JP2010249520A - 液体試料解析用容器及び液体試料の解析方法。 - Google Patents

Abstract

【課題】種々の液量の液体試料を移液することなく、複数種類の解析を高精度に行うことができる、汎用性の高い解析用容器、及び該容器を使用する液体試料の解析方法の提供。
【解決手段】液体試料を収容するためのウェル１１２が表面１１１に形成された基板１１と、ウェルの開口部１１２ｃを封止する蓋１０とを備え、蓋１０には、ウェル１１２内に嵌合する凸部１０２が設けられ、凸部１０２は、嵌合時にウェル１１２内でその容積の５０体積％以上の空間を占め、蓋１０の凸部１０２が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上である液体試料解析用容器１を使用して、液体試料を解析する。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体試料解析用容器、及び該容器を使用する液体試料の解析方法に関する。

ヒトゲノムの解読は、１９８０年代後半にその計画の議論が始まり、１９９０年頃から国際協力の下に進められてきた。そして２００３年には、最初のゴールである全ゲノムの構造決定がほぼ終わり、本格的なゲノム研究時代に突入した。ゲノム研究時代を迎え、タンパク質や糖の構造・機能解析や、疾患と関連したＳＮＰｓ解析等の研究が促進されている。そして近年は、微量な検体（液体試料）を使用して、核酸の抽出、増幅及び検出、あるいはタンパク質の検出等を小容量の容器中で行なう、所謂μ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ技術について、盛んに研究されている。

一方、近年は、ゲノム、タンパク質、糖鎖等について、それぞれの構造及び機能を別々に解析することの限界が議論されており、システムバイオロジーの必要性が強調されている。そのような中で、個々の細胞の機能や形状の違いを、個々の細胞における遺伝子やタンパク質の発現に関する時間的空間挙動の解析等に基づいて、一細胞レベルで包括的にとらえようとする試みがなされている。
上記技術分野では、これまでに様々な解析技術が提供されてきている。具体的には、細胞内の画像解析を３次元的に行なう共焦点光学顕微鏡を使用する解析方法、一個の細胞から数個程度の細胞等、微量な細胞で遺伝子解析を行なうポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）デバイスを使用した解析方法、微量溶液中の核酸やタンパク質等の生体分子間の相互作用解析を可能とする蛍光相関分光法を使用した解析方法等が例示できる。
しかし、これらの解析技術に使用する解析用容器は、それぞれ目的に応じて形状に制約があるだけでなく、必要とされる光学特性、耐熱性等に応じて材質にも制約があり、共通の容器を使用して複数種類の解析を連続的に行なうことが困難であった。さらに、その結果として、複数種類の高度な機能を複合化した解析技術や装置の開発が進展しないという問題点があった。

小容量の容器として従来は、ガラス製や樹脂製等の基板表面に、各種反応を行うこともできる、ウェルと呼ばれる微小な凹部を形成したものが知られている。
例えば、特許文献１には、検体を反応させるための複数のウェルが基板表面に形成され、該ウェルの開口部に、保護フィルムがヒートシールにより貼り合わされた容器が開示されている。しかし、この容器は、極微量の液体試料への適用には不向きであり、ウェル内に極微量の液体試料を収容し、基板を加熱して反応を行うと、液体試料中の水分がウェル内で蒸発することがある。この場合、液体試料中の成分の組成比が変化してしまうため、正確な反応結果が得られなかったり、ウェル内で液体試料中の水分が全て蒸発してしまうことで、反応が起こらないという問題点があった。

そこで、特許文献２では、ウェル内の水分の蒸発を防止するために、ミネラルオイル等で液体試料を被覆し、さらにウェルの開口部を保護フィルムで封止する方法が開示されている。しかし、この方法は、ミネラルオイルの使用により種々の制約が加わってしまう。例えば、ウェル内の液体試料を加熱するためには、ウェルが形成されていない裏面から基板を加熱することになるが、この場合液体試料はウェルの上方から検出する必要があり、ウェル毎のミネラルオイル量のばらつきにより、検出結果もばらついてしまうという問題点があった。また、液体試料中の蛍光を検出する際には、ミネラルオイルが励起光や蛍光を減衰させ、検出感度を低下させることがあるという問題点があった。また、ミネラルオイルのウェル内への添加が必要になり、作業が煩雑になるという問題点があった。さらに、基板の材質として、ミネラルオイルに耐性のあるものを選ぶ必要があり、材質が制限されるという問題点があった。

これに対して、特許文献３では、表面にウェルが形成された基板と、前記ウェルに嵌合し、その空間の一部を占める凸部が形成された蓋とを備える容器が開示されている。この容器を使用すれば、ウェル内に極微量の液体試料を収容し、基板を加熱する場合、ミネラルオイルを使用しなくても、液体試料中の水分の蒸発を防止できる。

特開２００７−１８９９６０号公報 特開２００７−２６３８１２号公報 特開２００７−１４３４０６号公報

しかし、特許文献３で開示されている容器は、凸部も含めて蓋の形状が複雑であるため、ウェル上方からの液体試料の光学的な検出には不向きな構造であり、正確に解析できないという問題点があった。
このように従来は、種々の液量の液体試料に適用でき、液体試料を移液することなく、複数種類の解析を高精度に行うことができる容器や解析方法が無いのが現状であった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、種々の液量の液体試料を移液することなく、複数種類の解析を高精度に行うことができる、汎用性の高い解析用容器、及び該容器を使用する液体試料の解析方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、液体試料を収容するためのウェルが表面に形成された基板と、前記ウェルの開口部を封止する蓋とを備えた液体試料解析用容器であって、前記蓋には、前記ウェル内に嵌合する凸部が設けられ、該凸部は、嵌合時に前記ウェル内でその容積の５０体積％以上の空間を占め、前記蓋の凸部が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることを特徴とする液体試料解析用容器である。
請求項２に記載の発明は、前記凸部の先端面、及び前記凸部が設けられている部位の蓋の表面の少なくとも一方が平面であることを特徴とする請求項１に記載の液体試料解析用容器である。
請求項３に記載の発明は、前記蓋において、前記凸部がその他の部位と一体成形されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の液体試料解析用容器である。
請求項４に記載の発明は、前記蓋が、シリコーン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリオレフィン樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、シクロオレフィン系樹脂、メチルペンテン系樹脂又はフッ素系樹脂からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体試料解析用容器である。
請求項５に記載の発明は、前記ウェルの底面、及び前記ウェルが設けられている部位の基板の裏面の少なくとも一方が平面であり、前記底面と裏面との間の厚さが０．１２〜１ｍｍであり、該厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体試料解析用容器である。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体試料解析用容器を使用することを特徴とする液体試料の解析方法である。
請求項７に記載の発明は、前記ウェル内に収容する液体試料の体積Ｖｓを、前記ウェルの容積Ｖｗ、及び嵌合時に前記凸部が前記ウェル内で占める体積Ｖｃに対して、下記式（１）で表される関係を満たすようにすることを特徴とする請求項６に記載の液体試料の解析方法である。
Ｖｗ−５Ｖｓ≦Ｖｃ≦Ｖｗ−２Ｖｓ・・・・（１）
（ただし、Ｖｓ、Ｖｗ及びＶｃは、すべて同じ単位とする。）

本発明によれば、種々の液量の液体試料を移液することなく、複数種類の解析を高精度に行うことができる。

本発明の容器を例示する概略図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における断面図である。 本発明の他の容器を例示する概略断面図である。 実施例１で作成した増幅核酸の検量線を示すグラフである。 実施例２で使用した液体試料の解析装置を示す概略構成図である。 実施例２のリアルタイムＰＣＲで得られた核酸増幅曲線を示すグラフである。

＜液体試料解析用容器＞
本発明の液体試料解析用容器（以下、容器と略記することがある）は、液体試料を収容するためのウェルが表面に形成された基板と、前記ウェルの開口部を封止する蓋とを備えた液体試料解析用容器であって、前記蓋には、前記ウェル内に嵌合する凸部が設けられ、該凸部は、嵌合時に前記ウェル内でその容積の５０体積％以上の空間を占め、前記蓋の凸部が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることを特徴とする。
以下、図面を参照しながら、本発明について詳しく説明する。

図１は、本発明の容器を例示する概略図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ線における断面図である。
ここに示す容器１は、基板１１及び蓋１０を備える。基板１１の表面１１１には、液体試料を収容するためのウェル１１２が、基板１１の裏面１１３側に複数凸設され、形成されている。また、蓋１０には、ウェル１１２内に嵌合する凸部１０２が設けられており、ウェル１１２の開口部１１２ｃを封止する。

ウェル１１２は略円錐台状であり、ただし、底面１１２ｂは外側へ向けて凸状の曲面となっている。
ウェル１１２は、側面１１２ａにおける厚さＴ_１１２ａ及び底面１１２ｂにおける厚さＴ_１１２ｂは同一でも異なっていても良く、０．２〜０．８ｍｍであることが好ましく、０．４〜０．６ｍｍであることがより好ましい。厚さＴ_１１２ａ及びＴ_１１２ｂを下限値以上とすることにより、ウェル１１２の強度を一層高めることができる。また、上限値以下とすることで、液体試料をウェル１１２の側面１１２ａ側又は基板１１の裏面１１３側（ウェル１１２の底面１１２ｂ側）から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。

基板１１のウェル１１２が形成されていない平端部の厚さＴ_１１は、特に限定されないが、０．５〜１．５ｍｍであることが好ましい。このようにすることで、基板１１の取り扱い製が良好となる。
ウェル１１２の容積Ｖｗは、目的に応じて適宜設定すれば良いが、通常は、５ｍｌ以下であることが好ましく、３ｍｌ以下であることがより好ましい。容積Ｖｗの下限値は、ウェル１１２が形成できる限り特に限定されない。このように、微量な液体試料の解析用とすることで、本発明の効果が一層優れたものとなる。
ウェル１１２の深さＤ_１１２は、容積Ｖｗ応じて任意に設定でき、特に限定されない。

ウェル１１２の側面１１２ａにおける厚さ方向の、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_１１２ａ、及び底面１１２ｂにおける厚さ方向の、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_１１２ｂは、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが特に好ましく、８５％以上であることが最も好ましい。光の透過率を下限値以上とすることで、液体試料をウェル１１２の側面１１２ａ側又は基板１１の裏面１１３側から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。光の透過率τ_１１２ａ及びτ_１１２ｂは、基板１１（ウェル１１２）の材質と、当該部位の厚さを適宜選択することで調整できる。

蓋１０は、表面１０１が平面であり、表面１０１の反対側に凸部１０２が設けられている。
凸部１０２は略円錐台状であり、ウェル１１２内への嵌合時に、側面１０２ａがウェル１１２の側面１１２ａに密着する一方、先端面１０２ｂはウェル１１２の底面１１２ｂには接触しないようになっている。これにより、蓋１０装着時に、ウェル１１２内に液体試料を収容するための空間が確保されると共に、ウェル１１２内の液体試料の蒸発が防止される。

凸部１０２の先端面１０２ｂは平面である。本発明においては、先端面１０２ｂ、及び凸部１０２が設けられている部位の蓋１０の表面１０１の少なくとも一方が平面であることが好ましく、少なくとも先端面１０２ｂが平面であることがより好ましく、図１に示すように、先端面１０２ｂ、及び凸部１０２が設けられている部位の蓋１０の表面１０１の両方が共に平面であることが特に好ましい。このようにすることで、液体試料をウェル１１２の上方側（蓋１０の表面１０１側）から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。

凸部１０２は、ウェル１１２内への嵌合時に、ウェル１１２の容積Ｖｗの５０体積％以上の空間を占める。そして、ウェル１１２内の液体試料の量にもよるが、凸部１０２は、ウェル１１２の容積の５０〜９９．９体積％の空間を占めることが好ましく、６０〜９９．９体積％の空間を占めることがより好ましく、６５〜９９．９体積％の空間を占めることが特に好ましい。下限値以上とすることで、ウェル１１２内に収容された液体試料の蒸発を防止する一層高い効果が得られる。

凸部１０２の高さＨ_１０２は、ウェル１１２の深さＤ_１１２に応じて適宜設定すれば良い。Ｈ_１０２を適切に設定することにより、ウェル１１２内に収容された液体試料の蒸発を防止する高い効果が得られると共に、液体試料をウェル１１２の上方側から光学的に検出する際に、高精度に検出できる。

蓋１０の凸部１０２が設けられていない平坦部の厚さＴ_１０、及び蓋１０の凸部１０２が設けられている部位の凸部１０２を除いた部分の厚さＴ_１０’は、同一でも異なっていても良い。ただし、ここに示すように同一であることが好ましく、０．５〜１．５ｍｍであることが好ましく、０．８〜１．２ｍｍであることがより好ましい。Ｔ_１０及びＴ_１０’を下限値以上とすることで、蓋１０の強度を一層高めることができる。一方、Ｔ_１０を上限値以下とすることで、蓋１０の取り扱い性が一層良好となる。さらに、Ｔ_１０’を上限値以下とすることで、液体試料をウェル１１２の上方側から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。

蓋１０の凸部１０２が設けられた部位の厚さ方向（蓋１０の表面１０１と、凸部１０２の先端面１０２ｂとを結ぶ最短の線分方向、すなわち図１中の矢印Ａの方向）における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_１０は６０％以上であり、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることが特に好ましい。光の透過率τ_１０を下限値以上とすることで、液体試料をウェル１１２の上方側から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。光の透過率τ_１０は、蓋１０の材質と、当該部位の厚さを適宜選択することで調整できる。

基板１１の大きさ、すなわちＸ軸方向の長さＬ_Ｘ及びＹ軸方向の長さＬ_Ｙは、特に限定されない。従来のマイクロタイタープレートで採用されているＳＢＳ規格（ＡＮＳＩ／ＳＢＳ １）や、スライドガラスで採用されているＪＩＳ規格（ＪＩＳ Ｒ ３７０３）等のいずれかの規格に準拠して設定することが好ましい。既存の解析装置は、上記のような規格に準拠した容器の使用を前提として、容器保持部や駆動部が設計されているものが多い。そこで、大きさをこれら規格に準拠して設定することで、容器１を従来の解析装置にそのまま設置して使用できるようになる。

基板１１の材質は特に限定されないが、各種ガラス類又は樹脂類が好ましく、成形の容易さ及び取り扱いの容易さから、各種樹脂類がより好ましい。そして、液体試料をウェル１１２の側面１１２ａ側又は基板１１の裏面１１３側（ウェル１１２の底面１１２ｂ側）から検出する時は、光の透過率が高く、自家蛍光が少なく、屈折率が低い材質が好ましい。

ガラス類の好ましいものとしては、水板ガラス、白板ガラス、ハーフホワイトガラス等が例示できる。
樹脂類の好ましいものとしては、シリコーン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリオレフィン樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、シクロオレフィン系樹脂、メチルペンテン系樹脂又はフッ素系樹脂等が例示できる。例えば、シクロオレフィン系樹脂の市販品としては、ゼオネックス（登録商標、日本ゼオン株式会社製）、ゼオノア（登録商標）、日本ゼオン株式会社製）、メチルペンテン系樹脂の市販品としては、ＴＰＸ（登録商標）、三井化学株式会社製）が好適である。

蓋１０の材質も基板１１と同様で良い。そして、液体試料をウェル１１２の上方側（蓋１０の表面１０１側）から検出する時は、光の透過率が高く、自家蛍光が少なく、屈折率が低い材質が好ましい。なかでも、成形の容易さ及び取り扱いの容易さから、各種樹脂類が好ましく、例えば、シリコーン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリオレフィン樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、シクロオレフィン系樹脂、メチルペンテン系樹脂又はフッ素系樹脂等が例示できる。
また、蓋１０において、凸部１０２とその他の部位とは、同じ材質でも良いし、異なる材質でも良い。

基板１１は、例えば、射出成形、圧縮成形等、材質に応じて公知の方法で作製すれば良い。
蓋１０も、基板１１の場合と同様に公知の手法で作製すれば良。さらに、凸部をその他の部位と一体成形しても良いし、凸部とその他の部位（例えば、基板状のもの）とを別々に作製した後、凸部をその他の部位に接合しても良い。凸部とその他の部位とが一体成形された蓋１０は、気密性に優れるので、ウェル１１２内の液体試料の蒸発防止効果が最も高い。また、容易に作製できる。一方、凸部をその他の部位に接合して作製された蓋１０は、凸部１０２の差し替えが可能であり、最も汎用性が高い。接合方法は特に限定されず、例えば、接着剤で接合する方法、ねじ止めする方法、凸部及びその他の部位の一方にねじ孔、他方にねじ山を形成し、これらを螺合する方法等いずれでも良い。

図１では、凸部１０２及びウェル１１２が、略円錐台状のものを示しているが、角錐台状、円柱状、角柱状等、その他の形状でも良い。また、基板１１におけるウェル１１２の配置形態も特に限定されず、ウェル１１２の数、ウェル１１２間の距離、配置位置等は、目的に応じて適宜調整すれば良い。

図２は、本発明の他の容器を例示する概略断面図である。なお、図２において、図１に示すものと同様の構成要素には、図１の場合と同様の符号を付し、その詳細な説明は省略する。
ここに示す容器２は、ウェルが基板の裏面側に凸設されて形成されている代わりに、より肉厚の基板２１の表面２１１に凹設されて形成され、基板２１の裏面２１３が平面であり、ウェル２１２の形状が異なる点以外は、図１に示す容器１と同様である。

ウェル２１２は略円錐台状であり、底面２１２ｂは平面である。本発明においては、ウェル２１２の底面２１２ｂ、及びウェル２１２が設けられている部位の基板２１の裏面２１３の少なくとも一方が平面であることが好ましく、少なくともウェル２１２の底面２１２ｂが平面であることがより好ましく、図２に示すように、底面２１２ｂ、及びウェル２１２が設けられている部位の基板２１の裏面２１３の両方が共に平面であることが特に好ましい。このようにすることで、液体試料を基板２１の裏面２１３側（ウェル２１２の底面２１２ｂ側）から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。

ウェル２１２の底面２１２ｂと、基板２１の裏面２１３との間の厚さＴ_２１２ｂは、０．１２〜１ｍｍであることが好ましく、０．１２〜０．５ｍｍであることがより好ましく、０．１４〜０．２５ｍｍであることが特に好ましい。厚さＴ_２１２ｂを下限値以上とすることにより、基板の強度を高めることができ、上限値以下とすることで、液体試料を基板２１の裏面２１３側から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。

ウェル２１２の容積Ｖｗ、深さＤ_２１２、開口部２１２ｃは、ウェル１１２の場合と同様で良い。

基板２１のウェル２１２が形成されていない平端部の厚さＴ_２１は、ウェル２１２の容積Ｖｗに応じて適宜設定すれば良いが、１〜７ｍｍであることが好ましく、１〜５ｍｍであることがより好ましい。

ウェル２１２の底面２１２ｂにおける厚さ方向（底面２１２ｂと、基板２１の裏面２１３とを結ぶ最短の線分方向、すなわち図２中の線分Ｂの方向）の、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_２１２は６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが特に好ましく、８５％以上であることが最も好ましい。光の透過率τ_２１２を下限値以上とすることで、液体試料を基板２１の裏面２１３側から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。光の透過率τ_２１２は、基板２１の材質と、当該部位の厚さを適宜選択することで調整できる。

本発明の容器は、基板に蓋を装着する時に、蓋に設けられた凸部を、基板に形成されたウェル内に嵌合させ、それぞれの接触面を密着させることで、蒸発防止用のオイルを使用しなくても、ウェル内に収容された液体試料の蒸発を防止できる。この時、凸部は、ウェル内でウェルの容積の５０体積％以上の空間を占めるので、ウェル内の空間の容積は、封止時に開放時よりも小さくなり、液体試料の蒸発を防止する一層高い効果が得られる。さらに、凸部の体積を調節することで、封止時のウェル内の空間の容積を調節できる。例えば、複数の工程を組み合わせて解析する時に、いずれかの工程でウェルの容積に対して液体試料が微量である場合には、当該工程では、本発明における蓋を基板に装着して、蒸発を防止すれば良い。そして、その他の工程は、目的に応じた任意の方法で行えば良い。例えば、同じ蓋を装着して行っても良いし、蓋を外して基板を開放した状態で行っても良い。さらには、凸部の体積が異なる別の蓋を基板に装着して行っても良いし、従来の蓋を装着して行っても良い。
また、本発明の容器は、蓋の凸部が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上であるので、液体試料をウェルの上方側から光学的に検出する際に、一層高精度に検出できる。
このように、本発明の容器によれば、種々の液量の液体試料を移液することなく、複数種類の解析を連続的に高精度に行うことができる。

＜液体試料の解析方法＞
本発明の液体試料の解析方法は、上記本発明の容器を使用することを特徴とする。すなわち、本発明の解析方法では、ウェル内の空間の容積を、封止時に開放時よりも小さくして解析する。

ウェルに収容する液体試料としては、目的に応じて任意のものが選択でき、特に限定されない。例えば、溶液、懸濁液及び分散液のいずれでも良いし、固形物が液体に単に浸漬しただけのものでも良く、溶媒のみでも良い。ただし、容器を劣化させないものが好ましい。なかでも好ましいものとしては、核酸等の生体由来成分、各種生理活性物質、細胞又は微生物等の検出対象物を含む液体が例示でき、溶媒成分としては水が好ましい。

核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド等いずれでも良い。具体的には、核酸増幅反応に供するものや、核酸増幅反応で得られたものが例示でき、より具体的には、増幅反応で得られた増幅核酸、増幅反応時に鋳型となる核酸、増幅核酸の原料となる核酸、プライマー等が例示できる。この場合の液体試料とは、酵素などの増幅反応に必要な各成分を含有する増幅反応開始前の反応液や、増幅反応中の反応液、増幅反応後の反応液のことを指す。
核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）法等、公知の如何なるものでも良い。

本発明において、液体試料の量は、目的に応じて任意に設定でき、特に限定されないが、好ましくは０．１〜１０００μｌ、より好ましくは０．５〜５００μｌ程度の極微量の場合に、特に優れた効果を奏する。

本発明の容器を適用する解析は、液体試料のウェル内への収容を必要とするものであれば特に限定されず、目的に応じて任意に選択できる。例えば、ウェル内で液体試料を処理する工程、ウェル内で各種反応を行う工程、ウェル内の液体試料を検出する工程等を有するものが例示できる。

本発明の解析方法では、ウェル内に収容する液体試料の体積をＶｓ、嵌合時に凸部がウェル内で占める体積をＶｃとした場合に、Ｖｓを、Ｖｗ及びＶｃに対して、下記式（１）で表される関係を満たすようにすることが好ましい。Ｖｃを下限値以上とすることで、ウェル内の液体試料の蒸発を防止する一層高い効果が得られる。また、Ｖｃを上限値以下とすることで、ウェル内の液体試料の凸部への付着を抑制する一層高い効果が得られる。
Ｖｗ−５Ｖｓ≦Ｖｃ≦Ｖｗ−２Ｖｓ・・・・（１）
（ただし、Ｖｓ、Ｖｗ及びＶｃは、すべて同じ単位とする。）

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）容器
図１に示す容器１を使用して、下記条件でリアルタイムＰＣＲを行なった。
容器１の基板１１としては、市販品のマイクロタイタープレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（商品名）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。また、側面１１２ａの厚さＴ_１１２ａ及び底面１１２ｂの厚さＴ_１１２ｂは０．６ｍｍ、基板１１の平端部の厚さＴ_１１は０．９ｍｍ、ウェル１１２の開口部１１２ｃの半径は２．７ｍｍ、ウェル１１２の深さＤ_１１２は２０ｍｍ、ウェル１１２の容積Ｖｗは３３０μｌ、Ｌ_Ｘは８５ｍｍ、Ｌ_Ｙは１２５ｍｍである。
また、蓋１０としては、シリコーン樹脂製で、射出成形により一体成形されたものを使用した。平坦部の厚さＴ_１０（Ｔ_１０’）は０．８ｍｍ、凸部１０２の高さＨ_１０２は１６ｍｍである。そして、蓋１０の凸部１０２が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_１０は８５％以上である。

（２）液体試料
表１に示す組成の液体試料１〜５を調製した。すなわち、フォワードプライマー、リバースプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ２×及び蒸留水（ｄＨ_２Ｏ）に、検体１〜５（ｇＤＮＡ水溶液）のいずれかを混合して、液体試料１〜５を調製した。

（３）リアルタイムＰＣＲ
容器１のウェル１１２内に、前記液体試料１〜５を１μｌずつ別々に収容し、基板１１に蓋１０を装着した。この時、凸部１０２をウェル１１２に嵌合及び密着させ、液体試料１〜５を封止した時の、凸部１０２がウェル１１２内で占める体積Ｖｃは３２８μlであった。したがって、Ｖｗ−５Ｖｓ＝３２５μｌ、Ｖｗ−２Ｖｓ＝３２８μｌであり、前記式（１）で表される関係を満たしていた。また、ＶｃはＶｗの９９．４体積％であった。
次いで、リアルタイムＰＣＲ装置として、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ（（商品名）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、下記温度条件でリアルタイムＰＣＲを行った。この間、液体試料１〜５の温度を６０℃に調節している時に、液体試料中の蛍光シグナルを、蓋１０の表面１０１側から検出した。

・ＰＣＲの温度条件
９５℃／１０分 → （９５℃／１５秒 → ６０℃／１分）×４０サイクル
なお、加熱、冷却時の温度変化の速度は、それぞれ１℃／秒、−１℃／秒とした。

（４）結果
液体試料１〜５の全てでＰＣＲが正常に進行し、ＰＣＲ増幅曲線が得られた。この時の液体試料１〜５のＣｔ値から、図３に示す検量線が作成できた。
このように、１μｌという極微量の液体試料に対して、蒸発防止用のオイルを使用することなく水分の蒸発を防止し、ＰＣＲを正常に行うことができ、液体試料を高精度に解析できた。

［比較例１］
蓋として、市販品でフィルム状のもの（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒｓ（商品名）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したこと以外は、実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。なお、蓋は、基板への装着時にウェル内には突出していない。
その結果、ＰＣＲ増幅曲線が得られず、検量線を作成できなかった。これは、ＰＣＲの加熱時に、液体試料の水分がウェル内で蒸発してしまい、ＰＣＲが進行しなかったためである。

［実施例２］
（１）容器
図２に示す容器２を使用して、下記条件でリアルタイムＰＣＲを行なった。
容器２の基板２１としては、ウェル２１２が３２個（４行×８列）形成されたものを使用した。各ウェル２１２に対して、行についてはＡ〜Ｄの符号で、列については１〜１２の数字をそれぞれ割り当て、位置を特定できるようにした。
基板２１の平端部の厚さＴ_２１は３ｍｍ、ウェル２１２の底面２１２ｂにおける厚さＴ_２１２ｂは０．１９ｍｍ、底面２１２ｂの半径は０．５ｍｍ、ウェル２１２の開口部２１２ｃの半径は１．６ｍｍ、ウェル２１２の深さＤ_２１２は３ｍｍ、ウェル２１２の容積Ｖｗは１１μｌ、Ｌ_Ｘは２５ｍｍ、Ｌ_Ｙは７５．６ｍｍである。ウェル２１２の底面２１２ｂにおける厚さ方向の、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_２１２は８５％以上である。上記のような形状の基板２１を、シクロオレフィン系樹脂ゼオネックス（（登録商標）、日本ゼオン株式会社製）を使用して、射出成形により作製した。
また、蓋１０としては、シリコーン樹脂製で、射出成形により一体成形されたものを使用した。厚さＴ_１０は０．８ｍｍ、凸部１０２の高さＨ_１０２は２ｍｍである。そして、蓋１０の凸部１０２が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率τ_１０は８５％以上である。

（２）液体試料
（２−１）フローサイトメトリーによるバクテリアのソート
ＰＢＳを溶媒としたＨｏｅｃｈｓｔ Ｈ３３３４２（３．３３μｇ／ｍｌ）を使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属するバクテリアを室温で１０分間染色した。次いで、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、下記条件でフローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａを用意した。そして、基板２１のすべてのウェル２１２内に、バクテリアを１個ずつスポッティングした。次いで、倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ ８１（オリンパス社製）を使用して、基板２１の裏面２１３側からウェル２１２内を観察し、各ウェル内のバクテリアの有無を確認し、記録した。

・フローサイトメーター；
７０μｍ ｎｏｚｚｌｅ、
ｏｐｅｎ ＦＳＣ−Ａ／ＳＳＣ−Ａ，ＦＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ｗ，ＦＳＣ−Ａ／Ｈｏｅｃｈｓｔ ｄｏｔ ｐｌｏｔｓ（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ）、
ｇａｔｅ ｏｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｓｍａｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ，ｅｘｃｌｕｄｅ ｄｏｕｂｌｅｔｓ

（２−２）ウェル内のバクテリアの溶解
ウェル２１２内に、Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を０．７５μｌ分注した後、基板２１に蓋１０を装着した。この時、凸部１０２をウェル２１２に嵌合及び密着させ、液体試料を封止した時の、凸部１０２がウェル２１２内で占める体積Ｖｃは７．５μlであった。したがって、Ｖｗ−５Ｖｓ＝約７．２５μｌ、Ｖｗ−２Ｖｓ＝約９．５μｌであり、前記式（１）で表される関係を満たしていた。また、ＶｃはＶｗの６８．２体積％であった。
次いで、容器２をサーマルサイクラーＡｍｐｌｉＳｐｅｅｄ（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）に設置し、下記温度条件でプログラムを実行した。

・温度条件
６５℃／３０秒 → ３７℃／３０秒 → ６５℃／９０秒 → ９７℃／３分 → （３７℃／１分 → ６５℃／３分 → ９７℃／１分）×３サイクル → ６５℃／１分
なお、加熱、冷却時の温度変化の速度は、それぞれ１℃／秒、−１℃／秒とした。

（３）リアルタイムＰＣＲ（バクテリアの１６ＳリボソームＤＮＡの増幅）
表２に示す組成のリアルタイムＰＣＲ用ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを調製した。
そして、基板２１から蓋１０を取り外し、調製した前記ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを０．７５μｌずつウェル２１２内に分注して液体試料を調製し、再度、基板２１に蓋１０を装着した。この時、凸部１０２をウェル２１２に嵌合及び密着させ、液体試料を封止した時の、凸部１０２がウェル２１２内で占める体積Ｖｃは前回と同様、７．５μlであった。したがって、Ｖｗ−５Ｖｓ＝約３．５μｌ、Ｖｗ−２Ｖｓ＝約８μｌであり、前記式（１）で表される関係を満たしていた。
次いで、容器２を、図４に示す解析装置中のサーマルサイクラーＡｍｐｌｉＳｐｅｅｄ（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）に設置し、下記温度条件でリアルタイムＰＣＲを行った。この間、４５サイクル中で液体試料の温度が７２℃の時に、蓋１０の表面１０１側から基板２１全体に励起光を照射し、蓋１０の表面１０１側から、ＣＣＤカメラにて基板２１全体を撮像して、各サイクルにおける液体試料中の蛍光シグナルを検出し、蛍光強度を算出した。

・ＰＣＲの温度条件
９５℃／１０分 → （９４℃／３０秒 → ６３℃／７５秒 → ７２／７５秒）×４５サイクル → ７２／１０分
なお、加熱、冷却時の温度変化の速度は、それぞれ１℃／秒、−１℃／秒とした。

図４に示す解析装置９は、光源９１、励起フィルタ９２、照明用光学系９３、ミラー９４、サーマルサイクラー９５、対物レンズ９６、吸収フィルタ９７、ＣＣＤカメラ９８を備える。これらは、例えば、通常の蛍光検出装置において使用されるものであり、光源９１以外は、暗箱９９内に配置されている。
光源９１からの照射光９１０は、励起フィルタ９２によって、特定範囲の波長の光のみが透過して励起光９１１となり、照明用光学系９３を通過後、ミラー９４によって反射され、蓋１０を介して容器２の基板２１全体に、蓋１０の表面１０１側から照射される。
励起光９１１の照射により生じた蛍光シグナル９２０は、対物レンズ９６を通過し、吸収フィルタ９７によって、特定範囲の波長の蛍光のみが透過して、検出すべき検出光９２１となる。そして、検出光９２１はＣＣＤカメラ９８によって検出される。

（４）結果
（４−１）フローサイトメトリーによるバクテリアのソート
前記（２−１）におけるウェル２１２内のバクテリアの有無の確認結果を、表３に示す。表３中、「○」は「バクテリア有り」を、「×」は「バクテリア無し」をそれぞれ示す。

（４−２）リアルタイムＰＣＲ（バクテリアの１６ＳリボソームＤＮＡの増幅）
前記（３）におけるバクテリアの１６ＳリボソームＤＮＡの増幅結果を図５に示す。
図５に示すように、リアルタイムＰＣＲの増幅曲線としては、二種類のもの（ライン１、ライン２）が確認された。ライン１は、バクテリアの存在が確認されたウェル２１２内の液体試料から得られたものであり、蛍光強度はサイクル数の増加に伴って強くなり、その後一定となっている。これは、ソートされた１個のバクテリアがウェル２１２内で溶解され、１６ＳリボソームＤＮＡが増幅されたことを示している。一方、ライン２は、バクテリアの存在が確認されなかったウェル２１２内の液体試料から得られたものであり、いずれのサイクルでも蛍光シグナルが検出されなかった。これは、バクテリアがソートされなかったので、１６ＳリボソームＤＮＡが増幅されなかったことを示している。
このように、極微量の液体試料に対して、蒸発防止用のオイルを使用することなく水分の蒸発を防止し、複数の工程に渡って連続的に、液体試料を移液することなく高精度に解析できた。

［比較例２］
蓋として、市販品でフィルム状のもの（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒｓ（商品名）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したこと以外は、実施例２と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。なお、蓋は、基板への装着時にウェル内には突出していない。

前記（２−１）におけるウェル２１２内のバクテリアの有無の確認結果を、表３に示す。
前記（３）におけるバクテリアの１６ＳリボソームＤＮＡの増幅曲線としては、バクテリアの有無に関わらず、図５におけるライン２と同じもののみが得られた。これは、バクテリアの存在が確認されなかったウェル２１２内の液体試料だけでなく、バクテリアの存在が確認されたウェル２１２内の液体試料においても、１６ＳリボソームＤＮＡが増幅されなかったことを示している。その原因は、「（２−２）ウェル内のバクテリアの溶解」及び／又は「（３）リアルタイムＰＣＲ」の際の加熱時に、液体試料の水分がウェル２１２内で蒸発してしまい、ＰＣＲが進行しなかったためである。

本発明は、医学、薬学、生化学等の分野における微量成分の解析に利用可能である。

１，２・・・液体試料解析用容器、１０・・・蓋、１１，２１・・・基板、１０１・・・蓋の表面、１０２・・・凸部、１０２ｂ・・・凸部の先端面、１１１，２１１・・・基板の表面、１１２，２１２・・・ウェル、１１２ｂ，２１２ｂ・・・ウェルの底面、１１２ｃ，２１２ｃ・・・ウェルの開口部、１１３，２１３・・・基板の裏面

Claims (7)

1. 液体試料を収容するためのウェルが表面に形成された基板と、前記ウェルの開口部を封止する蓋とを備えた液体試料解析用容器であって、
   前記蓋には、前記ウェル内に嵌合する凸部が設けられ、該凸部は、嵌合時に前記ウェル内でその容積の５０体積％以上の空間を占め、
   前記蓋の凸部が設けられた部位の厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることを特徴とする液体試料解析用容器。
2. 前記凸部の先端面、及び前記凸部が設けられている部位の蓋の表面の少なくとも一方が平面であることを特徴とする請求項１に記載の液体試料解析用容器。
3. 前記蓋において、前記凸部がその他の部位と一体成形されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の液体試料解析用容器。
4. 前記蓋が、シリコーン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリオレフィン樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、シクロオレフィン系樹脂、メチルペンテン系樹脂又はフッ素系樹脂からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体試料解析用容器。
5. 前記ウェルの底面、及び前記ウェルが設けられている部位の基板の裏面の少なくとも一方が平面であり、前記底面と裏面との間の厚さが０．１２〜１ｍｍであり、該厚さ方向における、波長４００〜７５０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体試料解析用容器。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体試料解析用容器を使用することを特徴とする液体試料の解析方法。
7. 前記ウェル内に収容する液体試料の体積Ｖｓを、前記ウェルの容積Ｖｗ、及び嵌合時に前記凸部が前記ウェル内で占める体積Ｖｃに対して、下記式（１）で表される関係を満たすようにすることを特徴とする請求項６に記載の液体試料の解析方法。
   Ｖｗ−５Ｖｓ≦Ｖｃ≦Ｖｗ−２Ｖｓ・・・・（１）
   （ただし、Ｖｓ、Ｖｗ及びＶｃは、すべて同じ単位とする。）

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