JP2010518175A - ノッティン(knottin)タンパク質部分を含むポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、骨格部分およびヘリックス部分を含むポリペプチドであって、このとき前記ヘリックス部分は前記骨格部分内に挿入され、前記骨格部分はノッティン(ノッティン(knottin))タンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントを含み、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記ノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
Description
本発明は、骨格部分およびヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分を含むポリペプチド、同一物を含む医薬組成物およびそれらの使用に関する。
骨粗しょう症は、閉経後の女性において一般的であるが、閉経前の女性や男性も罹患する疾患であり、骨ミネラル密度の減少および骨微細構造の崩壊と結び付いている。骨粗しょう症は、骨を弱化させる骨格の疾患であり、特に脊柱、股関節および手関節における骨折のリスク上昇を引き起こす。この疾患は無症状で発生することが多く、骨折が発生するまで数十年にわたり知覚されないまま進行する。骨粗しょう症により弱化した骨は、非骨粗しょう症性のヒトにおいては通常は発生しないような小さな転倒や傷害の結果として折れることがあり、可動度の減少、疼痛および変形を引き起こす。
骨粗しょう症を治療および/または予防するために使用できる多数の療法(総説については、Hodsman,A.B.,Bauer,D.C.,Dempster,D.W.,Dian,L.,Hanley,D.A.,Harris,S.T.,Kendler,D.L.,McClung,M.R.,Miller,P.D.,Olszynski,W.P.,Orwoll,E.,and Yuen,C.K.(2005),Endocrine Rev.26,688−703を参照されたい)、特にビスホスフォネート製剤(Storm,T.,Thamsborg,G.,Steiniche,T.,Genant,H.K.,and Sorensen,O.H.(1990),N.Engl.J.Med.322,1265−1271;Watts,N.B.,Harris,S.T.,Genant,H.K.,Wasnich,R.D.,Miller,P.D.,Jackson,R.D.,Licata,A.A.,Ross,P.,Woodson,G.C.,and Yanover,M.J.(1990),N.Engl.J.Med.323,73−39;Black,D.M.,Cummings,S.R.,Karpf,D.B.,Cauley,J.A.,Thompson,D.E.,Nevitt,M.C.,Bauer,D.C.,Genant,H.K.,Haskell,W.L.,Marcus,R.,Ott,S.M.,Tomer,J.C.,Quandt,S.A.,Reiss,T.F.,and Ensrud,K.E.(1996),Lancet 348,1535−1541;Cummings,S.R.,Black,D.M.,Thompson,D.E.,Applegate,W.B.,Barrett−Connor,E.,Musliner,T.A.,Palermo,L.,Prineas,R.,Rubin,S.M.,Scott,J.C.,Bogt,T.,Wallace,R.,Yates,A.J.,and LaCrois,A.Z.(1998),JAMA 280,2077−2082)、エストロゲン(Rossouw,J.E.,Anderson,G.L.,Prentice,R.L.,LaCroiz,A.Z.,Kooperberg,C.,Stefanick,M.L.,Jackson,R.D.,Beresford,S.A.,Howard,B.V.,Johnson,K.C.,Kotchen,J.M.,and Ockene,J.(2002):Writing Group for the Womens’s Health Initiative Investigators 2002,JAMA 288,321−333)、ラロキシフェン(Ettinger,B.,Black,D.M.,Mitlak,B.H.,Knickerbocker,R.K.,Nickelsen,T.,Genant,H.K.,Christiansen,C.,Delmas,P.D.,Zanchetta,J.R.Stakkestad,J.,Gluer,C.C.,Krueger,K.,Cohen,F.J.,Eckert,S.,Ensrud,K.E.,Avioli,L.V.,Lips,P.,and Cummings,S.R.(1999),JAMA 282,637−645)、鼻腔内カルシトニン(Chesnut,C.H.,Silverman,S.,Andriano,K.,Genant,H.,Gimona,A.,Harris,S.,Kiel,D.,LeBoff,M.,Maricic,M.,Miller,P.,Moniz,C.,Peacock,M.,Richardson,P.,Watts,N.,and Baylink,D.(2000),Am.J.Med.109,267−276)および副甲状腺ホルモン(PTH)(Hodsman,A.B.,Hanley,D.A.,Ettinger,M.P.,Bolognese,M.A.,Fox,J.,Metcalfe A.J.,and Lindsay,R.(2003),J.Clin.Endocrinol.Metab.88,5212−5220)は公知である。
PTHは、84個のアミノ酸残基を含むペプチドであり、血液および腎臓における細胞外カルシウム恒常性を調節する責任を担っている(Chorev,M.,Alexander,J.,and Rosenblatt,M.(2001),In:The Parathyroids − Basic and Clinical Concepts(Bilezikian,J.,Levine,M.,and Marcus,R.,eds),pp.53−91.Raven Press,New York;M.Chorev,M.,and Rosenblatt,M.(2002),In:Principles of Bone Biology(Bilezikian,J.,Raisz,L.,and Rodan,G.A.,eds),pp.423−461.Academic Press,San Diego,USA.)。PTHは、クラスIIのGタンパク質結合受容体であるPTH/PTHrP受容体に作用して、アデニリルシクラーゼ/cAMPおよびホスホリパーゼC/イノシトールリン酸シグナル伝達経路を刺激する。ペプチド欠失試験は、PTHのN末端残基がP1R活性化(Tregear,G.W.,Van Rietschoten,J.,Greene,E.,Keutmann,H.T.,Niall,H.D.,Reit,B.,Parsons,J.A.,and Potts,J.T.(1973),Endocrinology 93,1349;Takasu,H.,Gardella,T.J.,Luck,M.D.,Potts,J.T.,and Bringhurst,F.R.(1999),Biochemistry 38,13453)および架橋結合に極めて重要な役割を果たすことを証明している。受容体突然変異誘発試験は、PTHのN末端残基が、膜貫通ヘリックスの細胞外ループおよび細胞外末端を含有するP1Rの部分と相互作用することを解明した(Bergwitz,C.,Gardella,T.J.,Flannery,M.R.,Potts,J.T.,H.Kronenberg,M.,Goldring,S.R.,and Jueppner,H.(1996),J.Biol.Chem.271,26469;Hoare,S.R.J.,Gardella,T.J.,and Usdin,T.B.(2001),J.Biol.Chem.276,7741;V.Behar,A.Bisello,B.Bitan,M.Rosenblatt,M.Chorev(2000),J.Biol.Chem.275,9;M.D.Luck,P.H.Carter,T.J.Gardella(1999),Mol.Endocrinol.13,670.)。
図1に示したPTHのN末端1−34配列は、PTH(1−34)とも呼ばれ、無傷PTHホルモンの全カルシウム調節活性(calciotropic activity)を維持している。臨床試験は、PTH(1−34)が、閉経後の女性における骨ミネラル密度を回復させる、そして骨折のリスクを減少させることのできる強力な骨同化剤であることを証明している。近年、FORTEO(登録商標)(テリパラチド;Eli Lilly and Company社、米国インディアナ州インディアナポリス)という名称が付けられた組換えヒトPTH(1−34)が、骨折に対して高リスク状態にある閉経後の女性における骨粗しょう症を治療する目的でFDAにより承認された。
PTHもしくはそのN末端フラグメントが骨粗しょう症の治療薬として適切な薬剤であるという所見は、例えば腫瘍の結果としてのPTH過剰の存在に結び付いた病理的状態である副甲状腺機能亢進症は骨量の増加ではなく骨量の減少と関連付けられていたので、若干驚くべきことである。しかし厳密には、PTHは骨粗しょう症を治癒させるのではなく、骨量を大きく回復させ、骨の強度を増加させ、そして骨折の発生率を劇的に減少させる(Reeve,J.,Meunier,P.J.,Parsons,J.A.,BErnat,M.,Bijvoet,O.L.,Courpron,P.,Edouard,C.,Klenerman,L.,Neer,R.M.,Renier,J.C.,Slovik,D.,Vismans,F.J.,and Potts,J.T.(1980),British Medical Journal 280,1340−1344;Tam,C.S.,Heersche,J.M.,Murray,T.M.,and Parsons,J.A.(1982),Endocrinology 110,506−512;Lindsay,R.,Nieves,J.,Formica,C.,Henneman,E.,Woelfert,L.,Shen,V.,Dempster,D.,and Cosman,F.(1997),Lancet 350,550−555;Lane,N.E.,Sanchez,S.,Modin,G.W.,Genant,H.K.,Pierini,E.,and Arnaud,C.D.(1998),Journal of Clinical Investigation 102,1627−1633;Dempster,D.W.,Cosman,F.,Kurland,E.D.,Zhou,H.,Nieves,J.,Woelfert,L.,Shane,E.,Plavetic,K.,Muller,R.,Bilezikian,J.,and Lindsay,R.(2001),Journal of Bone and Mineral Research 16,1846−1853;Neer,R.M.,Arnaud,C.D.,Zanchetta,J.R.,Prince,R.,Gaich,G.A.,Reginster,J.Y.,Hodsman,A.B.,Eriksen,E.F.,Ish−Shalom,S.,Genant,H.K.,Wand,O.,and Mitlak,B.H.(2001) Effect of parathyroid hormone(1−34) on fractures and bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis.New England Journal of Medicine 344,1434−1441)。PTH(1−84)は、EU内での製造販売承認を得たもので、Preotact(登録商標)として公知である。その作用機序は、骨芽細胞上にのみ存在するPTH受容体に関連している。ホルモンによるその活性化は骨芽細胞の寿命を延長させ、その活性を増加させて骨形成を導くことができる。骨芽細胞から破骨細胞への幾つかの中間メッセンジャーによる後者を刺激して骨を吸収することのシグナル伝達は、骨芽細胞の初期の直接刺激ほど迅速には発生しない。そこで、一過性であるPHTレベルの上昇は骨芽細胞同化活性を刺激する可能性があるが、それでもまだ破骨細胞を通しての結合異化反応は誘発しない(Potts,J.T.(2005),Journal of Endocrinology 187,311−325)。PTHの投与においては、タイミングが極めて重要であると思われる。制御された速度でホルモンの投与を行った試験動物における重要な試験(Dobing,H.,and Turner,R.T.(1997),Endocrinology 138,4607−4612)は、PTHへの2時間未満の暴露が同化反応を誘発するが、2時間より長くなると異化反応を誘発することを証明した。このため、増加したPTHレベルへの短時間の暴露の結果として好都合の同化反応が発生する精確な細胞機序は公知ではないが、PTHの間欠的投与、例えば組換えPTH(1−34)の1日20μgの皮下投与は、ペプチドの持続的投与とは対照的に有益であることは明瞭に確証されている(Compston,J.E(2006),Bone 2006 Oct 11,electronic publication ahead of print)。
極性および非極性溶媒中のPTH(1−34)アナログについてのNMRおよび構造計算による立体配座研究(Marx,U.C.,Austermann,S.,Bayer,P.,Adermann,K.,Eschart,A.,Stich,H.,Walter,S.,Schmid,F.X.,Janicke,R.,Forssmann,W.G.,and Rosch,P.(1995) J.Biol.Chem.270,15194;Marx,U.C.,Adermann,K.,Bayer,P.,Meyer,M.,Forssmann,W.G.,Rosch,P.(1998),J.Biol.Chem.273,4308;M.Pellegrini,A.Bisello,M.Rosenblatt,M.Chorev,D.F.Mierke(1998),Biochemistry 37,12737)は、膜貫通ヘプタヘリカルGタンパク質結合受容体の活性化の責任を担っていることが公知のPTHのN末端部分が、10個のアミノ酸残基の短いヘリックス部分を含有すると提案している。さらに、もっと短いアナログであるPTH(1−14)は、細胞中の高マイクロモル濃度でcAMP形成を活性化することができる(Shimizu,M.,Potts,J.T.,Gardella,T.J.(2000),J.Biol.Chem.275,21836)。PTH(1−14)の効力は、特異的アミノ酸置換の導入によって顕著に増加させることができる。ホモアルギニン(Har)含有アナログは、天然PTH(1−H)−NH2より40倍効力が高い。近年、Ca−四置換の立体障害α−アミノ酸(Aib)の導入は、PTH−(1−14)−NH2の効力およびより短い配列であるPTH(1−11)−NH2の効力さえ強度に増加させることが証明されている(Shimizu,N.,Guo,J.,Gardella,T.J.(2001),J.Biol.Chem.276,49003)。Aibならびに関連するキラルおよびアキラルアナログおよびホモログは、X線分析による極めて多数の結晶構造決定によって例示されるように、オリゴペプチドにおける安定性ヘリックス形成を促進することが広汎に公知である(Toniolo,C.,and Benedetti,E.(1991),Trends Biochem.Sci.1991,16,350;Karle,L.,and Balaram,P.(1990),Biochemistry 29,6747;Kaul,R.,and Balaram,P.(1999):Stereochemical control of peptide folding.Bioorg.Med.Chem.7,105)。
天然PTHのN末端残基の一部をペプチドヘリシティ増加性残基(Gln、Aib、Har)と交換すると、PTH−1受容体(P1R)への増加した結合効力を生じさせるという以前の所見と一致して、αヘリックス構造モチーフはPTH/P1R受容体との相互作用を助長できると提案されてきた(Shimizu,N.,Petroni,B.D.,Khatri,A.,and Gardella,T.J.(2003),Biochemistry 42,2282;Tsomaia,N.,Pellegrini,M.,Hyde,K.,Gardella,T.J.,Mierke,D.F.(2004),Biochemistry 43,690)。
しかし、短く、概して構造化されていないペプチドは細胞プロテアーゼによって容易に分解されるという見解と一致して、ヒト血漿中のPTHおよび最小化PTHの半減期は極端に短い。結果として、FORTEO(登録商標)は、皮下注射によって毎日投与されなければならず、患者および医師両方の側で高度の努力を必要とする、むしろ非便宜的な投与方法である。
このため、本発明の基礎にある課題は、好ましくは生物活性ペプチドであるペプチドを例えば有機体などの生体系へ投与することを許容する手段を提供することである。
本発明の基礎にあるまた別の課題は、好ましくは生物活性ペプチドおよび/または非構造化ペプチドであるペプチドが生物学的に非活性にされることから保護することを可能にする手段を提供することであるが、そのような非活性化はペプチドの分解またはそれに該ペプチドが投与されている有機体などの生体系からのペプチドの除去によって発生する可能性がある。
これらやその他の課題は、本発明およびそれに添付の独立請求項によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から取り出すことができる。
本発明の基礎にある課題は、第1態様では、骨格部分およびヘリックス部分を含むポリペプチドによって解決されるが、このとき
該ヘリックス部分は該骨格部分内に挿入され、
該骨格部分はノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントを含み、
該ポリペプチドのアミノ酸配列は、該ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
該ヘリックス部分は該骨格部分内に挿入され、
該骨格部分はノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントを含み、
該ポリペプチドのアミノ酸配列は、該ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
本発明の基礎にある課題は、第2態様では、骨格部分および生物活性ペプチド部分を含むポリペプチドによって解決されるが、このとき
該生物活性ペプチド部分は該骨格部分内に挿入され、
該骨格部分はノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントを含み、
該ポリペプチドのアミノ酸配列は、該ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
該生物活性ペプチド部分は該骨格部分内に挿入され、
該骨格部分はノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントを含み、
該ポリペプチドのアミノ酸配列は、該ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違する。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ポリペプチドおよび/または骨格部分は、環状である。
本発明の第1および第2態様のまた別の実施形態では、ポリペプチドおよび/または骨格部分は、直鎖状である。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質は、EETI−II M7I、oMcoTI−II、McoEeTI、AGRP’およびObtustatinを含む群から選択される。
本発明の第1および第2態様のまた別の実施形態では、ヘリックス部分はアミノ酸配列を含み、このときそのようなアミノ酸配列は生物活性ペプチドであり、好ましくはそのような生物活性ペプチドは、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、GPCRリガンド、イオンチャネルリガンド、DNAもしくはRNAリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび/または誘導体を含む群から選択される。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、生物活性ペプチド部分はアミノ酸配列を含んでおり、このときそのようなアミノ酸配列は、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、プロテアーゼ阻害剤、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび/または誘導体を含む群から選択されるペプチドの1つである。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、骨格部分のアミノ酸配列は、少なくとも2個、好ましくは少なくとも4個、およびより好ましくは6個のCys残基を含む。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、骨格部分のアミノ酸配列は、6または8個のシステインを含む。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分内に、骨格部分のノッティン(knottin)タンパク質の2個のCys残基間で挿入されている。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分内に、N末端からC末端へ計数して、骨格部分の第1および第2、第4および第5、または第5および第6Cys残基間で挿入されている。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、骨格部分は、それらの間にヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分が挿入されているノッティン(knottin)タンパク質もしくはそれらのフラグメントのCys残基間の少なくとも1個、好ましくはそれ以上、および最も好ましくは全部のアミノ酸残基が欠失していることによってノッティン(knottin)タンパク質から引き出される。
1つの好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質もしくはそのフラグメントのCys残基間のアミノ酸残基の全部が欠失している。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ポリペプチドは、以下の構造を含むか、それからなる。
ノッティン(knottin)タンパク質は、EETI−II M7Iであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、oMcoTI−IIであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、McoEeTIであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、AGRP’であり、ノッティン(knottin)タンパク質の第5および第6システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、Obtustatinであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第4および第5システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている。
ノッティン(knottin)タンパク質は、EETI−II M7Iであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、oMcoTI−IIであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、McoEeTIであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、AGRP’であり、ノッティン(knottin)タンパク質の第5および第6システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、または
ノッティン(knottin)タンパク質は、Obtustatinであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第4および第5システイン間のアミノ酸配列は、一部またはその全部がヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分のN末端またはC末端に融合している。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、生物活性ペプチド部分は、PTH、PTH誘導体およびPTHアナログを含む群から選択され、好ましくは配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、およびそれらのフラグメントおよび/または誘導体から選択される。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、骨格部分は配列番号4に記載のoMcoTI−IIであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号2記載のアミノ酸配列もしくは配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分のヘリックス部分は配列番号4に記載のアミノ酸配列の第1システインおよび第2システインの間に挿入され、アミノ酸残基の置換はノッティン(knottin)タンパク質のアミノ酸配列の該2つのシステイン間で発生する。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、骨格部分は配列番号4に記載のoMcoTI−IIであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号3記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分のヘリックス部分は配列番号4に記載のアミノ酸配列の第1システインおよび第2システインの間に挿入され、アミノ酸残基の置換はノッティン(knottin)タンパク質のアミノ酸配列の該2つのシステイン間で発生する。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ヘリックス部分および/または生物活性ペプチド部分の長さは約4〜30アミノ酸、好ましくは約4〜25アミノ酸、より好ましくは約4〜20アミノ酸、および一層より好ましくは約4〜15アミノ酸である。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ポリペプチドは、組換えタンパク質である。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号6、配列番号7、または配列番号13に記載のアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる。
本発明の第1および第2態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、化学的に合成されたタンパク質もしくは合成タンパク質である。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、骨格部分は、1つのノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントを含む。
本発明の第1および第2態様の別の実施形態では、骨格タンパク質は、1つのノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのマルチマー、好ましくはダイマーを含む。
本発明の第1および第2態様の1つの実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントは、本発明の第1および第2態様の1つの実施形態のいずれかの実施形態で規定したノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントである。
本発明の基礎にある課題は、第3態様では、本発明の第1および/または第2態様に記載のポリペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物によって解決される。
本発明の第3態様の実施形態では、医薬組成物は、経口投与用である。
本発明の基礎にある課題は、第4態様では、疾患を治療または予防するための医薬品を製造するための本発明の第1および/または第2態様によるポリペプチドの使用によって解決される。
本発明の基礎にある課題は、第5態様では、疾患を診断するための診断薬を製造するための本発明の第1および/または第2態様によるポリペプチドの使用によって解決される。
本発明の第4および第5態様の1つの実施形態では、疾患は、骨関連疾患である。
本発明の第4および第5態様の1つの実施形態では、骨関連疾患は、低骨ミネラル含量(BMD)および/または骨脆弱性を特徴とする骨疾患である。
本発明の第4および第5態様の1つの実施形態では、骨疾患は、原発性および続発性骨粗しょう症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折およびインプラント治癒、ならびに他の疾患に起因する骨量減少を含む群から選択される。
本発明の第4および第5態様の1つの実施形態では、骨量減少の結果として生じる他の疾患は、HIV感染症、癌および関節炎を含む群から選択される。
本発明の第4および第5態様のまた別の実施形態では、インプラント治癒は、歯科インプラントまたは股関節インプラントのインプラント治癒である。
本発明の第4および第5態様の1つの実施形態では、骨関連疾患は、変形性関節症、関節炎、ならびに骨溶解性病変の形成および存在を含む群から選択される。
本発明者らは、驚くべきことに、骨格部分およびヘリックス部分、より好ましくはαヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分を含むポリペプチドであって、該ヘリックス部分もしくは該生物活性ペプチド部分は該骨格部分内に挿入され、該骨格部分はノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントを含み、および該ポリペプチドのアミノ酸配列は該ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違するポリペプチドは、該ヘリックス部分もしくは該生物活性ペプチド部分を安定的に提示するのに適していることを見いだした。
本明細書で使用するヘリックス部分は、好ましくはヘリックスを含む部分であるか、ヘリックスからなる。好ましい実施形態では、ヘリックスは、αヘリックスである。
本明細書で使用する生物活性ペプチド部分は、生物活性ペプチドを含む部分であるか、生物活性ペプチドからなる。
1つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語「ヘリックス」もしくは例えば「ヘリカル」などの関連用語は、αヘリックスに関する。αヘリックスは、球状タンパク質および線維性タンパク質中で見いだされるタンパク質の共通二次構造モチーフである。球状タンパク質中のαヘリックスの平均長さは11アミノ酸であるが、一部の場合には50を超えるアミノ酸に伸長させることができる。ヘリックスは1回転に付き3.6アミノ酸を含有し、水素結合は、n番目のペプチドC=O結合が(n+4番目)のN−H基を指示するように配列されている(Voet and Voet,Biochemistry,1990,Wiley and Sons Inc.,p.149−150)。
なお一層驚くべきことに、本発明者らは、それ自体が一部の生物学的作用を示しているそのようなヘリックス部分、およびそれ自体が一部の生物学的作用を有する生物活性ペプチド部分は、それらが本発明のポリペプチドの一部である場合には該作用を保持することを明確に認識した。同様に驚くべきことに、本発明者らは、ノッティン(knottin)タンパク質の機能性がヘリックス部分が挿入されると保持されることを見いだした。1つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する「ノッティン(knottin)タンパク質の機能性」は、各野生型タンパク質と比較して本質的に変化していない構造的および機能的特性の状態を意味する。
任意の理論によって結び付けることを望まなくても、本発明者らは、ノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントはそのようなヘリックス部分のための骨格として、すなわち好ましくは一部のヘリックスを二次構造として有するペプチド、およびそのような生物活性ペプチド各々としてそれらの作用または活性を妨害せずに作用するために適合することを見いだした。さらに本発明者らは、そのような分子環境において作用もしくは活性を保持することは、典型的には部分およびペプチド各々の安定化とともに進行することを見いだした。そのような安定化は、好ましくは、本発明によるポリペプチドの一部を形成するのでなければ、ヘリックスおよびペプチド各々の安定化と比較して、ヘリックスおよびペプチド各々の増加した寿命によって示される。
詳細にはPHTおよびそのアナログに関して、本発明者らは、驚くべきことに例えば本明細書ではPTH−2とも呼ばれ、Aib−Val−Aib−Glu−Ile−Gln−Leu−Met−His−Gln−Har(配列番号3)のアミノ酸配列を有するPTH(1−11)、ならびに本明細書ではPTH−1とも呼ばれ、Aib−Val−Aib−Glu−Ile−Gln−Leu−Met−His−Gln−Har−Ala−Lys−Trp(配列番号2)のアミノ酸配列を有するPTH(1−14)、およびAib−Val−Aib−Glu−Ile−Gln−Leu−Met−His−Gln−Har−Ala−Lys−Tyr(配列番号12)のアミノ酸配列を有するPTH−1*などの生物活性PTHフラグメントは、それらの生物活性を保持しながらノッティン(knottin)骨格部分内に安定性で挿入ことができることを見いだした。本発明の好ましい実施形態では、骨格部分は、阻害剤シスチンノット(ICK)ポリペプチド(ノッティン(knottin)s)の剛体分子骨格によって提供される。
当分野においてシスチンノットミニタンパク質、本明細書ではノッティン(knottin)タンパク質もしくはマイクロタンパク質とも呼ばれるノッティン(knottin)は、典型的には40未満のアミノ酸から構成され、典型的には図3に示したようにシスチンノット、小さな三重鎖βシートおよび短い310ヘリックスを形成する三重ジスルフィド結合の配列からなる規定構造によって特徴付けられる(Craik,D.J.,Daly,N.L.,and Waine,C.(2001),Toxicon 39,43−60)。本発明の好ましい実施形態では、本文書のいずれかの状況、より好ましくはシステイン間のヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分の挿入の状況で扱われる任意の「システイン」は、各ノッティン(knottin)の天然ジスルフィド結合形成システインの1つである。ここで、システインは、広く受容された教科書に記載の略称によると「Cys」とも呼ばれる。ノッティン(knottin)は、カボチャ(squash)科に属する植物におけるプロテアーゼ阻害からヒトにおけるシグナル変換事象の誘発、海洋イモガイ(cone snail)により産生するきわめて強力な毒素であるコノトキシンのメンバーによるイオンチャネル遮断にまで及ぶ多量の様々な生物活性を実際に提示する。
シスチンノットは、構造安定化のために高度に効率的なモチーフであると思われる。ノッティン(knottin)の自律フォールディング単位は、いわゆるシスチン安定化βシートである基本の2つのジスルフィドモチーフである。ノッティン(knottin)の規定構造は、それらをpH、温度、ならびに追加のペプチド結合によってそれらのN末端およびC末端の結合を通して環状骨格を有する一部の変異体において特に顕著な作用であるタンパク質分解性攻撃に対して安定性にさせる(Colgrave,M.L.,and Craik,D.J.(2004),Biochemistry 43,5965−5975)。
典型的なノッティン(knottin)タンパク質は、キュウリ植物であるEcbalium elateriumの種子由来のトリプシン阻害剤EETI−IIの変異体であるEETI−II M7I(「−ET」とも呼ばれる)(Heitz,A.,Chiche,L.,Le−Nguyen,D.&Castro,B.,Biochemistry,1989.28(6):p.2392−8),Momordica cochinchinensis(ナンバンキカラスウリ)の種子由来の天然環状トリプシン阻害剤MCoTI−IIの直鎖状変異体であるoMcoTI−II(「−MC」とも呼ばれる)(Avrutina,O.,Schmoldt,H.U.,Kolmar,H.&Diederichsen,U.,Eur J Org Chem,2004(23):p.4931−4935)、Mco TIのアミノ末端部分およびEETIのカルボキシ末端部分からなる雑種ミニタンパク質であるMcoEeTI(「−MG」とも呼ばれる)(Schmoldt,H.U.,Wentzel,A.,Becker,S.&Kolmar,H.,Protein Expr Purif,2005.39(1):p.82−89)、オレキシゲン作用を備える視床下部メラノコルチン受容体の内因性アンタゴニストであるヒト−アグーチ関連タンパク質由来の合理的に最小化されたミニタンパク質であるAGRP’(「−AG」とも呼ばれる)(Jackson,P.J.,McNulty,J.C Yang,Y.K.,Thompson,D.A.,Chai,B.,Gantz,I.,Barsh,G.S.&Millhauser,G.L.,Biochemistry,2002.41(24):p.7565−72)ならびにVipera lebetina obtusa viper(クサリヘビ)の毒液から最初に単離されたジスインテグリンであるObtustatin(「−OB」とも呼ばれる)(Paz−Moreno−Murciano,M.,Monieon,D.,Marcinkiewicz,C.,Calvete,J.J.&Celda,B.,J Mol Biol,2003 May 23;329(1):135−45)である。これらのタンパク質は、他のインテグリンに特徴的な伝統的RGD配列を含有していない。
1つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語「骨格部分」は、単独で、またはヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分と組み合わせてのいずれかで、安定性三次構造および/または四次構造を取るタンパク質またはポリペプチドを意味する。当業者であれば、例えば生物物理学的方法、例えば円偏光二色性(Circular Dichroism)分光法、比色法もしくは核磁気共鳴分光法などの技術によって監視される溶融実験を使用して、または例えばタンパク質分解消化にとって問題となる構築物の耐性を検出する機能アッセイを通して、そのような構築物の安定性を定量する方法を認識している。また別の特に好ましい実施形態では、骨格部分は、少なくとも2個、好ましくは少なくとも4個、およびより好ましくは6個、またはさらにそれ以上のシステイン残基を含む。また別の特に好ましい実施形態では、骨格部分は6または8個のシステインを含む。典型的には、該Cys残基は、ジスルフィド結合の形成を通してポリペプチドの安定性を増加させる。そのようなジスルフィド結合は、天然システインまたは遺伝子組換え技術を通して導入されたシステイン、またはそれらの任意の組み合わせを形成できる。当業者であれば、本明細書における他の状況において特に言及されているように、利用可能な構造情報に基づいてそのような追加のジスルフィド結合を導入することができる。さらに、当業者であれば、一次配列、例えばN末端を、原核細胞もしくは真核細胞分解機構による分解度を減少させる方法で修飾することができる。当業者であれば、そのようなポリペプチドの合成、発現および精製のための方法も認識している。発現させるための方法は、最も頻繁にはその後のタグを除去するためのプロテアーゼ開裂部位、または適切な抗体を用いてポリペプチドもしくはポリペプチドを含む複合体を単離もしくは検出するためのエピトープタグと組み合わせて、一次構造の修飾、例えばHisタグ、GSTタグもしくはMBPタグなどの親和性タグの使用を含むことができる。
本発明の1つの実施形態では、骨格部分は、ノッティン(knottin)gタンパク質を含む。本発明の好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)は、EETI−II M7I(−ET)、oMcoTI−II(−MC)、McoEeTI(−MG)、AGRP’(−AG)およびオブツスタチン(Obtustatin(−OB)を含む群から選択される。oMcoTI−IIは、それがトリプシンを阻害する活性によってMomordica cochinchinensisの種子から単離した天然環状カボチャ阻害剤MCoTI−IIに由来した。これらの2つのマイクロタンパク質間の唯一の差異は、oMcoTI−IIが環化ループの一部を有していないことである(すなわち、アミノ酸残基28−32)。この超マイクロタンパク質は、出発点として使用された。本明細書においてより詳細に記載するように、PTH(1−11)およびPTH(1−14)のヘリカルモチーフをoMcoTI−IIタンパク質のシステインIおよびIIの間に導入すると(図4)、PTH Microbodies(商標)NC−MC−PTH−1および−2が産生した。
1つの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび/または骨格は環状であるが、これは好ましくは、例えば追加のペプチド結合によって、N末端およびC末端の結合を通して達成できる。しかし、原理上は、適切なアミノ酸残基側鎖は、環状ポリペプチドおよび/または骨格部分の形成を許容するように化学的に修飾することもできる。代替実施形態では、ポリペプチドおよび/または骨格部分は直鎖状であるが、これはアミノ酸残基側鎖を化学的に修飾することによって生成できるあらゆる種類の分枝状分子を含む。さらに、本発明のポリペプチドが直鎖状もしくは非環状であるが骨格部分は環状であること、および逆もまた同様であることも本発明の範囲内に含まれる。さらに、ポリペプチドもしくは骨格部分が直鎖状であり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分が環状であることもまた本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用する骨格部分はノッティン(knottin)タンパク質、そのフラグメントもしくはその誘導体であることは認識される。ノッティン(knottin)タンパク質のフラグメントもしくは誘導体は、好ましくは、そのようなフラグメントもしくは誘導体がノッティン(knottin)タンパク質として依然として機能的に活性である、少なくともそのようなフラグメントもしくは誘導体を含む本発明のポリペプチドが全長ノッティン(knottin)タンパク質もしくはそのような全長ノッティン(knottin)タンパク質由来の骨格を含む本発明のポリペプチドの特性の少なくとも1つを有する程度まで機能的に活性であることを前提に、ノッティン(knottin)タンパク質のフラグメントもしくは誘導体である。
ノッティン(knottin)タンパク質は、典型的にはモノマーであり、本発明のポリペプチドの1つの実施形態ではモノマーとして使用できる。しかし本発明の1つの実施形態では、骨格タンパク質は、そのようなノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのマルチマーを含む、またはそのようなノッティン(knottin)タンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントの1つより多いモノマー、好ましくはダイマーから形成されている。本発明の好ましい実施形態では、本明細書で使用する「マルチマー」は、本明細書ではモノマーとも呼ばれる1つの種の1つより多い分子を含む複合体である。好ましくは本明細書で使用する「ダイマー」は、同一種の2つの分子からなる複合体を含む。そのような複合体は、共有結合もしくは非共有結合複合体であってよい。1つの実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、1つもしくは複数のそのようなモノマー内に挿入されている。
好ましくは、骨格部分は、ノッティン(knottin)タンパク質由来のタンパク質もしくはポリペプチドである。誘導体化は、ノッティン(knottin)タンパク質のアミノ酸配列から開始して、ノッティン(knottin)タンパク質の2個のCys残基間に存在する1つ、2つ以上もしくは全部のアミノ酸が欠失しているように行われる。
1つの好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語「ヘリックス部分」は、ヘリックスを形成する、もしくは少なくとも部分的にヘリックス特性を有するアミノ酸の配列を意味する。そのようなアミノ酸は、個別に、または任意の組み合わせで、天然アミノ酸、タンパク質生成性アミノ酸または非天然アミノ酸であってよい。好ましくは、そのようなアミノ酸は、自然にアミノ酸配列内、もしくはその誘導体内に組み込まれるとヘリックスの形成を促進する。当業者は、そのような部分が必ずしも100%ヘリカルではないが、非構造化部分もしくは他の二次構造要素さえ含む可能性があることを認識している。別の好ましい実施形態では、ヘリックス部分は、例えばGln、Aib、Harなどであるがそれらに限定されないペプチドヘリックス性増加残基として公知の天然もしくは非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、適切なアミノ酸前駆体を使用して例えばそのようなペプチドもしくはポリペプチドの化学合成によって、該ペプチドもしくはポリペプチドを発現する有機体へ非天然アミノ酸もしくはそれらの前駆体を供給することによって、またはそのような非天然アミノ酸もしくはそれらの前駆体が化学的に取り込まれたtRNA分子を使用することによって、非天然アミノ酸をペプチドもしくはポリペプチド内に導入することができる。好ましくは本明細書で使用するアミノ酸は、カルボキシ基およびアミノ基の両方を含み、好ましくはペプチドもしくはポリペプチドの一次配列内に組み込むことのできる化学化合物である。
ヘリックス部分は、原理上は、サイズもしくは機能に関して制限されない。1つの実施形態では、ヘリックス部分でさえ、本発明の骨格部分内に、したがってポリペプチド内に挿入されると生物活性もしくは生物学的作用が保持され、その安定性が危険に晒されない限り、完全にフォールディングされたポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む。特に好ましい実施形態では、生物活性ペプチド部分もしくはヘリックス部分はアミノ酸配列を含んでおり、そのようなアミノ酸配列は生物活性ペプチドの1つであり、好ましくはそのような生物活性ペプチドは、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、GPCRリガンド、イオンチャネルリガンド、DNAもしくはRNAリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび/または誘導体を含む群から選択される。
1つの好ましい実施形態では、本明細書で言及する用語「生物活性ペプチド部分」は、生物系における一部の生物学的作用を引き出せるペプチド部分を含む。生物活性ペプチド部分は、原理上は、サイズもしくは機能に関して制限されない。1つの実施形態では、ヘリックス部分は、骨格内に生物活性もしくはその生物学的作用が挿入されると保持され、骨格の安定性が危険に晒されない限り、完全にフォールディングされたポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む。
ヘリックス部分は、好ましくは生物活性もしくは生物活性ペプチド部分に類似する生物学的作用を有する、または有する可能性があることは認識される。そのような生物活性は、好ましくは生物学的作用である。好ましくは本明細書で使用する生物学的作用は、抗原作用、受容体もしくは他の生物活性分子を阻害すること、免疫刺激作用、受容体結合作用、シグナルカスケードを誘発すること、および生物学的情報を伝達することを含む群から選択される任意の作用である。
1つの好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は、各々約4〜約30アミノ酸を含む。より好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は各々、4〜約25アミノ酸を含んでおり、さらに一層好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は各々、4〜約20アミノ酸を含んでおり、最も好ましい実施形態では、ヘリックスおよびヘリックス部分は各々、4〜約15アミノ酸を含む。サイズに関する同一の考察は、生物活性ペプチドおよび生物活性ペプチド部分各々にも適用できる。
最後に、ヘリックス部分が生物活性ペプチドを含む、もしくは表すこと、および生物活性ペプチド部分がヘリックスを含む、もしくはヘリックスからなることは本発明の範囲内に含まれる。
特に好ましい実施形態では、生物活性ペプチド部分もしくはヘリックス部分は、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、GPCRリガンド、イオンチャネルリガンド、DNAもしくはRNAリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび/または誘導体を含む群から選択される。さらに一層好ましい実施形態では、生物活性ペプチド部分は、PTH、PTH誘導体およびPTHアナログを含む群から選択され、好ましくは配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号3およびPTH(1−34)に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよび/または誘導体から選択される。
本発明の特に好ましい実施形態では、骨格部分は配列番号4に記載のoMcoTI−IIであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号2もしくは配列番号12記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分の部分は配列番号4に記載のアミノ酸配列のCys1およびCys2の間に挿入され、全アミノ酸残基の置換はノッティン(knottin)タンパク質のアミノ酸配列の該2つのシステイン間で発生する。結果として生じるポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
本発明の別の特に好ましい実施形態では、骨格部分は配列番号4に記載のoMcoTI−IIであり、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、生物活性ペプチド部分のヘリックス部分は配列番号4に記載のアミノ酸配列のシステイン1およびシステイン2の間に挿入され、全アミノ酸残基の置換はノッティン(knottin)タンパク質のアミノ酸配列の該2つのシステイン間で自然に発生する。結果として生じるポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
本発明によると、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、様々な位置で骨格部分内へ挿入できる。好ましい位置は、骨格部分の2つのシステイン残基間である。より好ましい実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分の第1および第2システイン残基間で挿入されている。Cys残基のナンバリングに関連して、Cys残基の計数はポリペプチドおよび骨格部分各々のN末端から開始されることに留意されたい。したがって、アミノ末端アミノ酸残基は第1であり、第1残基のC末端に結合したアミノ酸残基は第2であるなどである。別の実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分の挿入の前には、2つのシステイン残基間の全アミノ酸が欠失している。本発明のまた別の実施形態では、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分は、骨格部分のN末端またはC末端に融合している。
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質は、EETI−II M7Iであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質は、oMcoTI−IIであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質は、McoEeTIであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第1および第2システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。本発明のポリペプチドの別の好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質は、AGRP’であり、ノッティン(knottin)タンパク質の第5および第6システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって置換されている。別の好ましい実施形態では、ノッティン(knottin)タンパク質はObtustatinであり、ノッティン(knottin)タンパク質の第4および第5システイン間のアミノ酸配列は、ヘリックス部分もしくは生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列によって完全または部分的に置換されている。
本発明の1つの実施形態では、ポリペプチドは組換えポリペプチドであり、すなわちポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが、例えば大腸菌(E.coli)、酵母もしくは哺乳動物細胞系などの適切な発現有機体を形質転換させるために使用され、タンパク質は発現有機体の培養から精製される。別の実施形態では、ポリペプチドは、化学的に合成されたタンパク質または例えば固相合成法によってインビトロで合成されるタンパク質などの合成タンパク質である。各発現ベクターは、本発明のさらに別の態様である。
さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物に関する。
そのような医薬組成物は、ポリペプチドがタンパク質性アミノ酸からなるという前提の下で、治療有効量の本発明のポリペプチドもしくはそれをコードする核酸分子、および任意で医薬上許容される担体を含む。医薬組成物は、本明細書に記載したように、生理学的に許容される担体とともに患者へ投与することができる。1つの実施形態では、用語「医薬上許容される」は、規制官庁または動物、およびより特別にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識された薬局方によって承認されていることを意味する。用語「担体」は、それと一緒に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、もしくはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、無菌液体、水および油、例えば石油、動物性、植物性もしくは合成起源の油を含む油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであってよい。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の好ましい担体である。食塩液および水性デキストロースおよびグリセロール液もまた、特別には注射溶液のための液体担体としても使用することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。本組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取ることができる。本組成物は、伝統的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として調製することができる。
本発明に記載の組成物の好ましい実施形態は、経口組成物、すなわち経口投与のために企図される組成物である。いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、本発明によるポリペプチドの高度の安定性がそれらを経口投与および経口医薬製剤各々にし易くさせることを想定している。経口製剤には、標準的担体、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。適切な医薬担体の例は、E.W.による“Remington’s Pharmaceutical Sciences”によって記載されている。そのような組成物は、患者への適正な投与のための形態を提供できるように適切な量の担体と一緒に、好ましくは精製形にある治療有効量の本発明のポリペプチドを含有している。本製剤は、投与様式に適合するはずである。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は経口投与用である。
さらに別の態様では、本発明の基礎にある課題は、疾患を治療または予防するための医薬品を製造するために本発明のポリペプチドを使用することによって解決される。別の態様では、本発明の基礎にある課題は、疾患を診断するための診断薬を製造するためにポリペプチドを使用することによって解決される。両方の態様の好ましい実施形態では、疾患は、骨粗しょう症である。本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ヘリックス部分および生物活性ペプチド部分各々としてPTHまたはフラグメントおよび/または誘導体を含んでおり、間欠的投与用である。
本発明のポリペプチドから発生する任意の治療作用に類似する任意の診断は、好ましくはヘリックス部分および/または生物活性ペプチド部分によって媒介される。該部分は、好ましくはそれと該部分自体が反応性および相互作用性であるパートナーである相互作用パートナーと相互作用する。この相互作用は、治療作用について責任を担っている反応または相互作用パートナーの検出または相互作用パートナーの作用のいずれかを誘発する。
以下では、本発明のまた別の特徴、実施形態、態様および利点をそれから取り出すことのできる以下の図面および実施例によって、本発明をさらに説明する。
(NC−MC−PTH−1*および−2の化学合成)
(材料および方法)
使用した全ての化学物質は、入手可能な最高等級の化学物質であった。溶媒は、分析等級の溶媒であり、供給されたままで使用した。Nα−Fmoc保護アミノ酸は、以下の側鎖保護基:t−Bu(Asp、Tyr)、Boc(Lys)、Trt(Cys、Asn)、Pbf(Arg)とともに使用した。シュード−プロリンジペプチドであるFmoc−Asp(OtBu)−Ser(ψMe,Me)プロ−OHは、Calbiochem−Novabiochem GmbH社から購入した。ESI質量スペクトルは、TSQ 700 Finnegan分光計を用いて測定した。高分解能ESI質量スペクトルは、Bruker APEX−Q III 7Tを用いて記録した。HPLCは、YMC J’sphere ODS H−80、分取的ラン(250×4.6mm、4μm、80Å)および分析サンプル(250×4.6μm、80Å)のためのRP C−18カラムを用いてPharmacia Akta basicシステム上で実施した。
(材料および方法)
使用した全ての化学物質は、入手可能な最高等級の化学物質であった。溶媒は、分析等級の溶媒であり、供給されたままで使用した。Nα−Fmoc保護アミノ酸は、以下の側鎖保護基:t−Bu(Asp、Tyr)、Boc(Lys)、Trt(Cys、Asn)、Pbf(Arg)とともに使用した。シュード−プロリンジペプチドであるFmoc−Asp(OtBu)−Ser(ψMe,Me)プロ−OHは、Calbiochem−Novabiochem GmbH社から購入した。ESI質量スペクトルは、TSQ 700 Finnegan分光計を用いて測定した。高分解能ESI質量スペクトルは、Bruker APEX−Q III 7Tを用いて記録した。HPLCは、YMC J’sphere ODS H−80、分取的ラン(250×4.6mm、4μm、80Å)および分析サンプル(250×4.6μm、80Å)のためのRP C−18カラムを用いてPharmacia Akta basicシステム上で実施した。
(NC−MC−PTH−1*および−2のSPPS)
マイクロタンパク質のBoc−SPPSにおいては進行を視認できるにもかかわらず、このアプローチには幾つかの不利益がある。収率は、通常は極めて低く、自動合成中の一段階工程監視は、適切な発色団の欠如に起因して妨害される。これらのマイクロタンパク質を効率的に生成させるために、合成進行の段階的制御は、特に非天然アミノ酸が組み込まれる場合は有益である。さらに、Fmocをベースとする合成は強度の酸分解を除去し、総合的により軽度の合成条件を生じさせる。このため、マイクロタンパク質はより長いペプチドを伴う可能性のある凝集現象を認識しているFmoc保護戦略に基づくSPPSによって生成された。
マイクロタンパク質のBoc−SPPSにおいては進行を視認できるにもかかわらず、このアプローチには幾つかの不利益がある。収率は、通常は極めて低く、自動合成中の一段階工程監視は、適切な発色団の欠如に起因して妨害される。これらのマイクロタンパク質を効率的に生成させるために、合成進行の段階的制御は、特に非天然アミノ酸が組み込まれる場合は有益である。さらに、Fmocをベースとする合成は強度の酸分解を除去し、総合的により軽度の合成条件を生じさせる。このため、マイクロタンパク質はより長いペプチドを伴う可能性のある凝集現象を認識しているFmoc保護戦略に基づくSPPSによって生成された。
マイクロタンパク質の合成は、2つの部分に分けられた。最初の20アミノ酸は、安全なCys取り込みのために特殊サイクルを適用してペプチド合成装置ABI 433Aを用いて標準自動合成によって組み立てられた。oMcoTI−IIのシステインIIまでのタンパク質のこの部分は、Zagotovkaと呼ばれた(заготовка は、ラフストックの半製品を意味するロシア語である)。この樹脂を2つの部分に分け、次のアミノ酸はマニュアルプロトコールを用いて組み立てた。本発明者らは、最短配列PTH−1から始めた。Zagotovkaの自動合成が完了し、N末端Fmoc基が開裂された後、Fmoc−Har−OH構築ブロックを手動でHATU/DIEA(O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/エチルジイソプロピルアミンもしくはHuenig塩基)を用いて周囲温度で1.5時間以内にNMP(N−メチルピロリジノン)におけるインサイチュー活性化を通して結合させた。ニンヒドリンを用いたKaiser試験は、不完全結合を示したが、市販で入手できるこの構築ブロックが過剰に高価なために新鮮試薬との二重結合は実施しなかった。Ac2OおよびFmoc脱保護を用いたキャッピング後、鎖は、2つのグルタミンのための二重結合を用いて、ジメチルホルムアミド(DMF)中のHCTU/DIEA活性化を用いてAib残基まで自動的に集合された。活性化因子(ABI433ペプチド合成装置の計算プログラムによると3.9等量過剰)は固体としてアミノ酸カートリッジ内に直接的に加え、通常はHBTU/HOBt(O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液を含有する活性化混合液は純粋DMFと置換した。送達時間は、純粋DMFを用いて実施されたフローテストDの結果に基づいてプログラミングした。Aib残基は、Har構築ブロックについてと同一条件を用いて手動で結合した。N末端部分GVCPは、Cysの結合についての直交プログラムを用いて自動的に結合した。ペプチド鎖の集合が完了した後、ペプチドを乾燥させ、TEA−スカベンジャー混合物を用いて開裂させた。粗ペプチドのHPLC分析はむしろ低い品質の生成物を示した。それでも、混合物は完全に分離可能であり、標的生成物の精製後には顕著なピークを産生した(図5)。
直鎖状前駆体を精製し、4倍および3倍に荷電したフラグメントの存在ならびに質量ピークを証明したESI−MSを用いて分析した(図6)後、酸化を後に記載するように実施すると(フォールディング法)、驚くほど高い品質および収率でフォールディングされた生成物が得られた(図7)。
酸化した生成物は、ノッティン(knottin)ファミリーのメンバーに典型的な挙動を示した。それは還元直鎖状前駆体より早期に溶出された。ESI−MS(図8)は、酸化ペプチド(直鎖状ペプチドより6Da少ない)を示したが、可能性のあるダイマー(各モノマー内の2つの分子内ジスルフィド架橋、および1つの分子間結合を含有する)が予想される領域ではシグナルは検出されなかった。これは、ヘリックスの挿入は構造を危険にさらさない、またはオリジナルのノッティン(knottin)骨格の特性に影響を及ぼさないことを確証している。
Zagotovkaから出発したペプチドNC−MC−PTH−1*の合成は、初合成よりはるかに困難であった。配列AibVAibEIQLMHQHarAKYを導入するために、この困難な配列へ、ペプチド合成の様々な技術を適用した。自動または手動合成いずれかによる標準Fmoc合成によってこのポリペプチドを合成する試みは、不成功に終わった。2つのAib残基が、この失敗の理由であると予測された。第2アプローチでは、PTH配列のFmoc−Har−OH構築ブロックは、周囲温度で1.5時間以内にNMPにおけるインサイチュー活性化によるHATU/DIEAを用いて2回結合させた。Ac2OおよびFmoc脱保護を用いたキャッピング後、鎖は、全アミノ酸のための二重結合を用いて、DMF中のHCTU/DIEA活性化を用いてAib残基まで手動で集合した。Aib残基は、1構築ブロック当たり10分間以内に20Wおよび50℃で手動ペプチド合成のためにマイクロ波反応器内でのHATU/DIEA活性化を用いて二重結合させた。N末端部分GVCPは、2回結合させたFmoc−Pro−OHを除いて、1アミノ酸単一結合当たり5分間、20Wおよび40℃でマイクロ波支援SPPSを用いて組み立てた。ペプチド鎖の集合が完了した後、ペプチドを乾燥させ、20分間以内に20Wおよび38℃のマイクロ波反応器内においてTFAスカベンジャー混合物を用いて開裂させた。生成物をHPLCによって合成後の粗混合物から精製すると(図9)、4mgのNC−MC−PTH2が産生した。
分取的HPLC中に収集した全ピークをフォールディングバッファー中に溶解させ、一晩のインキュベーション後にHPLCによって分析した(図10)。1つのピークだけがノッティン(knottin)ファミリーのメンバーに典型的な挙動を示したが、これは還元直鎖状前駆体より早期に溶出した。酸化生成物の収量は、1.6mgである。
最終酸化かつ精製されたNC−MC−PTH−1*に高分解能ESI−MSを受けさせた(図11)。計算分子量は4138.84(酸化形)であり、実験的に決定された分子量は4138.84である。
(フォールディング法)
直鎖状PTHミクロボディのシスチン−ノットへの酸化は、1mgのペプチド当たり50μLの10mM HCl中に還元凍結乾燥ペプチドを溶解させ、その後に1〜1.5mg/mLの最終濃度へのNH4HCO3(200mM、pH9.1)の添加によって実施した(Wentzel,A.,Christmann,A.,Kraetzner,R.and Kolmar,H.(1999):Sequence requirements of the GPNG b−turn of the Ecballium elaterium trypsin inhibitor II explored by combinatorial library screening.J.Biol.Chem.274,21037−21043)。反応混合物は、室温での強力な攪拌下でPET容器中において一晩インキュベートした。フォールディングされたペプチドの精製は、Phenomenex C18カラム(分析的:250×4.60mm、分取的:250×10.00mm)を用いてRP−HPLCによって実施した。条件は以下のとおりであった。溶離液A:0.1%のTFAを含有するH2O。溶離液B:50%アセトニトリル、0.1%(v/v)のTFAを含有する50%の2−プロパノール。10〜37%のBの線形勾配は、分析目的には1mL/分、および分取的ランのためには3.5mL/分各々の流速を用いて実施した。217nmでの監視を用いて、酸化ペプチドを含有する画分を収集して凍結乾燥させた。酸化の成功は、ESI質量分光法によって確証された。
直鎖状PTHミクロボディのシスチン−ノットへの酸化は、1mgのペプチド当たり50μLの10mM HCl中に還元凍結乾燥ペプチドを溶解させ、その後に1〜1.5mg/mLの最終濃度へのNH4HCO3(200mM、pH9.1)の添加によって実施した(Wentzel,A.,Christmann,A.,Kraetzner,R.and Kolmar,H.(1999):Sequence requirements of the GPNG b−turn of the Ecballium elaterium trypsin inhibitor II explored by combinatorial library screening.J.Biol.Chem.274,21037−21043)。反応混合物は、室温での強力な攪拌下でPET容器中において一晩インキュベートした。フォールディングされたペプチドの精製は、Phenomenex C18カラム(分析的:250×4.60mm、分取的:250×10.00mm)を用いてRP−HPLCによって実施した。条件は以下のとおりであった。溶離液A:0.1%のTFAを含有するH2O。溶離液B:50%アセトニトリル、0.1%(v/v)のTFAを含有する50%の2−プロパノール。10〜37%のBの線形勾配は、分析目的には1mL/分、および分取的ランのためには3.5mL/分各々の流速を用いて実施した。217nmでの監視を用いて、酸化ペプチドを含有する画分を収集して凍結乾燥させた。酸化の成功は、ESI質量分光法によって確証された。
(ノッティン(knottin)骨格内に挿入されたPTHフラグメントによる1型副甲状腺ホルモン受容体(PTHR1)の活性化)
(材料および方法)
1型副甲状腺ホルモン受容体(PTHR1)の活性化は、ヒト胚腎臓293細胞(HEK293)およびヒト組換え受容体を発現するハムスター肺線維芽細胞(CCL39)を用いて評価した。24ウエルプレート内で増殖させたコンフルエントな細胞培養を無血清DMEM培地中で4時間にわたり[3H]アデニン(100MBq/mL;Amersham社、スイス国チューリッヒ)を用いて標識した。細胞は次に37℃の、130mMのNaCl、0.9mMのNaH2PO4、5.4mMのKCl、0.8mMのMgSO4、1.8mMのCaCl2、25mMグルコースを含有する緩衝食塩液中でインキュベートした。cAMPの集積を許容するために、ホスホジエステラーゼ阻害剤であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX、1mM)を加えた。指示される場合は、ペプチドアゴニストと相乗させてアデニリルシクラーゼを刺激するためにホルスコリン(FSK、10μM)を加えた。インキュベーション時間は、15分間であった。細胞は次に、Salomon,Y.(1979):Adenylate cyclase assay.Adv.Cyclic Nucleotide Res.10,35−55に記載された方法にしたがってバッチ式カラムクロマトグラフィーを使用して、氷冷温のトリクロロ酢酸ならびに遊離アデニンおよびATPから分離したcAMPを用いて抽出した。cAMPを定量するための方法は、特に、Allen,Mm,Hall,D.,Collins.,B.,Moore.,K.(2002) J.Biomol.Screen.7,35−44;Golla,R.,Seethala,R.J.Biomol.Screen.7,515−25;Gabriel,D.,Vernier,M.,Pfeifer,M.J.,Dasen,B.,Tenaillon,L.,Bouhelal,R.(2003) 1,291−303;Kent,T.C.,Thompson,K.S.,Naylor,L.H..(2005) J Biomol Screen.5,437−46に記載されている。
(材料および方法)
1型副甲状腺ホルモン受容体(PTHR1)の活性化は、ヒト胚腎臓293細胞(HEK293)およびヒト組換え受容体を発現するハムスター肺線維芽細胞(CCL39)を用いて評価した。24ウエルプレート内で増殖させたコンフルエントな細胞培養を無血清DMEM培地中で4時間にわたり[3H]アデニン(100MBq/mL;Amersham社、スイス国チューリッヒ)を用いて標識した。細胞は次に37℃の、130mMのNaCl、0.9mMのNaH2PO4、5.4mMのKCl、0.8mMのMgSO4、1.8mMのCaCl2、25mMグルコースを含有する緩衝食塩液中でインキュベートした。cAMPの集積を許容するために、ホスホジエステラーゼ阻害剤であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX、1mM)を加えた。指示される場合は、ペプチドアゴニストと相乗させてアデニリルシクラーゼを刺激するためにホルスコリン(FSK、10μM)を加えた。インキュベーション時間は、15分間であった。細胞は次に、Salomon,Y.(1979):Adenylate cyclase assay.Adv.Cyclic Nucleotide Res.10,35−55に記載された方法にしたがってバッチ式カラムクロマトグラフィーを使用して、氷冷温のトリクロロ酢酸ならびに遊離アデニンおよびATPから分離したcAMPを用いて抽出した。cAMPを定量するための方法は、特に、Allen,Mm,Hall,D.,Collins.,B.,Moore.,K.(2002) J.Biomol.Screen.7,35−44;Golla,R.,Seethala,R.J.Biomol.Screen.7,515−25;Gabriel,D.,Vernier,M.,Pfeifer,M.J.,Dasen,B.,Tenaillon,L.,Bouhelal,R.(2003) 1,291−303;Kent,T.C.,Thompson,K.S.,Naylor,L.H..(2005) J Biomol Screen.5,437−46に記載されている。
(ノッティン(knottin)骨格(oMcoTi−II)内に挿入されたPTH1*およびPTH2によるPTHR1の活性化)
選択されたノッティン(knottin)骨格内に挿入されたPTH N末端フラグメントがそれらの生物活性を維持したことを確証するために、2つの構築体NC−MC−PTH−1*および−2がPTH(1−34)(臨床使用について承認されたPTHの生物活性N末端フラグメント)によって通常は提供される生物学的反応を引き出す能力について評価した。簡潔には、ヒト副甲状腺ホルモン受容体(hPTH)、CCl39hR5(ハムスター肺線維芽細胞)およびヒト肺腎臓細胞(HEK293)を機能的に発現する2つの哺乳動物細胞系を、様々な濃度の両方の構築体ならびに陽性コントロールとしてのPTH(1−34)を用いて処理した。
選択されたノッティン(knottin)骨格内に挿入されたPTH N末端フラグメントがそれらの生物活性を維持したことを確証するために、2つの構築体NC−MC−PTH−1*および−2がPTH(1−34)(臨床使用について承認されたPTHの生物活性N末端フラグメント)によって通常は提供される生物学的反応を引き出す能力について評価した。簡潔には、ヒト副甲状腺ホルモン受容体(hPTH)、CCl39hR5(ハムスター肺線維芽細胞)およびヒト肺腎臓細胞(HEK293)を機能的に発現する2つの哺乳動物細胞系を、様々な濃度の両方の構築体ならびに陽性コントロールとしてのPTH(1−34)を用いて処理した。
両方の構築体がCCl39hR5細胞に及ぼす作用を試験すると、ホルスコリンの存在下および非存在下の両方において、高濃度(100μg/mL)のNC−MC−PTH−1*および−2いずれかが加えられると、cAMP産生の有意な刺激が見いだされた。この作用は、HEK293細胞が使用された場合、特に100μg/mLのNC−MC−PTH2が適用されて最高濃度のPTH 1−34(100nM)で産生したcAMPのおよそ60%の産生を生じさせた場合に一層より顕著であった。これらをまとめると、高濃度のNC−MC−PTH−1*および−2はPTH 1−34によって活性化されたアデニレートシクラーゼを刺激できることは明白である。
本明細書、特許請求項および/または図面に開示した本発明の特徴は、個別およびそれらの任意の組み合わせで本発明をその様々な形態で実現するための材料となり得る。
Claims (35)
- 骨格部分およびヘリックス部分を含むポリペプチドであって、
前記ヘリックス部分は前記骨格部分内に挿入され、
前記骨格部分はノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントを含み、
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記ノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違するポリペプチド。 - 骨格部分および生物活性ペプチド部分を含むポリペプチドであって、
前記生物活性ペプチド部分は前記骨格部分内に挿入され、
前記骨格部分はノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントを含み、
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記ノッティンタンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのアミノ酸配列とは相違するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドおよび/または前記骨格部分は、環状である請求項1または2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドおよび/または前記骨格部分は、直鎖状である請求項1または2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ノッティンタンパク質は、EETI−IIM7I、oMcoTI−II、McoEeTI、AGRP’およびオブツスタチンを含む群から選択される請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ヘリックス部分はアミノ酸配列を含んでおり、そのようなアミノ酸配列は、生物活性ペプチドの1つであり、好ましくはそのような生物活性ペプチドは、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インテグリンリガンド、プロテアーゼ阻害剤、GPCRリガンド、イオンチャネルリガンド、DNAもしくはRNAリガンド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび/もしくは誘導体を含む群から選択される請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記生物活性ペプチド部分はアミノ酸配列を含んでおり、そのようなアミノ酸配列は、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、プロテアーゼ阻害剤、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、またはそれらのフラグメントおよび/もしくは誘導体を含む群から選択されるペプチドの1つである請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分のアミノ酸配列は、少なくとも2個、好ましくは少なくとも4個、およびより好ましくは6個のCys残基を含む請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分のアミノ酸配列は、6または8個のシステインを含む請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分は、前記骨格部分内であって、前記骨格部分の前記ノッティンタンパク質の2個のCys残基の間に挿入される請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分は、前記骨格部分内であって、N末端からC末端へ計数して、前記骨格部分の第1および第2のCys残基の間、第4および第5のCys残基の間、または第5および第6のCys残基の間に挿入される請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分は、前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が挿入されている前記ノッティンタンパク質またはそのフラグメントのCys残基間において、少なくとも1個のアミノ酸残基、好ましくはそれ以上のアミノ酸残基、および最も好ましくは全部のアミノ酸残基が欠失したノッティンタンパク質に由来する請求項8〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ノッティンタンパク質もしくは少なくとも1つのそのフラグメントのCys残基間のアミノ酸残基の全部が欠失している請求項12に記載のポリペプチド。
- 前記ノッティンタンパク質が、EETI−II M7Iであり、前記ノッティンタンパク質の前記第1および第2システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、oMcoTI−IIであり、前記ノッティンタンパク質の前記第1および第2システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、McoEeTIであり、前記ノッティンタンパク質の前記第1および第2システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、AGRP’であり、前記ノッティンタンパク質の第5および第6システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている、あるいは、
前記ノッティンタンパク質が、オブツスタチンであり、前記ノッティンタンパク質の第4および第5システイン間のアミノ酸配列が、一部またはその全部がヘリックス部分または生物活性ペプチド部分のアミノ酸配列で置換されている請求項1〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が、前記骨格部分のN末端またはC末端へ融合している請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記生物活性ペプチド部分が、PTH、PTH誘導体およびPTHアナログを含む群から選択され、好ましくは配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれらのフラグメントおよび/もしくは誘導体を含む群より選択される請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分が配列番号4に記載のoMcoTI−IIであり、前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が配列番号2記載のアミノ酸配列または配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記生物活性ペプチド部分の前記ヘリックス部分は配列番号4に記載のアミノ酸配列の前記第1システインおよび前記第2システインの間に挿入され、アミノ酸残基の置換が前記ノッティンタンパク質のアミノ酸配列の前記2つのシステイン間で発生する請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分が配列番号4に記載のoMcoTI−IIであり、前記ヘリックス部分または前記生物活性ペプチド部分が配列番号3記載のアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記生物活性ペプチド部分の前記ヘリックス部分は配列番号4に記載のアミノ酸配列の第1システインおよび第2システインの間に挿入され、前記アミノ酸残基の置換が前記ノッティンタンパク質のアミノ酸配列の前記2つのシステイン間で自然に発生する請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ヘリックス部分および/または前記生物活性ペプチド部分の長さは約4〜30アミノ酸、好ましくは約4〜25アミノ酸、より好ましくは約4〜20アミノ酸、および一層より好ましくは約4〜15アミノ酸である請求項1〜18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号6、配列番号7、または配列番号13に記載のアミノ酸配列を含む請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、組換えタンパク質である請求項1〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、化学的に合成されたタンパク質または合成タンパク質である請求項1〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分は、1つのノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントを含む請求項1〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記骨格部分は、1つのノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントのマルチマー、好ましくはダイマーを含む請求項1〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントは、請求項1〜21のいずれか一項に規定されたノッティンタンパク質または少なくとも1つのそのフラグメントである請求項23または24に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜25のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- 前記医薬組成物は、経口投与用である請求項26に記載の医薬組成物。
- 疾患を治療または予防するための医薬品を製造するための請求項1〜25のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 疾患を診断するための診断薬を製造するための請求項1〜25のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 前記疾患は、骨関連疾患である請求項28または29のいずれか一項に記載の使用。
- 前記骨関連疾患は、低骨ミネラル含量および/または骨の脆弱性を特徴とする骨疾患である請求項30に記載の使用。
- 前記骨疾患は、原発性および続発性骨粗しょう症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症、虚血壊死、骨折およびインプラント治癒、ならびに他の疾患に起因する骨量減少を含む群から選択される請求項31に記載の使用。
- 骨量減少を生じさせる前記他の疾患が、HIV感染症、癌および関節炎を含む群から選択される請求項32に記載の使用。
- 前記インプラント治癒が、歯科インプラントまたは股関節インプラントのインプラント治癒である請求項32に記載の使用。
- 前記骨関連疾患が、変形性関節症、関節炎、および溶骨性病変の形成および存在を含む群から選択される請求項31に記載の使用。
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