JP2010508027A - レジスチンアンタゴニストおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、抗体のようなレジスチンアンタゴニストおよび変形性関節症および線維性の病状がある疾患の処置におけるそれらの使用に関する。また本発明は抗−レジスチン抗体を生成するための有用な抗原に関する。
レジスチンは、保存されたC−末端Cys−リッチドメインを含むFIZZ(炎症性ゾーンに見いだされる:Found in Inflammatory Zone、RELMとしても知られている)タンパク質ファミリーに属する分泌型因子である(非特許文献1)。これは元々、マウスにおいて肥満とインスリン耐性との間の関連を与える脂肪細胞に誘導されるポリペプチドとして記載された(非特許文献2)。その一方でヒトのレジスチンは有力な前炎症性因子として認識されているマクロファージ/単球由来因子である。ヒトのレジスチンは免疫起源の種々の細胞からサイトカインの放出を誘導し、接着分子の発現をアップレギュレートし、そして内皮細胞における新脈管形成を促進する(非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6)。レジスチンの効果はNF−κb経路を介して媒介されるらしい(上記非特許文献6)。
引き起こす主要なエフェクター細胞であることを示唆した(上記非特許文献11)。さらに最近では、UIP患者からの繊維芽細胞が上昇したレベルのCCL7(単球走化性タンパク質3、MCP3)を発現し、そして分泌することが示された(非特許文献12)。非繊維性組織、UIPおよび強皮症が誘導する肺線維症に由来する繊維芽細胞中でのTGFβ1−誘導型の遺伝子発現を比較する実験も、細胞が単離された環境に依存して異なる表現型および繊維芽細胞の応答を示した(非特許文献13)。
使用された(非特許文献24)。C−反応性タンパク質(CRP)の全身レベルは、膝のOAおよび急速に進行する腰のOAの結果を予測するために追加の値を提供した(非特許文献25)。
本発明の1つの観点は、レジスチンのアンタゴニストである。1つの態様では、レジスチン アンタゴニストはレジスチンに反応性の単離された抗体であり、そしてレジスチンの生物学的活性の少なくとも1つを中和する。
における線維症の処置法または線維症の症状の緩和法である。
限定するわけではないが特許および特許出願を含め、本明細書で引用されているすべての刊行物は、引用することにより完全に記載されているかのように本明細書の内容となる。
本発明は、哺乳動物個体、好ましくはヒトのレジスチンレベルを評価することによりOAの危険性または進行を評価するための新規方法を提供する。本発明の1つの態様は、哺乳動物個体に由来する生物学的サンプル中のレジスチンレベルを測定することを含んでなるOAの危険性を診断する方法である。
技術分野で実在し、つまり現在工業的に使用することができ、あるいは免疫学の分野で現在、通常の技術により開発することができる。例えばリンコのヒトアディポカインキット(リンコ リサーチ:LINCO Research、セントチャールズ、ミズーリ州)を使用して血清および滑液中のレジスチンレベルを測定することができる。
本発明はレジスチンに対するアンタゴニストを提供する。1つの態様では、レジスチンアンタゴニストは、レジスチンに結合する特性を有し、そして少なくとも1つのレジスチンの生物学的活性を中和する抗体である。
の定常ドメインは重鎖の第1の定常ドメインに並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインに並ぶ。脊椎動物種の抗体軽鎖は、2つの明らかに異なる型、すなわちカッパ(κ)およびラムダ(λ)の1つに、それら定常ドメインのアミノ酸配列に基づき割り当てることができる。免疫グロブリンは重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに割り当てることができる。さらにIgAおよびIgGはアイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に再分類される(sub−classified)。
www.kabatdatabase.com/top.html;ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat;
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www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;www.jerini.de;imgt.cines.fr;およびKabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1987)に開示され、それぞれ引用により全部、本明細書に編入する。
al.,Nature 368:856−859(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845−851(1996)およびMendez et al.,Nature Genetics 15:146−156(1997)に引用されている技術によりヒト免疫グロブリンのトランスジェニックマウスから調製することができる。またヒトmAbは例えばKnappik et al.,J.Mol.Biol.296:57−86(2000)およびKrebs
et al.,J.Immunol.Meth.254:67−84(2001)に引用されている技術によりファージディスプレイライブラリーから調製し、そして至適化することができる。
ATCPR65(配列番号3)または78CGSWDVRAETTCHCQC93(配列番号4)に結合することができる。これらのレジスチンエピトープは、ヒトレジスチンに対するモノクローナル抗体を生産し、そしてスクリーニングする抗原として使用するために単離し、そして修飾することができる。例えばエピトープ配列は修飾してシステイン残基を除去してジスルフィド結合を防ぐことができる。これらの残基はセリンに置換することができる。例示的な修飾化レジスチンエピトープは、アミノ酸配列ESQSVTSRGDLATSPR(配列番号5)およびSGSWDVRAETTCHSQS(配列番号6)を有する単離されたポリペプチドを含んでなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。
本発明の別の観点は、CDRのアミノ酸配列を有する抗体重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、それに相補的またはそれと有意な同一性を有する単離された核酸分子である。所定の発現系での遺伝子コードまたはコドンの縮重の優先性を仮定すると、重鎖もしくは軽鎖可変領域のCDRをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
ンスフェクション法により生成され得る。
レジスチン抗体はとりわけ研究用試薬および治療薬として有用である。1つの観点では、本発明は本発明のレジスチン抗体を治療の必要がある哺乳動物に提供することを含んでなる、レジスチンの生物学的活性を修飾する方法に関する。レジスチンのそのような生物学的活性の例には、繊維芽細胞の異常な活性化、筋芽細胞分化の刺激、前線維性遺伝子の誘導、前炎症性サイトカインの放出、コラーゲンI蓄積の誘導ならびに当業者に知られている他の活性を含む。特異的にレジスチン抗体は、限定するわけではないがNF−κb経路のようなレジスチン媒介型の細胞シグナリングカスケードを低下させ、または阻害することができる。
別の観点では、本発明は本発明のレジスチン抗体を処置の必要がある哺乳動物に提供することを含んでなるレジスチンの生物学的活性を修飾する方法に関し、ここでそのようなレジスチンの生物学的活性には、軟骨の変性、前炎症性マーカー(PGE2およびサイトカイン)の放出、細胞外マトリックス生合成の破壊、ならびに当該技術分野で知られている他の活性を含む。特異的にレジスチン抗体は、限定するわけではないがNF−κb経路のようなレジスチン媒介型の細胞シグナリングカスケードを低下させ、または阻害することができる。
UIP、NSIPおよび肺腫瘍の正常辺縁に由来する肺の生検サンプルは、完全プロテアーゼインヒビター(ロッシュ:Roche)を含有するPBS中で均一化した。レジスチンレベルはELISA(リンコ リサーチ社、セントチャールズ、ミズーリ州)により製造元の使用説明に従い測定した。総タンパク質はBCAタンパク質アッセイ(ピアス バイオテクノロジー社;Pierce Biotechnology.Inc.、ロックフォード、イリノイ州)を使用して肺の各生検サンプルで測定した。次いでレジスチンレベルを各患者サンプル中のタンパク質量に対して標準化し、そして図1に表す。レジスチンタンパク質は、すべての肺生検体に由来するホモジネート中で検出された。非線維性と線維性群との間に有意な差異は観察されなかった。
肺の繊維芽細胞は、UIP患者(n=4)から採取した肺の生検体から単離した:本明細書では今後「線維性繊維芽細胞」または「UIP繊維芽細胞」と言う。また繊維芽細胞は肺腫瘍切除(n=5)中に採取した肺組織からも単離し、そしてこれらのサンプルは組織学的分析により非線維性であることを確認した。これらの非線維性組織由来の繊維芽細胞は本明細書で「非線維性繊維芽細胞」(NF)と言う。
逆転写試薬(アプライドバイオシステムズ:Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用してcDNAに逆転写した。前線維性遺伝子発現は、製造元の使用説明に従いTaqman(商標)Universal PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ)を使用してリアルタイムPCRにより測定し、そしてTaqman(商標)Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ)で前現像(pre−developed)した。定量的な遺伝子発現は、比較するCT法を使用して算出し、ここでCT値は遺伝子発現が最初に検出される閾値サイクル数として決定される。目的遺伝子の遺伝子発現における倍数変化を、最初にハウスキーピング遺伝子18Sに対して標準化し、ΔCT値を与える。インビトロ刺激による遺伝子発現の倍数変化は、ΔΔCT=ΔCT(unstimulated)−ΔCT(stimulated)により計算され、ここで非刺激(unstimulated)サンプルはキャリブレーターとして役立つ。レジスチンの有力な前線維性活性を調査するために、プロコラーゲンI、アルファ平滑筋アクチン(αSMA)、CTGF、TGFβ1、TGFbR、PDGFR、ヒアルロナン受容体CD44、フィブリリン(fbn1)、フィブロネクチン(fn1)およびIL−6の発現レベルを、未処理およびレジスチンで処理した肺繊維芽細胞で評価した。
ヒト組換えレジスチンを用いてインビトロで刺激した肺の生検体から単離した繊維芽細胞に由来する無細胞上清を、LINCOヒトサイトカインキット(リンコ リサーチ)によりサイトカインのレベルについて分析した。レジスチンは、肺の繊維芽細胞からIL−6(図5A)、IL−8(図5B)およびMCP−1(図5C)の放出を刺激した。分析した他のサイトカインは検出レベル未満であった。これらのデータはレジスチンが肺の繊維芽細胞で炎症性応答を開始することができ、これは次に線維症の発症および進行の一因となり得ることを示唆している。このデータはレジスチンが免疫細胞からサイトカインの放出を刺激できる有力な前炎症因子であることを示唆している。
新しく単離した初代血液単核細胞から精製したヒトCD14+単球は、AllCells、LLC(エメリービル、カリフォルニア州)から購入した。細胞は96U底ウェルプレートにウェルあたり75,000細胞の密度で、10%のウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI中でまいた。細胞は0または1ng/mlのTGFβ(R&Dシステムズ:Systems、ミネアポリス、ミネソタ州)およびPDGF(R&Dシステムズ)で処理した。48時間の培養後、上清中のレジスチンレベルをELISAキットで測定した。マクロファージの分化を誘導するために、単球を10%FBSを含有するRPMI中で96ウェルの平底プレートにまき、そして接着させ、次いで細胞を上記と同様に処理した。図6のデータは、平均±S.E.M.として表し、n=3、*はp−値<0.05を示す。
肺腫瘍の正常辺縁、UIPまたはNSIP患者のいずれかに由来する肺の生検サンプル(全部でn=9;n=3の各患者コホート)は、抗−レジスチン抗体(R&Dシテムズ)で2μg/mlの濃度で染色した。肺の検体では、レジスチンタンパク質はマクロファージ、組織球(組織−拘束性マクロファージ)およびマスト細胞で検出された。高度に炎症している非−線維性の肺検体のCD68抗体を用いた同時染色では、レジスチンがCD68陽性マクロファージ細胞と共に局在していることが示された(データは示さず)。単球およびマクロファージ細胞中のヒトレジスチンの発現は、以前に報告され(Jung et al.,Cardiovasc.Res.,69:76−85(2006);Lehrke et al.,PLoS Med.,1:e45(2004))、ならびに我々の知見により確認された(図6)。UIPおよびNSIP患者からの肺検体の抗−レジスチン抗体を用いた染色では、非線維性と線維性の肺検体の間で観察されたレジスチン染色に明瞭な差異は示されなかった(データは示さず)。
ヒト(配列番号1)およびマウス(配列番号2)のレジスチンのアミノ酸配列は、Swiss−Protからそれぞれ寄託コードQ9HD89およびQ99P87で得、そして並べた。図7はヒトとマウスレジスチンとの間の配列アライメントを表し;全体的な同一性は55%である。
チのような禁止された配置の残基を含まず、立体的衝突が無く、そして好ましくない環境での残基はなかった。マウスのタンパク質に対する配列類似性が比較的高く、そして立体化学的基準に合うことを仮定すると、生じた3次元モデルは現実的な構造に良い近似を提供する。
幾つかの証拠筋では、レジスチン3量体の球状ドメインの側面が有力な受容体結合部位であることを示唆している。例えばレジスチンは3量体で活性であり(Patel et
al.,同上)、したがって3量体で溶媒に接近できる表面のみが有力な受容体結合部位と考えられる。さらにタンパク質のC1q/TNF構造スーパーファミリーの一部として、レジスチンはその受容体に、他のファミリーメンバーに共通する様式、すなわち球状ドメインの側面で結合するのかもしれない。C1q/TNFスーパーファミリーはPfamデータベースに寄託コードCL0100で登録されている。これにはアディポネクチン、TNFαおよびβ、およびCD40Lを初めとする多数のサイトカインを含む。このスーパーファミリーのメンバーは特徴的なヘリックス/ゼリーロールホールドおよびコイルドコイルホモ3量体構造を有する。結晶構造はスーパーファミリーの多くのメンバーならびにそれらに対応する受容体との複合体について利用可能である。これらの構造は、例えばAPO2L+DR5およびTNFβ+TNFR55で観察されるように、受容体結合が球状ドメインの側面で起こる(通常はドメイン境界)ことを示す。受容体が球状ドメインの上部またはヘリックスドメインに結合することは観察されなかった。
ペプチド 2815:ESQSVTSRGDLATSPR (配列番号5)
ペプチド 2816:SGSWDVRAETTSHSQS (配列番号6)
合わせると、これら2種のペプチドが球状ドメインの表面の64%を網羅する。ペプチド2815の利点は2つのシステインを除くすべての残基がレジスチン中で暴露されているので、ペプチドの自由な状態でのホールディングにかかわらず、有力なエピトープ残基は抗体生成に利用できる。ペプチド2816はタンパク質中にβ−ヘアピンを形成する。β−ヘアピンの1面のみが受容体の認識に関与することができる。ここで重要な残基はR84−A85−E86である。ペプチド2816の別の利点は、この領域がより高次な哺乳動物で100%保存され、そしてマウスレジスチンに対しては75%保存されている点である。このフラグメント中での高い配列類似性を仮定すると、多くの種からレジスチンタンパク質と交差反応する抗体を生成することが可能である。
ポリクローナル抗体の生成:エピトープペプチド2815および2816は、ABI433Aペプチド合成器でRINK Resin SS(アドバンスト ケミテック:Advanced ChemTech、SA5030、Lot#17046)を使用して化学的に合成した。ペプチドを樹脂から開裂し、沈殿させ、濾過し、洗浄し、そして乾燥させた。ペプチドをインビトロジェンコーポレーション(Invitrogen Corporation)(カールスバーグ、カリフォルニア州)に送り、ここでペプチドは免疫感作のためにKLHタンパク質に融合された。ペプチドあたり2匹のウサギを標準法を使用して免疫感作した(Cat.番号M0300)。ペプチドに関するELISAアッセイは抗体力価を示し、そしてウサギは最終的に4週間の免疫感作手順後に採血された。抗体は血清アルブミンに結合したペプチドを使用してアフィニティ精製された。2815および2816ペプチドに対して生じたポリクローナル抗体を、それぞれC2815およびC2816と言う。
ポリクローナル抗体C2815およびC2816が完全長のヒトレジスチンに結合する能力を、標準的なサンドイッチELISA形式を使用して試験した。プレートに2μg/mlのC2815またはC2816(0.2M炭酸−重炭酸バッファー、pH8.5中)を4℃で一晩被覆した。非特異的結合を排除するために、プレートは280μlの0.5%ウシ血清アルブミン(PBS中)で37℃にて2時間、ブロッキングした。種々の濃度のヒトレジスチンをプレートに加え、そして4℃で一晩インキュベーションした。検出にはユーロピウムを用いたビオチン標識抗−レジスチン抗体BAM1359(R&Dシステムズ、ミネアポリス、ミズーリ州)を加え、続いて強化溶液を加えた。蛍光シグナルをVictorプレートリーダーで読み、そしてデータをGraphPad Prismにプロットした。
、抗体がMCP−1放出アッセイにおいてヒトレジスチンの活性を用量依存的に阻害できたことを示し、同定されたエピトープがレジスチン活性に重要であることを確証する。C2816(IC50 65μg/ml)は、C2515に比べて優れた中和活性を示した。しかしそれは完全長ヒトレジスチンタンパク質へのC2816のより高い親和性により部分的に説明されるものかもしれない(図8)。
滑液および血清サンプルは外的損傷(半月、靭帯およびOC骨折損傷を含む)後、あるいは変形性関節症と診断された患者(10年の時間枠にわたり)から種々の時点で得た。サンプルは263名の患者から集めた。アディポネクチン、レジスチンおよびPAI−1を含むアディポカインがLINCOヒトアディポカインキット(リンコリサーチ、セントチャールズ、ミズーリ州)を使用して検出された。
3名のOAおよび3名のRA患者に由来する滑膜および軟骨組織を、4mg/ml濃度の抗−レジスチン抗体(R&Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州)で染色した。レジスチンタンパク質は、OAおよびRA患者の両方に由来する滑膜中のいマクロファージ様細胞で検出された(データは示さず)。軟骨組織は1名のRA軟骨検体(ここで抗−レジスチン抗体は変性した軟骨細胞のサブセットを染色した)を除き、レジスチン染色について陰性であった(データは示さず)。このデータは、関節にある細胞がレジスチンの分泌の原因となる可能性があり、そして関節内レジスチンの蓄積が、すなわち関節内レジスチンレベルが血清レジスチン濃度から変動し得ることを示唆する。したがって関節内レジスチンレベルは、マクロファージ様の細胞数が損傷が誘導する炎症または軟骨の変性により増加する状況で増すと予想される。
2名の正常な健康な有志からのヒト末梢血単核細胞(PBMC)および単球を、LymphoprepTM勾配(グレイナー バイオ−ワン社:Greiner Bio−One,Inc、ロングウッド、フロリダ州)を使用して単離した。細胞は異なる濃度のヒト組換えレジスチン(ペプロテック社、ロッキーヒル、ニュージャージー州)で処理した。10%ウシ胎児血清を含有する完全DMEM培地中で2日間培養した後、コンディショニ
ングした培地を集め、そしてIL−1a,IL−1b,IL−1ra,IL−2,IL−4,IL−5,IL−6,IL−7,IL−8,IL−10,IL−12 p70,IL−12p40,IL−13,IL−15,IL−17,EGF,エオタキシン(eotaxin),フランクリン(francline),MIP−1b,IP−10,G−CSF,sCD40L,TGFα,VEGF,GM−CSF,IFN−g,IP−10,MCP−1,MIP−1a,TNF−αおよびRANTESを含むサイトカイン/ケモカインは、LINCOヒトサイトカインキット(リンコリサーチ)を使用してアッセイした。
ヒトPBMCまたは単球はヒト組換えレジスチンで処理し、そしてコンディショニングした培地を実施例11に記載したように集めた。3週齢のマウスから単離した大腿骨頭の関節軟骨を1:3に希釈したコンディショニング培地中で3日間培養した。培地を集め、そしてグリコサミノグリカン(GAG)をジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイにより測定した。DMMBアッセイは色素が硫酸化グリコサミノグリカンと錯化した時に起こる吸収最大の異染色性シフトに基づく。簡単に説明すると、培養基を色素と混合し、そして520nmでの吸収をプレートリーダーで読む。サンプルを標準曲線と比較して、GAGの濃度を決定する。
3週齢のマウスの股関節から大腿骨頭を単離し、そしてインビトロで2日間、10%FBSを含有する完全DMEM中で培養して平衡とした。次いで大腿骨頭の関節軟骨は種々の濃度のヒト組換えレジスチンで3日間処理した。コンディショニングした培地を集め、そしてグリコサミノグリカン含量を実施例12に記載のように測定した。軟骨組織を固定し、そして組織学用に調製した。簡単に説明すると、5mmの切片を脱パラフィン化し、水和し、そして10分間、0.1%トルイジンブルーで染色した。グリコサミノグリカン(GAG)はトルイジンブルーで暗青色に染まる。したがって染色強度の低下は軟骨からプロテオグリカンを含有するGAGの損失を示し、これは次いで軟骨組織の病理学的破壊を意味するであろう。
マウスの軟骨エクスプラントは、種々の濃度のヒト組換えレジスチンで3日間処理した。IL−1α,IL−1β,IL−2,IL−4,IL−5,IL−6,IL−7,IL−10,IL−12 p70,IL−13,IL−15,IL−17,IP−10,G−CSF,GM−CSF,IFN−γ,IP−10,MCP−1,MIP−1α,TNF−α,KCおよびRANTESを含むサイトカインは、LINCOマウスサイトカインキット(MCYTO−70K−PMX22、ルミネックス:Luminex、セントチャールズ、ミズーリ州)を使用してコンディショニング培地中で検出した。プロスタグランジンE2(PGE2)レベルは、ELISAキット(KGE004、R&Dシステムズ)によりコンディショニング培地で測定した。
Claims (17)
- ヒト レジスチンに結合し、そしてNF−κb媒介型シグナリングをモジュレートすることができるレジスチン アンタゴニスト。
- ヒト レジスチンに結合し、そしてMCP−1、IL−8、IL−6およびTNF−αからなる群から選択される少なくとも1つの炎症性サイトカインのレジスチン媒介型放出を阻害することができるレジスチン アンタゴニスト。
- ヒト レジスチンに結合し、そしてコラーゲンI、アルファ平滑筋アクチン、TGFβ1、CTGF、TGFβR、PDGFR、CD44、フィブリリン、フィブロネクチンおよびIL−6からなる群から選択される少なくとも1つの前線維性遺伝子発現のレジスチン媒介型誘導を阻害することができるレジスチン アンタゴニスト。
- ヒト レジスチンに結合し、そして繊維芽細胞機能をモジュレートすることができるレジスチン アンタゴニスト。
- アンタゴニストが抗体である請求項1、2、3または4に記載のレジスチン アンタゴニスト。
- ヒト レジスチンの残基50〜65(配列番号3)に位置するエピトープと反応性の単離された抗体。
- ヒト レジスチンの残基78〜93(配列番号4)に位置するエピトープと反応性の単離された抗体。
- 有効量の請求項5に記載のレジスチン アンタゴニストおよび製薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
- 請求項8に記載の製薬学的組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるレジスチンの生物学的活性を修飾する方法。
- 間質性肺疾患、過形成性瘢痕、ケロイド性瘢痕、強皮症、肝線維症、腎線維症および心筋線維症を含む異常な繊維芽細胞活性がある疾患の症状を処置または緩和する方法であって、請求項8に記載の製薬学的組成物をその必要がある患者に投与することを含んでなる上記方法。
- アミノ酸配列ESQSVTSRGDLATSPR(配列番号5)を有するペプチドを含んでなる単離されたポリペプチド。
- アミノ酸配列SGSWDVRAETTSHSQS(配列番号6)を有するペプチドを含んでなる単離されたポリペプチド。
- 配列番号5のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
- 配列番号6のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
- 変形性関節症の症状を処置または緩和する方法であって、請求項8に記載の製薬学的組成物をその必要がある患者に投与することを含んでなる上記方法。
- 患者の変形性関節症の危険性または進行を決定する方法であって:
a.患者の生物学的サンプル中のレジスチンタンパク質のレベルを測定し、そして
b.測定されたレジスチンレベルを集団における生物学的サンプル中のレジスチンレベルの標準と比較する、
ことを含んでなる上記決定法。 - 生物学的サンプルが滑液、血液、血清および血漿からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
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