の可能性のあるメガヌクレアーゼ部位(IL2RGn)は、それらの配列及び位置で示す。
- 図4は、IL2RG3標的配列及びその誘導体を示す。全ての標的を、I-CreIにより切断されるパリンドローム配列であるC1221標的(配列番号2)と整列させる。10GAC_P、10GAA_P、5CTG_P及び5AGG_P (配列番号10〜15、114)は、I-CreI変異体により切断されることが見出された近縁の誘導体である。これらは、C1221とは、箱で囲んだモチーフが異なる。IL2C_P (配列番号149)は、5AGG_Pとは、±11位及び±7位の塩基が異なる。IL2RG3.6標的(配列番号150)は、IL2RG3.4とは、箱で囲んだ4つの中央の塩基が異なる。C1221、10GAC_P、10GAA_P、5CTG_P及び5AGG_Pは、まず24 bp配列として記載されたが、構造データは、22 bpのみがタンパク質/DNA相互作用に関連することを示唆する。しかし、±12位を括弧内に示す。IL2RG3 (配列番号7)は、ヒトIL2RG遺伝子内の1686位に位置するDNA配列である。IL2RG3.2標的(配列番号12)において、標的の中ほどのTCTC配列を、C1221で見出される塩基であるGTACで置き換える。IL2RG3.3 (配列番号13)は、IL2RG3.2の左部分に由来するパリンドローム配列であり、IL2RG3.4 (配列番号14)は、IL2RG3.2の右部分に由来するパリンドローム配列である。図に示すように、10GAC_P、10GAA_P、5CTG_P及び5AGG_Pからの箱で囲んだモチーフは、標的のIL2RG3シリーズで見出される。
- 図5は、pCLS1055プラスミドマップを表す。
- 図6は、pCLS0542プラスミドマップを表す。
- 図7は、コンビナトリアル変異体によるIL2RG3.3標的の切断を示す。この図は、IL2RG3.3標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。フィルタにおいて、E3、F2及びG9の位置の陽性変異体の配列は、それぞれKHQS/KYSEQ、KRQS/RYSDQ及びKHQS/RYSDQである(表II及びIIIに従う)。
- 図6は、pCLS0542プラスミドマップを表す。
- 図7は、コンビナトリアル変異体によるIL2RG3.3標的の切断を示す。この図は、IL2RG3.3標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。フィルタにおいて、E3、F2及びG9の位置の陽性変異体の配列は、それぞれKHQS/KYSEQ、KRQS/RYSDQ及びKHQS/RYSDQである(表II及びIIIに従う)。
- 図8は、コンビナトリアル変異体によるIL2RG3.4標的の切断を示す。この図は、IL2RG3.4標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。2×2点のスクリーニングフォーマットでの2つの96ウェルプラーク。H11及びH12は、異なる強度の陽性対照である。フィルタにおいて、E11の位置の陽性変異体の配列は、RTYQS / AYSERである(表Vに従う)。
- 図9は、pCLS1107プラスミドマップを表す。
- 図9は、pCLS1107プラスミドマップを表す。
- 図10は、ヘテロ二量体コンビナトリアル変異体によるIL2RG3.2標的配列の切断を示す。A. I-CreI変異体の組み合わせのIL2RG3.2標的に対するスクリーニング。B. I-CreI変異体の同じ組み合わせのIL2RG3標的に対するスクリーニング。この配列を用いて、B8及びD8の位置に、変異体m10及びM1を同時発現する酵母に相当する弱いシグナルが二重に観察される。
レーンA、B、C、Dにおいて：ヘテロ二量体は、IL2RG3.4を切断するM1変異体と同時発現させたIL2RG3.3を切断するm1〜m20変異体である。レーンE及びFにおいて：ヘテロ二量体は、IL2RG3.4を切断するM2変異体と同時発現させたIL2RG3.3を切断するm1〜m20変異体である。m1〜m20変異体は、実施例2に記載する(表II及びIII)。M1及びM2変異体は、実施例3に記載する(表V)。H10及びH11は、異なる強度の陽性対照である。
レーンA、B、C、Dにおいて：ヘテロ二量体は、IL2RG3.4を切断するM1変異体と同時発現させたIL2RG3.3を切断するm1〜m20変異体である。レーンE及びFにおいて：ヘテロ二量体は、IL2RG3.4を切断するM2変異体と同時発現させたIL2RG3.3を切断するm1〜m20変異体である。m1〜m20変異体は、実施例2に記載する(表II及びIII)。M1及びM2変異体は、実施例3に記載する(表V)。H10及びH11は、異なる強度の陽性対照である。
- 図11は、IL2RG3標的の切断を示す。ランダム突然変異誘発により得られ(実施例5)、IL2RG3.4(表Vに従ってRTYQS / AYSER)を切断する変異体と同時発現させたI-CreI洗練(refined)変異体の2次スクリーニングの例。切断は、IL2RG3標的に対して試験する。
それぞれのクラスタにおいて：2つの左のスポットは、二重でのヘテロ二量体である(異なる強度の陰性及び陽性対照であるH10、H11及びH12を除く)；右のスポットは対照である。
それぞれのクラスタにおいて：2つの左のスポットは、二重でのヘテロ二量体である(異なる強度の陰性及び陽性対照であるH10、H11及びH12を除く)；右のスポットは対照である。
- 図12は、IL2RG3標的の切断を示す。IL2RG3.3標的を切断する元の変異体及びそれらに由来する最適化変異体の部位特異的突然変異誘発により実施例6で構築されたライブラリーのIL2RG3標的に対する1次スクリーニングの例。この図は、G19S置換を有するライブラリーについて得られた結果を示す。372個の酵母クローンを、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) 実施例3に記載されるIL2RG3.4標的を切断する変異体であるM1変異体(表Vに従ってRTYQS / AYSER)を発現する「変異体-標的」酵母株と交配させる。
それぞれのクラスタは、6個のスポットを含む。4つの左のスポットにおいて、ライブラリーからの4つのクローンを、「変異体-標的」酵母と交配させる(H10、H11及びH12を除く：異なる強度の陰性及び陽性対照)。右上のスポットにおいて、実施例5の表VIIに記載される6つの変異体の1つを発現する酵母株を、対照として「変異体-標的」酵母と交配させる。右下のスポットは、異なる強度の陰性及び陽性対照である。
それぞれのクラスタは、6個のスポットを含む。4つの左のスポットにおいて、ライブラリーからの4つのクローンを、「変異体-標的」酵母と交配させる(H10、H11及びH12を除く：異なる強度の陰性及び陽性対照)。右上のスポットにおいて、実施例5の表VIIに記載される6つの変異体の1つを発現する酵母株を、対照として「変異体-標的」酵母と交配させる。右下のスポットは、異なる強度の陰性及び陽性対照である。
- 図13は、IL2RG3標的の切断を示す。実施例7に記載される部位特異的突然変異誘発によりIL2RG3.4標的を切断する変異体から導かれる最適化変異体のスクリーニングの例。この例において、丸で囲むスポットは：
- A3：.4_R1及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- A5：.4_R2及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- G8：.4_R3及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- H3：.4_R0及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- A3：.4_R1及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- A5：.4_R2及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- G8：.4_R3及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- H3：.4_R0及び.3_R17により形成されるヘテロ二量体のIL2RG3標的(表Xに従う)に対するスクリーニング結果。
- 図14は、pCLS1058プラスミドマップを表す。
- 図15は、pCLS1069プラスミドマップを表す。
- 図16は、IL2RG3.4を切断する変異体のランダム突然変異誘発による洗練と、CHO細胞におけるIL2RG3標的の切断を示す。IL2RG3標的に対するCHOアッセイにおける実施例8に記載される変異体についてのOD値。灰色のバーは、洗練変異体を.3_R17 (26R 31R 33H 44K 54L 68Y 70S 75E 77V 139R I-CreI変異体)と同時発現させたヘテロ二量体からなり、黒色のバーは、洗練変異体のみを含有するホモ二量体である。空のpCLS1069ベクター及びpCLS1069にクローニングされたI-CreI N75は、陰性対照として用いる。
- 図15は、pCLS1069プラスミドマップを表す。
- 図16は、IL2RG3.4を切断する変異体のランダム突然変異誘発による洗練と、CHO細胞におけるIL2RG3標的の切断を示す。IL2RG3標的に対するCHOアッセイにおける実施例8に記載される変異体についてのOD値。灰色のバーは、洗練変異体を.3_R17 (26R 31R 33H 44K 54L 68Y 70S 75E 77V 139R I-CreI変異体)と同時発現させたヘテロ二量体からなり、黒色のバーは、洗練変異体のみを含有するホモ二量体である。空のpCLS1069ベクター及びpCLS1069にクローニングされたI-CreI N75は、陰性対照として用いる。
- 図17は、CHO細胞でのIL2RG3標的切断を示す。実施例9に記載されるIL2RG3標的に対する最大値を示すヘテロ二量体についてのCHOアッセイの結果。明示(revelation)の時間経過(OD値は、3回明示する：溶解/明示バッファーを加えた1時間後(白色のバー)、2時間後(灰色のバー)及び3時間後(黒色のバー))。I-CreI N75及び空のベクターを、陰性対照として用いる。pCLS1058にクローニングされたI-SceI標的のI-SceI切断を陽性対照として用いる。
- 図18は、ヒトIL2RG遺伝子で見出されるメガヌクレアーゼ標的配列と、該DNA標的を切断できるI-CreI変異型の例を表す。変異型の例(第1及び第2のI-CreI単量体により形成されるヘテロ二量体)を、それぞれの標的について示す。標的配列に最も近いエキソン及びエキソン接合部を示し(1列及び2列)、DNA標的の配列(3列)を、配列番号3を参照にしてその最初のヌクレオチドの位置を用いて(4列)示す。標的部位での切断を修復する最小修復マトリクスを、その最初のヌクレオチド(始点、7列)及び最後のヌクレオチド(終点、8列)で示す。それぞれのI-CreI変異型の配列を、記載される位置での変異残基で規定する。例えば、図18の最初のヘテロ二量体変異型は、33位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれT、Q、N、Y、S、Y及びQを有する第1単量体と、28位、38位、40位、44位、68位、70位及び75位にそれぞれS、R、K、D、N、S及びNを有する第2単量体とからなる。位置は、I-CreIの配列である配列番号1を参照にして示す。I-CreIは、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれK、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D及びIを有する。
- 図19は、SCID-X1患者で見出されるいくつかの変異を示す。
- 図20は、酵母でのIL2RG3標的の切断を示す。IL2RG3.4を切断するM1変異体に由来するI-CreI最適化変異体のシリーズ(.4_R5、.4_R9及びM1_24V)を、酵母において、IL2RG3.3を切断する洗練変異体(.3_R17、.3_R25及び.3_R28)とともに同時発現させる。切断を、IL2RG3標的に対して試験する。暗い着色の濃さが、切断効率に比例する。6スポットのそれぞれのクラスタにおいて、図23の見取図で示すように(E列)、2つの右の点は陽性及び陰性対照である。
- 図21は、pCLS1768プラスミドマップを表す。
- 図20は、酵母でのIL2RG3標的の切断を示す。IL2RG3.4を切断するM1変異体に由来するI-CreI最適化変異体のシリーズ(.4_R5、.4_R9及びM1_24V)を、酵母において、IL2RG3.3を切断する洗練変異体(.3_R17、.3_R25及び.3_R28)とともに同時発現させる。切断を、IL2RG3標的に対して試験する。暗い着色の濃さが、切断効率に比例する。6スポットのそれぞれのクラスタにおいて、図23の見取図で示すように(E列)、2つの右の点は陽性及び陰性対照である。
- 図21は、pCLS1768プラスミドマップを表す。
- 図22は、染色体外アッセイを用いたCHO K1細胞におけるIL2RG3標的の切断を示す。実施例10に記載される、IL2RG3標的に対して強い切断活性を示すヘテロ二量体についてのCHOアッセイの結果。明示の時間経過(OD値は3回明示する：溶解/明示バッファーを加えた1時間後(白色のバー)、2時間後(灰色のバー)及び3時間後(黒色のバー))。I-CreI N75、I-SceI及び空のベクターを、対照として用いる。
- 図23は、酵母でのIL2RG3標的の切断の例を示す。実施例11に記載されるアミノ酸置換を有するM1_24Vを発現する酵母クローンを、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) .3_R17又は.3_R28 I-CreI変異体(表IXに従う)を発現する酵母株と交配させる。それぞれのクラスタにおいて、組み合わせは次のとおりである。レーンAにおいて：IL2RG3標的を含有し.3_R28 I-CreI変異体を発現する酵母株。レーンBにおいて：IL2RG3標的を含有し.3_R17 I-CreI変異体を発現する酵母株。列Cにおいて：実施例11に記載されるアミノ酸置換を有するM1_24V I-CreI変異体を発現する酵母クローン。列Dにおいて：M1_24V I-CreI変異体を発現する酵母クローン。列Eにおいて：陽性及び陰性対照を有する酵母クローン。
- 図24は、ヒトIL2RG遺伝子を標的にするためのエキソンノックインベクターの設計を表す。ヒトIL2RG遺伝子の構造を示す。遺伝子ターゲティングマトリクスを記載する。LH及びRHは、相同な左及び右の腕に相当する。Neoは、ネオマイシンCDSに相当する。pEF1αHSV TK pA：ネガティブ選択カセット。BGHpA：BGHポリアデニル化シグナル。I-SceI +：フォワード方向でのI-SceI切断部位。I-SceI -：リバース方向でのI-SceI切断部位。pCLS1976において、ヌクレオチドの3%の異種構造がcDNAエキソン5〜8に導入された。
- 図25は、pCLS2037プラスミドマップを表す。
- 図26は、IL2C_P標的に対する5AGG_Pカッターの酵母スクリーニングを表す。変異体は、クラスタの左上のドットにある。2つの右のドットは、実験上の内部対照である。さらなる研究のために選択された3つのクローンに丸を付す。
- 図27は、SeqLib1ライブラリーに属する変異体のIL2RG3.4標的に対する1次スクリーニングの例を表す。列及び行はそれぞれ、1〜12及びA〜Hで示す。それぞれの6ドット酵母クラスタにおいて、4つのSeqLib1変異体をIL2RG3.4標的に対してスクリーニングする。2つの右のドットは、クラスタ内部対照である。H10、H11及びH12も実験上の対照である。陽性クローンに丸を付す。
- 図26は、IL2C_P標的に対する5AGG_Pカッターの酵母スクリーニングを表す。変異体は、クラスタの左上のドットにある。2つの右のドットは、実験上の内部対照である。さらなる研究のために選択された3つのクローンに丸を付す。
- 図27は、SeqLib1ライブラリーに属する変異体のIL2RG3.4標的に対する1次スクリーニングの例を表す。列及び行はそれぞれ、1〜12及びA〜Hで示す。それぞれの6ドット酵母クラスタにおいて、4つのSeqLib1変異体をIL2RG3.4標的に対してスクリーニングする。2つの右のドットは、クラスタ内部対照である。H10、H11及びH12も実験上の対照である。陽性クローンに丸を付す。
- 図28は、IL2RG3.4及びIL2RG3.6標的に対する3つの変異体Amel1〜Amel3の切断活性を表す。それぞれの6ドット酵母クラスタにおいて、同じ変異体を同じ標的に対して4回スクリーニングする(4つの左のドット)。右上のドットはSeq4変異体であり、右下のドットは実験上の内部対照である。
実施例1：ヒトIL2RG遺伝子を切断する新規なメガヌクレアーゼを工学的に作製するためのストラテジー
Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781に記載され、図2Dに説明されるコンビナトリアルアプローチを用いて、I-CreIのDNA結合ドメインを工学的に操作し、IL2RG3と呼ばれ、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4の1686位に位置する22 bp配列(非パリンドローム)を切断した(図3及び4)。IL2RG3配列を切断するメガヌクレアーゼを用いて、エキソン4内の変異を修正することができるだろう(図1A)。或いは、IL2RG3配列を切断するメガヌクレアーゼを用いて、機能的IL2RG遺伝子をIL2RG遺伝子座にて回復するエキソン配列をノックインできるだろう(図1B)。このストラテジーは、切断部位の下流に位置するいずれの変異にも用いることができる。
Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149並びに国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781に記載され、図2Dに説明されるコンビナトリアルアプローチを用いて、I-CreIのDNA結合ドメインを工学的に操作し、IL2RG3と呼ばれ、ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4の1686位に位置する22 bp配列(非パリンドローム)を切断した(図3及び4)。IL2RG3配列を切断するメガヌクレアーゼを用いて、エキソン4内の変異を修正することができるだろう(図1A)。或いは、IL2RG3配列を切断するメガヌクレアーゼを用いて、機能的IL2RG遺伝子をIL2RG遺伝子座にて回復するエキソン配列をノックインできるだろう(図1B)。このストラテジーは、切断部位の下流に位置するいずれの変異にも用いることができる。
IL2RG3配列は、部分的に、10GAC_P、10GAA_P及び5CTG_Pと5AGG_P標的のパッチワークであり(図4)、これらの標的は、国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/049156及びWO 2007/060495; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458並びにSmithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149に記載されるようにして得られた、以前に同定されたメガヌクレアーゼにより切断される。よって、IL2RG3は、これらの4つの標的を切断するI-CreI誘導体で見出される変異を組み合わせたメガヌクレアーゼにより切断できる。
10GAC_P、10GAA_P、5CTG_P及び5AGG_P配列は、I-CreIにより切断されるパリンドローム配列であるC1221の24 bp誘導体である(国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/049156及びWO 2007/060495; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458及びSmithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。しかし、そのDNA標的と結合したI-CreIの構造は、これらの標的の2つの外側の塩基対(-12位及び12位)が、結合及び切断に対して影響しないことを示唆するので(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びStoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3754; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、本研究においては、-11位〜11位のみを考慮した。よって、標的のIL2RG3シリーズを、24 bpではなく22 bp配列として規定した。
IL2RG3は、C1221とは、4 bpの中央領域のうち3つが異なる。その標的と結合したI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びStoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3754; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。つまり、これらの位置の塩基は、結合効率に影響するとは考えられない。しかし、これらは切断に影響する可能性があり、このことは、この領域の端での2つのニックをもたらす。よって、-2位〜2位のTCTC配列を、まず、C1221からのGTAC配列で置換して標的IL2RG3.2を得た(図4)。次いで、2つのパリンドローム標的であるIL2RG3.3及びIL2RG3.4を、IL2RG3.2から導いた。IL2RG3.3及びIL2RG3.4はパリンドロームであるので、これらはホモ二量体タンパク質により切断されるはずである。よって、IL2RG3.3及びIL2RG3.4配列をホモ二量体として切断できるタンパク質を、まず設計し(実施例2及び3)、次いで、同時発現させて、IL2RG3.2を切断するヘテロ二量体を得た(実施例4)。1つのヘテロ二量体は、IL2RG3を切断できたが、非常に低い切断活性であった。IL2RG3.3を切断する一連の変異体を選択し、次いで洗練した。選択された変異体に、ランダム及び部位特異的に突然変異を誘発し、IL2RG3.4を切断する変異体とともに新規なヘテロ二量体を形成するために用いた。ヘテロ二量体を、IL2RG3標的に対してスクリーニングし(実施例5及び6)、著しい切断活性を示すIL2RG3標的を切断するヘテロ二量体を同定できた。次いで、IL2RG3.4標的を切断する変異体も洗練し、IL2RG3.3を切断する洗練変異体との新規なヘテロ二量体を形成するために用いた(実施例7、8、10及び11)。
最後に、ヘテロ二量体を、IL2RG3標的に対して、CHO細胞での一本鎖アニーリング(SSA)に基づく染色体外アッセイでスクリーニングした(実施例9)。I-CreI変異体のいくつかの組み合わせは、同じアッセイにおけるI-SceI標的に対するI-SceIの活性に匹敵する、IL2RG3標的の非常に高い切断活性を示した。
実施例2：IL2RG3.3を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のIL2RG3標的の左部分に由来するIL2RG3.3 DNA標的配列を切断できることを示す(図4)。この実施例で記載される標的配列は、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらを、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、標的IL2RG3.3は、cgacctctggt_P (配列番号13)とも記載される。
この実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のIL2RG3標的の左部分に由来するIL2RG3.3 DNA標的配列を切断できることを示す(図4)。この実施例で記載される標的配列は、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらを、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、標的IL2RG3.3は、cgacctctggt_P (配列番号13)とも記載される。
IL2RG3.3は、5CTG_Pと、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位、±9位及び±11位にて類似し、10GAC_Pと、±1位、±2位、±4位、±8位、±9位、±10位及び±11位にて類似する。±6位及び±7位は結合及び切断活性に対してほとんど影響しないであろうと仮定した。5CTG_P (caaaacctggt_P; 配列番号10)を切断できる変異体は、I-CreI N75に対する24位、42位、44位、68位、70位、75位及び77位での突然変異誘発により、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149;国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156に記載されるようにして得た。10GAC_P標的(cgacacgtcgt_P; 配列番号15)を切断できる変異体は、I-CreI N75に対する28位、33位、38位、40位及び70位での突然変異誘発により、Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156に記載されるようにして得た。
タンパク質の両方の組は、70位にて変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインが存在すると仮定した。このことは、この位置が、標的の塩基10〜8における特異性に対してほとんど影響しないことを意味する。5CTG_P標的を切断する変異体で見出される24位及び42位に対する変異は、コンビナトリアルプロセスの間に失われる。しかし、組み合わせた変異体がIL2RG3.3標的を切断する能力に対してこのことはほとんど影響しないと仮定した。
よって、組み合わせた変異体がIL2RG3.3標的を切断できるかを調べるために、5CTG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAC_Pを切断するタンパク質からの28、33、38及び40変異と組み合わせた。
よって、組み合わせた変異体がIL2RG3.3標的を切断できるかを調べるために、5CTG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAC_Pを切断するタンパク質からの28、33、38及び40変異と組み合わせた。
1) 材料及び方法
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いられる哺乳類又は酵母細胞での切断誘発組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載される。これらのアッセイは、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは、標準的な方法によりモニターできる。
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いられる哺乳類又は酵母細胞での切断誘発組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載される。これらのアッセイは、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは、標準的な方法によりモニターできる。
a) 標的ベクターの構築
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOに注文した：5'tggcatacaagtttcgacctctggtaccagaggtcgacaatcgtctgtca3' (配列番号16)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母レポーターベクター(pCLS1055、図5)にクローニングした。酵母レポーターベクターで、サッカロミセス・セレビシエFYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOに注文した：5'tggcatacaagtttcgacctctggtaccagaggtcgacaatcgtctgtca3' (配列番号16)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母レポーターベクター(pCLS1055、図5)にクローニングした。酵母レポーターベクターで、サッカロミセス・セレビシエFYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
b) コンビナトリアル変異体の構築
10GAC_P又は5CTG_Pを切断するI-CreI変異体を、10GAC_P及び5CTG_P標的についてそれぞれ、Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156、並びにArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853に記載されるようにして同定した。両方のシリーズからの変異を含むI-CreI由来コード配列を作製するために、別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreIコード配列の5'末端(aa 1位〜43位)又は3'末端(39位〜167位)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542, 図6)に特異的なプライマーGal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号18)と、アミノ酸39〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマーassF 5'-ctannnttgaccttt-3' (配列番号19)又はassR 5'-aaaggtcaannntag-3'(配列番号20) (ここで、nnnは残基40をコードする)とを用いて行う。同じプライマーと残基40について同じコード配列とを用いて行った増幅反応により得られるPCRフラグメントを、プールした。次いで、プライマーGal10FとassR、又はassFとGal10Rを用いる反応により得られるPCRフラグメントのそれぞれのプールを、等モル比で混合した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれの最終プールおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leuΔ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。両方の群の変異を含有するインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
10GAC_P又は5CTG_Pを切断するI-CreI変異体を、10GAC_P及び5CTG_P標的についてそれぞれ、Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156、並びにArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853に記載されるようにして同定した。両方のシリーズからの変異を含むI-CreI由来コード配列を作製するために、別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreIコード配列の5'末端(aa 1位〜43位)又は3'末端(39位〜167位)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542, 図6)に特異的なプライマーGal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号18)と、アミノ酸39〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマーassF 5'-ctannnttgaccttt-3' (配列番号19)又はassR 5'-aaaggtcaannntag-3'(配列番号20) (ここで、nnnは残基40をコードする)とを用いて行う。同じプライマーと残基40について同じコード配列とを用いて行った増幅反応により得られるPCRフラグメントを、プールした。次いで、プライマーGal10FとassR、又はassFとGal10Rを用いる反応により得られるPCRフラグメントのそれぞれのプールを、等モル比で混合した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれの最終プールおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leuΔ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。両方の群の変異を含有するインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
c) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
スクリーニングは、以前に記載されたようにして行った(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(low gridding density) (約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを保持する酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシンとトリプトファンを欠き、ガラクトース(1%)を炭素源として有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含有する固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、適切なソフトウェアを用いて定量を行った。
スクリーニングは、以前に記載されたようにして行った(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(low gridding density) (約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを保持する酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシンとトリプトファンを欠き、ガラクトース(1%)を炭素源として有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含有する固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、適切なソフトウェアを用いて定量を行った。
d) 変異体の配列決定
変異体発現プラスミドを回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために用いた。変異ORFの配列決定を、次いで、プラスミド上でMILLEGEN SAにより行った。或いは、ORFを、酵母DNAからPCRにより増幅し(Akadaら, Biotechniques, 2000, 28, 668〜670)、配列決定を、PCR生成物に対して直接、MILLEGEN SAにより行った。
変異体発現プラスミドを回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために用いた。変異ORFの配列決定を、次いで、プラスミド上でMILLEGEN SAにより行った。或いは、ORFを、酵母DNAからPCRにより増幅し(Akadaら, Biotechniques, 2000, 28, 668〜670)、配列決定を、PCR生成物に対して直接、MILLEGEN SAにより行った。
2) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、5CTG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAC_Pを切断するタンパク質からの28、33、38及び40変異と、I-CreI足場上で組み合わせることにより構築して、264の複雑さ(complexity)のライブラリーを得た。組み合わせを表IIに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、864クローン(多様性の3.3倍)を、IL2RG3.3 DNA標的(cgacctctggt_P; 配列番号13)に対する切断についてスクリーニングした。合計で14個の陽性クローンが見出され、陽性の例を図7に示す。
I-CreIコンビナトリアル変異体を、5CTG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAC_Pを切断するタンパク質からの28、33、38及び40変異と、I-CreI足場上で組み合わせることにより構築して、264の複雑さ(complexity)のライブラリーを得た。組み合わせを表IIに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、864クローン(多様性の3.3倍)を、IL2RG3.3 DNA標的(cgacctctggt_P; 配列番号13)に対する切断についてスクリーニングした。合計で14個の陽性クローンが見出され、陽性の例を図7に示す。
それぞれの陽性酵母株は、いくつかのI-CreIコンビナトリアル変異体を発現し得る。変異体発現プラスミドを陽性クローンから回収し、大腸菌を形質転換するために用いた。それぞれについて3つのクローンを配列決定し、酵母を再形質転換して、それぞれのモノクローナル変異体を発現する酵母株による標的の切断を確認した。
スクリーニング及び変異体メガヌクレアーゼORFの配列決定による確認の後に、14個の陽性クローンが、IL2RG3.3標的を切断する20個の新規なエンドヌクレアーゼに相当することがわかった(m1〜m20と命名；それぞれ配列番号48、115、49〜65)。5つは、予測された変異体の組み合わせに相当する(表II)。他の15は、付加的な変異も同定されたI-CreI組み合わせ変異体である。このような変異体は、コンビナトリアルプロセスの間のPCRアーチファクトに起因するようである(材料及び方法を参照)。或いは、付加的な変異を有する変異体は、酵母でのインビボ相同組換え中の2つの元来の変異体同士のマイクロ組換え(micro recombination)に起因するI-CreI組み合わせ変異体であろう(表III)。
スクリーニング及び変異体メガヌクレアーゼORFの配列決定による確認の後に、14個の陽性クローンが、IL2RG3.3標的を切断する20個の新規なエンドヌクレアーゼに相当することがわかった(m1〜m20と命名；それぞれ配列番号48、115、49〜65)。5つは、予測された変異体の組み合わせに相当する(表II)。他の15は、付加的な変異も同定されたI-CreI組み合わせ変異体である。このような変異体は、コンビナトリアルプロセスの間のPCRアーチファクトに起因するようである(材料及び方法を参照)。或いは、付加的な変異を有する変異体は、酵母でのインビボ相同組換え中の2つの元来の変異体同士のマイクロ組換え(micro recombination)に起因するI-CreI組み合わせ変異体であろう(表III)。
実施例3：IL2RG3.4を切断するメガヌクレアーゼの作製
この実施例は、I-CreI変異型が、パリンドローム形のIL2RG3標的の右部分に由来するIL2RG3.4 DNA標的を切断できることを示す(図4)。この実施例で記載される標的配列は全て、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、IL2RG3.4は、tgaaccagggt_P (配列番号14)ともよばれる。
この実施例は、I-CreI変異型が、パリンドローム形のIL2RG3標的の右部分に由来するIL2RG3.4 DNA標的を切断できることを示す(図4)。この実施例で記載される標的配列は全て、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11ヌクレオチドと、それに続く接尾辞_Pによってのみ記載する。例えば、IL2RG3.4は、tgaaccagggt_P (配列番号14)ともよばれる。
IL2RG3.4は、5AGG_Pと、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位、±6位、±8位及び±9にて類似し、10GAA_Pと、±1位、±2位、±6位、±8位、±9位及び±10位にて類似する。±7位及び±11位は結合及び切断活性に対してほとんど影響しないであろうと仮定した。5AGG_Pを切断できる変異体は、I-CreI N75に対する24位、44位、68位、70位、75位及び77位での突然変異誘発により、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156に記載されるようにして得た。10GAA_P標的を切断できる変異体は、I-CreI N75及びD75に対する30位、32位、33位、38位及び40位での突然変異誘発により、Smithら Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156に記載されるようにして得た。5AGG_P 標的を切断する変異体で見出される24位での変異は、コンビナトリアルプロセスの間に失われる。しかし、組み合わせた変異体がIL2RG3.4標的を切断する能力に対してこのことはほとんど影響しないと仮定した。
組み合わせた変異体がIL2RG3.4標的を切断できるかを調べるために、5AGG_P (caaaacagggt_P)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAA_P (cgaaacgtcgt_P)を切断するタンパク質からの30、32、33、38及び40変異と組み合わせた。
組み合わせた変異体がIL2RG3.4標的を切断できるかを調べるために、5AGG_P (caaaacagggt_P)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAA_P (cgaaacgtcgt_P)を切断するタンパク質からの30、32、33、38及び40変異と組み合わせた。
1) 材料及び方法
実験手順は、実施例2に記載されるとおりである。
実験手順は、実施例2に記載されるとおりである。
2) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、5AGG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAA_Pを切断するタンパク質からの30、32、33、38及び40変異と、I-CreI足場上で組み合わせることにより構築して、4160の複雑さのライブラリーを得た。コンビナトリアル変異体の例を、表IVに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、8064クローン(多様性の1.9倍)を、IL2RG3.4 DNA標的 (tgaaccagggt_P)に対する切断についてスクリーニングした。3つの陽性クローンが見出され(2つの強いカッター及び1つの弱いカッター)、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認(実施例2のように)の後に、2つの異なる新規なエンドヌクレアーゼ：M1 (配列番号45)及びM2 (配列番号66)に相当することがわかった(表V)。M1によるIL2RG3.4標的の切断を図8に示す。2つの新規なメガヌクレアーゼは、酵母でのインビボ相同組換え中の2つの元来の変異体同士のマイクロ組換えに起因するI-CreI組み合わせ変異体である。そして、M2は、おそらくコンビナトリアルプロセスの間のPCRアーチファクトに起因するであろう付加的な変異(54L)を有する。
I-CreIコンビナトリアル変異体を、5AGG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAA_Pを切断するタンパク質からの30、32、33、38及び40変異と、I-CreI足場上で組み合わせることにより構築して、4160の複雑さのライブラリーを得た。コンビナトリアル変異体の例を、表IVに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、8064クローン(多様性の1.9倍)を、IL2RG3.4 DNA標的 (tgaaccagggt_P)に対する切断についてスクリーニングした。3つの陽性クローンが見出され(2つの強いカッター及び1つの弱いカッター)、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認(実施例2のように)の後に、2つの異なる新規なエンドヌクレアーゼ：M1 (配列番号45)及びM2 (配列番号66)に相当することがわかった(表V)。M1によるIL2RG3.4標的の切断を図8に示す。2つの新規なメガヌクレアーゼは、酵母でのインビボ相同組換え中の2つの元来の変異体同士のマイクロ組換えに起因するI-CreI組み合わせ変異体である。そして、M2は、おそらくコンビナトリアルプロセスの間のPCRアーチファクトに起因するであろう付加的な変異(54L)を有する。
実施例4：IL2RG3.2を切断するメガヌクレアーゼの作製
それぞれのパリンドロームのIL2RG3由来標的(IL2RG3.3及びIL2RG3.4)を切断できるI-CreI 変異体を、実施例2及び3で同定した。このような変異体の対(IL2RG3.3を切断するものとIL2RG3.4を切断するもの)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモ二量体と、1つのヘテロ二量体とが存在するはずである。形成されるはずのヘテロ二量体が、非パリンドロームのIL2RG3及びIL2RG3.2 DNA標的を切断するかをアッセイした。
それぞれのパリンドロームのIL2RG3由来標的(IL2RG3.3及びIL2RG3.4)を切断できるI-CreI 変異体を、実施例2及び3で同定した。このような変異体の対(IL2RG3.3を切断するものとIL2RG3.4を切断するもの)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモ二量体と、1つのヘテロ二量体とが存在するはずである。形成されるはずのヘテロ二量体が、非パリンドロームのIL2RG3及びIL2RG3.2 DNA標的を切断するかをアッセイした。
1) 材料及び方法
a) カナマイシン耐性ベクターでの変異体のクローニング
2つのI-CreI変異体を酵母で同時発現させるために、IL2RG3.3配列を切断する変異体を、カナマイシン耐性遺伝子をマーカーとして有する酵母発現ベクター(pCLS1107, 図9)にサブクローニングした。変異体を、PCR反応により、ベクターpCLS0542及びpCLS1107に共通のプライマーを用いて増幅した(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)及びGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号18)。およそ25 ngのPCRフラグメントと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした25 ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
a) カナマイシン耐性ベクターでの変異体のクローニング
2つのI-CreI変異体を酵母で同時発現させるために、IL2RG3.3配列を切断する変異体を、カナマイシン耐性遺伝子をマーカーとして有する酵母発現ベクター(pCLS1107, 図9)にサブクローニングした。変異体を、PCR反応により、ベクターpCLS0542及びpCLS1107に共通のプライマーを用いて増幅した(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)及びGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号18)。およそ25 ngのPCRフラグメントと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした25 ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
ベクターpCLS1107にサブクローニングされたIL2RG3.3標的を切断する変異体を含有するそれぞれの酵母株を、次いで、IL2RG3.3標的を発現する酵母と交配させて、これを確認した。プラスミドを発現する変異体を回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出した。次いで、大腸菌を酵母DNAで形質転換して、細菌DNAを調製した。
b) 変異体同時発現
pCLS0542発現ベクター中のIL2RG3.4標的を切断する変異体を発現する酵母株を、pCLS1107発現ベクター中のIL2RG3.3標的を切断する変異体をコードするDNAで形質転換した。形質転換体を、G418を含有する-L Glu培地で選択した。
pCLS0542発現ベクター中のIL2RG3.4標的を切断する変異体を発現する酵母株を、pCLS1107発現ベクター中のIL2RG3.3標的を切断する変異体をコードするDNAで形質転換した。形質転換体を、G418を含有する-L Glu培地で選択した。
c) メガヌクレアーゼ同時発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを保持する酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、G418を加え、ガラクトース(1%)を炭素源として有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含有する固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、適切なソフトウェアを用いて定量を行った。
交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。2回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを保持する酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして、交配を可能にした。次いで、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、G418を加え、ガラクトース(1%)を炭素源として有する合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含有する固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、適切なソフトウェアを用いて定量を行った。
2) 結果
IL2RG3.3標的を切断する変異体(表II及びIIIに記載する17個の選択された変異体)と、IL2RG3.4標的を切断する2つの変異体(表Vに記載する)との同時発現は、全ての場合においてIL2RG3.2標的の効率的な切断をもたらした(スクリーニングの例は図10Aに示す)。試験した全ての組み合わせを表VIにまとめる。しかし、これらの組み合わせのうち1つだけが、IL2RG3天然標的を非常に弱く切断できる(図10B及び表VI)。IL2RG3は、IL2RG3.2配列とは、-2位、-1位及び1位の3 bpだけが異なる(図4)。
IL2RG3.3標的を切断する変異体(表II及びIIIに記載する17個の選択された変異体)と、IL2RG3.4標的を切断する2つの変異体(表Vに記載する)との同時発現は、全ての場合においてIL2RG3.2標的の効率的な切断をもたらした(スクリーニングの例は図10Aに示す)。試験した全ての組み合わせを表VIにまとめる。しかし、これらの組み合わせのうち1つだけが、IL2RG3天然標的を非常に弱く切断できる(図10B及び表VI)。IL2RG3は、IL2RG3.2配列とは、-2位、-1位及び1位の3 bpだけが異なる(図4)。
実施例5：IL2RG3.3を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びIL2RG3.4を切断するタンパク質との組み立てによる、IL2RG3を切断するメガヌクレアーゼの作製
非パリンドロームのIL2RG3.2標的を切断できるI-CreI変異体は、パリンドロームのIL2RG3.3及びIL2RG3.4標的を切断する変異体の組み立てにより以前に同定された。しかし、これらの組み合わせのいずれも、IL2RG3.2とは-2位、-1位及び1位の3 bpのみが異なるIL2RG3を効率的に切断できなかった。変異体の組み合わせの1つについて観察された弱いシグナルは、充分でなかった。
非パリンドロームのIL2RG3.2標的を切断できるI-CreI変異体は、パリンドロームのIL2RG3.3及びIL2RG3.4標的を切断する変異体の組み立てにより以前に同定された。しかし、これらの組み合わせのいずれも、IL2RG3.2とは-2位、-1位及び1位の3 bpのみが異なるIL2RG3を効率的に切断できなかった。変異体の組み合わせの1つについて観察された弱いシグナルは、充分でなかった。
よって、IL2RG3.2を切断するタンパク質の組み合わせに突然変異を誘発し、IL2RG3を効率的に切断する変異型をスクリーニングした。その標的と結合したI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びStoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3754; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。よって、突然変異を誘発する位置の組を合理的に選択することは困難であり、突然変異誘発をタンパク質のC-末端部分(最後の83アミノ酸)又はタンパク質全体に対して行った。ランダム突然変異誘発は、高い複雑さのライブラリーをもたらし、試験した変異型ライブラリーの複雑さは、IL2RG3.2を切断するヘテロ二量体の2つの成分のうちの1つのみに対して突然変異を誘発することにより制限した。
よって、IL2RG3.3を切断するタンパク質に突然変異を誘発し、IL2RG3.4を切断するタンパク質と同時発現させたときに、これらがIL2RG3を効率的に切断できるかを試験した。
1) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発を、選択された変異体のプールに対して、Mn2+を用いるPCR、又はJBS dNTP-突然変異誘発キット中のJENA BIOSCIENCE GmbHからのプロトコルに記載されるようにして、8-オキソ-dGTP及びdPTPのようなdNTP誘導体を用いる2ステップPCRにより、創出した。
タンパク質全体に対するランダム突然変異誘発のために用いたプライマーは、preATGCreFor (5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3'; 配列番号21)及びICreIpostRev (5'- ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc -3'; 配列番号22)であった。タンパク質のC-末端部分に対するランダム突然変異誘発のために用いたプライマーは、AA78a83For (5'-ttaagcgaaatcaagccg-3'; 配列番号23)及びICreIpostRevとdNTP誘導体であった。タンパク質の残りの部分は、高忠実度taqポリメラーゼを用い、dNTP誘導体を用いずに、プライマーpreATGCreFor及びAA78a83Rev (5'-cggcttgatttcgcttaa-3'; 配列番号24)を用いて増幅する。
a) ランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発を、選択された変異体のプールに対して、Mn2+を用いるPCR、又はJBS dNTP-突然変異誘発キット中のJENA BIOSCIENCE GmbHからのプロトコルに記載されるようにして、8-オキソ-dGTP及びdPTPのようなdNTP誘導体を用いる2ステップPCRにより、創出した。
タンパク質全体に対するランダム突然変異誘発のために用いたプライマーは、preATGCreFor (5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3'; 配列番号21)及びICreIpostRev (5'- ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc -3'; 配列番号22)であった。タンパク質のC-末端部分に対するランダム突然変異誘発のために用いたプライマーは、AA78a83For (5'-ttaagcgaaatcaagccg-3'; 配列番号23)及びICreIpostRevとdNTP誘導体であった。タンパク質の残りの部分は、高忠実度taqポリメラーゼを用い、dNTP誘導体を用いずに、プライマーpreATGCreFor及びAA78a83Rev (5'-cggcttgatttcgcttaa-3'; 配列番号24)を用いて増幅する。
変異体のプールを、pCLS0542 (図6)及びpCLS1107 (図9)ベクターに共通のこれらのプライマーを用いるPCR反応により増幅した。およそ75 ngのPCRフラグメントと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107)を用いて酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列のライブラリーを、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。陽性をもたらすクローンを、配列決定(MILLEGEN)により確認した。
b) IL2RG3標的を含有する酵母株でのベクターpCLS0542中の変異体のクローニング
酵母レポーターベクター(pCLS1055、図5)中にIL2RG3標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、pCLS0542ベクター中のIL2RG3.4標的を切断する変異体で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。変異体-標的酵母を、実施例4に記載される交配アッセイの標的として用いる。
酵母レポーターベクター(pCLS1055、図5)中にIL2RG3標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、pCLS0542ベクター中のIL2RG3.4標的を切断する変異体で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。変異体-標的酵母を、実施例4に記載される交配アッセイの標的として用いる。
2) 結果
IL2RG3.4標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成するときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI変異体を、同定した。
IL2RG3.3を切断する8つの変異体(m1 / m3 / m7 / m10 / m14 / m17 / m18 / m19、表II及びIIIに従う)をプールし、タンパク質全体又はタンパク質のC-末端部分に対してランダム突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。8928個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) 実施例3に記載されるIL2RG3.4標的を切断する変異型であるM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)を発現する酵母株と交配させた。表VIIに記載される6クローン(配列番号67〜72)が、このような酵母株と交配させたときに、IL2RG3標的の切断を引き起こすことがわかった。
IL2RG3.4標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成するときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI変異体を、同定した。
IL2RG3.3を切断する8つの変異体(m1 / m3 / m7 / m10 / m14 / m17 / m18 / m19、表II及びIIIに従う)をプールし、タンパク質全体又はタンパク質のC-末端部分に対してランダム突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。8928個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) 実施例3に記載されるIL2RG3.4標的を切断する変異型であるM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)を発現する酵母株と交配させた。表VIIに記載される6クローン(配列番号67〜72)が、このような酵母株と交配させたときに、IL2RG3標的の切断を引き起こすことがわかった。
これらの6つの最適化クローンを、2回目の最適化に供した。これらをプールし、タンパク質全体又はタンパク質のC-末端部分に対してランダムに突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。4464個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) 実施例3に記載されるIL2RG3.4標的を切断する変異型であるM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)を発現する酵母株と交配させた。102個のクローンが、このような酵母株と交配させたときに、IL2RG3標的の効率的な切断を引き起こすことがわかった。陽性の例を図11に示す。
M1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を切断する11個の最良のI-CreI変異体(配列番号73〜83)の配列を、表VIIIに列挙する。
実施例6：IL2RG3.3を切断するタンパク質の部位特異的突然変異誘発及びIL2RG3.4を切断するタンパク質との組み立てによるIL2RG3を切断するメガヌクレアーゼの作製
表II、III及びVIIに記載される、IL2RG3.3を切断する元のかつ最適化されたI-CreI変異体(1回目)を、タンパク質中に選択されたアミノ酸置換を導入することにより突然変異を誘発し、実施例3で同定されたIL2RG3.4を切断するM1変異体との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型をスクリーニングした。
表II、III及びVIIに記載される、IL2RG3.3を切断する元のかつ最適化されたI-CreI変異体(1回目)を、タンパク質中に選択されたアミノ酸置換を導入することにより突然変異を誘発し、実施例3で同定されたIL2RG3.4を切断するM1変異体との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型をスクリーニングした。
5つのアミノ酸置換が、以前の研究で、I-CreI誘導体の活性を増強することが見出されている。これらの変異は、グリシン19のセリンでの置き換え(G19S)、フェニルアラニン54のロイシンでの置き換え(F54L)、フェニルアラニン87のロイシンでの置き換え(F87L)、バリン105のアラニンでの置き換え(V105A)及びイソロイシン132のバリンでの置き換え(I132V)に相当する。これらの変異を、個別に、IL2RG3.3を切断するタンパク質のコード配列内に導入し、得られたタンパク質を、IL2RG3.4を切断する変異体との同時発現によりIL2RG3標的の切断を誘発するそれらの能力について試験した。
1) 材料及び方法
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発ライブラリーを、IL2RG3.3を切断する20個の元の変異体m1〜m20 (実施例2; 表II及びIII)、及び表VIIに記載されるIL2RG3.3を切断する6つの最適化変異体(実施例5)のプールに対するPCRにより創出した。例えば、変異体のコード配列にG19S置換を導入するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreI N75コード配列の5'末端(残基1〜24)又は3'末端(残基14〜167)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクターに相同なプライマー[Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号18)]と、G19Sの置換変異を含有するアミノ酸14〜24についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー[G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3' (配列番号25)又はG19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3'(配列番号26)]とを用いて行う。得られたPCR産物は、互いに33 bpの相同性を有する。PCRフラグメントを精製した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれおよそ25 ngと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S置換を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
1) 材料及び方法
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発ライブラリーを、IL2RG3.3を切断する20個の元の変異体m1〜m20 (実施例2; 表II及びIII)、及び表VIIに記載されるIL2RG3.3を切断する6つの最適化変異体(実施例5)のプールに対するPCRにより創出した。例えば、変異体のコード配列にG19S置換を導入するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreI N75コード配列の5'末端(残基1〜24)又は3'末端(残基14〜167)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクターに相同なプライマー[Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (配列番号18)]と、G19Sの置換変異を含有するアミノ酸14〜24についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー[G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3' (配列番号25)又はG19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3'(配列番号26)]とを用いて行う。得られたPCR産物は、互いに33 bpの相同性を有する。PCRフラグメントを精製した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれおよそ25 ngと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S置換を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
同じストラテジーを、以下のオリゴヌクレオチドの対とともに用いて、F54L、F87L、V105A及びI132V置換をそれぞれ含むその他のライブラリーを創出する：
* F54LF: 5'-acccagcgccgttggctgctggacaaactagtg-3'(配列番号27)及びF54LR: 5'-cactagtttgtccagcagccaacggcgctgggt-3'(配列番号28);
* F87LF: 5'-aagccgctgcacaacctgctgactcaactgcag-3' (配列番号29)及びF87LR: 5'-ctgcagttgagtcagcaggttgtgcagcggctt-3'(配列番号30);
* V105AF: 5'-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3' (配列番号31)及びV105AR: 5'-ttcgataattttcagagccaggtttgcctgttt-3'(配列番号32);
* I132VF: 5'-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3'(配列番号33)及びI132VR: 5'-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3'(配列番号34)。
* F54LF: 5'-acccagcgccgttggctgctggacaaactagtg-3'(配列番号27)及びF54LR: 5'-cactagtttgtccagcagccaacggcgctgggt-3'(配列番号28);
* F87LF: 5'-aagccgctgcacaacctgctgactcaactgcag-3' (配列番号29)及びF87LR: 5'-ctgcagttgagtcagcaggttgtgcagcggctt-3'(配列番号30);
* V105AF: 5'-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3' (配列番号31)及びV105AR: 5'-ttcgataattttcagagccaggtttgcctgttt-3'(配列番号32);
* I132VF: 5'-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3'(配列番号33)及びI132VR: 5'-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3'(配列番号34)。
2) 結果
5つのアミノ酸置換(グリシン19をセリンに、フェニルアラニン54をロイシンに、フェニルアラニン87をロイシンに、バリン105をアラニンに、イソロイシン132をバリンに)を含有するライブラリーを、26個のI-CreI変異体(表II、III及びVIIに記載される)のプールに対して構築した。それぞれのライブラリーについての372個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii)実施例3に記載されるIL2RG3.4標的を切断する変異型であるM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)を発現する酵母株と交配させた。
IL2RG3.4標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI変異体を同定した。
合計で123個のクローンが、このような酵母株と交配させたときにIL2RG3標的の切断を引き起こすことがわかった。陽性の例を図12に示す。
5つのアミノ酸置換(グリシン19をセリンに、フェニルアラニン54をロイシンに、フェニルアラニン87をロイシンに、バリン105をアラニンに、イソロイシン132をバリンに)を含有するライブラリーを、26個のI-CreI変異体(表II、III及びVIIに記載される)のプールに対して構築した。それぞれのライブラリーについての372個の形質転換クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii)実施例3に記載されるIL2RG3.4標的を切断する変異型であるM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)を発現する酵母株と交配させた。
IL2RG3.4標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI変異体を同定した。
合計で123個のクローンが、このような酵母株と交配させたときにIL2RG3標的の切断を引き起こすことがわかった。陽性の例を図12に示す。
M1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を切断する17個の最良のI-CreI変異体(配列番号84〜100)の配列を、表IXに列挙する。これらのI-CreI変異体は、部位特異的突然変異誘発による予測される変異体であるが、おそらくPCR反応及びライブラリーの構築のために用いたプールの2つの変異体同士のマイクロ組換えによる予期せぬ変異も含む。
実施例7：IL2RG3.4を切断する変異体の部位特異的突然変異誘発によるIL2RG3標的部位を切断するメガヌクレアーゼの洗練
IL2RG3標的を切断できるI-CreI変異体は、IL2RG3.4を切断する変異体とIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせにより以前に同定された。メガヌクレアーゼの活性を増大させるために、IL2RG3を切断するヘテロ二量体の第2成分に突然変異を誘発した。よって、IL2RG3.4を切断する変異体に突然変異を誘発し、実施例5及び6で同定されたIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせでIL2RG3をより効率的に切断する変異型をスクリーニングした。
IL2RG3標的を切断できるI-CreI変異体は、IL2RG3.4を切断する変異体とIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせにより以前に同定された。メガヌクレアーゼの活性を増大させるために、IL2RG3を切断するヘテロ二量体の第2成分に突然変異を誘発した。よって、IL2RG3.4を切断する変異体に突然変異を誘発し、実施例5及び6で同定されたIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせでIL2RG3をより効率的に切断する変異型をスクリーニングした。
2つの単独アミノ酸置換(グリシン-19のセリンでの、及びイソロイシン-132のバリンでの置換)を導入した。これらのアミノ酸置換は、I-CreI由来メガヌクレアーゼの切断活性を増大させることが以前に見出された(実施例6を参照)。変異は、IL2RG3.4標的を切断するM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に導入した。
1) 材料及び方法
a) 部位特異的突然変異誘発
G19S置換を、M1変異体コード配列(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に導入するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreIコード配列の5'末端(残基1〜24)又は3'末端(残基14〜167)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクターに相同なプライマー[Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号18)] と、G19Sの置換変異を含有するアミノ酸14〜24についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー[G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3'(配列番号25)又はG19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3'(配列番号26)] とを用いて行う。得られたPCR産物は、互いに33 bpの相同性を有する。PCRフラグメントを精製した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542) とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S置換を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
a) 部位特異的突然変異誘発
G19S置換を、M1変異体コード配列(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に導入するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreIコード配列の5'末端(残基1〜24)又は3'末端(残基14〜167)を増幅した。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクターに相同なプライマー[Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号17)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号18)] と、G19Sの置換変異を含有するアミノ酸14〜24についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー[G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3'(配列番号25)又はG19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3'(配列番号26)] とを用いて行う。得られたPCR産物は、互いに33 bpの相同性を有する。PCRフラグメントを精製した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれおよそ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542) とを用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S置換を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
同じストラテジーを用いて、I132V置換を、M1変異体コード配列(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に、オリゴヌクレオチドI132VF: 5'-acctgggtggatcaggttgcagctctgaacgat-3' (配列番号33)及びI132VR: 5'-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3' (配列番号34)を用いて導入する。
b) IL2RG3標的を含有する酵母株でのベクターpCLS1107中の変異体のクローニング
酵母レポーターベクター(pCLS1055、図5)中にIL2RG3標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、pCLS1107ベクター(図9)中の実施例5及び6で同定されたIL2RG3.3標的を切断する変異体に由来する最適化変異体(表VIII及びIX)で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。変異体-標的酵母を、実施例4に記載される交配アッセイのための標的として用いる。
酵母レポーターベクター(pCLS1055、図5)中にIL2RG3標的を含有する酵母FYBL2-7B株(MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を、pCLS1107ベクター(図9)中の実施例5及び6で同定されたIL2RG3.3標的を切断する変異体に由来する最適化変異体(表VIII及びIX)で、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。変異体-標的酵母を、実施例4に記載される交配アッセイのための標的として用いる。
2) 結果
変異G19S及びI132Vを、IL2RG3.4標的を切断するM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に組み込んだ。部位特異的突然変異誘発により得られたクローンを、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) IL2RG3.3を切断する変異体に由来する洗練変異体を発現する6つの酵母株と交配させた。このような6つの酵母株は、変異体.3_R1、.3_R13、.3_R17、.3_R18、.3_R19及び.3_R21を用いて構築した(実施例5及び6に記載、表VIII及びIX)。
変異G19S及びI132Vを、IL2RG3.4標的を切断するM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に組み込んだ。部位特異的突然変異誘発により得られたクローンを、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) IL2RG3.3を切断する変異体に由来する洗練変異体を発現する6つの酵母株と交配させた。このような6つの酵母株は、変異体.3_R1、.3_R13、.3_R17、.3_R18、.3_R19及び.3_R21を用いて構築した(実施例5及び6に記載、表VIII及びIX)。
クローンは、このような酵母株と交配させたときに、IL2RG3標的の切断を引き起こすことが見出された(例を図13に示す)。これらを配列決定し、最良のクローンは、IL2RG3.4を切断するM1変異体に由来する4つの新規なエンドヌクレアーゼであることがわかった(表Xに記載)。
よって、IL2RG3.3標的を切断する変異体に由来する最適化変異体とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を効率的に切断できる、IL2RG3.4標的を切断する変異体に由来する4つのI-CreI 変異体(配列番号101〜104)を同定した(表X)。4つの最適化変異体のうちの2つは、G19S又は132V置換を含有する。他の2つは、G19S変異と、おそらくPCR反応に起因する他の変異とを含む。
実施例8：IL2RG3.4標的を切断するI-CreI変異体のランダム突然変異誘発及びCHO細胞でのスクリーニングによる、IL2RG3標的を切断するメガヌクレアーゼの洗練
酵母でIL2RG3標的を切断できるI-CreI変異体は、IL2RG3.4を切断する洗練変異体とIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせにより以前に同定された。
この実施例では、メガヌクレアーゼの活性を増大できるかと、同時に、メガヌクレアーゼがCHO細胞において活性であるかを確認した。実施例7に記載されるIL2RG3.4を切断する変異体(表X)をランダム突然変異誘発に供し、IL2RG3.3を切断する洗練変異体(実施例6で同定した)との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型を、CHO細胞にてスクリーニングした。CHO細胞におけるスクリーニングは、染色体外一本鎖アニーリング(SSA)に基づくアッセイであり、ここでは、メガヌクレアーゼによる標的の切断が、相同組換え及びLagoZレポーター遺伝子の発現を誘発した。
酵母でIL2RG3標的を切断できるI-CreI変異体は、IL2RG3.4を切断する洗練変異体とIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせにより以前に同定された。
この実施例では、メガヌクレアーゼの活性を増大できるかと、同時に、メガヌクレアーゼがCHO細胞において活性であるかを確認した。実施例7に記載されるIL2RG3.4を切断する変異体(表X)をランダム突然変異誘発に供し、IL2RG3.3を切断する洗練変異体(実施例6で同定した)との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型を、CHO細胞にてスクリーニングした。CHO細胞におけるスクリーニングは、染色体外一本鎖アニーリング(SSA)に基づくアッセイであり、ここでは、メガヌクレアーゼによる標的の切断が、相同組換え及びLagoZレポーター遺伝子の発現を誘発した。
1) 材料及び方法
a) CHOスクリーニングのためのベクター中のIL2RG3標的のクローニング
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOに注文した：5' tggcatacaagtttcgacctctggtaccagaggtcgacaatcgtctgtca 3' (配列番号16)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター(pCLS1058、図14)にクローニングした。クローニングした標的を、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
a) CHOスクリーニングのためのベクター中のIL2RG3標的のクローニング
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOに注文した：5' tggcatacaagtttcgacctctggtaccagaggtcgacaatcgtctgtca 3' (配列番号16)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター(pCLS1058、図14)にクローニングした。クローニングした標的を、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
b) ランダム突然変異誘発によるライブラリーの構築
表Xに記載されるIL2RG3.4を切断するI-CreI変異体をプールし、ランダム突然変異を誘発した。ランダム突然変異誘発ライブラリーを、Mn2+、又はJBS dNTP-突然変異誘発キット中のJENA BIOSCIENCE GmbHからのプロトコルに記載される2ステップPCRにおける8-オキソ-dGTP及びdPTPのようなdNTP誘導体を用いるPCRにより、構築した。用いたプライマーは、attB1-ICreIFor (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3'; 配列番号35)及びattB2-ICreIRev (5'- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3'; 配列番号36)である。得られたPCR生成物は、CHO細胞での発現用ベクターであるINVITROGENからのpCDNA6.2に(pCLS1069、図15)、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてクローニングした。
表Xに記載されるIL2RG3.4を切断するI-CreI変異体をプールし、ランダム突然変異を誘発した。ランダム突然変異誘発ライブラリーを、Mn2+、又はJBS dNTP-突然変異誘発キット中のJENA BIOSCIENCE GmbHからのプロトコルに記載される2ステップPCRにおける8-オキソ-dGTP及びdPTPのようなdNTP誘導体を用いるPCRにより、構築した。用いたプライマーは、attB1-ICreIFor (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3'; 配列番号35)及びattB2-ICreIRev (5'- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3'; 配列番号36)である。得られたPCR生成物は、CHO細胞での発現用ベクターであるINVITROGENからのpCDNA6.2に(pCLS1069、図15)、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてクローニングした。
c) メガヌクレアーゼの再クローニング
実施例5で同定されたIL2RG3.3標的を切断するI-SceI、I-CreI N75及びI-CreI変異体のORFを、pCLS1069 (図15)に再クローニングした。ORFを、PCRにより、酵母DNA上で、上記のattB1-ICreIFor及びattB2-ICreIRevプライマーを用いて増幅した。PCR生成物を、INVITROGENからのCHO発現ベクターpCDNA6.2 (pCLS1069、図15)に、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてクローニングした。得られたクローンを、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
実施例5で同定されたIL2RG3.3標的を切断するI-SceI、I-CreI N75及びI-CreI変異体のORFを、pCLS1069 (図15)に再クローニングした。ORFを、PCRにより、酵母DNA上で、上記のattB1-ICreIFor及びattB2-ICreIRevプライマーを用いて増幅した。PCR生成物を、INVITROGENからのCHO発現ベクターpCDNA6.2 (pCLS1069、図15)に、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてクローニングした。得られたクローンを、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
d) 哺乳動物細胞での染色体外アッセイ
CHO K1細胞を、Polyfect (登録商標)トランスフェクション試薬を供給業者のプロトコル(QIAGEN)に従って用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後に、培養培地を回収し、150μlのβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイ用の溶解/明示バッファーを加えた(典型的には、1リットルのバッファーは：100 mlの溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH7.5、NaCl 150 mM、Triton X100 0.1%、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)、10 mlのMg 100×バッファー(MgCl2 100 mM、β-メルカプトエタノール35%)、110 ml ONPG 8 mg/ml及び780 ml リン酸ナトリウム0.1M pH7.5を含有する)。37℃でのインキュベーションの後に、ODを420 nmで測定した。全体の手順を、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行う。ライブラリーのスクリーニングにより得られた陽性クローンを2次スクリーニングし、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
アッセイごとに、150 ngの標的ベクターを、両方の変異体のそれぞれ12.5 ng (12.5 ngのパリンドロームIL2RG3.3標的を切断する変異体と12.5 ngのパリンドロームIL2RG3.4標的を切断する変異体)で同時トランスフェクションした。
CHO K1細胞を、Polyfect (登録商標)トランスフェクション試薬を供給業者のプロトコル(QIAGEN)に従って用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後に、培養培地を回収し、150μlのβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイ用の溶解/明示バッファーを加えた(典型的には、1リットルのバッファーは：100 mlの溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH7.5、NaCl 150 mM、Triton X100 0.1%、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)、10 mlのMg 100×バッファー(MgCl2 100 mM、β-メルカプトエタノール35%)、110 ml ONPG 8 mg/ml及び780 ml リン酸ナトリウム0.1M pH7.5を含有する)。37℃でのインキュベーションの後に、ODを420 nmで測定した。全体の手順を、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行う。ライブラリーのスクリーニングにより得られた陽性クローンを2次スクリーニングし、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
アッセイごとに、150 ngの標的ベクターを、両方の変異体のそれぞれ12.5 ng (12.5 ngのパリンドロームIL2RG3.3標的を切断する変異体と12.5 ngのパリンドロームIL2RG3.4標的を切断する変異体)で同時トランスフェクションした。
2) 結果
実施例7に記載されるIL2RG3.4を切断する洗練変異体(表X)を、別の回の最適化に供した。これらをプールし、タンパク質全体に対してランダムに突然変異を誘発し、新しいI-CreI変異型のライブラリーをpCLS1069ベクターにクローニングして、CHO細胞内で変異体を発現させた(図15)。1728個のクローンを、CHO細胞での染色体外アッセイを用いてスクリーニングした。スクリーニングを、CHO細胞での3つのプラスミドの同時トランスフェクションにより行う：1つはIL2RG3.4を切断する変異体のランダム突然変異誘発により得られる変異型を発現し、2つ目はpCLS1069に再クローニングしたIL2RG3.3を切断する選択された変異体を発現し(図15)、3つ目はpCLS1058にクローニングされたIL2RG3標的を含む(図14)。IL2RG3.3を切断する2つのI-CreI変異体を、ライブラリーのスクリーニングのために用いた：.3_R17及び.3_R14 (26R、31R、33H、44K、54L、68Y、70S、75E、77V、139R及び19S、33H、40Y、44K、68Y、70S 75E、77V、139R、実施例6の表IXによる)。
実施例7に記載されるIL2RG3.4を切断する洗練変異体(表X)を、別の回の最適化に供した。これらをプールし、タンパク質全体に対してランダムに突然変異を誘発し、新しいI-CreI変異型のライブラリーをpCLS1069ベクターにクローニングして、CHO細胞内で変異体を発現させた(図15)。1728個のクローンを、CHO細胞での染色体外アッセイを用いてスクリーニングした。スクリーニングを、CHO細胞での3つのプラスミドの同時トランスフェクションにより行う：1つはIL2RG3.4を切断する変異体のランダム突然変異誘発により得られる変異型を発現し、2つ目はpCLS1069に再クローニングしたIL2RG3.3を切断する選択された変異体を発現し(図15)、3つ目はpCLS1058にクローニングされたIL2RG3標的を含む(図14)。IL2RG3.3を切断する2つのI-CreI変異体を、ライブラリーのスクリーニングのために用いた：.3_R17及び.3_R14 (26R、31R、33H、44K、54L、68Y、70S、75E、77V、139R及び19S、33H、40Y、44K、68Y、70S 75E、77V、139R、実施例6の表IXによる)。
8つのクローンが、1次スクリーニングにおいて、.3_R17 (26R、31R、33H、44K、54L、68Y、70S、75E、77V、139R) I-CreI 変異体とヘテロ二量体を形成したときに、CHOアッセイにおいてIL2RG3標的の切断を誘発することがわかった。8つのクローン(配列番号105〜111)を、2次スクリーニングにおいて確認し(図16)、配列決定した(表XI)。2次スクリーニングにおいて、これらの8つのクローンの効率を、.3_R17と同時発現させた元のM1変異体と比較し、8つのうち5つが、IL2RG3に対して強い活性を示した(表XI中の太字)。
結論として、26R、31R、33H、44K、54L、68Y、70S、75E、77V、139R I-CreI 変異体とヘテロ二量体を形成するときに、元のM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)及び26R、31R、33H、44K、54L、68Y、70S、75E、77V、139R I-CreI 変異体により形成されるヘテロ二量体を用いて観察されるよりも優れた効率でCHOアッセイにおいてIL2RG3標的を切断できる5つの新しい洗練変異体を同定した。
実施例9：CHO細胞での染色体外モデルにおけるIL2RG3標的切断の確認
ヘテロ二量体を形成したときに酵母又はCHOにおいてIL2RG3標的を効率的に切断できるいくつかのI-CreI洗練変異体を、実施例5、6、7及び8において同定した。CHO細胞においてIL2RG3標的を切断する最大有効性を示すヘテロ二量体の特徴を決定するために、IL2RG3標的を切断する変異体の全ての組み合わせの効率を、CHO細胞での染色体外アッセイを用いて比較した。
ヘテロ二量体を形成したときに酵母又はCHOにおいてIL2RG3標的を効率的に切断できるいくつかのI-CreI洗練変異体を、実施例5、6、7及び8において同定した。CHO細胞においてIL2RG3標的を切断する最大有効性を示すヘテロ二量体の特徴を決定するために、IL2RG3標的を切断する変異体の全ての組み合わせの効率を、CHO細胞での染色体外アッセイを用いて比較した。
1) 材料及び方法
実験手順は、実施例8に記載されるとおりである。
実験手順は、実施例8に記載されるとおりである。
2) 結果
実施例5、6及び7に記載される変異体を、まず、pCLS1069に再クローニングした。次いで、CHO細胞においてIL2RG3標的を切断する最大有効性を示すヘテロ二量体の特徴を決定するために、IL2RG3.3又はIL2RG3.4標的を切断する洗練I-CreI変異体(実施例5、6、7及び8に記載)を一緒に、ヘテロ二量体として、CHO染色体外アッセイにおいてIL2RG3 標的に対して試験した。
実施例5、6及び7に記載される変異体を、まず、pCLS1069に再クローニングした。次いで、CHO細胞においてIL2RG3標的を切断する最大有効性を示すヘテロ二量体の特徴を決定するために、IL2RG3.3又はIL2RG3.4標的を切断する洗練I-CreI変異体(実施例5、6、7及び8に記載)を一緒に、ヘテロ二量体として、CHO染色体外アッセイにおいてIL2RG3 標的に対して試験した。
最大値は、.4_R2、.4_R5、.4_R9又は.4_R11 I-CreI変異体(表X及びXIに記載)と組み合わせた.3_R27又は.3_R28 (31R、33H、44K、68Y、70S、75E、77V、80G、132V、139R又は31R、33H、44K、68Y、70S、75E、77V、132V、139R、表IXに記載されるように)により形成されるヘテロ二量体を用いて観察された。図17は、その標的に対するI-SceIの活性と比較した、CHO細胞アッセイにおけるIL2RG3標的に対する8つのヘテロ二量体について得られた結果を示す。
結論として、CHO細胞においてIL2RG3標的を、I-SceI標的(tagggataacagggtaat: 配列番号37)に対するI-SceIのものと同様の活性で切断できるI-CreI変異体の6つの組み合わせ(表XII)を同定した。
結論として、CHO細胞においてIL2RG3標的を、I-SceI標的(tagggataacagggtaat: 配列番号37)に対するI-SceIのものと同様の活性で切断できるI-CreI変異体の6つの組み合わせ(表XII)を同定した。
実施例10：IL2RG3.4を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びIL2RG3.3を切断する洗練タンパク質との組み立てによる、IL2RG3標的部位を切断するメガヌクレアーゼの洗練
IL2RG3標的を切断できるI-CreI変異体は、IL2RG3.4を切断する洗練変異体とIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせにより以前に同定された(実施例5〜9)。この実施例において、IL2RG3.4を切断するM1 変異体(実施例3、表V)を、タンパク質全体についてランダム突然変異誘発し、酵母において、実施例6に記載されるIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型についてスクリーニングした。
IL2RG3標的を切断できるI-CreI変異体は、IL2RG3.4を切断する洗練変異体とIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせにより以前に同定された(実施例5〜9)。この実施例において、IL2RG3.4を切断するM1 変異体(実施例3、表V)を、タンパク質全体についてランダム突然変異誘発し、酵母において、実施例6に記載されるIL2RG3.3を切断する洗練変異体との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型についてスクリーニングした。
1) 材料及び方法
a) ランダム突然変異誘発
実験手順は、実施例5に記載されるとおりである。この実施例において、ランダム突然変異誘発を、タンパク質全体に対して、Mn2+をM1変異体に対して用いて行った。75ngのPCRフラグメントと、NcoI/EagIによる消化により線状にされた75ngのpCLS0542とを用いて、酵母でのインビボ相同組換えにより変異型のライブラリーを作製した。
a) ランダム突然変異誘発
実験手順は、実施例5に記載されるとおりである。この実施例において、ランダム突然変異誘発を、タンパク質全体に対して、Mn2+をM1変異体に対して用いて行った。75ngのPCRフラグメントと、NcoI/EagIによる消化により線状にされた75ngのpCLS0542とを用いて、酵母でのインビボ相同組換えにより変異型のライブラリーを作製した。
b) IL2RG3標的を含有する酵母株におけるベクターpCLS1107中の変異体のクローニング
実験手順は、実施例5に記載されるとおりである。本実施例では、IL2RG3標的を含有する酵母株FYBL2-7Bを、pCLS1107ベクター中のIL2RG3.3を切断する変異体で形質転換する。
実験手順は、実施例5に記載されるとおりである。本実施例では、IL2RG3標的を含有する酵母株FYBL2-7Bを、pCLS1107ベクター中のIL2RG3.3を切断する変異体で形質転換する。
c) メガヌクレアーゼの再クローニング
実験手順は、実施例8に記載されるとおりである。
実験手順は、実施例8に記載されるとおりである。
d) CHO K1細胞での染色体外モデルにおけるIL2RG3標的切断の確認
実験手順は、実施例8に記載されるとおりである。
実験手順は、実施例8に記載されるとおりである。
2) 結果
IL2RG3.3標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成するときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI変異体を同定した。
IL2RG3.4を切断するM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に、PCRにより、タンパク質全体に対してランダムに突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。2232個の形質転換酵母クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) 実施例6に記載されるIL2RG3.3標的を切断する変異型である.3_R17 (I-CreI 26R 31R 33H 44K 54L 68Y 70S 75E 77V 139R、表IXに従う)又は.3_R19 変異体( I-CreI 19S 33H 40Y 44R 68Y 70S 75D 77T 87L 139R、表IXに従う)を発現する酵母株と交配させた。22個のクローンが、このような酵母と交配させたときに、IL2RG3標的の切断を引き起こすことがわかった。配列決定の後に、これらは、.3_R17及び.3_R19 (表XIII)との組み合わせでIL2RG3を切断するM1変異体に由来する12個の新規なエンドヌクレアーゼ(配列番号128〜139)であることがわかった。
IL2RG3.3標的を切断する変異体とヘテロ二量体を形成するときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI変異体を同定した。
IL2RG3.4を切断するM1変異体(RTYQS / AYSER、表Vに従う)に、PCRにより、タンパク質全体に対してランダムに突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。2232個の形質転換酵母クローンを、次いで、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) 実施例6に記載されるIL2RG3.3標的を切断する変異型である.3_R17 (I-CreI 26R 31R 33H 44K 54L 68Y 70S 75E 77V 139R、表IXに従う)又は.3_R19 変異体( I-CreI 19S 33H 40Y 44R 68Y 70S 75D 77T 87L 139R、表IXに従う)を発現する酵母株と交配させた。22個のクローンが、このような酵母と交配させたときに、IL2RG3標的の切断を引き起こすことがわかった。配列決定の後に、これらは、.3_R17及び.3_R19 (表XIII)との組み合わせでIL2RG3を切断するM1変異体に由来する12個の新規なエンドヌクレアーゼ(配列番号128〜139)であることがわかった。
IL2RG3標的に対して酵母で非常に効率的な切断活性を示すM1_24Vに焦点を当てた。図20において、酵母でのIL2RG3標的の切断活性を、変異体のいくつかの組み合わせと比較した：実施例6に記載される.3_R17、.3_R25及び.3_R28 I-CreI変異型(表IX)と組み合わせた.4_R5、.4_R9 (表XI)及びM1_24V (表XIII)。最良の切断活性は、M1_24Vと.3_R17 I-CreI変異体との組み合わせで観察された(図20)。
メガヌクレアーゼを、.3_R28、.4_R5及び.4_R9についてpCLS1069に、.3_R17、.3_R25及びM1_24VについてpCLS1768に再クローニングした(pCLS1768は、図21に示すように、T7起点を有さないpCLS1069に相当する)。再クローニング工程中に、変異が.3_R25 I-CreI変異型に出現し、3つの新規なエンドヌクレアーゼ(表XIVに記載される.3_R25a、.3_R25b及び.3_R25c)をもたらした。
これらの再クローニングされた変異体の全ての組み合わせの、IL2RG3標的を切断する効率を、CHO K1細胞において、それぞれの標的(C1234及びS1234と命名する)に対するI-CreI N75及びI-SceIの活性と、実施例8に記載される染色体外SSAアッセイを用いて比較した。
I-SceI標的に対するI-SceI及びI-CreI標的に対するI-CreI N75の活性と同様の活性でIL2RG3標的を切断するI-CreI変異体の新しい組み合わせを同定した(図22)。IL2RG3標的に対するI-CreI変異系の効率的な組み合わせは、.4_R5、.4_R9又はM1_24Vと同時発現させた.3_R28：.4_R5、.4_R9又はM1_24Vと同時発現させた.3_R17、及びM1_24Vと同時発現させた.3_R25a又は.3_R25cである。M1_24Vと組み合わせた.3_R25bは、活性がより低い。.4_R5又は.4_R9と同時発現させた.3_R25a、.3_R25b又は.3_R25cの組み合わせは非活性である。CHO K1細胞での染色体外SSAアッセイにおいて、IL2RG3標的切断の最良の効率は、.3_R25aとM1_24Vとの組み合わせを用いて観察された。
実施例11：IL2RG3.4を切断する洗練タンパク質の部位特異的突然変異誘発及びIL2RG3.3を切断する洗練タンパク質との組み立てによる、IL2RG3標的部位を切断するメガヌクレアーゼの洗練
実施例10に記載されるM1_24V I-CreI 24V 30R 32T 44A 68Y 70S 75E 77R変異体(表XIII)を、選択されたアミノ酸置換を導入し、実施例6で同定されたIL2RG3.3を切断する.3_R17及び.3_R25洗練変異体との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型をスクリーニングすることにより、次の工程の最適化に供した。
5つのアミノ酸置換は、以前の研究において、I-CreI誘導体の活性を増強することが見出されている(G19S、F54L、F87L、V105A及びI132V、実施例6を参照)。E80K置換も導入した。
実施例10に記載されるM1_24V I-CreI 24V 30R 32T 44A 68Y 70S 75E 77R変異体(表XIII)を、選択されたアミノ酸置換を導入し、実施例6で同定されたIL2RG3.3を切断する.3_R17及び.3_R25洗練変異体との組み合わせでIL2RG3を切断するより効率的な変異型をスクリーニングすることにより、次の工程の最適化に供した。
5つのアミノ酸置換は、以前の研究において、I-CreI誘導体の活性を増強することが見出されている(G19S、F54L、F87L、V105A及びI132V、実施例6を参照)。E80K置換も導入した。
1) 材料及び方法
部位特異的突然変異誘発
M1_24V I-CreI変異体に対する部位特異的突然変異誘発を、実施例6に記載される実験手順を用いるPCRにより行った。E80K置換について、以下のオリゴヌクレオチドの対を用いた：
*E80KF: 5'-ttaagcaaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3' (配列番号151)及びE80KR: 5'-caggaagttgtgcagcggcttgattttgcttaa-3' (配列番号152)。
部位特異的突然変異誘発
M1_24V I-CreI変異体に対する部位特異的突然変異誘発を、実施例6に記載される実験手順を用いるPCRにより行った。E80K置換について、以下のオリゴヌクレオチドの対を用いた：
*E80KF: 5'-ttaagcaaaatcaagccgctgcacaacttcctg-3' (配列番号151)及びE80KR: 5'-caggaagttgtgcagcggcttgattttgcttaa-3' (配列番号152)。
2) 結果
6つのアミノ酸置換のうち1つ又は2つを有するM1_24V I-CreI変異型を含有する酵母株を、IL2RG3標的切断効率について、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) .3_R17、.3_R25又は.3_R28 I-CreI変異体(表IXに従う)を発現する酵母株と交配させることによりスクリーニングした。
.3_R17及び.3_R25 I-CreI変異体とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI 変異体(表XVに記載される)を同定した(スクリーニングの結果の例を図23に示す)。
6つのアミノ酸置換のうち1つ又は2つを有するM1_24V I-CreI変異型を含有する酵母株を、IL2RG3標的切断効率について、(i) レポータープラスミド中にIL2RG3標的を含有し、(ii) .3_R17、.3_R25又は.3_R28 I-CreI変異体(表IXに従う)を発現する酵母株と交配させることによりスクリーニングした。
.3_R17及び.3_R25 I-CreI変異体とヘテロ二量体を形成したときにIL2RG3標的を効率的に切断できる新しいI-CreI 変異体(表XVに記載される)を同定した(スクリーニングの結果の例を図23に示す)。
実施例12：ヒト株化細胞でのIL2RG遺伝子でのゲノム工学のためのKIマトリクス構築
ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4に位置するIL2RG3標的を酵母及び哺乳動物細胞(CHO K1細胞)において効率的に切断できるI-CreI洗練変異体を、前の実施例で同定した。X-SCID症候群を引き起こす多くの変異が、ヒトIL2RG遺伝子において記載されている。これらのうち、ほぼ半数は、IL2RG3標的の下流に位置する(図19)。
IL2RG3標的を切断するメガヌクレアーゼの組み合わせを用いて、切断及びその後の修復マトリクスを用いる相同組換えにより、患者細胞中のIL2RG遺伝子の変異を修正できた。IL2RGメガヌクレアーゼがhIL2RGを修正する効率を試験するために、エキソンノックインマトリクス(KIマトリクス)を設計した。
ヒトIL2RG遺伝子のイントロン4に位置するIL2RG3標的を酵母及び哺乳動物細胞(CHO K1細胞)において効率的に切断できるI-CreI洗練変異体を、前の実施例で同定した。X-SCID症候群を引き起こす多くの変異が、ヒトIL2RG遺伝子において記載されている。これらのうち、ほぼ半数は、IL2RG3標的の下流に位置する(図19)。
IL2RG3標的を切断するメガヌクレアーゼの組み合わせを用いて、切断及びその後の修復マトリクスを用いる相同組換えにより、患者細胞中のIL2RG遺伝子の変異を修正できた。IL2RGメガヌクレアーゼがhIL2RGを修正する効率を試験するために、エキソンノックインマトリクス(KIマトリクス)を設計した。
材料及び方法
ノックイン(KI)マトリクス
ノックインマトリクスは、2つのヒトIL2RG相同腕(ゲノム配列NC_000023.9における130〜1398の1268bpのLHと、1740〜3451の1717bpのRH) (図24)の間にクローニングされたhIL2RGのエキソン5〜8を含有するcDNA (mRNAヒトIL2RG配列NM_000206中の609〜1128の520bpのcDNAフラグメント)を用いるエキソンノックインストラテジーである。得られたプラスミドはpCLS2037である(図25)。相同腕は、ヒト株化細胞(LHについてHEK-293、及びRHについてEBV形質転換ヒトB細胞株)から精製したゲノムDNAから増幅させる。ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)のコード配列は、IRES領域及びSV40ポリAシグナルに機能可能に連結される。ネオマイシン発現カセット(IRES_Neo_pA)は遊離でき、酵素消化によりpA部位で置き換えることができる。RH腕の後にクローニングされたEF1αプロモーターの制御下のHSVからのチミジンキナーゼを用いて、KIマトリクスのランダム組み込みを有するクローンを消去できる。
ノックイン(KI)マトリクス
ノックインマトリクスは、2つのヒトIL2RG相同腕(ゲノム配列NC_000023.9における130〜1398の1268bpのLHと、1740〜3451の1717bpのRH) (図24)の間にクローニングされたhIL2RGのエキソン5〜8を含有するcDNA (mRNAヒトIL2RG配列NM_000206中の609〜1128の520bpのcDNAフラグメント)を用いるエキソンノックインストラテジーである。得られたプラスミドはpCLS2037である(図25)。相同腕は、ヒト株化細胞(LHについてHEK-293、及びRHについてEBV形質転換ヒトB細胞株)から精製したゲノムDNAから増幅させる。ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)のコード配列は、IRES領域及びSV40ポリAシグナルに機能可能に連結される。ネオマイシン発現カセット(IRES_Neo_pA)は遊離でき、酵素消化によりpA部位で置き換えることができる。RH腕の後にクローニングされたEF1αプロモーターの制御下のHSVからのチミジンキナーゼを用いて、KIマトリクスのランダム組み込みを有するクローンを消去できる。
2番目の遺伝子ターゲティングベクターを、エキソンノックインの同じストラテジーを用いて構築した(pCLS1976。図24)。pCLS1976において、ヌクレオチドにおける3%の異種性を、cDNAエキソン5〜8に導入した。
実施例13：逐次的(sequential)コンビナトリアルアプローチを用いることによる、IL2RG3.6標的配列を切断するメガヌクレアーゼの作製
IL2RG3.6 DNA配列は、IL2RG3.4とは、2NN_2NNとよばれる4つの中央塩基対のみが異なる。IL2RG3.4は、C1221標的と同様にGTACを有するが、IL2RG3.6は、IL2RG3標的と同様にTCTC配列を有する(図4)ので、I-CreI由来変異体により切断されるのがより難しい。我々は、野生型2NN_2NN配列を有するパリンドローム標的を切断する変異体を、他のパリンドローム標的を切断する変異体と会合させると、興味対象の標的の切断の可能性が増加することを、以前に観察した。
IL2RG3.6 DNA配列は、IL2RG3.4とは、2NN_2NNとよばれる4つの中央塩基対のみが異なる。IL2RG3.4は、C1221標的と同様にGTACを有するが、IL2RG3.6は、IL2RG3標的と同様にTCTC配列を有する(図4)ので、I-CreI由来変異体により切断されるのがより難しい。我々は、野生型2NN_2NN配列を有するパリンドローム標的を切断する変異体を、他のパリンドローム標的を切断する変異体と会合させると、興味対象の標的の切断の可能性が増加することを、以前に観察した。
そのようなIL2RG3.6カッターを得るために、逐次的コンビナトリアルアプローチに基づくストラテジーを用いた。このアプローチは、IL2RG3.4標的を切断するメガヌクレアーゼを得るために実施例3で開発した伝統的なコンビナトリアルアプローチとは異なる。実施例3では、10GAA_P標的を切断する変異体と5AGG_P標的を切断する変異体とを組み合わせて、IL2RG3.4を切断できる変異体を得た。逐次的コンビナトリアルアプローチでは、まず、IL2C_P標的を切断する変異体を探した(図4)。このパリンドローム標的は、5AGG_P標的と同一であるが、IL2RG3.4標的の±11位及び±7位の塩基を有する(図4)。IL2C_Pカッターを、次いで選択して、I-CreIアミノ酸28位、30位、32位及び33位で縮重した異なる変異体ライブラリーを創出し、これらを、IL2RG3.4標的に対して、我々の酵母スクリーニングアッセイを用いてスクリーニングした。実施例3でのような2変異の組を組み合わせる代わりに、逐次アプローチの概念は、1変異の組を固定した後に(ここではIL2C_P切断を可能にする変異)、第2変異の組を探す。最後に、部位特異的突然変異誘発を、逐次法により得られたIL2RG3.4タンパク質に対して行って、IL2RG3.6標的に対する切断活性を得る。
1) 材料及び方法
a) 逐次変異体ライブラリーSeqLib1及びSeqLib2の構築
2つの変異体ライブラリーSeqLib1及びSeqLib2を、3つのIL2C_PカッターのプールのDNAから作製した。30位及び33位に変異を含むSeqLib1を構築するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreI由来変異体コード配列の5'末端(aa 1位〜41位)又は3'末端(aa 34位〜166位)を増幅した。3'末端について、PCR増幅を、pCLS0542ベクターに特異的なプライマー(Gal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'; 配列番号18)と、アミノ酸34〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(10RG34For 5'-aagtttaaacatcagctaagcttgaccttt-3'; 配列番号153)とを用いて行う。5'末端について、PCR増幅を、pCLS0542ベクターに特異的なプライマー(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3': 配列番号17)と、アミノ酸25〜41についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(10RG34Rev1 5'-caagcttagctgatgtttaaacttmnnagactgmnntggtttaatctgagc-3'; 配列番号154)とを用いて行う。30位及び33位にてNNKコドンをもたらすオリゴヌクレオチド中のMNNコードは、これらの位置で、20個の可能なアミノ酸の中で縮重を可能にする。28位、32位及び33いにて変異を含むSeqLib2ライブラリーは、同じ方法であるが、10RG34Rev1の代わりにプライマー10RG34Rev2 (5'-caagcttagctgatgtttaaacttmbnmbnctggtttggmbnaatctgagc-3'; 配列番号155)を用いて構築した。28位、32位及び33位にてNVKコドンをもたらすオリゴヌクレオチド中のMBNコードは、これらの位置で、20個全ての可能なアミノ酸のうちF、L、M、I及びV以外のものの中で縮重を可能にする。次いで、両方のライブラリーについて、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75ngのベクターDNA (pCLS0542)とを用いて、サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz R D及びWoods R A Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 2002; 350:87〜96)を用いて形質転換した。所望の位置での変異を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
a) 逐次変異体ライブラリーSeqLib1及びSeqLib2の構築
2つの変異体ライブラリーSeqLib1及びSeqLib2を、3つのIL2C_PカッターのプールのDNAから作製した。30位及び33位に変異を含むSeqLib1を構築するために、2回の別々のオーバーラップPCR反応を行い、これは、I-CreI由来変異体コード配列の5'末端(aa 1位〜41位)又は3'末端(aa 34位〜166位)を増幅した。3'末端について、PCR増幅を、pCLS0542ベクターに特異的なプライマー(Gal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'; 配列番号18)と、アミノ酸34〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(10RG34For 5'-aagtttaaacatcagctaagcttgaccttt-3'; 配列番号153)とを用いて行う。5'末端について、PCR増幅を、pCLS0542ベクターに特異的なプライマー(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3': 配列番号17)と、アミノ酸25〜41についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(10RG34Rev1 5'-caagcttagctgatgtttaaacttmnnagactgmnntggtttaatctgagc-3'; 配列番号154)とを用いて行う。30位及び33位にてNNKコドンをもたらすオリゴヌクレオチド中のMNNコードは、これらの位置で、20個の可能なアミノ酸の中で縮重を可能にする。28位、32位及び33いにて変異を含むSeqLib2ライブラリーは、同じ方法であるが、10RG34Rev1の代わりにプライマー10RG34Rev2 (5'-caagcttagctgatgtttaaacttmbnmbnctggtttggmbnaatctgagc-3'; 配列番号155)を用いて構築した。28位、32位及び33位にてNVKコドンをもたらすオリゴヌクレオチド中のMBNコードは、これらの位置で、20個全ての可能なアミノ酸のうちF、L、M、I及びV以外のものの中で縮重を可能にする。次いで、両方のライブラリーについて、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれ25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にした75ngのベクターDNA (pCLS0542)とを用いて、サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz R D及びWoods R A Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 2002; 350:87〜96)を用いて形質転換した。所望の位置での変異を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
b) 部位特異的突然変異誘発
I132V及びE80K変異を、実施例6及び11に記載されるSeq4、Seq5及びSeq7 I-CreI変異体により構築されたDNAプールに対して導入した。
I132V及びE80K変異を、実施例6及び11に記載されるSeq4、Seq5及びSeq7 I-CreI変異体により構築されたDNAプールに対して導入した。
2) 結果
IL2C_P標的に対する、5AGG_P標的を切断できる36個のI-CreI変異体の酵母スクリーニングは、いくつかの陽性クローンを与えた(図26)。3つの陽性変異体を単離した。これらは全てI24V変異を有し、それぞれ以下の配列を有していた：TRSER、TYSER、RYSET (ここで、文字は44位、68位、70位、75位及び77位のアミノ酸を示す(例えばTRSERはT44、R68、S70、E75及びR77のことである))。これらの3つの陽性クローンのDNAをIL2C_P標的に対して用いて、2つの異なる変異体ライブラリーを、次いで、第1ライブラリー(SeqLib1)について30位及び33位のアミノ酸を、第2ライブラリー(SeqLib2)について28位、32位及び33位のアミノ酸を縮重させることにより構築した。ライブラリー1からの1116クローンのIL2RG3.4標的に対する酵母スクリーニングは、ユニーク配列を有する6個の陽性クローン(図27)を生じ、ライブラリー2からの2232クローンのスクリーニングは、1つの陽性クローンをもたらした。7つのIL2RG3.4カッターの配列を、表XVIに示す。
IL2C_P標的に対する、5AGG_P標的を切断できる36個のI-CreI変異体の酵母スクリーニングは、いくつかの陽性クローンを与えた(図26)。3つの陽性変異体を単離した。これらは全てI24V変異を有し、それぞれ以下の配列を有していた：TRSER、TYSER、RYSET (ここで、文字は44位、68位、70位、75位及び77位のアミノ酸を示す(例えばTRSERはT44、R68、S70、E75及びR77のことである))。これらの3つの陽性クローンのDNAをIL2C_P標的に対して用いて、2つの異なる変異体ライブラリーを、次いで、第1ライブラリー(SeqLib1)について30位及び33位のアミノ酸を、第2ライブラリー(SeqLib2)について28位、32位及び33位のアミノ酸を縮重させることにより構築した。ライブラリー1からの1116クローンのIL2RG3.4標的に対する酵母スクリーニングは、ユニーク配列を有する6個の陽性クローン(図27)を生じ、ライブラリー2からの2232クローンのスクリーニングは、1つの陽性クローンをもたらした。7つのIL2RG3.4カッターの配列を、表XVIに示す。
7つのクローンSeq1〜Seq7についてのIL2RG3.4標的に対する切断活性はまだ比較的弱いので、変異E80K及びI132Vを、部位特異的突然変異誘発により、Seq4、Seq5及びSeq7クローンにより構築される変異体のプールに対して導入した。得られた変異体のスクリーニングにより、IL2RG3.4標的に対する非常に強いカッターが得られ、それらのうちで、表XVIIに示すユニーク配列を有するものは、IL2RG3.6標的を切断できた(図28)。
部位特異的突然変異誘発により導かれる洗練プロセスにより、IL2RG3.6を切断できる3つのI-CreI由来変異体が得られた。元のIL2RG3.4カッターは、逐次コンビナトリアルアプローチを用いることにより単離され、このことは、この実施例の導入に記載したこの概念を確認する。3つのIL2RG3.6カッターは、ここで、IL2RG3標的を切断するためにIL2RG3.3変異体との同時発現に用いることができる。
Claims (40)
- 2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ少なくとも2つの置換を有し、変異型が、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、かつ少なくとも以下の：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、及び／又は
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成し、
(j) ヒトIL2RG遺伝子からのDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする
工程を含む方法により得ることができることを特徴とする、I-CreI変異型。 - 前記方法が、(i) -2位〜+2位のヌクレオチドがヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-2位〜+2位に存在するヌクレオチドと同一であり、(ii) -11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、ヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドと同一であり、(iii) +3位〜+11位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は-11位〜-3位(工程(h)の組み合わせ変異型)のヌクレオチドが、ヒトIL2RG遺伝子からの前記DNA標的配列の-11位〜-3位(工程(g)の組み合わせ変異型)又は+3位〜+11位(工程(h)の組み合わせ変異型)に存在するヌクレオチドの逆相補配列と同一である偽パリンドローム配列を切断できる、工程(g)又は工程(h)で得られた組み合わせ変異型を選択／スクリーニングするさらなる工程を含む請求項1に記載の変異型。
- I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に位置する請求項1又は2に記載の変異型。
- I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に位置する請求項1又は2に記載の変異型。
- 前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
- I-CreIの26位〜40位及び/又は44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の組み合わせにより得られるヘテロ二量体であり、前記へテロ二量体がヒトIL2RG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型。
- 前記DNA標的が、配列番号5〜9及び116〜119の配列からなる群より選択される請求項6に記載の変異型。
- 第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位、及び44位、68位、70位、75位、77位に、KNSTQQ/NYSYQ及びSNSYRK/DNSNI、KHTCRS/QRDNR及びKNDYYS/QRSHY、KRANQE/YRSQI及びKNSCAS/NRSYN、KNSTQQ/RYSEY及びKNTYQS/DYSSR、KNSSRE/LRNNI及びKDSRTS/AYSYK、KNSRNQ/YRSDV及びKNSTAS/QYSRQ、KSSCQA/AYSYI及びKNTYWS/AYSYK、KNRDQS/DNSNI及びKNSTAS/AYSYKからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項7に記載の変異型。
- 第1単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位に、KNSRQY/RYSDT、KNSHQS/KYSEV、KNSRQS/RYSDT、KNSHQY/RYSDT、KNSHQY/KYSEV、KNSRQY/RYSEV、KNSHQY/RYSEVからなる群より選択されるアミノ酸を有し、第2単量体が、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位に、KRTYQS/AYSER、KRSYQS/TRSER、KRSNQS/TYSER、KRSAQS/TRSER、KRSVQS/TRSER、KRSSQS/ RYSET及びKNGHQS/ TRSERからなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項7に記載の変異型。
- I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の変異型。
- ヒト IL2RG遺伝子からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換を、I-CreI配列全体に対して含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
- N2D、K4E、K7E、E8G、G19S、G19A、I24V、I24T、Q26R、Q31R、K34R、L39I、F43L、F43I、Q50R、R52C、F54L、K57R、V59A、D60G、V64A、G71R、S79G、E80K、E80G、K82R、F87L、T89A、K96R、K98R、K100R、N103Y、N103D、V105A、K107R、K107E、Q111R、E117G、E117K、K121R、F122Y、T127N、V129A、I132V、I132T、L135Q、K139R、T140A、T143I、T147A、D153G、S154G、S156R、E157G、K159E、K159R、K160G、S162F、S162P及びP163Lからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む請求項11に記載の変異型。
- G19S、I24V、F54L、E80K、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む請求項12に記載の変異型。
- 第1及び第2単量体がそれぞれ、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び44位、68位、65位、77位並びに付加的な位置に：
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER +19S+59A+103Y+107R、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R又は KRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+80G+132V+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R又はKRTYQS/AYSER+19S+59A+82R+111R+ 140A (第2単量体)、
- KNSHQS/KYSEV+31R+132V+139R (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+19S+59A+111R、KRTYQS/AYSER+19S+59A+103Y+107R、KRTYQS/AYSER+19S+60G+156R、KRTYQS/AYSER+19S+59A+82R+111R+ 140A又はKRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、
- KNSHQY/RYSEV+19S+132V、KNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V+139R又はKNSHQY/RYSEV+19S+71R+132V (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V (第2単量体)、及び
- KNSHQS/KYSEV+26R+31R+54L+139R又はKNSHQY/RYSEV+ 19S+132V (第1単量体)と、KRTYQS/AYSER+24V+132V、KRTYQS/AYSER+24V+80K、KRTYQS/AYSER+24V+54L、KRTYQS/AYSER+24V+87L、KRTYQS/AYSER+24V+105A又はKRTYQS/AYSER+24V+105A+132V (第2単量体)
からなる群より選択されるアミノ酸を有する請求項9及び11〜13のいずれか1項に記載の変異型。 - 第1単量体及び第2単量体が、以下の配列の対：配列番号38と43; 配列番号39と44; 配列番号40と配列番号45; 配列番号41と配列番号46; 配列番号42と配列番号47; 配列番号120と121、配列番号122と123、配列番号124と125、配列番号126と127、並びに配列番号67〜100、140〜142 (第1単量体)と、配列番号101〜111、128〜139、143〜148及び156〜165のいずれか(第2単量体)から選択される請求項8、9及び11〜14のいずれか1項に記載の変異型。
- 2つのI-CreI単量体の少なくとも一方が、請求項15で規定される配列の1つと少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜14のいずれか1項に記載の変異型。
- 核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型。
- 第1単量体及び第2単量体がそれぞれD137R変異及びR51D変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項6〜17のいずれか1項に記載の変異型。
- 第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む偏性へテロ二量体である請求項6〜17のいずれか1項に記載の変異型。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン、或いはその両方の組み合わせを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
- ペプチドリンカーで連結された請求項8、9、14及び15のいずれか1項で規定される第1及び第2単量体を含む請求項20に記載の単鎖メガヌクレアーゼ。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の変異型又は請求項20若しくは21に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
- 請求項22の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
- それぞれが請求項6〜19のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項23に記載の発現ベクター。
- ヒトIL2RG遺伝子に導入される配列と、請求項1、6及び7のいずれか1項で規定されるI-CreI 変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトIL2RG遺伝子配列に相同な配列とを含むターゲティング構築物を含む請求項23又は24に記載のベクター。
- I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位と接するヒトIL2RG遺伝子配列に相同な前記配列が、配列番号3の250位〜449位、991位〜1190位、1116位〜1305位、1546位〜1745位、1597位〜1796位、2108位〜2307位、2860位〜3059位、2879位〜3078位又は3041位〜3240位を含むヒトIL2RG遺伝子のフラグメントである請求項25に記載のベクター。
- 導入される前記配列が、ヒトIL2RG遺伝子内の変異を修復する配列である請求項25又は26に記載のベクター。
- 前記変異を修復する配列が、野生型ヒト共通サイトカイン受容体ガンマ鎖の一部分をコードする請求項27に記載のベクター。
- I-CreI変異型のゲノムDNA切断部位に接するヒトIL2RG遺伝子の配列に相同な前記配列が、請求項28で規定される野生型ヒト共通サイトカイン受容体ガンマ鎖の一部分をコードする配列を含む請求項25又は26に記載のベクター。
- 前記変異を修復する前記配列が、ヒトサイトカイン受容体共通ガンマ鎖ORFと、3'の転写を停止するポリアデニル化部位とを含む請求項27に記載のベクター。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターを含む組成物。
- 請求項25〜30のいずれか1項で規定されるターゲティングDNA構築物を含む請求項31に記載の組成物。
- 前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項32に記載の組成物。
- 請求項22若しくは24で規定される少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つのベクターにより改変された宿主細胞。
- 請求項22若しくは24で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項22若しくは24で規定される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、X連鎖重症複合型免疫不全の予防用の医薬品の製造のための使用。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項20若しくは21に記載の1つの単鎖メガヌクレアーゼ、及び／又は請求項23〜30のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
- 前記変異型、単鎖メガヌクレアーゼ又はベクターが、請求項25〜30のいずれか1項で定義されるターゲティングDNA構築物と組み合わされている請求項37又は38に記載の使用。
- X連鎖重症複合型免疫不全の動物モデルを作製するための請求項38又は39に記載の使用。
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