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JP2010284101A - Reactor vessel, parallel processing apparatus and sequencer - Google Patents

Reactor vessel, parallel processing apparatus and sequencer

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JP2010284101A
JP2010284101A JP2009139771A JP2009139771A JP2010284101A JP 2010284101 A JP2010284101 A JP 2010284101A JP 2009139771 A JP2009139771 A JP 2009139771A JP 2009139771 A JP2009139771 A JP 2009139771A JP 2010284101 A JP2010284101 A JP 2010284101A
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JP
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improved
detection
parallel
reaction
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Pending
Application number
JP2009139771A
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Japanese (ja)
Inventor
Ryoji Inaba
Koichi Kato
良仁 伊名波
宏一 加藤
Original Assignee
Hitachi High-Technologies Corp
株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a sequencer that has a more improved throughput.
SOLUTION: A power density of 10 times or more of fluorescence excitation intensity is achieved by using an inexpensive high-intensity LED light source. Consequently, the excitation light irradiation time in detection is made 1/10 or less to shorten the time required for detection. Consequently the throughput is improved by treating a plurality of three or more reaction substrates in parallel within a reaction time of a minimum unit which has been conventionally rate-controlling.
COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は蛍光検出用反応制御装置に関わる。 The present invention is related to the reaction control apparatus for fluorescence detection. より具体的には、DNAあるいはRNAなどの核酸の塩基配列を解読するための方法および核酸配列解析装置に関わる。 More specifically, concerning the method and nucleic acid sequence analysis apparatus for decoding a base sequence of nucleic acids such as DNA or RNA.

1990年から2005年の間に30億ドルの予算を投じたヒトゲノム計画では、解読が最も容易な部分(全体の93%)を予定よりも2,3年早く読み取ることができ、非特許文献1にみられるように解読に必要な技術や方法を遺産として残した。 In the Human Genome Project, which invested $ 3 billion budget of between 2005 from 1990, it can be read two or three years ahead of schedule the easiest part to decipher (93% of the total), Non-Patent Document 1 technology and methods that you need to decipher as can be seen to the left as a legacy. そうした技術はその後もさらに改良が進み、今日では約2000万ドル($2×10 7 )程度で、実用に耐えられる精度でのゲノム解読が可能になった。 Such techniques may then be improved proceeds further, today about 20 million US dollars ($ 2 × 10 7) extent, allowed the genome sequencing of accuracy for practical use. それでもなお、この金額では大規模な塩基配列解読ができるのは、専門の解読センターか、巨額の予算を得た大きな研究プロジェクトに限られる。 Nevertheless, in the can is a large-scale base sequencing this amount of money, or professional decoding center, limited to large research project got a huge budget. しかし、配列決定のコストが下がれば、より大量のゲノムを多数扱うことができる。 However, if residual values ​​decrease the cost of sequencing, it is possible to handle a large number of larger amounts of the genome. 例えば患者と健常者のゲノムの比較が可能となり、結果としてゲノム情報の価値の向上が期待される。 For example comparison of the genome of the patients and normal persons becomes possible, improving the value of genome information is expected as a result. 非特許文献2にみられるようにこのような基礎的データの取得は将来のテーラーメード医療への発展に大きく寄与することが予想される。 Acquisition of such basic data as seen in Non-Patent Document 2 is expected to contribute greatly to the development of future personalized medicine.

上述した状況の下、米国立衛生研究所(NIH)が資金援助している「革新的ゲノム配列決定技術」のための2つのプログラムは、2009年までにヒトゲノム解読1人分で10万ドル($1×10 5 )、そしてそれを2014年までに1000ドル($1×10 3 )にすることを目標としている。 Under the above-mentioned situation, the two programs for "Innovative genome sequencing technology," the US National Institutes of Health (NIH) has funded the $ 100,000 the human genome deciphered one person by 2009 ( $ 1 × 10 5), and is targeted to be $ 1000 ($ 1 × 10 3) in it until 2014. いわゆる「1000ドルゲノム」解読技術の開発である。 It is the development of so-called "1000 Dorugenomu" decoding technology.

既に非特許文献3にみられるように454Life Science社,Solexa社およびAB社の3社の次世代シーケンサが商品化されている。 Already Non-Patent Document 3 as seen in 454Life Science Co., Solexa, Inc. and AB, three companies next generation sequencer have been commercialized. これらの技術は既に従来技術の1/10〜1/100のコストを達成している。 These techniques have already achieved a 1 / 10-1 / 100 cost of the prior art. また、1回の解析により計測可能な塩基数も10 9オーダーを達成している。 Also achieved even 10 9 order number of bases measurable by one analysis. しかしながらこれらのシーケンサのコスト面での向上はほぼ頭打ちであり、既に商品化されている装置・方式による$1000ゲノムの達成は困難と予想されている。 However improvement in cost of these sequencers are substantially peaked already achieved the $ 1000 genome by device-type commercialized is expected difficult.

また、現在市販されている次世代シーケンサは10 9程度までの塩基配列を解読できるものの、10 9塩基に相当する大量データの配列解読のランタイムのみで2,3日以上の時間を要している。 Further, it takes the current although the next generation sequencers commercially available can identify the nucleotide sequence of up to about 10 9, 10 9 only run time sequencing of large amounts of data corresponding to the base in two or three days or longer . 医療現場において個人レベルのゲノム配列解読がルーチン・ワークとなるためにはコストのみならず配列解読の高速化が必要となる。 Genome sequencing of the individual level it is necessary to speed up the sequencing not cost only in order to become a routine work in the medical field.

特許文献1にはAB社の次世代シーケンサにおけるシステムの詳細が述べられている。 System Details are set forth in the AB, the next generation sequencers Patent Document 1. システムは、CCDカメラ,蛍光顕微鏡,可動ステージ,Peltierフローセル,温度制御装置,液体操作装置および専用のコンピュータを備える。 The system comprises a CCD camera, a fluorescence microscope, a movable stage, Peltier flow cell, the temperature control device, the computer liquid handling devices and private. AB社のシステムでは、Olympusエピ蛍光顕微鏡本体(横向きに設置)を主部とし、自動オートフォーカシングステージおよびCCDカメラを備える。 The AB's system, Olympus epifluorescence microscope main body (placed sideways) as a main unit, an automatic auto-focusing stage and a CCD camera. 回転式ホルダ内の4つのフィルタキューブにより、さまざまな励起および発光波長での4色検出が可能である。 The four filter cubes in a rotary holder, it is possible to four-color detection at various excitation and emission wavelengths. 装置はカメラが常時作動中で維持されるように設計されている。 Device camera is designed to be maintained in operation at all times. そのためにAB社やHelicos社の次世代シーケンサは2つのフローセルを装着して、1つのフローセルの反応時間中にもう1つのフローセルを用いて蛍光画像の取得を行うシステムを採用している。 Its company AB and Helicos's next generation sequencers for the wearing the two flow cells, have adopted a system for acquiring fluorescence image with another flow cell during the reaction time of one flow cell.

特表2008−528040号公報 JP-T 2008-528040 JP

上記背景技術で説明したように、次世代シーケンシング技術においては更なるスループットの向上が望まれている。 As explained above background art, it has been desired to further improvement of throughput the next generation sequencing techniques. しかしながら、シーケンシングのスループット向上において伸長反応に代表される生化学反応が律速となっている。 However, the biochemical reaction is a rate-limiting typified by elongation reaction at increased throughput sequencing. ポリメラーゼを用いる伸長反応及びリガーゼを用いるライゲーション反応のいずれも反応が完了するまでに90分程度のインキュベーションを要する。 Any of the ligation reaction using an extension reaction and a ligase using the polymerase requires incubation of about 90 minutes to until the reaction is complete. このインキュベーション時間をデッドタイムとしないために、AB社やHelicos社は装置に2つのフローセルを装着して、1つのフローセルの反応時間中にもう1つのフローセルを用いて蛍光画像の取得を行うシステムを採用している。 The incubation time for no dead time, AB Company and Helicos Inc. wearing the two flow cell device, a system for acquiring a fluorescence image with another flow cell during the reaction time of one flow cell It has been adopted. しかしながら、上述の方式でも依然最小ユニットの反応に要する時間が律速なために、スループットの更なる向上が困難であった。 However, since the time required for the still reacting minimum unit in the manner described above is rate-limiting, further improvement in throughput is difficult.

また、次世代シーケンシング技術では、光源ON/OFF時の挙動が不安定なレーザあるいは或いは高出力の水銀ランプやXeランプを用いている。 Further, in the next generation sequencing techniques, behavior when the light source is ON / OFF is used unstable laser or alternatively high power mercury lamp or Xe lamp. これらの光源そのもののON/OFFを秒のオーダーで制御することには困難が伴った。 Difficulties accompanied in controlling the ON / OFF of the light sources themselves in the order of seconds. そのため、上記いずれの方式においてもCCDのデータ転送時には高価なシャッタにより励起光を遮断する必要があった。 Therefore, it was necessary to block the excitation light by expensive shutter during CCD data transfer In any of the above methods.

また、蛍光検出を行うための基板として表面修飾を施したスライドガラスが広く用いられている。 The slide glass is widely used which has been subjected to surface modification as a substrate for performing fluorescence detection. 実験時においてはユーザが手動でスライドガラス上にビーズを吸着させる必要があるが、スライドガラスが剥き出しであるためハンドリングに細心の注意を要するため、使い勝手の改善が待たれている。 It is necessary to adsorb the beads on a glass slide user manually in the experiment, it takes great care in handling because the slide glass is exposed, improvement of usability is awaited.

また、従来の落射蛍光照明においては通常スライド面に対して励起光を対物レンズの後焦点面の中央に垂直に集光させることでケーラー照明といわれる均一な照明を行っている。 Also, we have made the uniform illumination is said to Koehler illumination by a conventional epifluorescence illumination for converging vertically exciting light in the center of the focal plane of the objective lens with respect to the normal slide surface. この後焦点面の縁に入射後を垂直に集光させスライドガラス表面で全反射照明を達成することが可能となる。 It becomes possible to achieve a total reflection illuminated slide glass surface is focused the post incident perpendicularly to the edge of the focal plane this.

本発明では低価格な高輝度LED光源を使用して、従来用いられてきた水銀ランプなどのアーク光源による蛍光励起の10倍以上のパワー密度を達成する。 The present invention uses an inexpensive high-brightness LED light source, to achieve a power density of more than 10 times the fluorescence excitation by arc source such as a mercury lamp which has been used conventionally. これにより検出における励起光照射時間を1/10以下とすることで検出に要する時間を短縮する。 Thereby shortening the time required for detection by the excitation light irradiation time 1/10 in detection. これにより従来律速となっていた最小ユニットの反応時間内に3枚以上の複数の反応基板を並列に処理することにより、従来律速となっていた最小ユニットの反応時間に限定されることなくスループットの向上を図ることが可能となる。 By thus processing a plurality of the reaction substrate in parallel three or more in the reaction time of the minimum unit, which has been a conventional rate-throughput is not limited to the reaction time of the minimum unit, which has been a conventional rate-determining it is possible to improve.

また、LEDを用いることでシャッタを用いることなく、電流制御により励起光の照射を制御できる。 Further, without using the shutter with the use of LED, it can be controlled irradiation of the excitation light by the current control. 従って、シャッタレスのシステムの構築が可能となり、低コスト化が図れる。 Therefore, it is possible to construct the shutter-less system, cost can be reduced.

また、スライドガラスをパッケージングすることにより、スライドガラスのハンドリングを容易なものとする。 Furthermore, by packaging the slides, the handling of the slide glasses and easy. 更にパッケージングしたスライドガラス中に蛍光色素の発光の基点となるビーズを予め配置することにより、更にユーザの負担を軽減することが可能となる。 Further by previously placing the beads as a base point of emission of the fluorescent dye in a slide glass packaging, it is possible to further reduce the burden on the user.

本発明の蛍光測定装置は低価格なLED光源を使用して、検出に要する時間を短縮する。 The fluorescence measurement device of the present invention using low cost LED light source, to shorten the time required for detection. これにより最小ユニットの反応時間内のスキャン枚数を3枚以上に並列化する。 Thereby parallel to three or more scan number of the reaction time of the minimum unit. 本発明の効果として低コストかつハイスループットなDNAシーケンサのシステムを実現する。 To achieve low cost and high throughput DNA sequencer system as an effect of the present invention.

また、LEDの採用によるシャッタレスのシステムを構築し、装置の低コスト化を実現する。 Further, to build a system of shutter-less by adopting LED, to realize the cost reduction of the apparatus.

更にスライドガラスのパッケージ化を図ることにより、ユーザの操作性を向上させる効果をもたらす。 Further, by achieving packaging of the slide glass, resulting in an effect of improving the operability of the user.

実施例1におけるスライドガラスのパッケージングについての説明図。 Illustration of the packaging of the slide glass in Example 1. 実施例2におけるシーケンス反応についての説明図。 Illustration of the sequence reactions in Example 2. 実施例3において用いる蛍光色素の吸収スペクトルと蛍光スペクトル。 Absorption spectrum and fluorescence spectrum of the fluorescent dye used in Example 3. 実施例3における2個或いは4個のLEDより構成される光源についての説明図。 Illustration of two or light source composed of four LED according to the third embodiment. 実施例3におけるLED照明のために用い光学素子の配置についての説明図。 Illustration of the arrangement of the optical elements used for LED lighting in Example 3. 実施例3におけるRoyal BlueのLEDの発光スペクトル。 Emission spectrum of the Royal Blue of LED in the third embodiment. 実施例3におけるWarm WhiteのLEDの発光スペクトル。 Emission spectrum of the LED Warm White in Example 3. 実施例3におけるLEDからの発光を混合するためのダイクロイックミラーの透過特性。 Transmission characteristics of the dichroic mirrors for mixing the light emitted from the LED in the third embodiment. 実施例3における4蛍光色素用のバンドパスフィルタの透過特性。 Transmission characteristics of the band-pass filter for 4 fluorescent dyes in Example 3. 実施例3における4蛍光色素用のエミッションフィルタの透過特性。 Transmission characteristic of the emission filter for 4 fluorescent dyes in Example 3. 実施例3における4蛍光色素用のダイクロイックミラーの透過特性。 Transmission characteristic of the dichroic mirror for 4 fluorescent dyes in Example 3. 実施例3における落射蛍光装置についての説明図。 Illustration of epifluorescence in Example 3. 実施例3においてシャッタレス化した場合のタイミングチャート。 Timing chart when the shutter-less in Example 3. 実施例4における複数のスライドガラスの並列処理する方法についての説明図。 Illustration of a method for parallel processing of a plurality of glass slides in Example 4. 実施例4における複数のスライドガラスの並列処理する方法についての説明。 Description of how to parallel processing of a plurality of glass slides in Example 4. 実施例4における複数のスライドガラスの並列処理する方法についての説明。 Description of how to parallel processing of a plurality of glass slides in Example 4. 実施例5におけるスライドガラスのパッケージングについての説明図。 Illustration of the packaging of the slide glass in Example 5. DNA断片が多数結合したビーズをスライドガラスに固定する説明図。 Illustration of fixing beads DNA fragment is bound multiple glass slide. ビーズが予め配列されたスライドガラスがパッケージングされている場合の説明図。 Illustration of when the slide glass beads are pre-arranged is packaged.

本発明の第1の実施例として、解析すべきDNA断片を複数結合したビーズを予めパッケージングされたスライドガラス上に固定する方法について図1を用いて以下に説明する。 As a first embodiment of the present invention, a method of fixing on a slide glass which is pre-packaged beads plurality bind DNA fragment to be analyzed will be described below with reference to FIG. パッケージングされたスライドガラスは上面のカバー103とスライドガラス107によってスペーサ104を挟み込むことにより形成する。 Packaged slide glass is formed by sandwiching the spacer 104 by the cover 103 and the slide glass 107 of the upper surface. 溶液交換を円滑に行うため、スペーサの104厚みは350um程度が望ましい。 To perform the solution exchange smoothly, 104 the thickness of the spacer is about 350um is desirable. カバー103上面には溶液のインレットとなるセプタ101及びアウトレットとなるセプタ102が形成されている。 The cover 103 top septum 102 as a septum 101 and an outlet as the inlet of the solution is formed. このセプタ101、102に注射針などを挿入し、溶液を注入することでフローセル内に溶液を満たすことができる。 The septa 101, 102, etc. injection needle was inserted into the solution can meet the solution into the flow cell by injecting. この場合、セプタ101をインレットとして、溶液を注入する。 In this case, the septum 101 as the inlet and the solution is injected. セプタ102はアウトレットとして空気抜きの役割を担う。 Septa 102 plays the role of an air vent as outlet. 溶液内にはプローブオリゴ109を複数固定したビーズ108が多数存在している。 Beads 108 are present a number of a plurality fixing the probe oligonucleotides 109 into the solution. ビーズ108はスライドガラス107と接触した際に共有結合を形成するように化学処理されているため、溶液を満たしたスライドガラス107を遠心することによりビーズ108はスライドガラス107上に沈降し、固定される。 Since bead 108 is chemically treated to form a covalent bond upon contact with the slide glass 107, beads 108 by centrifuging the slide glass 107 filled with solution is precipitated on the slide glass 107 is fixed that.

パッケージングされていないままのスライドガラス107を用いる場合、スライドガラス107の表面をユーザが不注意に触れてしまう危険性があった。 When using a glass slide 107 remains to be packaged, the surface of the slide glass 107 user had danger of touching inadvertently. また、スライドガラス107に固定したビーズ108は乾燥すると化学状態が変化してしまうため、後段のシーケンシング反応が円滑に進行しなくなる。 Further, since the bead 108 fixed to the slide glass 107 to dry the chemical state varies, the subsequent sequencing reaction no longer proceeds smoothly. 従ってビーズ108が結合したスライドガラス107の表面には乾燥を発生させないため、常時水溶液内に存在させる必要がある。 Therefore the surface of the slide glass 107 which beads 108 are attached so as not to generate a dry, should be present at all times in an aqueous solution. 従って、本実施例で説明したパッケージングされたスライドガラス107を用いることにより、スライドガラス107への接触及びスライドガラス107上のビーズ108の乾燥を防止することが可能となる。 Thus, by using the slide glass 107 which is packaged as described in the present embodiment, it is possible to prevent contact and drying of the beads 108 on the slide glass 107 to the slide glass 107. また、予めパッケージングされたスライドガラス107を使用することにより、操作性よくビーズ108をスライドガラス107上に固定することが可能となる。 Further, by using the slide glass 107 which is prepackaged, it is possible to fix the good operability beads 108 on the slide glass 107.

次に本発明の第2の実施例として、シーケンス反応について図2を用いて以下に説明する。 Next, as the second embodiment of the present invention will be described below with reference to FIG. 2 for the sequence reaction. フローセル213内のスライドガラス表面には反応液がセプタ211,212を通して注入されている。 The slide glass surface in the flow cell 213 reaction solution is injected through the septa 211 and 212. 反応液はそれぞれ異なる蛍光色素でラベルされた4種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼを含む。 The reaction solution contains four kinds of nucleotides and polymerases labeled with different fluorescent dyes, respectively. 各ヌクレオチドはそれぞれFAM−dCTP214,Cy3−dATP215,y5−dCTP216,Cy5−dCTP217である。 Each nucleotide is respectively FAM-dCTP214, Cy3-dATP215, y5-dCTP216, Cy5-dCTP217. 各ヌクレオチドの濃度は200nMである。 The concentration of each nucleotide is 200nM. また、反応液は伸張反応が効率よく行われるように塩濃度,マグネシウム濃度およびpHが最適化されている。 The reaction solution salt concentration as the extension reaction is carried out efficiently, magnesium concentration and pH are optimized. 計測領域218は、サンプル面上における対物レンズの計測可能な視野である。 Measurement area 218 is measurable field of view of the objective lens at the sample surface. 従ってスライドガラス全面を計測するためには、少なくともスライドガラス全面の面積を計測領域218の面積で除した数だけスキャンする必要がある。 To measure the glass slide entire therefore, it is necessary to scan the number obtained by dividing an area of ​​at least glass slide entire surface area of ​​the measurement region 218. 反応開始前に配列を解読したいDNA断片206とプローブオリゴ205はハイブリダイゼーションさせる。 DNA fragments 206 and probe oligonucleotides 205 wants to decrypt the array before the beginning of the reaction are hybridized. 反応溶液中にはポリメラーゼが含まれており、DNA断片206に相補的な蛍光ヌクレオチドが1塩基だけ取り込まれる。 The reaction solution includes a polymerase, is complementary fluorescent nucleotides into the DNA fragment 206 is captured by one base. 2塩基目の伸長が発生しないのは、1塩基目の蛍光色素がバルキーであるため、2塩基目の取り込みについて立体障害を起こすからである。 2 The base-th extension does not occur, since one base-th fluorescent dye is bulky, the two bases th uptake because cause steric hindrance. 1塩基が取り込まれた後、浮遊する蛍光ヌクレオチドを洗浄により除去した後、蛍光計測を行う。 After 1 bases were incorporated, it was removed by washing the fluorescent nucleotides floating performs fluorescence measurement. なお、以降の最小ユニットの反応を行うために、蛍光計測後、解離溶液により塩基から蛍光色素を解離させる工程が必須である。 In order to carry out the reaction of the minimum units of subsequent after fluorescence measurement, the step of dissociating the fluorescent dye from the base by dissociation solution is essential. この工程により、最小ユニットの反応における蛍光色素の立体障害をリセットすることができる。 This step can be reset steric hindrance of the fluorescent dye in the reaction of a minimum unit. これにより反応の継続が可能となる。 This makes it possible to continue the reaction. 再び蛍光ヌクレオチドをフローセル内に送液し、反応を繰り返すことにより、DNA断片206の逐次的なシーケンスが可能となる。 Again fluorescent nucleotides was fed into the flow cell, by repeating the reaction, it is possible to sequential sequence of DNA fragment 206.

次に本発明の第3の実施例として、LEDを蛍光色素の励起用光源として用いるシーケンス反応計測にいついて図3,図4,図5,図6,図7,図8を用いて以下に説明する。 Next, as the third embodiment of the present invention, FIG. 3 Itsui the sequencing reaction measurement using an LED as an excitation light source of a fluorescent dye, 4, 5, 6, 7, below with reference to FIG. 8 explain. シーケンス反応には実施例2で説明したように4種類の蛍光色素を用いる。 The sequence reaction using four kinds of fluorescent dyes as described in Example 2. より具体的な4種類の蛍光色素セットの例としては図3に示すようにFAM,Cy3,Texas Red,Cy5を挙げることが可能である。 More examples of specific four fluorescent dye set can be cited as FAM, Cy3, Texas Red, Cy5 as shown in FIG. 図3(a)および(b)にFAM,Cy3,Texas Red,Cy5の吸収および発光特性を示す。 Figure 3 (a) and (b) shows the absorption and emission characteristics of the FAM, Cy3, Texas Red, Cy5. 図3(a)よりFAM,Cy3,Texas Red,Cy5の最適な励起波長は495,512,590,650nmであることがわかる。 Optimum excitation wavelengths of Figure 3 from (a) FAM, Cy3, Texas Red, Cy5 is found to be 495,512,590,650Nm. この4つの蛍光色素を励起するために、図4(a)で示すように2つのLEDを用いることが考えられる。 To excite the four fluorescent dyes, it is conceivable to use two LED as shown in Figure 4 (a). より具体的には1つはRoyal Blue色のLEDであり、これはFAMの励起に用いる。 More specifically one is a LED of Royal Blue color, which is used for the excitation of FAM. もう1つは広い波長範囲に渡って励起光を発生することができるWarm-White色のLEDであり、これはCy3,Texas Red,Cy5の励起に用いる。 The other is a Warm-White Color LED capable of generating excitation light over a wide wavelength range, which is used for excitation of Cy3, Texas Red, Cy5. この2つのLEDの発光特性を図6(a),(b)に示す。 The luminescence properties of the two LED FIG. 6 (a), the shown (b). Royal Blue色のLED401はスペクトル幅が小さく、450nm付近に発光中心波長を持ち、FAM蛍光色素を効率よく励起することができる。 Royal Blue color LED401 the spectral width small, has an emission center wavelength of around 450 nm, can be excited efficiently FAM fluorescent dye. Warm-white色のLED402は白色光源に近い広いスペクトル幅を示し、Cy3,Texas Red,Cy5を効率よく励起することができる。 LED402 of Warm-white color indicates the broad spectral width close to white light, can be excited efficiently Cy3, Texas Red, Cy5. それぞれのLEDのカタログに記載されている出力は515mW,180lumenである。 Output that is described in each of the LED catalog 515MW, is 180Lumen. また、これらのLEDから発せられた光より色素励起に最適な波長成分を通過させるためのバンドパスフィルタの波長特性を図6(d)に示す。 Also shows a wavelength characteristic of a band pass filter for passing the optimum wavelength components from the light emitted from these LED dye excitation in FIG. 6 (d). 4つの色素の励起時にはこれらのバンドパスフィルタを光源であるLEDの前に順次設置することにより、各色素に最適な励起光を選択することができる。 During excitation of four dyes by sequentially installed in front of the LED as a light source of these band-pass filter, it is possible to select the optimal excitation light for each dye.

LED401,402は700mAの電流を流すことにより発光する。 LED401,402 emits light by applying a current of 700 mA. LED401,402の素子サイズは1mm角であるが、砲弾レンズのために見かけの素子サイズは1.39mm角となる。 Element size of LED401,402 but is 1mm square, the element size of the apparent for shells lens becomes 1.39mm angle.

LED照明を行う場合の光学素子の配置について図5を用いて以下に説明する。 The arrangement of the optical element when performing the LED lighting is described below with reference to FIG. LED121で発光した光は非球面レンズ122により集光され、バンドバスフィルタ123を通過し、対物レンズ124の瞳面に結像する。 Light emitted in LED121 is condensed by the aspherical lens 122, it passes through the band-pass filter 123 to form an image on the pupil plane of the objective lens 124. 対物レンズ124の瞳にLED121の像を置いた場合には、ケーラー照明が達成される。 If you place the image of the LED121 to the pupil of the objective lens 124, Kohler illumination is achieved. ケーラー照明とは光源自体に輝度ムラがあった場合においてもサンプル面での照明を均一に行うことができる照明法のことである。 The Kohler illumination is that the illumination method which can uniformly perform illumination with the sample surface even when there is a brightness unevenness in the light source itself. 像のある位置から射出した光は、射出した位置に対応した角度でサンプル面を通過・照明する。 Light emitted from a image position passes and lighting the sample surface at an angle corresponding to the injection position. 以上の構成でスライドガラス125上に固定された上の蛍光色素126をLED光源の輝度ムラに依存することなく均一に照明することが可能となる。 It becomes possible to uniformly illuminate without depending fluorescent dye 126 on which is fixed on the slide glass 125 in the above configuration the luminance unevenness of the LED light source.

より詳細な光学素子の大きさおよび位置について以下に説明する。 Described below the size and position of the more detailed optical element. 非球面レンズ122の直径は16mmで前焦点距離(BFL)は11.2mm、後焦点距離(BFL)は7.8mm、厚みは6mmである。 The diameter of the aspherical lens 122 is the front focal length at 16 mm (BFL) is 11.2 mm, the back focal length (BFL) is 7.8 mm, a thickness of 6 mm. また、LEDの発光面は1mm角の大きさであるが、砲弾レンズがLEDに被さっているため、LEDの見かけの大きさは1.39mmとなる。 Although the light emitting surface of the LED is the magnitude of 1mm square, because the shells lens is overlaying the LED, the size of the LED the apparent becomes 1.39 mm. また、20倍対物レンズ(NA0.45)と焦点距離180mmの集光レンズを用いる場合、対物レンズの焦点距離は180/20=9mmとなる。 In the case of using 20 × objective lens and (NA 0.45) a condenser lens with a focal length of 180 mm, the focal length of the objective lens becomes 180/20 = 9 mm. 対物レンズがサンプル面で発光したビーズから光を集光できる角度はNA=nsinθの公式よりsinθ=NA/n=0.45/1=0.45である。 Angle objective lens light from beads emitted by the sample surface can be condensed light is sinθ = NA / n = 0.45 / 1 = 0.45 from the official NA = nsinθ. 従って対物レンズの瞳の直径は2×9mm×0.45=8.1mmとなる。 Therefore pupil diameter of the objective lens becomes 2 × 9mm × 0.45 = 8.1mm. 従って1.39mmのLEDを8.1mm以下に結像する光学系の構築が必要である。 Therefore it is necessary to build an optical system for forming an LED of 1.39mm below 8.1 mm. この場合、光学系の倍率は8.1/1.39=5.8倍である。 In this case, the magnification of the optical system is 8.1 / 1.39 = 5.8 times. 前焦点距離11.2mmの比球面レンズを用いて5.8倍の拡大像を作りたい場合、物体を置くべき位置を計算することができる。 Before If you want to make the focal length 5.8 times magnified image using the ratio spherical lens of 11.2 mm, it is possible to calculate the position to place the object. 結論としてLED固定面から光軸上での非球面レンズの像側の面までの距離を15.8mmとすれば、非球面レンズの像側の面からLEDの像が形成される距離は一意に76.0mmと決定される。 If the LED fixed surface conclusion the distance to the surface on the image side of the aspherical lens on the optical axis and 15.8 mm, the distance which the LED image of is formed from the surface on the image side of the aspherical lens is uniquely It is determined to 76.0mm. 従ってこの位置に対物レンズの瞳面を設置することによりケーラー照明が達成される。 Therefore Koehler illumination is achieved by placing a pupil plane of the objective lens to this position.

次にLEDから出射した光をサンプル面上に集光できるパワー密度について以下に見積もる。 Then estimate below the power density that can condensing the light emitted from the LED to the sample surface. 例としてFAMの励起に用いるRoyal Blue のLEDを用いて説明する。 It will be described with reference to the Royal Blue of LED used for exciting the FAM as an example. このLEDの出力はカタログ値で515mWである。 The output of this LED is 515mW catalog value. 515mWの光は非球面レンズ122より1/3以上集光できる。 Light of 515mW can 1/3 or more condensing aspherical lens 122. 非球面レンズ122を通過後、集光する光路上にFAM用のバンドパスフィルタ(図6(d)に図示)を設置することによりFAM励起に適した波長帯域が選択される。 After passing through the aspheric lens 122, a wavelength band suitable for FAM excitation is selected by placing a band-pass filter for FAM the condensing light path (shown in Figure 6 (d)). バンドパスフィルタにより選択されるエネルギー量はバンドパスフィルタの幅にも依存するが、図6(d)のバンドパスフィルタを用いた場合は約30%のエネルギーが選択される。 Amount of energy selected by the band-pass filter is dependent on the width of the band-pass filter, the energy of about 30% in the case of using a band-pass filter shown in FIG. 6 (d) is selected. また、バンドパスおよびダイクロイックミラー,対物レンズ通過時に失うエネルギー量の割合をそれぞれ95%,90%,90%とする。 Further, band-pass and a dichroic mirror, 95% the percentage of energy lost during the objective lens passes, respectively 90%, 90%. 最終的にスライドガラスのサンプル面上に到達する光のパワー密度は515mW×1/3×0.3×0.95×0.9×0.9=35.7mWを得る。 Power density of light that ultimately reaches the sample surface of the glass slide to obtain a 515mW × 1/3 × 0.3 × 0.95 × 0.9 × 0.9 = 35.7mW. 20倍対物レンズの照明範囲は1mm以下であるため、最終的なパワー密度は35.7mW/mm 2以上となる。 For illumination range of 20 × objective lens is 1mm or less, the final power density becomes 35.7mW / mm 2 or more. Cy3,Texas Red,Cy5におけるパワー密度についても図6(b)に示されるWarm-White LEDのスペクトルについてCy3,Texas Red,Cy5のバンドパスフィルタを通過させた場合の光量を見積もることで算出できる。 Cy3, Texas Red, the power density at the Cy5 for spectrum Warm-White LED, also shown in FIG. 6 (b) can be calculated by estimating the amount of light when passed through a bandpass filter Cy3, Texas Red, Cy5. 結果として得られたパワー密度はCy3,Texas Red,Cy5につきそれぞれ15.0,15.7,14.8mW/mm 2である。 Power density obtained as a result are each 15.0,15.7,14.8mW / mm 2 per Cy3, Texas Red, Cy5. この値は一般に蛍光色素の観察に必要とされるパワー密度である1.5mW/mm 2よりも10倍以上大きいため、従来よりも短い露光時間で信号を取得することが可能である。 This value is typically larger 10 times or more than 1.5 mW / mm 2 is the power density required for the observation of the fluorescent dye, it is possible to obtain a signal with short exposure time than before.

次にLEDを用いた照明光源について図4を用いて説明する。 Next will be explained with reference to FIG illumination light source using a LED. LED401,402は発生した熱を大気中に逃がすためにヒートシンク403,404にそれぞれ固定されている。 LED401,402 is the generated heat is fixed to the heat sink 403 and 404 in order to escape into the atmosphere. 更に詳細には図5で示されるように発生した熱はサーミスタ129でモニタされ、熱を効率よく外部へと散逸させるためにファン128により送風される。 The heat generated as more particularly shown in Figure 5 is monitored by a thermistor 129, it is blown by the fan 128 to dissipate heat to the outside efficiently. また、フォトダイオード130を用いることでLED121の劣化をモニタすることができる。 Further, it is possible to monitor the degradation of the LED121 by using a photo diode 130. 図4においてLED401,402で発光した光は0.7以上のNAを持つ非球面レンズ406及び407で集光される。 Light emitted by LED401,402 4 is condensed by the aspherical lens 406 and 407 having a 0.7 or more NA. LED401及び402から発した光はダイクロイックミラー408により同一光路上に導かれる。 Light emitted from the LED401 and 402 is guided to the same optical path by the dichroic mirror 408. 本実施例で用いたダイクロイックミラーの分光特性を図6(c)に示す。 The spectral characteristics of the dichroic mirror used in the embodiment shown in FIG. 6 (c). このダイクロイックミラーは500nm近傍で急峻に立ち上がるため、LED401からの光は反射し、LED402からの光を直進させることで効率よく2つのLEDからの光を混合することができる。 The dichroic Because dichroic mirror is rising sharply at 500nm vicinity, it is possible to light reflected from the LED 401, mixing light efficiently from the two LED by linearly moving the light from the LED 402. 混合された光はミラー409で反射され、測定対象物に対して照射される。 Mixed light is reflected by the mirror 409 and is irradiated to the object of measurement. なお図4(b)では4色の蛍光色素の励起波長に最適化された4つのLED410,411,412,413を用いる。 Note optimized four used LED410,411,412,413 the excitation wavelength shown in FIG. 4 (b) in 4-color fluorescent dyes. (a)と比較して強い信号を取得することができる反面、ダイクロイックミラーおよびミラーなどを(a)よりも多数用意する必要があるため、コスト高であるという問題も発生する。 Although capable of obtaining a stronger signal compared to (a), it is necessary to prepare a large number than dichroic mirror or the like and a mirror (a), also occurs a problem that it is costly. 従って以下より2つのLEDを用いた説明を行う。 Therefore a description using the two LED from the following.

更に図7を用いて4蛍光色素の蛍光計測装置について説明する。 Furthermore for fluorescence measuring apparatus 4 fluorochromes will be described with reference to FIG. LED光源501は電源519から駆動回路518を経て駆動され、発光する。 LED light source 501 is driven from the power source 519 via the drive circuit 518 to emit light. LED401,402が格納されたLED光源501より射出した光は、回転ターレット502に保持されたキューブ504,505,506,507に向かう。 Light LED401,402 is emitted from the LED light source 501 which is stored, toward the cube 504,505,506,507 held by the rotary turret 502. キューブ504,505,506,507にはそれぞれ図6(d),(e),(f)で図示されたバンドパスフィルタ521,ダイクロイックミラー522,エミッションフィルタ523が装着されている。 Each Figure 6 is a cube 504,505,506,507 (d), (e), the bandpass filter 521 is shown in (f), a dichroic mirror 522, emission filter 523 is mounted. キューブ504,505,506,507内の光学フィルタはそれぞれFAM,Cy3,Texas Red,Cy5について最適化されている。 Optical filter in a cube 504,505,506,507 is optimized for FAM, Cy3, Texas Red, Cy5, respectively. 回転ターレット502は測定すべき蛍光色素に適したキューブを回転させることで光路上に設置する。 Rotary turret 502 is disposed on the optical path by rotating the cubes suitable fluorescent dye to be measured. LED401及び402から発した光はバンドパスフィルタ521を経てダイクロイックミラー522により上方に反射され、対物レンズ509により集光され、スライドガラス上に固定されたビーズに照射される。 Light emitted from the LED401 and 402 is reflected upward by the dichroic mirror 522 through a bandpass filter 521, is condensed by the objective lens 509, it is irradiated onto the bead which is fixed on a slide glass. 伸長反応に伴ってビーズ上に取りこまれた蛍光色素は励起され、蛍光を発する。 Fluorescent dye incorporated into the beads with the extension reaction are excited and emit fluorescence. スライドガラス上で等方的に発光した蛍光のうち一部が再び対物レンズ509により回収され、平行光となる。 Some of the isotropically emitted fluorescence on glass slides are again collected by the objective lens 509, the collimated light. 更に蛍光はダイクロイックミラー522,エミッションフィルタ523を通過し、集光レンズ517を経てCCD516の検出面で像を形成する。 Further fluorescence passes through the dichroic mirror 522, the emission filter 523, to form an image in the detection plane of CCD516 through the condensing lens 517. 伸長反応に伴い、フローセル上では固定されたビーズ上で蛍光色素が取り込まれ、4色のうち伸長した塩基に相当する1色の蛍光を発する。 As the extension reaction, a fluorescent dye is taken on beads fixed on the flow cell, it emits a single color fluorescence corresponding to bases extending out of the four colors. 以下FAMの場合を例として説明する。 The following case of FAM is described as an example. 伸長反応に伴い、取り込まれたFAM−dCTPを励起するためにLED401がONとなりLED402はOFFとなる。 As the extension reaction, LED 401 to excite the incorporated FAM-dCTP are turned ON LED402 is turned OFF. また、回転ターレットはキューブ504を回転させて光路に導く。 The rotary turret is guided to the optical path by rotating the cube 504. これによりFAMに最適な励起光がサンプル面に照射され、FAM−dCTPが取り込まれたビーズのみが発光する。 Thus optimal excitation light FAM is irradiated to the sample surface, only beads FAM-dCTP is incorporated emits light. この蛍光像をCCDカメラ520で取得・保存する。 The fluorescent image is acquired and stored by the CCD camera 520. 次にCy3,Texas Red,Cy5の蛍光像を取得するためにLED401はOFF、LED402をONとする。 Then LED401 to obtain the fluorescent images of Cy3, Texas Red, Cy5 is turned ON to OFF, LED 402. Cy3の励起を行うために光路にキューブ505を導く。 It leads to a cube 505 in the optical path in order to perform the excitation of Cy3. これによりCy3に最適な励起光がサンプル面に照射され、Cy3−dATPが取り込まれたビーズのみが発光する。 Thus optimal excitation light Cy3 is irradiated to the sample surface, only beads captured Cy3-dATP emits light. 蛍光像取得の直前にはピントを合わせるため、対物レンズオートフォーカス用モータ508により対物レンズ509をZ方向に駆動し、オートフォーカスを行う。 For focusing immediately before the acquisition fluorescence image, to drive the objective lens 509 in the Z direction by the objective lens autofocus motor 508 performs autofocus.

LED401,402のON/OFFは駆動回路518によって容易に行うことができる。 ON / OFF of LED401,402 can easily be performed by the drive circuit 518. 従来のシーケンサの光源はレーザ或いは水銀ランプやキセノンランプなどに用いられるアーク光源だった。 Light source of a conventional sequencer was arc source used such as laser or a mercury lamp and a xenon lamp. しかし、これらの光源は光源ON/OFF時の挙動が不安定だった。 However, these light sources behavior when the light source is ON / OFF was unstable. 従ってレーザあるいはアーク光源を光源として用いる場合にはCCDの転送時において高価なシャッタを用いて励起光を遮断する必要があった。 Thus in the case of using a laser or arc source as the light source it has been necessary to cut off the excitation light using an expensive shutter during CCD transfer. この状態を図8(a)に示す。 This state is shown in FIG. 8 (a). LED401,402のON/OFFは駆動回路518によって容易に行うことができるため、図8(b)のようにシャッタレスのシステムの構築が可能となり、装置の低コスト化が図れる。 Since ON / OFF of LED401,402 is capable of easily by the drive circuit 518, it is possible to construct the shutter-less system as in FIG. 8 (b), the attained cost reduction of the apparatus.

スライドガラス524は25×75mmの大きさであり、そのうちビーズを結合している反応領域は20×60mmの大きさである。 Slides 524 is the size of 25 × 75 mm, the reaction zone has them bound beads a size of 20 × 60 mm. 計測に用いる対物レンズ509は視野数22の20x対物レンズである。 Objective lens 509 used for the measurement is a 20x objective lens field of view number 22. 従って計測可能な領域の大きさは770um角程度の大きさである。 Therefore the size of measurable area has a size of about 770um angle. 従ってスライドガラス524の全ての反応領域を計測するためにはスライドガラス524を移動させ、画像を取得する必要がある。 Therefore, in order to measure all of the reaction regions of the slide glass 524 by moving the slide glass 524, it is necessary to acquire an image. 20×60mmの領域を770um角の計測で網羅するためには2100回程度のスライドガラス524の移動が必要となる。 To cover an area of ​​20 × 60 mm in the measurement of 770um angle is required movement of 2100 times about the slide glass 524. この場合、スライドガラス524はXYステージにより移動する。 In this case, the slide glass 524 is moved by the XY stage.

次に本発明の第4の実施例として、LEDを蛍光色素の励起用光源として用いるシーケンス反応計測の並列化について図9,図10,図11を用いて以下に説明する。 Then a fourth embodiment of the present invention, FIG. 9 for parallelizing the sequencing reaction measurement using an LED as an excitation light source of a fluorescent dye, 10, will be described below with reference to FIG. 11.

一般に1つの塩基の伸長に要する反応時間は90分程度と長い。 Generally the reaction time required for the extension of one base in the long and about 90 minutes. 従来の次世代シーケンサでは塩基伸長を行っている時間を有効に活用するため、1枚のスライドガラスで伸長反応を行っている90分の間にもう1枚のスライドガラスをスキャンできるように、2枚のスライドガラスの装着が可能なように設計されているものが多い。 In the conventional next generation sequencers to effectively utilize the time doing base extension, so can scan other glass slides during 90 minutes doing an elongation reaction at one slide glass, 2 like what is often mounted in the slide glass is designed to be. 具体的な例としてはLifeTech社のSOLiDやHelicos社のHeliscopeなどを挙げることができる。 Specific examples and the like LifeTech Co. SOLiD or Helicos's Heliscope.

本発明ではLEDを用いた照明を行い、FAM,Cy3,Texas Red,Cy5についてのパワー密度は35.7,15.0,15.7,14.8mW/mm 2を得た。 In the present invention performs illumination using the LED, the power density for FAM, Cy3, Texas Red, Cy5 got 35.7,15.0,15.7,14.8mW / mm 2. これは通常の水銀ランプなどを用いて蛍光色素を励起するために必要なパワー密度の1.5mW/mm 2の10倍以上のパワー密度である。 This is the power density of more than 10 times 1.5 mW / mm 2 in the power density necessary to excite the fluorescent dye using a conventional mercury lamp. このことは純粋に光照射している時間を1/10以下に短縮できるということを意味する。 This means that the purely the time that the light irradiation can be reduced to 1/10 or less. 露光時間を短縮することはスキャニング時間の大幅な短縮に繋がる。 To shorten the exposure time leads to a significant shortening of the scanning time. 一方化学反応である最小ユニットの反応の短縮は反応効率の低下を招くため、短縮は困難である。 Whereas shorter reaction smallest unit is a chemical reaction for causing a decrease in reaction efficiency, shortening is difficult. 従ってスループットの向上のためには最小ユニットの反応の90分の間に複数のスライドをどれだけ並列処理できるかによって決定される。 Thus for throughput of is determined by whether multiple slides how can parallelism between 90 minutes of reaction the minimum unit. 図9(b)の表に示されるとおり、反応とスキャンに要する時間の比が1:1の場合は2枚のスライドの並列処理が可能である。 As shown in the table of FIG. 9 (b), the ratio of the time required for the reaction and the scan is 1: 1 is capable of parallel processing of two slides. ここで注目すべき点は、対物レンズやCCDカメラが1つであるため、スキャニングは並列化できないが、最小ユニットの反応については溶液をフローセルに満たすだけなので、並列化できるという点である。 It should be noted here that, since the objective lens or CCD camera is one, scanning is not be parallelized, the reaction of the minimum unit because only fill the solution into the flow cell is that parallelizable.

反応とスキャンに要する時間の比が2:1の場合は3枚のスライドの並列処理が可能である。 The ratio of the time required for the reaction and scan 2: 1 is capable of parallel processing of the three slides. 同様に反応とスキャンに要する時間の比が3:1の場合は4枚のスライドの並列処理が可能である。 Time ratio required for the same reaction and scan 3: 1 is capable of parallel processing of 4 slides. これを一般化して反応とスキャンに要する時間の比がn:1の場合はn+1枚のスライドの並列処理が可能である。 The ratio of the time required for this generalization to react with scan n: For 1 is capable of parallel processing of n + 1 slides.

図9(a)では4枚のスライドガラス704,705,706,707を同時並列処理する場合を示す。 In FIG. 9 (a) shows a case of simultaneously parallel processing of four glass slides 704,705,706,707. この場合、スライドガラス4枚を同時に搭載可能なXYステージが必要となる。 In this case, at the same time capable of mounting XY stage 4 glass slides are required. スライドガラス707で伸長反応が進行している間にスライドガラス704,705,706のスキャンを完了し、次にスライドガラス706の伸長反応に移行する。 Complete scanning of the slide glass 704, 705, 706 while the extension reaction on glass slides 707 is in progress, then the process proceeds to the extension reaction of the slide glass 706. この伸長反応の間にスライドガラス704,705,707のスキャンを行う。 Performing a scan of the slide glass 704,705,707 during the extension reaction. 以上の手続きを繰り返すことで複数のスライドガラスの並列処理が可能となり、スループットをこの場合においては4倍向上させることが可能となる。 Enables parallel processing of a plurality of glass slides by repeating the above procedure, it is possible to improve four times in this case the throughput.

図10でも同様の処理を10枚のスライドガラスについて行っている。 Also in FIG. 10 are performed the same processing on the 10 glass slides. 10枚のスライドガラスを同時並列処理する場合を示す。 It shows a case of simultaneously parallel processing of 10 glass slides. この場合、10枚のスライドガラスを同時に搭載可能なXYステージが必要となる。 In this case, it is necessary to simultaneously loadable XY stage 10 glass slides. スライドガラス804で伸長反応が進行している間にそれ以外のスライドガラスのスキャンを完了し、次にスライドガラス805の伸長反応に移行する。 Complete scanning of the other of the slide glass while the extension reaction on glass slides 804 is in progress, then the process proceeds to the extension reaction of the slide glass 805. この間にスライドガラス805以外のスキャンを行う。 To scan other than the slide glass 805 during this time. 以上の手続きを繰り返すことで10枚のスライドガラスの並列処理が可能となり、スループットを向上させることが可能となる。 Enables parallel processing of 10 glass slides by repeating the above procedure, it is possible to improve the throughput.

図11ではスライドガラスを環状ステージに設置し、複数のスライドガラスを同時並列処理する実施例を説明する。 In Figure 11 the slide glass was placed in an annular stage, an embodiment of a simultaneous and parallel processing of multiple slides. 環状のステージには8枚のフローセルが設置されている。 Eight of the flow cell is installed in the annular stage. フローセル内にはスライドガラスが保持されている。 Slide glass is held in the flow cell. フローセル911にはピペッタ907,908を介して反応液がフローセル内に送液される。 The flow cell 911 reaction solution is fed into the flow cell via the pipettor 907 and 908. 環状ステージは反応時間/(8−1)≒13分毎に隣接するフローセルの位置まで回転する。 Annular stage is rotated to the position of the flow cell adjacent to the reaction time / (8-1) ≒ every 13 minutes. ピペッタ912,913はスキャン直前に反応溶液を洗浄溶液で洗浄する。 Pipettor 912 and 913 to wash the reaction solution with a washing solution to the scan immediately before. フローセル910のスキャン時には環状ステージはXY方向へ駆動し、フローセル910内のスライドガラス上に固定されたビーズから発せられる蛍光信号をスライド表面全体について取得することが可能である。 During scanning of the flow cell 910 annular stage drives the XY directions, it is possible to a fluorescent signal emitted from the beads fixed on a slide glass in the flow cell 910 to obtain the entire slide surface. プライマの解離反応などのために必要な温調装置906を設置する。 Installing the temperature control device 906 necessary for such dissociation reaction of the primer. 環状ステージであるため8つのスライドガラス804について8つの温調装置を設置しなくてもよい。 The eight glass slides 804 may not set up eight temperature control device for a circular stage. それはスライドガラス804は円運動を行うため、いずれのスライドガラス804も温調装置906を順次通過していくからである。 It order to carry out the slide glass 804 is circular, because either of the slide glass 804 sequentially passes through the temperature control device 906. ピペッタの設置個数についても同様の効果がある。 There is a similar effect for the installed number of the pipettor. 従って環状ステージを採用することにより、ピペッタ907,908,912,913の能動的駆動を省略し、かつ温調装置906の個数を1個にできるという効果をもたらす。 Therefore by adopting an annular stage, omitting the active drive of the pipetter 907,908,912,913, and brings about an effect of the number of the temperature control apparatus 906 to one. また、環状ステージは常時同じ速度で回転することも可能である。 The annular stage it is also possible to rotate at the same speed at all times. ステップ動作をしないで常時定常速度で回転しているため、装置としての安定性が向上する。 Since rotating at all times a steady rate without the step operation, thereby improving the stability of the device.

次に第5の実施例として、全反射照明による蛍光増強方法について図12を用いて以下に説明する。 Next, as a fifth embodiment, the fluorescence enhancement method according to the total reflection illumination will be described below with reference to FIG. 12. 図12(a)に示すように通常の落射蛍光法では対物レンズを介してサンプル面に垂直に励起光が入射する。 Figure vertically excitation light to the sample surface through the objective lens is incident at 12 conventional epifluorescence method as shown in (a). 一方全反射照明ではスライドガラスと溶液の界面に励起光を臨界角よりも大きい角度で入射させることで、スライドガラスよ溶液の界面にエバネッセント場が形成され、試料側の厚さ数百ナノメートルの領域が照明される。 The slide glass and the solution whereas the total reflection illuminated interface excitation light that is incident at an angle greater than the critical angle, the evanescent field is formed at the interface of the slide glass by the solution, the sample-side thickness of several hundred nanometers region is illuminated. 従って、この厚みの範囲でのみ励起光が当たった試料からの蛍光が発生する。 Therefore, fluorescence is generated from the sample excitation light hits only the scope of this thickness. 図12(b)に示すように入射角を臨界角に近づけるにつれて、境界面の光強度が入射光強度に対して増加することが知られている。 As close to the critical angle of incidence angle as shown in FIG. 12 (b), the light intensity of the boundary surfaces are known to increase the incident light intensity. 臨界角ではその増強倍率は4倍である。 At the critical angle thereof enhancement ratio is four times. シーケンス反応後の蛍光検出においても従来の落射照明法の代わりに全反射照明を用いることで境界面近傍から発せられる蛍光量を増大させることが可能となる。 It becomes possible to increase the amount of fluorescence emitted from the interface vicinity by using the total internal reflection illumination in place of the conventional incident-light illumination method in fluorescence detection after sequencing reaction. 現状では直径1umのビーズを用いているが、高スループット化の要求に伴ってビーズの高密度化が要求され、ひいてはビーズの微小化が必要となる。 Although at present is using beads having a diameter of 1um, density of the beads is required in accordance with the requirements of high throughput and thus miniaturization of the beads is required. 特に全反射照明においては100nm以下の領域において増強効果が得られるため、100nm程度のビーズを用いることも有効である。 Especially because the enhancing effect is obtained in the following areas 100nm in total internal reflection, it is effective to use a 100nm approximately beads. この場合、落射照明と比較して4倍の蛍光増強効果が得られる。 In this case, 4-fold fluorescence enhancement effect compared with epi-illumination can be obtained. また、落射照明において2umのビーズを用いることも有効である。 Further, it is effective to use a bead of 2um in epi-illumination. 現在は1umのビーズを用いて蛍光信号を取得しているが、装置関数にマッチしたビーズの径は2umである。 Although currently acquires a fluorescence signal using the beads of 1um, the diameter of the bead matches the device function is 2um. より具体的には1umのビーズを分解するためにCCDカメラの3ピクセルを使用した場合、周辺に像が滲む影響を考慮すると現実には1umのビーズにも5ピクセルを用いていることとなる。 More specifically when using 3 pixels of the CCD camera in order to decompose the beads 1um, the fact that by using a 5 pixel to beads 1um in consideration of the reality of the image is bleeding effect on peripheral. 2umのビーズを用いた場合にはすでに十分ビーズは大きいため、1umビーズのような滲みは発生しない。 For already enough beads large in the case of using the beads of 2um, bleeding such as 1um bead does not occur. 従って1umのビーズも2umのビーズも結局解像するために5−6ピクセル程度を要している。 Thus it takes about 5-6 pixels to beads also beads also eventually resolution of 2um of 1um. 従って像の大きさという観点からは1umと2umビーズの差は殆どない。 Thus there is little difference between 1um and 2um beads from the viewpoint of the size of the image. 一方1umビーズと2umビーズの表面積の大きさは4倍であるため、DNA断片が結合する量も4倍となり、取得可能な蛍光量の増大が見込める。 On the other hand, since the size of the surface area of ​​1um beads and 2um beads is four times the amount of DNA fragments is bound becomes four times, it can be expected increase in acquisition fluorescent amount. また、図13に示すように、DNA断片が多数結合した直径500umのビーズ108をスライドガラス112に固定する。 Further, as shown in FIG. 13, to secure the bead 108 having a diameter of 500um, which DNA fragment is bound number to the slide glass 112. このビーズ108の内部は微小な空隙が多数存在しているため、遠心処理によりビーズ108に対して加圧すると扁平につぶれてしまい、円盤状のスポット113を形成する。 Therefore the interior of the bead 108 are present many minute gap, it would be collapsed flat when pressed against the bead 108 by centrifugation, to form a disk-shaped spot 113. 円盤状のスポットの直径は1um、高さは0.1umとなる。 The diameter of the disk-shaped spot 1um, the height becomes 0.1um. この状態で全反射照明を行うと、ビーズ108から発せられる蛍光をエバネッセント場に含むことが可能となり、落射照明法と比較して4倍に近い蛍光増強が確認される。 Doing total internal reflection in this state, it is possible to include a fluorescence emitted from the beads 108 in the evanescent field fluorescence enhancement is observed near 4 fold compared to the epi-illumination method.

第6の実施例として、ビーズが予め配列されたスライドガラスがパッケージングされている場合について図14を用いて以下に説明する。 As a sixth embodiment, the slide glass beads are pre-arranged will be described below with reference to FIG. 14 for when packaged. 実施例1で説明したように、従来は外部で調整したビーズを計測直前にスライドガラスへ流し込むことにより固定していた。 As described in Example 1, it has been conventionally fixed by pouring the slide glass beads prepared in externally measured immediately before. しかし、計測者にとってより望ましいのは予めビーズ1111がスライドガラス1112表面に固定されている状態である。 However, more desirable for measurer is a state in which the advance bead 1111 is fixed to the slide glass 1112 surface. これにより計測者に必要な作業は調整したサンプルをフローセル内に注入することのみとなり、外部でビーズを用いて化学処理などを行う手間を省略できる。 Thus work required measurer is only the injecting samples were adjusted to the flow cell, it can be omitted time and labor for performing chemical treatment using the bead externally. また、ビーズを流路に流さないため、流路の詰まりを回避することが可能となる。 Since no shed beads in the flow path, it is possible to avoid clogging of the flow path. 将来は更なるビーズの高密度化が進むことが予想されるため、ビーズ1111を格子状に配置したスライドガラス1112をパッケージングすることが望ましい。 Since the future it is expected that the density of the further bead proceeds, it is desirable to package the slides 1112 of arranging the bead 1111 in a lattice pattern. 本実施例についてはビーズ1111がスライドガラス1112表面に格子状に配置されている以外は実施例1と同じである。 For this example, except that the beads 1111 are arranged in a grid on a glass slide 1112 surface it was the same as in Example 1.

本発明の課題は、次のように表現できる。 An object of the present invention can be expressed as follows. 次世代シーケンシング技術スループット向上において1塩基伸長反応に代表される生化学反応が律速となっている。 Biochemical reaction represented by 1 base extension reaction in the next-generation sequencing technologies throughput improvement has become a rate-limiting. ポリメラーゼと用いる伸長反応及びリガーゼを用いるライゲーション反応のいずれも最小ユニットの反応が完了するまでに90分程度のインキュベーションを要する。 Any of the ligation reaction using an extension reaction and a ligase using the polymerase requires incubation of about 90 minutes to until the reaction is complete a minimum unit. このインキュベーション時間をデッドタイムとしないために、AB社やHelicos社はは2つのフローセルを装着して、1つのフローセルの反応時間中にもう1つのフローセルを用いて蛍光画像の取得を行うシステムを採用している。 The incubation time for no dead time, AB Company and Helicos Inc. is wearing the two flow cells, employs a system for the acquisition of fluorescence images with another flow cell during the reaction time of one flow cell are doing. しかしながら、上述の方式でも依然最小ユニットの反応に要する時間が律速なるために、スループットの更なる向上が困難であった。 However, in order to be rate-limiting the time required for the still reacting minimum unit in the manner described above, a further improvement in throughput is difficult.

また、この課題を解決するための手段は次のように表現できる。 Further, it means for solving the problem can be expressed as follows. 本発明では低価格な高輝度LED光源を使用して、蛍光励起強度の10倍以上のパワー密度を達成する。 The present invention uses an inexpensive high-brightness LED light source, to achieve a power density of 10 times or more fluorescent excitation intensity. これにより検出における励起光照射時間を1/10以下とすることで検出に要する時間を短縮する。 Thereby shortening the time required for detection by the excitation light irradiation time 1/10 in detection. これにより従来律速となっていた最小ユニットの反応時間内に3枚以上の複数の反応基板を並列に処理することにより、スループットの向上を図ることが可能となる。 By thus processed in parallel a plurality of reaction substrates three or more in the reaction time of the minimum unit which has a conventional rate-determining, it is possible to improve the throughput. また、LEDを用いることでシャッタを用いることなく、電流制御により励起光の照射を制御できる。 Further, without using the shutter with the use of LED, it can be controlled irradiation of the excitation light by the current control. 従って、シャッタレスのシステムの構築が可能となり、低コスト化が図れる。 Therefore, it is possible to construct the shutter-less system, cost can be reduced. また、スライドガラスをパッケージングすることにより、スライドガラスのハンドリングを容易なものとする。 Furthermore, by packaging the slides, the handling of the slide glasses and easy. 更にパッケージングしたスライドガラス中に蛍光色素の発光の基点となるビーズを予め配置することにより、更にユーザの負担を軽減することが可能となる。 Further by previously placing the beads as a base point of emission of the fluorescent dye in a slide glass packaging, it is possible to further reduce the burden on the user.

また、本発明の効果は次のように表現できる。 The effects of the present invention can be expressed as follows. 本発明の蛍光測定装置は低価格なLED光源を使用して、検出に要する時間を短縮する。 The fluorescence measurement device of the present invention using low cost LED light source, to shorten the time required for detection. これにより最小ユニットの反応時間内のスキャン枚数を3枚以上に並列化する。 Thereby parallel to three or more scan number of the reaction time of the minimum unit. 本発明の効果として低コストかつハイスループットなDNAシーケンサのシステムを実現する。 To achieve low cost and high throughput DNA sequencer system as an effect of the present invention. また、LEDの採用によるシャッタレスのシステムを構築し、装置の低コスト化を実現する。 Further, to build a system of shutter-less by adopting LED, to realize the cost reduction of the apparatus. 更にスライドガラスのパッケージ化を図ることにより、ユーザの操作性を向上させる効果をもたらす。 Further, by achieving packaging of the slide glass, resulting in an effect of improving the operability of the user.

101,102,211,212 セプタ103 カバー104 スペーサ107,112,125,524,704,705,706,707,804,805,904,910, スライドガラス108,111 ビーズ109 プローブオリゴ113 円盤状のスポット121,401,402,410,411,412,413 LED 101,102,211,212 septa 103 cover 104 spacer 107,112,125,524,704,705,706,707,804,805,904,910, slides 108 and 111 beads 109 probe oligonucleotides 113 discoid spot 121,401,402,410,411,412,413 LED
122,418,419,420,421 非球面レンズ123,521 バンドパスフィルタ124,509,703,803,903 対物レンズ126 蛍光色素127,403,404,414,415,416,417 ヒートシンク128 ファン129 サーミスタ130 フォトダイオード206 DNA断片213 フローセル214 FAM−dCTP 122,418,419,420,421 aspheric lenses 123,521 bandpass filter 124,509,703,803,903 objective lens 126 fluorescent dye 127,403,404,414,415,416,417 heatsink 128 fan 129 Thermistor 130 photodiode 206 DNA fragment 213 flow cell 214 FAM-dCTP
215 Cy3−dATP 215 Cy3-dATP
216 Texas Red−dCTP 216 Texas Red-dCTP
217 Cy5−dCTP 217 Cy5-dCTP
218 計測領域408,423,424,425,522 ダイクロイックミラー409,426 ミラー501 LED光源502,701,801,901 回転ターレット504,505,506,507 キューブ508,702,802,902 対物レンズオートフォーカス用モータ516 CCDカメラ517 集光レンズ518 駆動回路519 電源520 PC 218 measurement area 408,423,424,425,522 dichroic mirror 409,426 mirrors 501 LED light sources 502,701,801,901 rotary turret 504,505,506,507 cube 508,702,802,902 objective lens autofocus motor 516 CCD camera 517 a condenser lens 518 driving circuit 519 power supply 520 PC
523 エミッションフィルタ525,526,907,908,912,913 送液用チューブ905 環状ステージ906 温調装置 523 emission filter 525,526,907,908,912,913 Okuekiyo tube 905 annular stage 906 temperature controller

Claims (22)

  1. 水溶液を注入する穴を少なくとも2個以上保持する基板と、注入される水溶液中に含まれる微粒子と強く結合する表面処理を施されている光透過性を持つ基板と、2つの基板の間隔を一定に保つためのスペーサと、前記スペーサを2つの基板で挟んで張り合わせることにより形成されることを特徴とする反応容器。 Constant and substrate holding the hole injecting an aqueous solution of at least two or more, a substrate having optical transparency are subjected to a surface treatment strongly bonded to fine particles contained in the aqueous solution to be injected, the distance between the two substrates spacer and a reaction vessel, characterized in that it is formed by laminating sandwiching the spacer with two substrates to keep.
  2. 請求項1記載の反応容器において、前記微粒子の表面に増幅された複数の核酸断片が結合していること特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 1, wherein the reaction vessel in which a plurality of nucleic acid fragments amplified on the surface of the fine particles are characterized in that attached.
  3. 請求項2記載の反応容器において、前記核酸断片の配列解析を前記基板上に結合した微粒子からの4色以上の蛍光信号に基づいて前記核酸断片の配列解析すること特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 2, wherein the reaction vessel to sequence analysis of the nucleic acid fragments on the basis of four or more colors of the fluorescent signal of the sequence analysis from the microparticles bound on the substrate of the nucleic acid fragments.
  4. 請求項3記載の反応容器において、前記スペーサの厚みが350±50umであることを特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 3, the reaction vessel thickness of the spacer is characterized by a 350 ± 50um.
  5. 請求項4記載の反応容器において、前記光透過性を持つ基板の大きさが25×75mmであることを特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 4, reaction vessel size of the substrate having said light permeability was characterized by a 25 × 75 mm.
  6. 請求項5記載の反応容器において、前記微粒子の直径が1umであることを特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 5, wherein the reaction vessel diameter of the fine particles are characterized by a 1um.
  7. 水溶液を注入する穴を少なくとも2個以上保持する基板と、複数の微粒子を結合させた光透過性を持つ基板と、2つの基板の間隔を一定に保つためのスペーサと、前記スペーサを2つの基板で挟んで張り合わせることにより形成されることを特徴とする反応容器。 A substrate holding the hole injecting an aqueous solution of at least two or more, a substrate having optical transparency bound with multiple fine particles, and a spacer for keeping the distance between the two substrates constant, the spacers of the two substrates reaction vessel being formed by laminating by being sandwiched.
  8. 請求項7記載の反応容器において、前記微粒子がランダムに前記光透過性を持つ基板上に結合していることを特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 7, reaction vessel, wherein the fine particles are bonded to the substrate with the light transmitting randomly.
  9. 請求項7記載の反応容器において、前記微粒子が格子状に前記光透過性を持つ基板上に結合していることを特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 7, wherein the reaction vessel in which the fine particles are characterized in that they are bonded on the substrate with the light transmitting in a grid pattern.
  10. 請求項9記載の反応容器において、前記微粒子の大きさが1umであり、かつ格子間が3umであることを特徴とした反応容器。 In the reaction vessel according to claim 9, wherein the reaction vessel the size of the fine particles is 1um, and interstitial was characterized by a 3um.
  11. 複数の反応容器をn個保持し、前記反応容器1個の最小ユニットの反応が完了する間に前記複数の反応容器n−1個の計測を自動で完了させ、順次反応を自動で進行させていくことで、計測のスループットをn倍に向上させる並列処理装置。 A plurality of reaction vessels and the n holds, the to complete the automatic reaction of the reaction vessel one of the smallest units of the plurality of reaction vessels (n-1) measured between the completion, allowed to proceed sequentially reacting automatically by going, parallel processing apparatus for improving the throughput of measurement in n-times.
  12. 請求項11記載の装置において、前記反応が請求項1或いは7の容器内で進行することを特徴とする基板表面上におけるシーケンス反応であり、かつ前記シーケンスの最小ユニットの反応に要する時間が90分以上であり、かつシーケンス反応に用いる蛍光色素の数が4種以上であることを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 11, wherein a sequence reaction on the substrate surface on which the reaction characterized in that it proceeds in a container according to claim 1 or 7, and the time required for the reaction of the smallest unit of the sequence is 90 minutes sequencer, wherein the above, and the and the number of fluorescent dye used in sequencing reaction is 4 or more.
  13. 請求項12記載の装置において、前記蛍光画像測定に用いる光源が2種類以上のLEDであり、かつ蛍光検出方法が対物レンズを介した落射蛍光検出法であり、前記蛍光色素に最適化されたバンドパスフィルタ,ダイクロイックミラー,エミッションフィルタを装着したキューブを回転ターレットにより回転制御し、かつオートフォーカスを行い、蛍光検出に用いるセンサが2次元CCDカメラであることを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 12, wherein the light source used for the fluorescence image measurement is 2 or more types of LED, and the fluorescence detection method is epifluorescence detection method through the objective lens, optimized band the fluorescent dye sequencer-pass filter, a dichroic mirror, and rotation control by rotating turret cubes equipped with emission filters, and performs autofocus, and wherein the sensor used for fluorescence detection is a two-dimensional CCD camera.
  14. 請求項13記載の装置において、前記LED光源のON−OFFを回路上から制御することにより蛍光励起のための光の遮断を不要とし、シャッタレスであることを特徴とするシーケンサ。 Sequencer The apparatus of claim 13, wherein the unnecessary blocking of light for fluorescence excitation by the ON-OFF of the LED light source is controlled from the circuit, characterized in that it is a shutter-less.
  15. 請求項14記載の装置において、前記LED光源の出力が全て15mW/mm 2以上であることを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 14 wherein the sequencer, wherein the output of the LED light source is all 15 mW / mm 2 or more.
  16. 請求項15記載の装置において、2種類のLED光源の一つがRoyal Blue色、もう一つがWarm-White色のLEDであり、かつダイクロイックミラーで前記2種類のLED光源から発する光を混合し、光路を同一にして照射することを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 15, wherein two types of LED light source one is Royal Blue colored, other is a LED of Warm-White color, and mixing the light emitted from the dichroic the two LED light sources in the mirror, the optical path sequencer characterized by to irradiate the same.
  17. 請求項16記載の装置において、前記LEDから発する光を高い開口角を持つ非球面レンズにより集光し、対物レンズの後焦点面にLEDの像を結像させることにより、前記反応容器の基板表面で光源の照明ムラを除去した均一な照明であるケーラー照明を行うことを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 16, condensed by the aspherical lens having a high aperture angle light emitted from the LED, by focusing LED image of the focal plane of the objective lens, the substrate surface of the reaction vessel in sequencer and performing Koehler illumination is uniform illumination removing the uneven illumination of the light source.
  18. 請求項17記載の装置において、前記反応容器をXYステージにより前記対物レンズの計測視野の大きさだけ逐次移動していくことにより前記反応容器の全表面でスキャンすることを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 17, sequencer, characterized by scanning the entire surface of the reaction vessel by the reaction vessel by the XY stage moves by the amount sequential measurement visual field of the objective lens.
  19. 請求項18記載の装置において、前記反応容器を移動させるXYステージが反応容器を環状回転させるθステージを含み、反応容器の溶液交換および温度調節を順次回転に伴い処理していくことを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 18, wherein the θ stage XY stage which moves the reaction vessel to the reaction vessel cyclic rotation, characterized in that successively in accordance with the rotation handle solution exchange and temperature regulation of the reaction vessel sequencer.
  20. 請求項17記載の装置において、対物レンズの後焦点面の外周付近にLEDを結像させることにより前記反応容器の基板表面で臨界角近傍における全反射照明により蛍光を4倍増強することを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 17, and characterized by fluorescence to 4 times enhanced by total reflection illumination at the critical angle near the substrate surface of the reaction vessel by imaging the LED in the vicinity of the outer periphery of the focal plane of the objective lens sequencer that.
  21. 請求項20記載の装置において、100nmのビーズを用いることによりビーズに結合した蛍光色素を全て蛍光増強場内に配置させることにより蛍光を4倍増強することを特徴とするシーケンサ。 The apparatus of claim 20 wherein the sequencer, characterized in that to enhance the fluorescent 4-fold by placing all fluorescence intensifying hall fluorescent dye attached to the beads by using a 100nm beads.
  22. 請求項5記載の反応容器において、前記微粒子の直径が2umであり、1umの微粒子と比較してDNA断片の結合サイトが4倍に増加したことによる蛍光増強効果を特徴とする反応容器。 In the reaction vessel according to claim 5, wherein the diameter of the fine particles is 2um, reaction vessel, wherein fluorescence enhancement effect by binding sites of DNA fragments as compared to the particles of 1um increased fourfold.
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