JP2010509256A - エンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原 - Google Patents
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Abstract
【化1】
Description
−高齢の患者数が増加すること、
−内因感染に対する防御力が弱い患者を病院で治療する機会が増えること、
−外科技術の進歩により、以前より複雑かつ困難な手術が実施されること、
−複雑な装置を用いた感染リスクの高い侵襲性の処置を行う可能性がますます高まっていること、
−防御力が低下するような治療的処置を行う機会が増加すること、および
−抗生物質、特に広域スペクトルを持った抗生物質の使用頻度が増すことで、多剤耐性微生物が増加すること。
[式中、Foはホルミル基を表し、R2は、それぞれ独立してH、CnHm、CnHm−1NHR3およびCnHm−1N(CH3)3からなる群より選ばれる(式中、R3は、それぞれ独立してH、Fo、Acおよびアシル基からなる群より選ばれる)]、
Xは、それぞれ独立してO、S、CH2、NHおよびPOOR4からなる群より選ばれ
[式中、R4は、H、CnHm、CnHm−1NHR3またはCnHm−1N(CH3)3を表す]、
Yは、それぞれ独立してO、S、CH2およびHPO4からなる群より選ばれ、
CAは、それぞれ独立してC1−C6アシル基、特にヒドロキシアシル基、好ましくはラクチル基、ならびにH、OH、OCH3、OAc、OCnHm、OFo、OAcyl、SH、SCH3、SCnHm、SFo、SAc、SAcyl、NH2、NHCH3、NHCnHm、NHFo、NHAc、NHAcyl、PO2OR2、F、Cl、BrおよびIからなる群より選ばれ
[式中、Foはホルミル基を表し、R2は、それぞれ独立してH、OCnHm、OCnHm−1NHR3およびOCnHm−1N(CH3)3からなる群より選ばれる(式中、R3は、それぞれ独立してH、Fo、Acおよびアシル基からなる群より選ばれる)]、
m=2n+1およびnは、自然数1〜10より選ばれる。}
→−v)−D−Galf−(1→−z)−D−Glcp−(1→−、
→−v)−D−Galf−(1→−z)−D−Glcf−(1→−、
→−v)−D−Galp−(1→−z)−D−Glcp−(1→−または
→−v)−D−Galp−(1→−z)−D−Glcf−(1→−
−酵素標識抗体を用いて、例えば血清や細胞培養上清などに含まれる抗原または抗体を定量するELISA法、
−酵素標識抗体を用いて、形質細胞などの抗体産生細胞または抗原産生細胞を検出するELISPOT法、
−細胞表面、細胞質内、または核内の抗原に結合する蛍光標識抗体を用いて、細胞を定量するFACS法、
−ウェスタンブロット、
−スーパーゲルシフトアッセイ(EMSAも含む)、
−ファージディスプレイ、
−ドラッグワイプ(drugwipe)分析、
−アブザイム法、または
−適切なアフィニティー法による本発明の抗原または抗体の精製方法。
−エンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の有無を調べる試料と、本発明の抗原とを接触させる工程。
−抗体−抗原複合体または抗体−複合抗原複合体を検出する工程。
このような複合体が検出されることにより、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の存在が示される。
−エンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の有無を調べる試料と、本発明の抗体とを接触させる工程。このとき、本発明の抗体は担体に固定されていてもよい。
−抗原−抗体複合体または複合抗体−抗原複合体を検出する工程。
このような複合体が検出されることにより、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の存在が示される。
CPS−D型株であるE.フェカリス菌5型株(Maekawa,S.,et al.,Microbiol.Immunol.,36:671−681,1992)から、最近報告された血清型分類法(Hufnagel,M.,et al.,J.Clin.Microbiol.42:2548−2557,2004)を用いて莢膜多糖体を単離した。菌体は、スタータカルチャーを1%グルコース含有コロンビア培養液(Columbia nutrient solution:Becton Dickinson製,Sparks,MD,USA)で37℃、2時間撹拌せずに培養することにより得られた。
E.フェカリス菌5型株の完全な菌体に対する抗血清については過去に記載がある(Hufnagel,M.,et al.,J.Clin.Microbiol.42:2548−2557,2004)。菌株12030から精製したLTAを用いて、過去の報告(Theilacker,C.,et al.,Infect.Immun.74,2006)の記載通りにLTAに対する抗血清を作製した。まず、雌性ニュージーランド白ウサギに、100μgのLTAを完全フロイントアジュバントで懸濁した液を皮下注射して免疫を行った。次いで7日後、同量のLTAを不完全フロイントアジュバントで懸濁した液で同様に免疫を行い、さらに翌週、3日ごとに10μgの追加免疫を行った。
E.フェカリス菌のLTAを、過去の報告(Huebner,J.,et al.,Infect.Immun.67:1213−1219,1999;Theilacker,C.,et al.,Infect.Immun.74,2006)の記載通りに単離した。本明細書に記載の抗原を以下の通り調製した。簡単に述べると、遠心分離によって菌体を回収し、これにムタノリジンおよびリゾチーム(それぞれ100pg/ml、Sigma Chemicals製(St.Louis,MO,USA)、それぞれ5mM MgCl2、1mM CaCl2および0.05% NaN3含有PBSに溶解)を加えて37℃で18時間反応させ、菌体を消化した。遠心分離によって不溶性物質を除去し、上清をヌクレアーゼ(DNaseIおよびRNaseA、100pg/ml)で37℃、4時間処理した。続いて、プロテナーゼK(100pg/ml)を加えて56℃で18時間処理した(試薬はいずれもSigma Chemicals製である)。上清にエタノール(最終容量80%)を加え、得られた沈殿を遠心分離によって回収した。透析外液に脱イオン化水を使用して透析した後、得られた物質を凍結乾燥した。ゲル浸透クロマトグラフィー用に、上記物質を0.01M炭酸水素アンモニウム緩衝液に溶解し、これをSephacryl S−400カラム(1.6×90cm)(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)にロードした。Kav値が約0.45の溶出画分をまとめて透析し、凍結乾燥した。得られた物質を20mM NaHCO3(pH8.4)で再懸濁し、陰イオン交換カラム(Sepharose Q FF,GE Healthcare)にロードした。NaClの直線濃度勾配をかけて、カラムに結合している抗原を溶出した。多糖体を含む画分を、Duboisアッセイ(Dubois,M.,et al.,Anal.Chem.28:350−356,1956.)および5型株に対するウサギ免疫血清を用いたイムノブロッティング法により同定した。450mM NaClで溶出され免疫反応を示した物質をまとめて透析し、凍結乾燥した。最終精製工程として、1.5×75cmのToyopearl HW−40(Tosoh Corporation,Tokyo,Japan)カラムを用いてゲル浸透クロマトグラフィーを行った。次いで、泳動バッファーとしてMOPS緩衝液(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用い、10%ビス−トリスゲルを用いてSDS PAGEを行った後、付属の製品マニュアルに従ってクマシー(Invitrogen)染色およびPAS(Sigma)染色を行うことにより、単離した物質の純度を求めた。
E.フェカリス菌5型株のペプチドグリカンを酵素で消化して、菌体から莢膜多糖体を分離した。目的の抽出物は、Sephacryl S−400ゲル浸透クロマトグラフィーによって、糖鎖を含む2つの画分として溶出された。第1の画分は、ボイド容量で溶出した画分で、1H NMR分析(データ示さず)によってLTAを含むことがわかった。容量の大きい第2の画分は、Kav値が約0.45の溶出画分で、これをさらにQ Sepharoseを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。450mM NaClの時点で、免疫反応を示す少量の物質が溶出した。この物質は、グルコースとガラクトースのみを含んでおり、これをToyopearl HW−40Sを用いたゲル浸透クロマトグラフィーに供した。その後、さらに分析を行った。この精製物質に対してSDS PAGEを行ったところ、100kDaの位置に1つのブロードなバンドが検出された。このバンドは、PASで染色されたが、クマシーでは染色されなかった。同様に、5型株に対する抗血清で染色したウェスタンブロットにおいても、100kDaの位置に1つのブロードなバンドが検出され、それ以外のバンドは存在しなかった(データ示さず)。
過去の報告(Theilacker,C.,et al.,Infect.Immun.74,2006)の記載通りに、ブタノール抽出と疎水性相互作用クロマトグラフィーによってLTAを調製した。調製したLTAの純度は、完全な菌体に対するLTAの抗血清(上記参照)を用いて、SDS PAGEとウェスタンブロット分析によって評価した。
また、最近の報告(Theilacker,C.,et al.,Infect.Immun.74,2006)の記載通りにNMR測定を行い、LTAと構造が一致することを確認した。
2Mトリフルオロ酢酸を用いて、120℃で3時間加水分解を行った。次いで、単糖をアルジトール酢酸に変換し、SPB−5カラム(30m×0.25mm×0.25pm,Supelco,Munich,Germany)を装着したHewlett−Packard5890クロマトグラフを用いてGC分析を行った。150℃を3分保持した後、毎分3℃の速度で300℃まで昇温させる温度プログラムを使用した。
また、過去の報告(Haseley,S.R.,et al.,Eur.J.Biochem.244:761−766,1997;Leontein,K.,et al.,Carb.Res.62:359−362,1978)の記載通りに、糖残基の絶対配置を決定した。
試料を99.0%の2H2Oで3回置換した後凍結乾燥し、99.9%の2H2Oに再度分散した。一次元および二次元のスペクトルはすべて、Bruker DRX Avance 600MHzスペクトロメータ(動作周波数:1H NMRでは600.31MHz、13C NMRでは150.96MHz)と慣用のBruker Software(Bruker,Rheinstetten,Germany)を用いて27℃で測定したものである。化学シフト値は、アセトン(δH 2.225;δC 31.45)を基準としたものである。相関分光法(COSY)、全相関分光法(TOCSY)、およびROESYは、4096×512データポイントを含むデータシート(t1×t2)を用い、32回スキャンして測定した。
精製多糖体の1H NMRスペクトル(図1)では、低磁場領域において、2つのアノメリックシグナルがδ5.315(A基、[3JH1,H2<2Hz])とδ4.542(B基、[3JH1,H2=7.8Hz])に観測された。これらのシグナルは、β−Galfとβ−D−Glcpに帰属すると同定された。さらに、δ1.361のダブレットは、乳酸基(LA)のメチル基に帰属すると同定された(Knirel,Y.A.,et al.,Carbohydr.Res.259,1994;Knirel,Y.A.,et al.,Carbohydr.Res.235:C19−23,1992)。D−Glcp基の存在は、化学分析、絶対配置決定法、およびNMR測定データによって確認された。3位の炭素が乳酸で置換されたGalf基は、NMRデータのみから同定された(Beynon,L.M.,et al.,Eur.J.Biochem.250:163−167,1997;Knirel,Y.A.,et al.,Carbohydr.Res.259,1994;Knirel,Y.A.,et al.,Carbohydr.Res.235:C19−23,1992)。E.フェカリス菌5型株の莢膜多糖体の1Hと13Cの化学シフト値(表1)はすべて、1H−1H COSYおよびTOCSYスペクトル、ならびに1H−13C HMQCスペクトルから求めた。
ELISA実験を過去の報告(Theilacker,C.,et al.,Infect.Immun.74,2006)の記載通りに慣用的な方法を用いて行った。簡単に述べると、マイクロタイタープレートをE.フェカリス菌由来の種々の糖鎖抗原(10pg/ml、0.04Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解)でコーティングし、4℃で18時間静置した。プレートの洗浄は、0.05%Tween 20含有PBSで行った。これらのプレートを、0.02%アジ化ナトリウム含有PBSで調製した3%スキムミルクで、37℃、2時間ブロッキングした。二次抗体としては、ヤギ抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ複合体(Sigma)を1:1000に希釈して用い、基質としては、パラニトロフェニルリン酸(Sigma)を用いた。37℃で60分インキューベーションした後、405nmで吸光度を測定した。
オプソニン活性測定を過去の報告(Theilacker,C.,et al.,Infect.Immun.74,2006)の記載通りに行った。補体供給源として、標的菌株で吸着した子ウサギ血清(Cedarlane Laboratories,Hornby,Ontario,Canada)を用いた。免疫血清のオプソニン活性を、正常ウサギ血清を含むコントロールと比較した。免疫血清は、使用前に56℃で30分間熱失活させた。ネガティブコントロールの試験管は、多形核白血球、補体および血清のいずれも含まなかった。免疫血清のオプソニン活性を以下の通りに算出した。
[1−(免疫血清による90分後のCFU/免疫前血清による90分後のCFU)]×100
オプソニン化貪食作用の阻害実験においては、まず1:200に希釈した抗血清を、0.08〜100μg/mlの阻害剤とともに4℃で60分間インキュベートした。インキューベーション後に、吸着済みの血清を加えて、上記と同様にオプソニン活性測定を行った。阻害剤非存在下では、いずれの免疫血清においても、接種原に対するオプソニン活性の最小値は70%を上回った。
E.フェカリス菌5型株(Maekawa,S.,et al.,Microbiol.Immunol.36:671−681,1992)の菌体に対する抗血清は、上述の精製多糖体に反応した(図4)。またこの抗血清は、E.フェカリス菌のLTAに対する高濃度のIgG抗体を含んでいた(図4)。抗LTA抗体は、E.フェカリス菌株12030のオプソニン化貪食作用を媒介するので、E.フェカリス菌5型株に対するオプソニン抗体の特異性を調べた。精製LTAは、5型株に対する抗血清のオプソニン活性を阻害しなかった(図5)。これは、E.フェカリス菌5型株およびE.フェカリス菌株12030のそれぞれのオプソニン抗体が交差反応を示さないという所見(Hufnagel,M.,et al.,J.Clin.Microbiol.42:2548−2557,2004)に合致している。一方、上述の精製莢膜多糖体は、5型株に対するオプソニン抗体の作用を強力に阻害した(図5)。また、精製LTAに対するウサギ抗血清は、オプソニン活性測定において、菌株12030に対するオプソニン化貪食作用を促進するが、5型株に対してはオプソニン作用を示さなかった。これは、我々が行った阻害実験結果(データ示さず)を裏付けるものである。
このインビトロアッセイは、顆粒細胞、抗血清および菌体を組み合わせて、産生された抗体がエンテロコッカス・フェカリス菌を殺滅可能かどうか調べるものである。このアッセイ混合物について、以下に正確に述べる。健康なドナーから採取した新鮮な全血を、ヘパリンデキストラン緩衝液と混合した。次いで、白血球を精製し、所定の細胞数(5×106cells/ml)に調整した。アッセイに用いる菌体は、対数増殖中期に、培養液から遠心分離により回収し、分光光度法により白血球と同様に5×106cells/mlに調整した。補体供給源として、凍結乾燥した子ウサギ血清を細胞培養液で1:15に希釈し、これを標的菌株に吸着させて、使用するエンテロコッカス菌株に対する既存抗体を除去したものを用いた。同様にウサギ血清を、実験の慣例に合った細胞培養液で希釈した。実験の実施にあたり、それぞれ、100μlの菌体懸濁液、100μlの白血球(菌体:白血球比率は1:1)、100μlの補体供給源および上記菌体に対応する100μlの希釈抗体液を混合した。このアッセイ混合液を希釈してプレート上に植菌し、最初の菌体数を求め、次いで、アッセイ混合液を転倒型回転器で37℃、90分間インキュベートした。実験が終了したところで、先と同様に、アッセイ混合液を再び希釈してプレート上に植菌し、翌日コロニー数を数えた。接種原混合時と実験終了時とを比べた際の菌体数の減少率をパーセントで示し、オプソニン作用を介した殺菌率とした。この値は、感染力を有する病原性細菌に対して防御的な免疫反応を示すかどうかを調べる上で、最良の間接的なマーカーである。
Claims (34)
- 下記の一般式で示される構成単位を少なくとも1つ含むことを特徴とするエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原。
[式中、Foはホルミル基を表し、R2は、それぞれ独立してH、CnHm、CnHm−1NHR3およびCnHm−1N(CH3)3からなる群より選ばれる(式中、R3は、それぞれ独立してH、Fo、Acおよびアシル基からなる群より選ばれる)]、
Xは、それぞれ独立してO、S、CH2、NHおよびPOOR4からなる群より選ばれ
[式中、R4は、H、CnHm、CnHm−1NHR3またはCnHm−1N(CH3)3を表す]、
Yは、それぞれ独立してO、S、CH2およびHPO4からなる群より選ばれ、
CAは、それぞれ独立してC1−C6アシル基、特にヒドロキシアシル基、好ましくはラクチル基、ならびにH、OH、OCH3、OAc、OCnHm、OFo、OAcyl、SH、SCH3、SCnHm、SFo、SAc、SAcyl、NH2、NHCH3、NHCnHm、NHFo、NHAc、NHAcyl、PO2OR2、F、Cl、BrおよびIからなる群より選ばれ
[式中、Foはホルミル基を表し、R2は、それぞれ独立してH、OCnHm、OCnHm−1NHR3およびOCnHm−1N(CH3)3からなる群より選ばれる(式中、R3は、それぞれ独立してH、Fo、Acおよびアシル基からなる群より選ばれる)]、
m=2n+1およびnは、自然数1〜10より選ばれる。} - 2つの糖がD体であることを特徴とする、請求項1に記載の抗原。
- フラノース型ガラクトースおよびピラノース型グルコースからなる二糖類が、下記式より選ばれる構造を有することを特徴とする請求項1または2に記載の抗原:
→−v)−D−Galf−(1→−z)−D−Glcp−(1→−、
→−v)−D−Galf−(1→−z)−D−Glcf−(1→−、
→−v)−D−Galp−(1→−z)−D−Glcp−(1→−または
→−v)−D−Galp−(1→−z)−D−Glcf−(1→−、
(式中、vおよびzは、それぞれ1、2、3、4、5または6である)。 - R1がOH、XがO、YがO、およびCAがラクチル基であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の抗原。
- 分子量が、約1,000〜200,000Da、より好ましくは約50,000〜150,000Da、特に好ましくは約100,000Daであることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の抗原。
- 1抗原当たり前記構成単位が、少なくとも5回、好ましくは少なくとも10回、より好ましくは少なくとも100回、特に好ましくは少なくとも1,000回繰り返されている構造であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の抗原。
- 担体に結合していることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の抗原。
- 前記担体への結合が共有結合であることを特徴とする請求項8に記載の抗原。
- 前記担体が免疫担体であることを特徴とする請求項8または9に記載の抗原。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の抗原を含む組成物。
- 薬学的に許容される基剤を含む請求項11に記載の組成物。
- エンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対するワクチンであることを特徴とする請求項11または12に記載の組成物。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の抗原に対する抗体。
- 請求項14に記載の抗体を含む組成物。
- 薬学的に許容される基剤を含む請求項15に記載の組成物。
- エンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対するワクチンであることを特徴とする請求項14または15に記載の組成物。
- 医薬組成物であることを特徴とする請求項11〜13または15〜17に記載の組成物。
- エンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の検出方法であって、
−エンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の有無を調べる試料と、請求項1〜10に記載の抗原とを接触させる工程、および
−抗体−抗原複合体または抗体−複合抗原複合体を検出する工程を含み、
該複合体が検出されることによって、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体の存在が示されることを特徴とする検出方法。 - エンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の検出方法であって、
−担体に固定されていてもよい請求項14に記載の抗体と、エンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の有無を調べる試料とを接触させる工程、および
−抗原−抗体複合体または複合抗体−抗原複合体を検出する工程を含み、
該複合体が検出されることによって、試料中にエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原の存在が示されることを特徴とする検出方法。 - 前記抗原または抗体が、担体に、特に固相担体に、好ましくはマイクロタイタープレートに固定されていることを特徴とする請求項19または20に記載の方法。
- 前記抗原または抗体が、マーカーで標識されていることを特徴とする請求項19〜21に記載の方法。
- 前記マーカーが、放射性マーカー、色素マーカー、酵素マーカーおよび磁気マーカーからなる群より選ばれることを特徴とする請求項22の方法。
- 抗体に結合した後に、前記マーカーが特性変化を示すことを特徴とする請求項22または23に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の抗原を含む、試料中のエンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体を検出するためのキット。
- 担体に結合していてもよい請求項14に記載の抗体を含む、試料中のエンテロコッカス・フェカリス菌抗原および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌抗原を検出するためのキット。
- 前記抗原または抗体が、マーカーで標識されていることを特徴とする請求項25または26に記載のキット。
- 前記マーカーが、放射性マーカー、色素マーカー、酵素マーカーまたは磁気マーカーであることを特徴とする請求項27に記載のキット。
- 前記抗原または抗体が、担体に、好ましくは固相担体に結合していることを特徴とする請求項25〜28のいずれかに記載のキット。
- エンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体および/または抗体フラグメント、具体的にはFabまたはscFvを検出または産生するための請求項1〜10に記載の抗原の使用。
- 産生されるエンテロコッカス・フェカリス菌および/またはエンテロコッカス・フェシウム菌に対する抗体および/または抗体フラグメントを、エンテロコッカス菌抗原に対する受動的免疫療法または感染予防に使用することを目的とする請求項30に記載の使用。
- 前記抗体または抗体フラグメント、具体的にはFabまたはscFvの産生方法であって、前記抗体または抗体フラグメントの産生に十分な量の請求項1〜10に記載の抗原を、動物、特に哺乳動物に投与することを含む方法。
- 請求項14に記載の抗体と構造的に同等である組換え抗体、またはその組換えフラグメント、具体的にはFabまたはscFv。
- 請求項14に記載の抗体、またはそのフラグメント、具体的にはFabまたはscFvを遺伝子組換えで産生する方法であって、前記抗体またはそのフラグメントをコードするDNA配列を発現ベクターへクローニングした後、このコンストラクトを用いて細胞、特に大腸菌または酵母菌を形質転換して組換え抗体またはそのフラグメントを発現させることを含む方法。
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