JP2010286481A

JP2010286481A - 光反応性化合物を有する磁気ビーズへの化合物の固定法

Info

Publication number: JP2010286481A
Application number: JP2010110952A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Osada; 裕之長田; Kaori Honda; 香織本田; Kunifumi Ota; 邦史太田; Akiho Murayama; 晃歩村山
Original assignee: University of Tokyo NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: University of Tokyo NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2010-05-13
Publication date: 2010-12-24
Anticipated expiration: 2030-05-13
Also published as: US8901044B2; JP5681982B2; US20100311608A1

Abstract

【課題】本発明は、化合物を磁気ビーズに安定的かつ効率的に結合させる方法の提供を目的とする。
【解決手段】本発明は、化合物を光反応性化合物が表面に結合している磁気ビーズと接触させた後、磁気ビーズを化合物と共に支持体上に伸展し、該磁気ビーズに光を照射し、光反応性化合物と化合物との間に共有結合を形成させることにより、化合物が結合した磁気ビーズを作製する方法である。
【選択図】なし

Description

本発明は、化合物の磁気ビーズへの固定法に関する。

磁気ビーズは、種々の物質の混合物の中から目的のもの、例えば、タンパク質、ＤＮＡ、細胞などを取得する上で非常に有用性の高いものである。
例えば、細胞の抽出物の中から、特定のタンパク質を取得する場合、磁気ビーズの表面に目的のタンパク質と特異的に結合するリガンドを固定する。リガンドが固定された磁気ビーズを抽出物の中に添加し、リガンドを介して磁気ビーズに目的タンパク質を結合させたのち、磁力等を利用して磁気ビーズを回収すれば、目的タンパク質を取得することができる。このように、磁気ビーズの特徴をうまく利用すれば、多様な物質が混在する混合物中から目的の物質を効率的に取得することが可能となる。

生体物質の中でも所望の特異性を持つ抗体を抗体ライブラリーの中から選択する場合には、特に、磁気ビーズの利用が効果的である。例えば、タンパク質を抗原として、これに特異的に結合する抗体をライブラリー中から選択する場合、トシル基やエポキシ基などがその表面上に存在する磁気ビーズを利用すれば、これらの官能基とタンパク質に多数存在する遊離のアミノ基との間に共有結合を形成させることができるため、容易に、磁気ビーズ上へ抗原タンパク質を固定することができる。
しかし、アミノ基をほとんど有しない化合物（例えば、脂質などの低分子化合物）の場合、アミノ基を介した磁気ビーズへの結合が困難であるため、他の方法を利用する必要があった。例えば、その方法として、キャリアータンパク質を介する方法、ビオチン化によるビオチン−アビジン結合を利用する方法、疎水性官能基を持つ磁気ビーズを用いる方法、抗原に人工的にアミノ基を導入する方法（非特許文献１）、あるいは、光反応性架橋試薬を使用する方法（特許文献１）などが試みられていた。
しかし、抗原にキャリアータンパク質を結合させる方法、抗原をビオチン化する方法などを使用すると、抗原分子の立体構造に影響が出たり、ビオチン化部位に対して、又はキャリアータンパク質に対して選択的に抗体が得られてしまうという問題が生じていた。また、疎水性官能基を持つ磁気ビーズを用いる方法を生細胞によって構成される抗体ライブラリー（例えば、ＡＤＬｉｂ法によって調製される抗体ライブラリー、特許文献２、非特許文献２を参照のこと）からの抗体選択に使用すると、抗原がビーズから遊離し易いため、遊離した抗原がライブラリーを構成する細胞に致死的な影響を及ぼしていた。さらに、抗原に人工的にアミノ基を導入して磁気ビーズと直接結合する方法は、複雑な工程を含む化学合成を必要とするため、多くの時間と莫大な費用が必要となっていた。

これら方法に対し、光反応性架橋試薬（光反応性化合物）を用いて抗原を磁気ビーズに結合させる方法は、汎用的に種々の化合物を磁気ビーズに固定できる有効な手段であると期待されていた。ところが、従来使用されていた固相やアガロースビーズへの結合条件（例えば、紫外線照射・架橋条件）では、磁気ビーズへの抗原固定効率が著しく低く、期待される効果を得ることができなかった。
このような状況において、従来法では磁気ビーズに固定し難い抗原に対する抗体を、磁気ビーズを利用して、抗体ライブラリーから選択するためには、抗原となる化合物と磁気ビーズを安定的かつ効率的に固定するためのより改善された方法を確立する必要があった。

特許３９０１１２０号特許４２１４２３４号

http://www.riken.jp/lab-www/bioarchitect/report/2007/07-G/07_G26_ohta%20.pdf Ｓｅｏら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２３：７３１−７３５、２００５

本発明は、化合物を磁気ビーズに安定的かつ効率的に結合させる方法の提供を目的とする。具体的には、本発明は、化合物の中でも、特に、アミノ基をほとんど有しない化合物を、磁気ビーズに安定的かつ効率的に結合させる方法の提供を目的とする。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行ったところ、化合物を低密度（濃度）で伸展させた磁気ビーズと反応させることにより、これらの分子を安定的かつ効率的に磁気ビーズに結合させることができることを見出し、本発明を完成させた。
従来は、光反応性化合物が結合した磁気ビーズと化合物との混合物に対して、エッペンドルフチューブや試験管中で光照射することが多かったが、このような方法では、化合物の磁気ビーズへの固定率が低く、実用的な方法ではなかった。そこで、本発明者らは、上記方法では照射光が磁気ビーズに吸収されてしまうために化合物の固定効率が著しく低くなるのではないかとの仮説を定立し、この点を改善すべく試行錯誤を繰り返した結果、本発明を完成させた。本発明によれば、後述の実施例において示されるように、従来の方法と比較して顕著に高い化合物の固定率を実現することができる。

すなわち、本発明の主たる態様は以下の（１）〜（９）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「光反応性化合物が表面に結合している磁気ビーズに化合物を接触させ、該磁気ビーズを該化合物と共に支持体上に伸展し、該磁気ビーズに光を照射し、該光反応性化合物と該化合物との間に共有結合を形成させ、化合物が結合した磁気ビーズを作製する方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「磁気ビーズに光を照射する前に該磁気ビーズを乾燥させることを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「伸展した磁気ビーズの密度が１×１０^８個／ｃｍ^２以下であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記化合物がアミノ基を有しないか、ほとんど有しない化合物であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記化合物が脂質であることを特徴とする上記（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法で作製された磁気ビーズ」である。
（７）本発明の第７の態様は、「磁気ビーズ及び使用説明書を含み請求項（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法に使用されるキット」である。
（８）本発明の第８の態様は、「さらに、光反応化合物及び／又は化合物を含む上記（７）に記載のキット」である。
（９）本発明の第９の態様は、「上記（６）に記載の磁気ビーズを用いて抗体ライブラリーから前記化合物と結合する抗体を選択する方法」である。

本発明によれば、任意の化合物を安定的かつ効率的に磁気ビーズに結合させることができる。

本発明によれば、アミノ基を有さない化合物であっても、安定的で効率的に磁気ビーズへ結合させることができる。

本発明によれば、磁気ビーズに抗原として化合物を確実に結合させることができるため、生細胞を含む抗体ライブラリーからの目的抗体の選択に、副次的な作用（例えば、細胞への致死的な影響）を引き起こすことなく利用することができる。

本発明によれば、安価なコストで該化合物を磁気ビーズに結合させることができる。

図１は、磁気ビーズに光反応性化合物を結合させる過程の概念図である。図２は、磁気ビーズに結合させたサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を抗原として、ＡＤＬｉｂライブラリーから抗体を選択した結果を示す。図３は、磁気ビーズに結合させたスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）を抗原として、ＡＤＬｉｂライブラリーから抗体を選択した結果を示す。図４は、磁気ビーズに結合させたスフィンゴシン１−リン酸（ＳＩＰ）を抗原として、ＡＤＬｉｂライブラリーから抗体を選択した結果を示す。図５は、磁気ビーズに結合させたガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）を抗原として、ＡＤＬｉｂライブラリーから抗体を選択した結果を示す。図６は、従来法により化合物を磁気ビーズに結合させた結果を示す。結合画分（レーン１〜４）、非結合画分（レーン５，６）図７は、ラパマイシン結合磁気ビーズを用いたＦＫＢＰ１２の共沈実験の結果を示す。図は抗ヒトＦＫＢＰ抗体によるウェスタンブロットの結果である。ｉｎｐｕｔは、磁気ビーズに結合しているラパマイシンの量（ｍｇ）を示す。ｍａｒｋｅｒは、最左列に泳動したマーカータンパク質のことであり、左端の数字は分子量を示す。図８は、各種ＬＰＳを結合した磁気ビーズによって誘導される、ＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦ−α放出量を測定した結果を示す。本発明の方法による磁気ビーズ結合ＬＰＳ及び遊離ＬＰＳを、各々、図に示す濃度でＴＨＰ−１細胞に添加し、インキュベートした後、放出されるＴＮＦ−α量をグラフ化した。ＴＮＦ−αの放出量は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社のキットを使用し（実験方法を参照のこと）、ＯＤ_４５０の吸光度として示した。

本発明の実施形態には、光反応性化合物が表面に結合している磁気ビーズに化合物を接触させ、該磁気ビーズを該化合物と共に支持体上に伸展し、該磁気ビーズに光を照射し、該光反応性化合物と該化合物との間に共有結合を形成させ、化合物が結合した磁気ビーズを作製する方法が含まれる。
本発明の対象となる「化合物」は、特に限定はしないが、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄などを含む有機化合物、より具体的には、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、核酸などの生体分子や、低分子有機化合物など、好ましくは、分子量が比較的小さい低分子化合物である。また、本発明の対象となる化合物には、アミノ基を有しないか、ほとんど有しない化合物も含まれる。アミノ基をほとんど有しない化合物とは、特に限定はしないが、例えば、１分子あたりアミノ基の数が０〜５個、０〜３個、好ましくは、０〜１個の化合物のことである。

本発明における「光反応性化合物」は、光を照射することにより活性化され、任意の化合物と共有結合を形成するものであれば、いかなるものであってもよい。光反応性化合物としては、ナイトレンを発生する化合物（例えば、芳香族アジド、アルキルアジド、ヘテロ環アジドなどのアジド基を有する化合物）、カルベンを発生する化合物（例えば、ジアゾ基、ジアジリン環を有する化合物）、ラジカルを発生する化合物（例えば、ベンゾフェノン類、エノン類などの共役ケトン類、芳香族ハロゲン化合物類、オレフィン類）、炭素求電子剤を発生する化合物（例えば、芳香族ジアゾニウムなど）、ジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、又はジアゾ基を含む化合物などを挙げることができる。その他、特許第３９０１１２０号において開示されている光反応生化合物などを好適に使用することができる。より具体的には、光親和性団を有するポリエチレングリコールリンカー、Ｎ−（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカシル）−４（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−イル）−ベンズアミドなどを挙げることができる。

本発明において使用される「磁気ビーズ」は、光反応性化合物をその表面に直接的又は間接的に結合できるものであればいかなるものも使用可能であり、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基などを表面に導入できるように、表面がポリ陽イオンなどのポリマーにより被覆処理されているようなものを使用することができる。このような磁気ビーズは市販品を利用してもよく、例えば、Ｍ４５０−Ｅｐｏｘｙ（Ｄｙｎａｌ社）、Ｍ４５０−Ｔｏｓｙｌ（Ｄｙｎａｌ社）、μＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）などが利用可能である。また、光反応性化合物を磁気ビーズに結合させる方法に関しても、当業者であれば容易に選択することができる。光反応性化合物を結合させた磁気ビーズは、化合物との反応の前に、予め、該化合物が懸濁されている適当な溶媒中に懸濁しておいてもよく、その後の操作又は保存の段階において、好ましくは遮光してもよい。

本発明において、光反応性化合物を結合した磁気ビーズと化合物を接触させるために、当業者によって選択可能ないかなる手段を用いてもよい。例えば、チューブ中で適当な溶媒に懸濁させた磁気ビーズと化合物を適度に攪拌させてもよく、あるいは、後述の「支持体」上に伸展させた磁気ビーズに化合物を接触させ、支持体上で磁気ビーズと化合物を混合してもよい。
磁気ビーズに結合させる化合物の調製に使用される溶媒は、結合させる化合物の種類によって適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジオキサン、クロロホルムなどが使用可能である。磁気ビーズに結合させるために使用する化合物の量は、結合させる化合物の種類によって異なるが、磁気ビーズ表面に存在する光反応性化合物１分子に対し、例えば、化合物を約１〜１０分子程度、好ましくは、約１〜５分子程度、より好ましくは、約１分子程度であり、磁気ビーズ表面に存在する光反応性化合物の分子数より、化合物の分子数をやや多めに使用することが好ましい。あるいは、磁気ビーズと化合物の混合比は、当業者であれば、予備的な実験を行うことで容易に決定することが可能である。

本発明には、光反応性化合物が表面に結合している磁気ビーズをこれに結合させる化合物と共に支持体上に伸展する工程が含まれる。
ここで「支持体」としては、特に限定はしないが、表面が平らで、ＵＶ（紫外線）などの光照射や種々の化合物又は溶媒によって変質しない材質で、好ましくは、透明性のある材質であり、光反応性化合物と化合物との結合に影響を与えず、磁気ビーズ、光反応性化合物及び化合物を吸着等しない材質のものであれば利用可能である。好ましい支持体として、例えば、ガラス、陶器、セラミック、プラスチックなどを挙げることができる。支持体の形状又は面積（磁気ビーズ等を伸展する部分の面積）は、特に限定はされず、本発明を実施するスケール（化合物、あるいは、化合物を結合させる磁気ビーズの使用量に依存する）によって適宜選択することができる。例えば、少量で行う場合には、スライドガラスや、ガラスシャーレ（例えば、直径３ｃｍ程度）などが使用可能である。

ここで「伸展」とは、平らな支持体上に磁気ビーズを低密度で存在させることであり、溶液に懸濁されていても、溶液を含まずに該物質のみ乾燥した状態であってもよい。磁気ビーズを支持体上に伸展する場合、できるだけ均一な密度で、より好ましくは、単一層となるように実施する。伸展された磁気ビーズの密度は、例えば、１×１０^８個／ｃｍ^２以下、好ましくは、１×１０^３個／ｃｍ^２〜１×１０^８個／ｃｍ^２程度、より好ましくは、１×１０^６個／ｃｍ^２〜１×１０^７個／ｃｍ^２程度、さらに好ましくは、３×１０^６個／ｃｍ^２〜８×１０^６個／ｃｍ^２程度、さらにより好ましくは、４×１０^６個／ｃｍ^２〜６×１０^６個／ｃｍ^２程度である。

次に、本発明には、化合物と共に支持体上に伸展させた磁気ビーズ（光反応性化合物が結合している）に光を照射し、磁気ビーズ表面に存在する光反応性化合物と該化合物との間に共有結合を形成させる工程が含まれる。ここで照射する光は、用いる光反応性化合物の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、２００ｎｍ〜４００ｎｍ範囲の波長、好ましくは、３６０ｎｍ付近の波長の光を使用することができる。光源としては、水銀灯、レーザー光、発光ダイオードなどを適宜使用することができる。例えば、市販のＵＶクロスリンカーなどを使用してもよい。照射する光の強度、時間などは、当業者であれば、使用する磁気ビーズ、光反応性化合物及び低分子化合物に適する条件を、予備実験等により適宜決定することが可能である。例えば、照射する光を紫外線とした場合のその強度は、磁気ビーズの密度を１×１０^８個／ｃｍ^２以下とした場合、合計３Ｊ／ｃｍ^２〜６Ｊ／ｃｍ^２程度、好ましくは、合計４Ｊ／ｃｍ^２程度がよい。また、照射する紫外線の強度をビーズ１個あたりに換算すると、例えば、４．０×１０^−８Ｊ以上の強度、４．０×１０^−８Ｊ未満の場合、好ましくは、０．６×１０^−８Ｊ〜１．０×１０^−８Ｊ程度がよい。なお、紫外線照射条件（光線強度および時間）は、ビーズ径から計算される体積や、ビーズの基質に含まれる磁性物質濃度に応じて、増加・減少させることができる。

磁気ビーズに光を照射する場合、磁気ビーズは任意の溶媒中に懸濁状態で存在してもよいが、乾燥した状態の方が好ましい。化合物と共に支持体上に伸展させた磁気ビーズを乾燥させる場合、乾燥させる方法としては、特に限定されず、磁気ビーズ表面上の光反応性化合物の反応性を損なわず、また、該化合物の構造等に影響を与えないような任意の方法を実施することができる。例えば、遮光下において、溶媒成分を適当な温度、例えば、０〜７０℃程度、好ましくは２４〜３７℃程度で、適当な時間、例えば、１０分〜１時間程度、好ましくは３０分程度加温して、溶媒成分を蒸発させる。その後、遮光下にて、真空ポンプなどを適宜使用した減圧下において適当な時間、例えば、１０分〜１時間程度、好ましくは３０分程度乾燥させてもよい。

光照射を行った磁気ビーズは、適当な方法によって回収する。乾燥させた磁気ビーズに光照射を行った場合、適当な溶媒で磁気ビーズが付着している支持体表面をリンスしたのち、該溶媒と共に磁気ビーズを回収し、適当なチューブ等に回収する。この回収過程を数回（例えば、１〜１０回、２〜８回、好ましくは、４〜５回程度）、繰り返すことで、化合物が結合した磁気ビーズの回収率を向上させることができる。乾燥した磁気ビーズは、支持体上に強固に結合していることがあるため、付着した磁気ビーズを支持体表面から掻き取ることが必要となることもある。この場合、ある程度の物理的力を加えて支持体表面を擦ることになるため、支持体表面が削られることが無いような物（例えば、チップ、ラーバー製のスクレイパーなど）を使用してもよい。

本発明の他の実施形態には、本発明の方法により作製した磁気ビーズを用いて、磁気ビーズに結合している化合物に対する所望の抗体を、抗体ライブラリーから選択する方法が含まれる。
本発明において使用する抗体ライブラリーは、一群の（複数種類の）抗体を含むものであればいかなるライブラリーも使用することが可能で、いわゆる免疫グロブリンの分子形態を有する分子集団の他、細胞表面上に抗体を提示する細胞集団であっても、コートタンパク質に抗体を提示するウイルスであってもよく、本発明の実施に適したライブラリーを選択することは当業者であれば容易に行うことが出来る。そのようなライブラリーとしては、例えば、抗体を産生するＢ細胞集団（例えば、ニワトリ由来Ｂ細胞の株化培養細胞であるＤＴ４０細胞集団、例えば、ＡＤＬｉｂ法によって作製されたもの（ＡＤＬｉｂ法の詳細については、例えば、特許文献２及び非特許文献２を参照のこと））などを挙げることができる。
なお、本発明の抗体には、免疫グロブリンの形態を有するもの以外にも、例えば、単一鎖抗体、免疫グロブリンの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂなど）など、特定の分子と特異的に結合し、当業者が抗体として認識するあらやる分子が含まれる。
本発明の磁気ビーズを用いて抗体ライブラリーから所望の抗体を選択する方法は、用いる抗体ライブラリーによって異なり、選択条件について、当業者であれば容易に設定することができる。

本発明の実施形態には、本発明の磁気ビーズを作製するためのキットも含まれる。本発明のキットには、磁気ビーズ、光反応性化合物、磁気ビーズに結合させる化合物の他、本発明の磁気ビーズを作製する方法に使用される緩衝液、磁気ビーズを回収するための磁石なども適宜含まれる。キットに含まれる磁気ビーズは、光反応性化合物が結合しているものであっても、光反応性化合物が未だ結合していないものであってもよい。また、キットに含まれる磁気ビーズは、適当な容器中又は支持体上に散逸を防ぐような工夫（例えば、磁石等で磁気ビーズを容器中に留める）が施されていてもよく、乾燥状態でも溶媒中に懸濁された状態であってもよい。
さらに、本発明のキットには使用説明書が添付され、当該使用説明書には、本発明の磁気ビーズを作製する方法が詳細に記載されている。キットに添付される使用説明書は、紙その他の材質上に印刷されたものの他、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体であってもよい。さらに、使用説明書は、当該キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよく、必ずしも、キット中に実際に添付されていなくてもよい。

以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。

〔実験例〕
１．実験方法
１−１．細胞培養
ニワトリB細胞由来のＤＴ４０細胞は、ＣＯ_２インキュベーターにて、５％ＣＯ_２、３９．５℃で培養した。培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５５μＭ２−メルカプトエタノールを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、メタノールに５ｍｇ／ｍＬに溶解したものをストックとし、２．５ｎｇ／ｍＬとなるように培地に希釈した。
ヒトＴリンパ球性白血病細胞由来Ｊｕｒｋａｔ細胞（理研バイオリソースセンター）は培地ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）にて培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）を添加した。
ヒト単球性白血病由来ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ）は、培地ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）にて培養した。培地には、１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）を添加した。

１−２．光反応性架橋リンカーの磁気ビーズへの固定化
磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社、Ｍ４５０−Ｅｐｏｘｙ）懸濁液（磁気ビーズ密度＝４．０×１０^８／ｍＬ）を１．５ｍＬチューブ内に２００μＬ分取し、磁気スタンド上にて２分程度静置して磁気ビーズを集積した後、上清を除去した。緩衝液Ａ（０．１ＭＮａＨＣＯ_３−ジオキサン（１：１））を２００μＬ添加してボルテックスミキサーで懸濁し、上記同様に磁気スタンドに静置した後、上清を除去した。この洗浄操作を合計で３回繰り返し、最終的に沈殿状態として回収した。Ｎ−（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカシル）−４−（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−イル）−ベンズアミドを、２００μＬの緩衝液Ａに溶解し、上述の沈殿状態の磁気ビーズと混合し、懸濁した。
混合物を遮光し、３７℃下、振盪機により（毎分１５０ｒｐｍ）終夜反応させた。その後、２００μＬの緩衝液Ａで３回洗い、最終的にブロッキング液（１Ｍエタノールアミン、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２００μＬを加えて懸濁した。この懸濁液を遮光し、３７℃下、振盪機により（毎分１５０ｒｐｍ）２時間反応させた。２００μＬのエタノールで３回、２００μＬの純水で２回、２００μＬのメタノールで２回洗った。その後、磁気ビーズを２００μＬのメタノールに懸濁した。

１−３．化合物の磁気ビーズへの固定化
上記で作製した光反応性架橋基（光反応性化合物）を有する磁気ビーズ（図１）の懸濁液を、１００μＬ程度（５０μＬ〜１５０μＬでも可）、直径３ｃｍ（７．０７平方ｃｍ）のガラス製のシャーレ上に薄く伸展させた（１平方ｃｍ当たり、７μＬ〜２１μＬ、好ましくは１４μＬ程度）。
任意の低分子有機化合物を２００μＬのエタノールもしくはメタノールに溶解し、これを上記の磁気ビーズ懸濁液を伸展したシャーレ上に、滴下しつつ徐々に添加した。その後、シャーレ内に拡散した反応液を再度ピペットにて回収し、シャーレ中央部分から同心円状に滴下しつつ再度シャーレ上に伸展した（最終的な反応液量は、２１μＬ〜６３μＬ、好ましくは、４２μＬ程度となる）。

このシャーレを遮光下で３７℃のホットプレートに乗せ、３０分間加温して溶媒成分を蒸発させた。さらに、遮光条件・減圧下で３０分間程度乾燥を行った。ＵＶクロスリンカー（ＡＴＴＯ社製ＤＮＡ−ＦＩＸ，３６５ｎｍ）で、合計４Ｊ／ｃｍ^２の強度（合計３〜６Ｊ／ｃｍ^２でも可）、ビーズ１個あたり合計４×１０^−８Ｊ以上の強度（合計０．６×１０^−８〜１．０×１０^−８Ｊでも可）で紫外線を照射した。紫外線照射後、シャーレに２００μＬのメタノールを添加し、ピペットマン・チップの先端でガラス表面を削り取るように磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズ懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、該チューブを、磁気を有するスタンドに静置した。回収率を高めるために、さらに２００μＬのメタノールをガラスシャーレに添加し、残余の磁気ビーズを剥離し、先にスタンドに静置した１．５ｍＬチューブに添加した。２分ほど静置して磁気ビーズを集積し、上清のメタノール２００μＬを回収した。これを再度ガラスシャーレに添加し、磁気ビーズの残渣をさらに回収した。この操作を５回繰り返した。その後、一つの１．５ｍＬチューブに回収された磁気ビーズを、２００μＬのメタノールで１０回、２００μＬのエタノールで２回洗浄し、最終的に２００μＬのエタノールに懸濁した。

１−４．抗体産生細胞のセレクション
セレクション緩衝液（１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ：１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）１ｍＬに、上述の抗原化合物を結合させた５μＬの磁気ビーズ懸濁液を添加して混合し、磁気スタンドにて２分間静置の後、上清を除去した。これを３回繰り返し、最終的にセレクション緩衝液１ｍＬに懸濁し、氷冷した。
その後は、ＡＤＬｉｂ法の標準手法（例えば、特許文献２又は非特許文献２を参照のこと）に従って抗体産生細胞のスクリーニングを実施した。具体的には、ＡＤＬｉｂの細胞ライブラリー１００ｍＬを５０ｍＬチューブ２本に回収し、１９０×ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を除去した。次に、セレクション緩衝液１０ｍＬで細胞を懸濁し、１５ｍＬチューブに移した。１９０×ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を除去したセレクション緩衝液１ｍＬで細胞を懸濁し、１．５ｍＬチューブに移した。これを１，１００×ｇ、５分、４℃で遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物に前述の氷冷しておいた抗原付き磁気ビーズ懸濁液１ｍＬを添加して懸濁する。この懸濁液をローテーターを用い、３０分間４℃で反応させた後、ピペッティングで懸濁してから磁気スタンドにチューブを立て、氷上で５分間静置させた。上清を除去し、セレクション緩衝液１ｍＬで懸濁し、再度、磁気スタンドに立て、氷上で３分間静置させた。この操作を５回繰り返した。その後、最終的にセレクション緩衝液０．５ｍＬで懸濁した。コーニング社製リザーバーに３７℃で温めておいた培地３０ｍＬを添加し、その培地中に、この０．５ｍＬの懸濁液を全量投入し、ピペッティングで良く混合した。その後、９６穴プレートの各ウェルにこの細胞懸濁液を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。この際、７ｗｅｌｌにバックグラウンド用コントロールとして培地のみを３００μＬずつ添加しておいた。その後、３９．５℃で１週間、ＣＯ_２インキュベーターで培養した。

１−５．ＥＬＩＳＡ
目的抗原と対照抗原をそれぞれエタノールで０．５μｇ／ｍＬ以下になるように希釈し、１００μＬずつ９６穴イムノプレートに入れ、３７℃のハイブリオーブンで乾燥させ、イムノプレートを作製した。乾燥後、２００μＬのセレクション緩衝液を入れ、室温で３０分間以上反応させた。その後、２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳをよく除き、培養上清を１００μＬずつターゲット抗原（目的抗原）ｗｅｌｌとコントロール抗原（対照抗原）ｗｅｌｌに入れ、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳを除去し、さらに２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。次に、二次抗体（ａｎｔｉＣｈｉｃｋｅｎＩｇＭ−ＨＲＰ）をセレクション緩衝液で１０，０００倍に希釈した溶液を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、室温で４５分間反応させた。その後、反応液を除去し、２００μＬのＰＢＳで５回洗浄し、残余の溶液をできる限り吸引除去した。最後に３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）溶液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）１００μＬを５秒ごとに各レーンに添加し、室温で４分反応させた。その後、２０倍希釈硫酸（１Ｎ）１００μＬを、５秒ごとに各レーンに入れ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、洗浄や反応に用いるＰＢＳ、セレクション緩衝液にはＴｗｅｅｎなどの界面活性剤を入れてはならない。

１−６．ラパマイシン結合ビーズによるラパマイシン−ＦＫＢＰ１２複合体の共沈実験
１）ヒトＴリンパ球性白血病細胞由来Ｊｕｒｋａｔ細胞の培養細胞（１×１０^６／ｍＬ）を回収し、１０００回転で１０分間遠心した。
２）上清除去後、ＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ，３ｍＭＫＣｌ，９ｍＭＮａＨＰＯ_４，１．５ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．４）で洗浄した。
３）Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ，ｐＨ７．５）３００μＬに細胞を懸濁した。
４）超音波処理により細胞を破砕し、顕微鏡で破砕を確認した。
５）細胞破砕液を１５０００回転で３０分間、４℃にて遠心し、上清を回収した。
６）上清の細胞抽出液のタンパク質濃度を測定し、Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１３７ｍＭＮａＣｌ，３ｍＭＫＣｌ，９ｍＭＮａＨＰＯ_４，１．５ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４，ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ，ｐＨ７．４）により、最終タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。
７）次に、前述の方法にて作製したラパマイシン結合ビーズ）懸濁液１０−１００μＬと混合し、４℃で３０分〜２０時間インキュベートした。
８）その後、マグネットスタンドで磁気ビーズを集積し、上清を取り除いた。
９）磁気ビーズを、Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ，０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１ｍｌで５回洗浄した。
１０）最終的に、ＰＢＳ１５μＬ、２倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１０％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，４％ＳＤＳ，１０％ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ６．８）１５μＬを添加し、９５℃下で１０分間熱処理を行った。
１１）マグネットスタンド上で磁気ビーズを集め、上澄み１０μＬを１５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってタンパク質の分離を行い、抗ＦＫＢＰ１抗体（Ａｂｃａｍ社、１０００倍希釈）を用いてＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇを実施した。

１−７．ＴＨＰ−１細胞からのTＮＦ−α放出量の測定
１）ＴＨＰ−１細胞を２４ｗｅｌｌプレートに、１ｗｅｌｌにつき６×１０^５個播いた。
２）リポ脂質（ＬＰＳ_０１１１，ＬＰＳ_Ｒｅ，ＬｉｐｉｄＡ；いずれも、本発明の方法により磁気ビーズ修飾したものと未修飾のもの）を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。
３）細胞培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、遠心操作（３，５００回転，４℃，５分間）を行い、上清を回収した。この上清中に含まれるＴＮＦαを測定した。測定はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＨｕｍａｎＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａのプロトコルに従った。
４）あらかじめＡｓｓａｙＤｉｌｕｅｎｔＲＤ１Ｆを５０μＬ添加したアッセイプレートに、方法３）で回収した上清を２００μＬ添加し、室温で２時間インキュベートした。
５）上清をデカンテーションし、４００μＬのＷａｓｈｂｕｆｆｅｒで、４回洗浄した。
６）２００μＬのＴＮＦ−α Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを添加し、室温で１時間インキュベートした。
７）ＴＮＦ−α Ｃｏｎｊｕｇａｔｅをデカンテーションし、４００μＬのＷａｓｈｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した。
８）２００μＬのＳｕｂｓｔｒａｔｅｂｕｆｆｅｒを添加し、室温遮光にて２０分間インキュベートした。
９）５０μＬのＳｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、４５０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。

２．結果
２−１．疎水性タンパク質（サイクロスポリンＡ）に関する実施例
サイクロスポリンＡ、０．５μｇを用いて、上記の実験を行った。その結果、ＥＬＩＳＡ後のＯ．Ｄ．４５０値が０．６以上のクローンを２種類取得できた（図２）。
２−２．脂質に関する実施例
スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、ガラクトシルセラミドなどの糖脂質、及びスフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）などのスフィンゴ脂質を、各５０ｎｇを用いて上記実験を行った。その結果、Ｏ．Ｄ．４５０値が０．５以上の目的脂質抗体を産出する細胞クローンを、複数種取得することができた（図３〜５）。
２−３．ラパマイシン結合ビーズに関する実施例
磁気ビーズ（１００μＬ：４×１０^７）に種々の量のラパマイシン（０，０．１，１，１０ｍｇ）を結合させ、Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物（タンパク質量；１．２５ｍｇ、濃度；５ｍｇ／ｍＬ）中で、４℃、１２０分インキュベートした。インキュベート後、ラパマイシン結合磁気ビーズとの共沈産物に対し、マウス抗ヒトＦＫＢＰ１２抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、ラパマイシン結合ビーズと共に沈殿に回収されたＦＫＢＰ１２の量は、結合させたラパマイシンの量依存的に増大していることが明らかとなった（図７）。一方、ｍｏｃｋ処理（ラパマイシン量が０ｍｇの場合）により回収されたＦＫＢＰ１２の量は検出されなかった。
以上の結果から、本発明の方法により、ラパマイシンを磁気ビーズ上に確実かつ効率的に結合させることができることが明らかとなった。
２−４．ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−磁気ビーズの生理活性の検討
本発明の方法により、磁気ビーズに結合させたリポ脂質（ＬＰＳ）が、炎症シグナルを誘導する生理活性を保持しているかどうか、ＴＨＰ−１細胞を用いて確認した。炎症シグナルの誘導活性は、細胞からのＴＮＦ−αの分泌を測定することにより調べた（図８）。
図８に示す結果から、ＬＰＳ_０１１については、遊離のものに比べて磁気ビーズに固定したものは、約１／１０程度の活性を保持していることが分かる。また、ＬｉｐｉｄＡとＬＰＳ_ＲｅについてはＴＨＰ−１細胞での応答性がそれほど高くないが、それでも磁気ビーズ結合体は遊離型の１／１０−１／２０程度の活性を持つことが確認できた。なお、磁気ビーズ結合ＬＰＳ群の濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、あくまでも結合時の条件から推定される値であり、実際には図８中に示す値よりも低いと推定される。
以上の結果から、磁気ビーズに固定したＬＰＳなどの低分子化合物が生理活性を保持する場合、生体内などにおいて磁力により、任意の特定部位に低分子化合物を結合した磁気ビーズを集積させ、がんなどの治療に用いることが可能となる。

〔比較例〕
次に、〔実験例〕で抗原として使用した化合物（ＣｓＡ）を、従来行われるようにマイクロ試験管中でＵＶ照射を行って磁気ビーズに結合させ、化合物（ＣｓＡ）に対する抗体の選択を試みたのでその結果を以下に示す。
１．実験方法
通常の方法で光親和型リンカーを導入したＤｙｎａＢｅａｄｓと、サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）のメタノール溶液をマイクロ試験管に入れて混合し、乾燥後にＵＶを照射し、ＣｓＡをビーズに固定化した（ＣｓＡビーズ）。ＣｓＡビーズをメタノールで回収し、通常の方法で洗浄を行った。ＣｓＡがビーズに固定化されていることを確認するために、ＣｓＡビーズと、化合物を混合しないでＵＶ照射して作製したコントロールビーズを用いて、タンパク質競合結合実験を行った。ＣｓＡビーズの結合の特異性を確認するため、得られたＣｓＡビーズ及びコントロールビーズに、各々、磁気ビーズ抗ＣｓＡ抗体にＢＳＡを１：１０の割合で混合した溶液を添加して反応を行い、各ビーズを磁力により回収し、数回の洗浄を行った。その後、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。

２．結果
図６に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色の結果を示す。図６から分かるように、コントロールビーズのみならず、ＣｓＡビーズにも抗ＣｓＡ抗体は全く結合していなかった（図６、レーン１とレーン３を参照）。

以上の結果から、本発明の方法によれば、通常の方法では磁気ビーズに結合することが困難であった化合物であっても容易に結合することができ、任意の抗体ライブラリーから効果的に該化合物に対する抗体をスクリーニングすることが可能となる。

本発明によれば、任意の化合物、特に、アミノ基をほとんど有しないような化合物を磁気ビーズに安定的かつ効率的に結合させることができる。従って、本発明は、抗体関連分野の技術など、生命科学に関連する産業分野における技術の進歩に大いに寄与するものである。

Claims

光反応性化合物が表面に結合している磁気ビーズに化合物を接触させ、該磁気ビーズを該化合物と共に支持体上に伸展し、該磁気ビーズに光を照射し、該光反応性化合物と該化合物との間に共有結合を形成させ、化合物が結合した磁気ビーズを作製する方法。
磁気ビーズに光を照射する前に該磁気ビーズを乾燥させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
伸展した磁気ビーズの密度が１×１０^８個／ｃｍ^２以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
前記化合物がアミノ基を有しないか、ほとんど有しない化合物であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
前記化合物が脂質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
請求項１乃至５のいずれかに記載の方法で作製された磁気ビーズ。
磁気ビーズ及び使用説明書を含み請求項１乃至５のいずれかに記載の方法に使用されるキット。
さらに、光反応化合物及び／又は化合物を含む請求項７に記載のキット。
請求項６に記載の磁気ビーズを用いて抗体ライブラリーから前記化合物と結合する抗体を選択する方法。