JP2010524468A - Δ9エロンガーゼおよび多価不飽和脂肪酸の作成におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、2007年4月16日に出願された米国仮特許出願第60/911,925号明細書の優先権を主張する。
(a)Δ9エロンガーゼ活性を有して、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのClustal V法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号11、配列番号12または配列番号26に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのBLASTN法に基づいて少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
(c)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号11、配列番号12または配列番号26に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなり、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって100%相補的である、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞を提供する。
a)(i)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのClustal V法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)リノール酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、リノール酸がエイコサジエン酸に変換される条件下でステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサジエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサジエン酸を生成する方法を提供する。
a)(i)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのClustal V法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)α−リノレン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
b)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、α−リノレン酸がエイコサトリエン酸に変換される条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサトリエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサトリエン酸を生成する方法を提供する。
本開示の文脈で、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
オレイン酸がω−3/ω−6脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図1に示され下で述べられるように、特定ω−3/ω−6脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
本発明では、下の表3で要約するようにΔ9エロンガーゼをコードするヌクレオチド配列が、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)から単離されている。
(a)Δ9エロンガーゼ活性を有して、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのClustal V法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号11、配列番号12または配列番号26に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのBLASTN法に基づいて少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
(c)(a)または(b)のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなり、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって100%相補的である、単離されたポリヌクレオチドに関する。
本エロンガーゼ配列(すなわちEaD9Elo1、EaD9Elo2、またはEaD9eS)またはその部分のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、ユーグレナ属のまたは植物種中で、配列分析ソフトウェアを使用してΔ9エロンガーゼ相同体を検索してもよい。一般にこのようなコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修正に相同性の程度を割り当てることで、類似配列をマッチさせる。
適切なプロモーター制御下における、ここで述べられるΔ9エロンガーゼをコードするキメラ遺伝子(すなわちEaD9Elo1、EaD9Elo2、EaD9eSまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはそれらの相同体)の導入は、形質転換宿主生物中でのEDAおよび/またはETrA生成増大をそれぞれもたらすであろうことが予期される。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物(すなわちそれぞれEDAおよび/またはETrA)に変換されるように、脂肪酸基質(すなわちLAおよび/またはALA)をここで述べられるエロンガーゼ酵素(例えばEaD9Elo1、EaD9Elo2またはEaD9eS)に曝露するステップを含んでなる、PUFAを直接生成する方法を包含する。
(a)配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、アラインメントのClustal V法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(b)LA源
を含んでなり、微生物宿主細胞は、Δ9エロンガーゼをコードする核酸断片が発現されて、LAがEDAに変換されるような条件下で成長させ、EDAは場合により回収される。
(a)配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、アラインメントのClustal V法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
(b)ALA源
を含んでなり、微生物宿主細胞は、Δ9エロンガーゼをコードする核酸断片が発現されて、ALAがETrAに変換されるような条件下で成長させ、ETrAは場合により回収される。
ここで述べられるΔ9エロンガーゼ遺伝子および遺伝子産物(すなわちEaD9Elo1、EaD9Elo2、EaD9eSまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはそれらの相同体)は、異種の微生物宿主細胞中、特に油性酵母(例えばヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))細胞中で発現されてもよい。
ひとたび適切な微生物宿主細胞中での発現に適したDNAカセット(例えばプロモーター、ORF、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子)が得られたら、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、またはそれを宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座での遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
本遺伝子および核酸断片発現のための微生物宿主細胞としては、広範な温度とpH値にわたり、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロール、およびアルコール、および/または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で成長する宿主が挙げられる。出願人らの譲受人の要件に基づいて、本発明で述べられている遺伝子は油性酵母(特にヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))中で発現されているが、転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイルおよび/または真菌が、本核酸断片の発現に適した微生物宿主であることが考察される。
(a)i)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードして少なくとも1つの制御配列と作動的に連結する第1の組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)それぞれLAおよび/またはALAからなるエロンガーゼ基質源
を含んでなる油性酵母(例えばヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))を提供するステップと、
(b)適切な発酵性炭素源の存在下でステップ(a)の酵母を成長させて、Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現されて、LAがEDAに変換され、および/またはALAがETrAに変換されるステップと、
(c)ステップ(b)のEDAおよび/またはETrAを場合によりそれぞれ回収するステップと
を含んでなる、EDAまたはETrAのどちらかをそれぞれ生成する方法に関するものである。
(a)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードして少なくとも1つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第1の組み換えDNAコンストラクト、および
(b)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ9デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼ、およびC20/22エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードして少なくとも1つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも1つの追加的組み換えDNAコンストラクト
を含んでなる油性酵母に関する。
本Δ9エロンガーゼの配列知識は、様々な宿主細胞中でω−3および/またはω−6脂肪酸生合成を操作するのに有用であろう。生化学的経路を操作する方法は当業者によく知られており、油性酵母中で、特にヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中で、ω−3および/またはω−6脂肪酸生合成を最大化するのに多数の操作が可能なことが予期される。この操作は、直接にPUFA生合成経路内の代謝エンジニアリング、または炭素からPUFAへの生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路をアップレギュレートして、望ましくない生化学的経路をダウンレギュレートする有用な方法は当業者によく知られている。
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラデサチュラーゼおよびエロンガーゼ
遺伝子の発現を最適化する条件下で成長させて、最大かつ最も経済的な所望のPUFA収率を生じさせる。一般に、最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、生育温度、pH、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。油性酵母のような、対象の微生物(例えば、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)は、一般に複合培地(例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地(YPD))で、または生育に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地(例えばDIFCO Laboratories(Detroit,MI)からの酵母菌窒素ベース)上で成長させる。
PUFAは、宿主微生物中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態で含まれるかもしれず、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および許容基準に関する総説は、Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology,12(5/6):463〜491(1992年))によるものである。A.SinghおよびO.Ward(Adv.Appl.Microbiol.,45:271〜312(1997年))による後処理プロセスの短いレビューもまた入手できる。
市場は、目下ω−3および/またはω−6脂肪酸(例えば特にALA、GLA、ARA、EPA、DPA、およびDHA)を組み込んだ多岐にわたる食物および飼料製品をサポートする。長鎖PUFAを含んでなる微生物由来資源、PUFAを含んでなる部分的に精製された微生物由来資源、PUFAを含んでなる精製された微生物油、および/または精製されたPUFAは、食物および飼料製品中で機能して本調合物の健康上の利点を与えるであろうことが考察される。より具体的にはω−3および/またはω−6脂肪酸を含有する本発明の油は、類似食品、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない多様な食物および飼料製品中で使用するのに適する(詳細については米国特許出願公開第2006/0094092号明細書を参照されたい)。
実施例で使用する標準組み換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、1.)Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989年)(Maniatis);2.)T.J.Silhavy、M.L.Bennan、およびL.W.Enquist、「Experiments with Gene Fusions」、Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984年);および3.)Ausubel,F.M.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscienceによる出版(1987年)で述べられる。
発現カセット構造は、「X::Y::Z」の簡便表記体系によって表され、Xはプロモーター断片を示し、Yは遺伝子断片を示し、Zはターミネーター断片を示して、全て互いに作動的に連結する。
ATCC登録番号#20362、#76982、および#90812のヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株は、米国微生物系統保存機関(Rockville,MD)から購入した。ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株は、典型的に下に示す処方に従っていくつかの培地内で28〜30℃で成長させた。標準法に従って各液体培地に20g/Lの寒天を添加して、寒天プレートを必要に応じて調製した。
脂肪酸分析のために、Bligh,E.G.およびDyer,W.J.、Can.J.Biochem.Physiol.37:911〜917(1959年)で述べられるように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し(Roughan,G.およびNishida,I.、Arch Biochem Biophys.276(1):38〜46(1990年))、引き続きHewlett−Packardからの30m×0.25mm(内径)HP−INNOWAXカラムを装着したHewlett−Packard 6890 GCで分析した。オーブン温度は3.5℃/分で、170℃(25分間保持)から185℃であった。
ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373からのcDNAライブラリーの合成
本例はユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373からのcDNAライブラリーの合成について述べる。この作業は、RNAの調製、cDNAの合成、およびcDNAライブラリーの作成を含んだ。
ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373は、ミシガン州立大学(East Lansing,MI)のRichard Triemer博士の研究室から入手した。およそ2mLの培養物を脂質分析のために除去し、1,800×gで5分間遠心分離した。ペレットを水で1回洗浄し、再度遠心分離した。得られたペレットを真空下で5分間乾燥させ、100μLの水酸化トリメチルスルホニウム(TMSH)に再懸濁して、振盪しながら室温で15分間インキュベートした。インキュベーションの後0.5mLのヘキサンを添加して、バイアルを振盪しながら室温で15分間さらにインキュベートした。脂肪酸メチルエステル(ヘキサン層から5μLを注入)を分離させ、Omegawax 320溶融石英キャピラリーカラム(Supelco Inc.、カタログ番号24152)を装着したHewlett−Packard 6890ガスクロマトグラフを使用して定量化した。オーブン温度をプログラムして170℃に1.0分間保ち、5℃/分で240℃に上昇させ、次にさらに1.0分間保った。キャリアガスはWhatman水素発生装置によって供給された。滞留時間を市販される標準メチルエステル(Nu−Chek Prep,Inc.、カタログ番号U−99−A))と比較して、得られたクロマトグラムを図2に示す。脂肪酸プロフィール中のEDA、ETrA、EPA、およびDHAの存在は、GLAおよびSTAの不在と共に、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)が長鎖(LC)PUFA生合成のためにΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路を使用すること、およびΔ9エロンガーゼなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、LC−PUFA生合成遺伝子の良好な起源になり得ることを示唆した。
Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA)からのCloneminerTM cDNAライブラリー構築キット(カタログ番号18249−029)を使用し、提供された製造業者のプロトコール(バージョンB、25−0608)に従ってcDNAライブラリーを作成した。非放射標識法を使用して、5.12μgの(上述の)mRNAから、ビオチン−attB2−オリゴ(dT)プライマーを使用してcDNAを合成した。第1および第2のストランドの合成後、attB1アダプターを添加してライゲートし、カラムクロマトグラフィーを使用してcDNAをサイズ分画した。画分からのDNAを濃縮し、pDONRTM222に遺伝子組み換えして、大腸菌(E.coli)ElectroMAXTM DH10BTM T1ファージ−抵抗性細胞(Invitrogen Corporation)に形質転換した。ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)ライブラリーをeug1cと命名した。
ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373からの全長Δ9エロンガーゼの単離
本実施例は、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373からのΔ9エロンガーゼをコードするcDNA(配列番号1および2)の同定について述べている。この研究はミドリムシ(Euglena gracilis)Δ9エロンガーゼ(EgD9e;配列番号3)に由来するプローブの作成、およびユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373からのΔ9エロンガーゼ相同体を同定するためのプローブとcDNAライブラリーeug1cとのハイブリダイゼーションを含んだ。
New England Biolabs Inc.(Beverly,MA)からのVentR(登録商標)DNAポリメラーゼ(カタログ番号M0254S)使用し製造業者のプロトコールに従って、ミドリムシ(Euglena gracilis)Δ9エロンガーゼ(EgD9e;配列番号3;米国特許出願第11/601,563号明細書で述べられている)を含有してeeg1c.pk001.n5fと称されるユーグレナ(Euglena)cDNAライブラリーからのクローン(eeg1c)をテンプレートとして使用して、EgD9eをオリゴヌクレオチドプライマーoEugEL1−1(配列番号5)およびoEugEL1−2(配列番号6)によって増幅した。得られたDNA断片をZero Blunt(登録商標)PCRクローニングキット(Invitrogen Corporation)を使用し製造業者のプロトコールに従って、pCR−Blunt(登録商標)クローニングベクターにクローンしてpKR906(配列番号15)を生成した。
LB+50μg/mLカナマイシン寒天培地をそれぞれ含有するCorning(Corning,NY)からの3個の大型正方形(24cm×24cm)ペトリ皿に、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)cDNAライブラリーeug1cのおよそ17,000個のクローンを播種した。細胞を37℃で一晩成長させ、次にプレートを室温に冷却した。
膜を200mLハイブリダイゼーション溶液中で、65℃で2時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液は、6×SSPE(20×SSPEは3M塩化ナトリウム、0.2Mリン酸ナトリウム、20mM EDTA、pH7.4)、5×デンハルト試薬(100×デンハルト試薬は2%(w/v)Ficoll、2%(w/v)ポリビニルピロリドン、2%(w/v)アセチル化ウシ血清アルブミン)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100μg/mL剪断サケ精子DNA、および5%硫酸デキストランを含有した。
ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373(EaD9Elo1およびEaD9Elo2)のΔ9エロンガーゼ配列の一次配列分析およびその他の公開されたΔ9エロンガーゼ配列との比較
DNASTAR Inc.(Madison,WI)からのLASERGENEバイオインフォマティクス演算スイートMegAlignTMv6.1プログラムをペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター(KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5およびDIAGONALS SAVED=5およびGAP LENGTH PENALTY=10)で使用して、Clustal V法(Higgins,D.G.およびSharp,P.M.、Comput.Appl.Biosci.,5:151〜153(1989年);Higginsら、Comput.Appl.Biosci.,8:189〜191(1992年))を使用して、EaD9Elo1(配列番号13)およびEaD9Elo2(配列番号14)のアミノ酸配列を比較した。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中におけるユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)UTEX 373Δ9エロンガーゼの機能解析
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中におけるEaD9Elo1(配列番号13)およびEaD9Elo2(配列番号14)の機能解析について述べる。この研究は、(1)Gateway(登録商標)適合性ヤロウィア(Yarrowia)発現ベクターpY159を構築するステップと(2)EaD9Elo1およびEaD9Elo2をpY159に転移してpY173およびpY174を生成するステップと、(3)pY173およびpY174を含んでなる形質転換生物内の脂質プロフィールを比較するステップとを含む。
プラスミドpY5−30(米国特許第7,259,255号明細書ですでに述べられている)は、大腸菌(E.coli)およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の双方の中で複製できるシャトルプラスミドである。プラスミドpY5−30は、ヤロウィア(Yarrowia)自律複製配列(ARS18)、ColE1プラスミド複製起点、大腸菌(E.coli)中における選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子(AmpR)、ヤロウィア(Yarrowia)中における選択のためのヤロウィア(Yarrowia)LEU2遺伝子、およびキメラTEF::GUS::XPR遺伝子を含有する。当業者によく知られている技術を使用して、TEFプロモーターをヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)FBAINmプロモーター(米国特許第7,202,356号明細書)で置換して、プラスミドpDMW263(配列番号17)をpY5−30から作り出した。簡単に述べるとこのプロモーターは、fba1遺伝子によってコードされる果糖−ビスホスフェートアルドラーゼ酵素(E.C.4.1.2.13)の「ATG」翻訳開始コドン前の5’上流非翻訳領域に位置して発現に必要な修飾プロモーターと、イントロンを有する5’コード領域の部分とを指し、FBAINmは、FBAINプロモーターのATG翻訳開始コドンおよびイントロン間の52bpの欠失(その結果N−末端の22個のアミノ酸のみを含む)と、イントロン後の新しい翻訳コンセンサスモチーフとを有する。表6はpDMW263(配列番号17)の構成要素を要約する。
Gateway(登録商標)LR ClonaseTMII酵素ミックス(カタログ番号11791−020、Invitrogen Corporation)を使用し製造業者のプロトコールに従って、pLF121−1(配列番号9;実施例2)およびpLF121−2(配列番号10;実施例2)からのcDNA挿入断片をpY159(配列番号23)に転移して、pY173(配列番号24;図3C)およびpY174(配列番号25;図3D)をそれぞれ形成した。
Y2224株を次の様にして単離した。250mg/Lの5−FOA(Zymo Research)を含有するMMプレート(各75mg/Lのウラシルおよびウリジン、硫酸アンモニア添加6.7g/L YNB、アミノ酸非含有、20g/Lグルコース)上に、YPD寒天プレート(1%酵母抽出物、2%バクトペプトン、2%グルコース、2%寒天)からのヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362細胞を画線培養した。プレートを28℃でインキュベートし、得られたコロニーの内4つを200mg/mLの5−FOAを含有するMMプレートと、ウラシルおよびウリジンを欠くMMプレート上とに別々にパッチ培養して、ウラシルUra3栄養要求性を確認した。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)のためにコドン最適化されたΔ9エロンガーゼ遺伝子(EaD9ES)の合成
国際公開第2004/101753号パンフレットおよび米国特許第7,125,672号明細書で述べられているのと類似した方法で、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)のΔ9エロンガーゼ遺伝子(EaD9Elo1)のコドン使用頻度をヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中での発現のために最適化した。具体的には、コドン最適化されたΔ9エロンガーゼ遺伝子(「EaD9ES」と称される;配列番号26)をEaD9Elo1(配列番号11)のコード配列に基づいて、ヤロウィア(Yarrowia)コドン使用頻度パターン(国際公開第2004/101753号パンフレット)、「ATG」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびRNA安定性の原則(Guhaniyogi,G.およびJ.Brewer,Gene,265(1〜2):11〜23(2001年))に従ってデザインした。翻訳開始部位の修飾に加えて、774bpコード領域の106bp(13.7%)を修飾し、98個のコドン(38.0%)を最適化した。GC含量(52.1%)は、野性型遺伝子(すなわちEaD9Elo1)と合成遺伝子(すなわちEaD9ES)の間でほぼ同一であった。NcoI部位およびNotI部位を翻訳開始コドン周辺、およびEaD9ES(配列番号26)の停止コドン後にそれぞれ組み込んだ。図4Aおよび4Bは、EaD9Elo1(配列番号11)とEaD9ES(配列番号26)のヌクレオチド配列の比較を示す。コドン最適化された遺伝子によってコードされるタンパク質配列(すなわち配列番号27)は、野生型タンパク質配列(すなわち配列番号13)と同一である。デザインされたEaD9ES遺伝子は、GenScript Corporation(Piscataway,NJ)によって合成されpUC57(Genbank登録番号Y14837)にクローンされて、pEaD9ES(配列番号28;図5A)が作り出された。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中での発現のためにコドン最適化された(ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)に由来する)合成Δ9エロンガーゼ遺伝子(EaD9ES)を含んでなるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)発現ベクターpZUFmEaD9ESの構築および機能解析
本実施例は、キメラFBAINm::EaD9ES::Pex20遺伝子を含んでなる、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ベクターpZUFmEaD9ESの機能発現について述べており、EaD9ESはユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)に由来して、ヤロウィア(Yarrowia)中での発現のためにコドン最適化された合成Δ9エロンガーゼである。プラスミドpZUFmEaD9ES(図5B)は以下の構成要素を含有した。
一般方法で述べられるようにして、プラスミドpZUFmEaD9ESをY2224株(野生型ヤロウィア(Yarrowia)ATCC#20362株のUra3遺伝子の自律性突然変異からのFOA抵抗性変異体)に形質転換した。形質転換体を上MMプレートで選択した。30℃で2日間の生育後、形質転換体を拾って新鮮なMMプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を個々に3mLの液体MMに30℃で接種して、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてHewlett−Packard 6890 GCで分析した。
Claims (12)
- (a)Δ9エロンガーゼ活性を有して、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルV法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号11、配列番号12または配列番号26に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのブラストN法に基づいて少なくとも80%の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
(c)Δ9エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号11、配列番号12または配列番号26に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
(d)(a)、(b)または(c)のヌクレオチド配列の相補体
を含み、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって100%相補的である、単離されたポリヌクレオチドを含む、微生物宿主細胞。 - 単離されたポリヌクレオチドが、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項1に記載の微生物宿主細胞。
- 酵母、藻類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、請求項1に記載の微生物宿主細胞。
- 細胞がクサレケカビ属の真菌である、請求項3に記載の微生物宿主細胞。
- 細胞がヤブレツボカビ種およびシゾキトリウム種からなる群から選択されるストラメノパイルである、請求項3に記載の微生物宿主細胞。
- 酵母が油性酵母である、請求項3に記載の微生物宿主細胞。
- 油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、請求項6に記載の微生物宿主細胞。
- a)(i)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルV法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)リノール酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
b)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、リノール酸をエイコサジエン酸に変換する条件下でステップ(a)の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサジエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサジエン酸を生産する方法。 - a)(i)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号13または配列番号14に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルV法に基づいて少なくとも80%のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
(ii)α−リノレン酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
b)Δ9エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換する条件下で、ステップ(a)の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
c)場合によりステップ(b)のエイコサトリエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサトリエン酸を生産する方法。 - 微生物宿主細胞が、配列番号26に記載のΔ9エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子を含むヤロウィア種であり、組み換えヌクレオチド分子がヤロウィア中での発現のために最適化された少なくとも98個のコドンを含む、請求項8または9に記載の方法。
- a.)組み換え核酸分子が、配列番号11、配列番号12または配列番号26からなる群から選択される核酸配列を有し、
b.)宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、
請求項8または9に記載の方法。 - 配列番号26に記載のΔ9エロンガーゼをコードして、少なくとも98個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
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