JP2010261963A - 特異的結合対のメンバー間の結合相互作用を促進する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的エンティティー上の促進された(enhanced)磁性負荷によって、かかる生物分離を促進し、それにより、そのように単離された標的エンティティーの生物化学的および診断的分析を容易にする。
【選択図】なし
Description
本発明は、特異的結合対相互作用、バイオエンティティー(bioentity)の分離および希薄な物質の生物学的流体からの単離の分野に関する。好ましくは、標的エンティティー上の促進された(enhanced)磁性負荷によって、かかる生物分離を促進し、それにより、そのように単離された標的エンティティーの生物化学的および診断的分析を容易にする方法が提供される。
制御および最適化された様式で生物学的溶液中に存在する特異的結合対メンバー間の衝突を組織的に強制することによって、特異的結合対メンバー間の相互作用を促進するための有効な方法を提供することが本発明の目的である。これは、衝突数が増えるように、1の特異的結合対メンバーの他のメンバーに対する相対的な運動を引き起こすことによって達成される。顕微鏡レベルで、溶液の勢いのある攪拌は、常に特異的結合対のメンバー間に最適数の衝突をもたらすわけではないようである。例えば、細胞表面決定子に特異的なモノクローナル抗体に結合したコロイド状磁性ナノ粒子は、磁気的に標識されるべき標的細胞と混合したとき、2つのエンティティーが互いに相対的に移動する場合に、かかる細胞をより効果的により高い標識密度で標識するであろう。したがって、細胞が懸濁液中にあり、磁性コロイドが細胞中を「引っ張られる」場合、実質的により多数のナノ粒子が連続攪拌、ボルテックスおよび他の混合法と比べて特異的に細胞に結合する。別法では、磁性コロイドが遠心分離に対して安定である場合、細胞を遠心分離によってコロイド中を移動させてもよい。該過程はまた、標的細胞に特異的に結合したコロイド状ナノ粒子の量を有意に増加する。したがって、該原理を混合の代わりに、または混合に加えて用いることができる。
上記の議論から、特異的結合対のメンバー間の結合相互作用を促進するためのいずれかの手段が1または他のかかるメンバーを有する被検体の分離性を改善することが明らかであろう。広く認められている特許出願(名称「磁性ナノ粒子の調節した凝集方法("Methods of Controlled Aggregation of Magnetic Nanoparticles")」、Libertiら)において、凝集原理によって標的エンティティー上での磁性負荷を増加する方法が開示されている。該開示は、正常な集団の約85%由来のヒト血液中において種々のレベルで生じるIgMと考えられる特異的因子の発見に基づいている。該IgM−様因子は、LibertiおよびPinoの米国特許第5,597,531号に記載の方法によって調製された強磁性流体と反応する。強磁性流体凝集因子(FFAF)は、付加的な強磁性流体をすでに細胞に結合している強磁性流体上に密集させる。該付加的な磁性負荷は有意に希薄な細胞単離、特に低決定子密度細胞の単離の効率を上げる。これらの観察は、また、細胞が損傷せず、細胞回収が増えるように、強磁性流体の密集を逆転させる方法の開発を容易にした。好ましい順序は、(1)その多くが潜在的に存在する血中のいずれかの内因性FFAFを除去または無能力にし;(2)細胞を決定子特異的リガンドに結合した強磁性流体と共にインキュベートし;(3)工程2と同時またはその後に、可逆性凝集剤を添加することによって強磁性流体の凝集を引き起こし;(4)試料を磁気勾配に付して標的の単離を引き起こし;(5)少なくとも1つの細胞相溶性脱凝集剤を用いて凝集を逆転させることである。該手順は、全血由来の希薄な低決定子密度細胞の効率のよい、再現可能な単離をもたらす。内因性FFAFを含有しない血液を洗浄することによって、工程1を削除でき、回収が増えるであろうことは明らかである。
強磁性流体の不在下での細胞特異的モノクローナル抗体を用いる細胞標識
上皮細胞接着分子(EpCAM)は、典型的標的抗原であり、本発明の方法にしたがって標的バイオエンティティー上の促進された磁性負荷を明らかにするために利用された。EpCAMは、上皮細胞起源の細胞上で発現するが、造血起源の細胞上では発現しない。EpCAM抗原の密度は単離および/または分析されるべき細胞型に依存する。例えば、前立腺腫瘍細胞系統(PC3細胞)上でのEpCAMの発現は均一であり、発現レベルは比較的低い。図1Aは、EpCAMに特異的なマウスモノクローナル抗体を用いるPC3細胞上でのEpCAMの分布を示すヒストグラムである。次に、EpCAM抗体結合のレベルをフルオレセインイソチオシアネート(FITC)に結合した二次ヤギ抗−マウス抗体(GAM)GAM−FITCを用いて定量した。蛍光強度は、細胞上の抗体量に正比例する。図1のヒストグラムは、細胞上でのEpCAMの分布を示すPC3細胞の蛍光強度を示す。図1Aはまた、PC3細胞がEpCAMに関して細胞の1集団よりなることを示す。抗原の飽和は、図1Bに示すように、4μg/ml濃度のEpCAMモノクローナル抗体で得られる。
相対的磁気移動運動の不在下での抗−EpCAM−強磁性流体を用いる細胞標識
EpCAMに特異的なマウスモノクローナル抗体を磁性ナノ粒子(強磁性流体)と結合させた。PC3細胞を1mlあたり5、10、20、40および60μgの鉄(Fe)の濃度の上皮細胞特異的強磁性流体(抗−EpCAM−FF)と共にインキュベートした。強磁性流体に結合した抗体の全てが標的に特異的に結合できると仮定する場合、およその抗体濃度は、1mlあたり各々、0.4、0.8、1.5、3.1および4.6μgである。実験において、0.75mlの等張緩衝液中における約200,000個のPC3細胞を12x75mmポリスチレン管に加えた。抗−EpCAM−FF(20μl容量)を5、10、20、40および60μg/mlの最終濃度で試料に加えた。穏かなボルテックスによって試料を混合した。15分間のインキュベーション後、試料を500gで5分間遠心分離して、細胞を非標識強磁性流体から除去した。上記および下記に示すように、該工程は細胞上への強磁性流体負荷を促進する。該実施例の目的の場合、該工程によって負荷された加えられた強磁性流体は、全結果に影響しないであろう。上澄液を廃棄した。細胞ペレットを100μlの等張緩衝液中に再懸濁した。次いで、細胞をGAM−FITCで染色して、細胞に結合した抗−EpCAM−FFの量を定量した。15分間インキュベーション後、1mlの等張緩衝液を細胞に加え、試料を遠心分離して過剰のGAM−FITCを除去した。細胞ペレットを500μlの等張緩衝液中に再懸濁し、細胞の蛍光強度をフローサイトメトリー(FACScaliber, Becton-Dickinson,San Jose, CA)によって測定した。観察された蛍光強度は、細胞上の強磁性流体量に正比例した。
磁気分離の前後の細胞特異的または非特異的強磁性流体の標識強度
該実施例および追随するいくつかは、どのように相対的運動原理が見出されたのか、ならびに、その効果の規模およびその結果を明らかにする。該実施例において、低EpCAM決定子密度を有する前立腺腫瘍細胞系統PC3の細胞を使用した。1.5mlの等張緩衝液中における約500,000個のPC3細胞を12x75mmポリスチレン管に加えた。抗−EpCAM−FF(20μl容量)を0、5、10、20、40および60μg/mlの最終濃度で試料に加えた。試料を穏かにボルテックスしながら混合し、四極子磁気分離器中に10分間置いて分離をもたらした。10分後、上澄液を廃棄した。管を磁気分離器からはずした。容器壁に収集された細胞および遊離の強磁性流体を1mlの等張緩衝液中でボルテックスしながら再懸濁した。試料を上記のように遠心分離して細胞を遊離の強磁性流体から除去した。細胞ペレットを飽和量のGAM−FITCを含有する100μlの等張緩衝液中に再懸濁した。15分間インキュベーション後、1mlの等張緩衝液を管に加え、遠心分離して過剰のGAM−FITCを除去した。細胞ペレットを500μlの等張緩衝液中に再懸濁し、細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。
標識密度の増加は異なる抗原を用いて得ることができる
本明細書に記載の現象が腫瘍細胞上に存在する特定の抗原決定基に限らないことを明らかにするために、CD34+KG1a細胞系統およびCD34モノクローナル抗体が結合した強磁性流体を用いる実験を行った。該実験で用いられた実験手順は、上記のPC3細胞および抗−EpCAM−FFについて記載されたものと同様であった。該実験の結果は、図4に示される。データは、磁気分離が標的細胞に結合している磁性粒子の量に増加をもたらしたことを明らかにする。平均蛍光強度(MFI)は、非標識細胞(バックグラウンド蛍光)で2.1、磁気分離前の強磁性流体標識化細胞で16.7、磁気選択後に得られた細胞で125.1および磁気選択後の懸濁液中に残存した細胞で20.2であった。これらの結果は、EpCAM抗原陽性細胞について得られた結果と一致する。
相対的移動によって誘導される標識密度の増加は粒子の大きさに無関係である
上記の実施例は、磁性粒子が標的細胞に対して相対的に移動しているとき、特異的磁性ナノ粒子を用いる細胞の標識における増加を分離過程の間に得ることができることを示す。上記で使用した磁性ナノ粒子は、150−180nmの大きさの範囲の強磁性流体である。該現象がより大きな磁性粒子に適用されるかどうかに取り組むために、ダイナルビーズを用いる実験を行った。ダイナル社(ノルウェー)は、細胞の単離に用いられる2つの異なる大きさ(2.8および4.5μm)の磁性ビーズを製造している。該実施例において、2.8μmの大きさであって、EpCAMに特異的なマウスモノクローナル抗体(Ber-EP4)でコートされた抗−上皮細胞ダイナビーズ(Dynabeads)を使用した。これらのビーズは顕微鏡下で見ることができるので、細胞に結合したビーズの量を定量するために二次染色(例えば、GAM−FITC)は必要とされない。400,000個の前立腺腫瘍細胞(PC3)を含有する等張緩衝液(0.75ml)を12x75mmポリスチレン管に加えた。抗−上皮細胞特異的ダイナビーズ(1x106個のビーズ)を含有するPBS緩衝液(50μl)を試料に加え、ボルテックスによってよく混合し、試料を単極子磁気分離器に接して10分間置いた。2分毎に試料を磁気分離器から離し、混合し、戻した。該実験に用いられた磁気勾配は、ダイナルビーズが試料中をゆっくりと移動するようなものであった。対照として、PC3細胞を含有するもう1つ別の試料をダイナビーズと共に磁場の不在下で混合しながら10分間インキュベートした。10分間処理したこれらの試料の各々から、5μlを顕微鏡スライド上にスポットした。次いで、細胞および遊離のダイナビーズをデジタルカメラを取り付けた顕微鏡を用いて撮影した。
磁気分離の前後の細胞特異的強磁性流体を用いるインキュベーション後の細胞の標識強度
本明細書に記載の原理をさらに確認するため、および細胞標識において観察される増加を得るために溶液中で遊離した強磁性流体が必要か否かを決定するために、下記の実験を行った。実験は、抗−EpCAM−FFおよび抗−CD34−FFを用い、前立腺腫瘍細胞系統PC3を用いて行った。図7Aは、磁気分離の前後の両方で、抗−EpCAM−FFを用いるインキュベーション後に得られるPC3細胞の蛍光強度のヒストグラムを示す。図3に示される実験と対照的に、磁気分離前に遠心分離によって細胞を溶液中で遊離した強磁性流体から除去した。図7Aから明らかなように、標識密度は、磁気分離の間に増加せず、磁気分離の間に遊離の強磁性流体が必要なことを示した。図7Bにおいて、磁気分離の前に2μg/mlの濃度で添加された抗−EpCAM−FFを用いて、実験を繰り返した。この場合、収集細胞の標識は明らかに増加した。しかしながら、抗−CD34−FFを分離前に添加した場合、細胞の標識強度における増加は観察されなかった。さらに、このことは、図3および下記の表Iに示されるように、細胞の標識増加を得るために、溶液中で遊離した強磁性流体が標的細胞に特異的でなければならないことを明らかにする。したがって、磁気勾配は、細胞に対して相対的に強磁性流体を動かすように作用して、特異的結合を促進する。
標識強度および分離効率を上げるための最適化
上記の実験から、細胞標的に対して相対的な特異的磁性粒子の移動は、結合反応を有意に増大させる。該実施例において、観察される増大のための最適条件を提供するために、異なるインキュベーション条件下での特異的抗−EpCAM−FFを用いる腫瘍細胞の標識を評価した。200,000個の前立腺細胞(PC3)を含有する等張緩衝液(1ml)を異なる12x75mmポリスチレン管に加えた。特異的抗−EpCAM−FF(20μl)を各試料に最終濃度5μg/mlまで加え、各試料をボルテックスによって混合した。表IIに示す種々の条件下で試料をインキュベートした。15分インキュベーション後、試料をボルテックスによって混合し、500gで5分間遠心分離して、過剰の強磁性流体から細胞を除去した。上澄液を吸引後、細胞ペレットを100μlの等張緩衝液中に再懸濁した。次いで、細胞をGAM−FITCで染色し、細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。結果を表IIに下記する。
重力によって強磁性流体中を細胞を移動させることによる標的細胞の標識
上記の実験は、磁場の高勾配領域における強磁性流体の移動が標的細胞への強磁性流体の結合を促進すること、すなわち、細胞がより速く、より効果的に標識されることを示す。強磁性流体に対して相対的な標的細胞の移動が同様に、特異的強磁性流体の結合の増加をもたらすことを明らかにするために、遠心分離実験を行った。該実験のために、標的細胞(PC3)を上記の抗−EpCAM−FFと混合し、すぐに、500gで5分間遠心分離した。これらの条件下で、強磁性流体は顕著に再分布しない。強磁性流体を用いる細胞の標識は、上記のようにGAM−FITCでの染色後にチェックした。これらの実験は、遠心力によって強磁性流体中を細胞を移動させることもまた、静止インキュベーションに付された細胞と比べて、2倍の細胞標識の増加をもたらしたことを明らかにした。注目すべきは、標識量を測定するために使用される手段が非結合強磁性流体からの細胞の遠心分離を用いることである。したがって、コントロールは全て、人為的に上昇する。しかしながら、得られたデータは明らかに、特異的結合対メンバー間の結合の増加のための差別的な移動の原理を示す。
細胞上の粒子数の増加は細胞回収を増加する
本明細書で下記する実験の結果は、さらに、本発明の方法を用いて標的バイオエンティティー上の磁性粒子の負荷を増加することが有意にかかるエンティティーの収集効率を向上することを示す。血液(1ml)を遠心分離し、血漿を除去し、等張緩衝液で置き換えて、細胞の標識をもたらすことのできるいずれかの潜在的な成分を取り出した。血液細胞を12x75mmポリスチレン管に加え、次いで、0.5mlの希釈洗浄緩衝液(Immunicon)を加えた。既知数の低EpCAM密度PC3細胞を含有する等張緩衝液(50μl)を血液試料中にスパイクした。20μlの抗−EpCAM−FFを各試料に最終濃度5μg/mlまで加えた。
細胞標識の増加は広範囲な抗原密度を発現する細胞を用いて得ることができる
嚢癌系統T24、前立腺癌細胞系統PC3および胸部癌細胞系統SKBR−3由来の細胞は、種々の密度のEpCAM抗原を細胞表面上に発現する。抗原密度を、細胞をEpCAMに特異的なフルオレセイン化モノクローナル抗体で染色することによって評価した。非染色細胞の蛍光強度と比べた場合、下記の表Vに示すように、T24細胞の平均蛍光強度は2倍高く、PC3細胞は8倍高く、SKBR3細胞は50倍高かった。本発明の基礎を成す原理においてかかる範囲の抗原密度の効果を評価するために、下記の実験を行った。洗浄した血液細胞のアリコート(1ml)を12x75mmポリスチレン管に加え、次いで、0.5mlの希釈−洗浄緩衝液を加えた。各細胞系統について既知数の腫瘍細胞を含有する細胞緩衝液(50μl)を各試料中にスパイクした。抗−EpCAM−FF(20μl)を各試料に最終濃度5μg/mlまで加えた。試料をよく混合し、適当な対を混合せずに室温で15分間インキュベートするか、または磁気分離器中に15分間置いた。上記のように、全試料をよくボルテックスし、磁気分離器中に10分間置いて分離をもたらした。
Claims (7)
- 特異的結合対のメンバーの両方が移動できるキャリヤー媒体中における特異的結合対のメンバー間の結合相互作用を促進する方法であって、該キャリヤー媒体中を、特異的結合対の1のメンバーを特異的結合対の他のメンバーに対して相対的に移動させることを特徴とし、ここに、1の特異的結合対メンバーを粒状磁性材料の表面上に結合し、他の特異的結合メンバーを標的被検体と結合し、該粒状磁性材料の表面上に結合した1の特異的結合対メンバーを磁場勾配の影響下で媒体中を移動させる方法。
- 該粒状磁性材料の表面上に結合した1の特異的結合対メンバーを最初に1の方向に移動させ、次いで異なる方向に移動させる請求項1記載の方法。
- 特異的結合対メンバーがビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、ミメトープ(mimetope)−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、レクチン−炭水化物、プロテインA−抗体Fcおよびアビジン−ビオチンよりなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 標的被検体がホルモン、タンパク質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、薬剤、化学物質、核酸分子、細胞、ウイルスおよび細菌よりなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 磁性材料が50nm〜50μmの範囲の粒子の大きさを有する請求項1記載の方法。
- 磁性材料が90〜400nmの範囲の粒子の大きさを有する請求項5記載の方法。
- 該粒状磁性材料の表面上に結合した1の特異的結合対メンバーを、前記メンバーの両方を混合した直後に移動させる請求項1記載の方法。
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