JP2010203875A - 表面増強ラマン散乱反応性ナノスケールｐＨセンサ - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、別種のナノスケールｐＨセンサ、すなわち、生理学的に有意な範囲においてｐＨの高感度かつ安定した検出に用いることのできる、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）反応性ナノスケールｐＨセンサを提供することである。
【解決手段】本発明者らは、ナノファイバと、前記ナノファイバ表面へと修飾された金属ナノ粒子と、前記金属ナノ粒子表面に吸着させたｐＨ反応性分子とを含んでいる表面増強ラマン散乱効果に基づくナノスケールｐＨセンサを調製した。本発明のナノスケールｐＨセンサを用いることにより、ナノメートルスケールの空間分解能で、生理学的に有意な範囲において試料のｐＨ値を検出（または決定）することができる。
【選択図】図２

Description

本発明は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）効果を示す能力を有するｐＨ感受性ナノファイバ（本明細書では「ナノスケールｐＨセンサ」とも称する）に関する。本発明はまた、ナノスケールｐＨセンサを用いて、ナノメートルスケールの空間分解能でｐＨ値を決定する方法にも関する。

膜を挟んだプロトン濃度の変化またはプロトン勾配の測定は、基本的な生物学的過程を理解するのに重要であり、疾患の治療法の開発に関連する。細胞などの微小環境におけるプロトン濃度の測定には、高空間分解能が不可欠である。マウスにおける腫瘍発症の診断には、細胞内ｐＨおよび細胞外ｐＨを測定するのに、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）が広範に用いられてきた（非特許文献１を参照のこと）。化学的な微小環境の存在を同定するには、ＭＲＳは有用ではあるが、その空間分解能は０．１〜１ｍｍに限定されている。微小環境は、さらに小さなスケールにおいて存在すると推測され、これらの微小環境における化学濃度を測定する、より高分解能の技法に対する必要を促している。カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、興味深い１次元ナノ材料であり、高分子としてのナノチューブを探索し、生物学的研究および臨床診断における広範な応用を可能にする各種の機能化が展開されている。また、Ｘ．Ｃｈｅｎらは、ＣＮＴが、細胞内部に対する最小限の摂動により細胞膜を透過する、理想的なナノスケール針であることを示している（非特許文献３を参照のこと）。

蛍光プローブは、事実上非侵襲的な形で、個別の生細胞またはヒト体内などの複雑な環境の化学的に特異な情報を提供する能力を有する。この方法の空間分解能は、蛍光検出に用いられる光学顕微鏡の回折限界により限定されている。Ｄａｉら（非特許文献２を参照のこと）は、ポリエチレングリコール化した（ＰＥＧ化した）フルオレセインを塗布して、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）を非共有結合的に機能化した。この試みは、ＳＷＣＮＴにｐＨ依存的な光学特性を与えるために行われた。しかし、染料分子とＳＷＣＮＴとの間の相互作用はＯＨ⁻の存在により弱められるので、弱められた相互作用の結果として、特に、より高いｐＨ値においては、こうして物理的に吸着された染料分子がＳＷＣＮＴから浸出する。

細胞における表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）測定は、細胞内構造の化学プロービング（単一粒子からの検出可能なシグナル）を可能とし、細胞過程を調べるのに適した収集時間を許容する空間分解能を可能とするため、急速に関心を増しつつある話題である（非特許文献４を参照のこと）。残念ながら、これらのプローブのｐＨ範囲は、それらがクラスターおよび凝集物を形成する傾向により限定され、その結果、粒子径のばらつきによる粒子接合部間の複雑なｐＨ微小環境が生じる。ＳＥＲＳによるナノ粒子のｐＨ測定が、新たな生物学的問題に信頼できる形で適用できるには、さらなる技術的な改善が必要である。

ＰＥＧ化されたフルオレセインに非共有結合的に結合した上記ＳＷＣＮＴの著しい浸出の問題は、浸出した染料が細胞に有害でありうるために、実際の適用を妨げる。さらに、不都合なことに、ＰＥＧ化したフルオレセインは、その強度がｐＨ依存的である蛍光ピークをただ１つしか有さない。センサ染料の浸出速度が一定でないため、センサは、細胞内ｐＨ値を反映できない。
本発明者らは、先に、生理学的に有意な範囲においてｐＨの高感度かつ安定した検出に用いることのできる、新型の、蛍光染料により改変されたｐＨ感受性ナノファイバ（「ナノスケールｐＨセンサ」）を提案した。
本発明の目的は、別種のナノスケールｐＨセンサ、すなわち、生理学的に有意な範囲においてｐＨの高感度かつ安定した検出に用いることのできる、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）反応性ナノスケールｐＨセンサを提供することである。

〔発明の概要〕
上記目的を達成するため、我々は、金属化されたナノファイバを、どのようにしてｐＨ反応性分子を有するＳＥＲＳ基質として組み込むかについて検討した。そして、本発明を完成させた。
すなわち、我々は、ナノファイバと、前記ナノファイバ表面へと修飾された金属ナノ粒子と、および金属ナノ粒子表面に吸着させたｐＨ反応性分子とを含んでいる表面増強ラマン散乱効果に基づくナノスケールｐＨセンサを初めて提供する。
より具体的には、前記ナノファイバは、ナノチューブおよびナノワイヤからなる群から選択され、前記ナノチューブおよびナノワイヤは、炭素から作製され、前記金属ナノ粒子は、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ａｇ被膜したＡｕ、Ａｇ被膜したＰｔ、Ａｕ被膜したＰｔ、およびＰｔ被膜したＡｕからなる群から選択され、前記ｐＨ反応性分子は、ビオチンフルオレセインおよび４−メルカプト安息香酸からなる群から選択され、前記ナノファイバは、ティップの先端に付着している。

我々は、第二に、ナノメートルスケールの空間分解能で試料中のｐＨ値を決定する方法を提供する。その方法は以下のステップを含む。
（ｉ）上記本発明のナノスケールｐＨセンサを、試料と接触させるステップと、
（ｉｉ）定められた波長を有するレーザー光を、前記ナノスケールｐＨセンサに照射するステップと、
（ｉｉｉ）前記ナノスケールｐＨセンサからのラマン散乱を、前記レーザー光の下で検出するステップと、
（ｉｖ）測定されたラマン散乱のｐＨ依存的なピーク強度を計算し、２つのピークの比を標準検量線に照合するステップと、
（ｖ）標準検量線から試料のｐＨ値を決定するステップと、
（ｖｉ）前記ナノファイバ上のｐＨ感受性領域のサイズにより、ｐＨ測定の空間分解能を決定するステップ。

本発明の表面増強ラマン散乱反応性ナノスケールｐＨセンサは、試料中のｐＨ値を決定する上記方法と同様に新規である。ナノスケールｐＨセンサまたは該方法を用いることにより、ナノメートルスケールの空間分解能で、生理学的に有意な範囲（ｐＨ ５．６〜ｐＨ ８．２）において試料のｐＨ値を検出（または決定）することができる。本発明の測定範囲は、上記ｐＨ範囲（ｐＨ ５．６〜ｐＨ ８．２）に限定されない。

本発明のナノスケールｐＨセンサの合成スキームを示す図である。 実施例１で得られたナノスケールｐＨセンサの概略構造を示す図である。 実施例１で得られたナノスケールｐＨセンサのＳＥＭ画像を示す図である。 環境の含水ｐＨ値が変化する場合において、実施例１で得られたナノスケールｐＨセンサのＳＥＲＳ強度を示す図である。 実施例１で得られたナノスケールｐＨセンサのｐＨ検量線を示す図である。波数（１）：１１８４ｃｍ^−１、波数（２）：１６３６ｃｍ^−１ ナノ針としての、本発明のナノスケールｐＨセンサのＳＥＭ画像を示す図である。 本発明のｐＨ感受性ナノ針を用いる、細胞膜周囲におけるｐＨ決定を示す概略図解である。

〔発明の更に詳しい説明〕
上記の通り、第１の発明は、その表面にｐＨ反応性分子を有する金属ナノ粒子または二元金属ナノ粒子で修飾した、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）効果を示す能力を有するナノファイバである。
本明細書において、「ナノファイバ」は、炭素、窒化ホウ素、酸化タングステンＷＯ_ｘ（２＜ｘ＜３）、または酸化亜鉛（ＺｎＯ）などの各種材料から作製されるナノチューブまたはナノワイヤから選択される。これらのうちで、カーボンナノチューブが、典型的材料として選択される。
カーボンナノチューブは、炭素に基づく材料の同素体の１つである。これらは、その直径が２ｎｍ〜１００ｎｍの範囲にある円筒状の炭素分子の形態を有し、（１枚または複数枚の）巻いたグラファイトシートからなる形態を有する。単層カーボンナノチューブまたは多層カーボンナノチューブを用いることができ、フラーレン（Ｃ_６０、Ｃ_７２、およびより大型のフラーレン分子）も用いることができる。
ナノファイバを金属ナノ粒子または二元金属ナノ粒子で修飾するためには、チオール官能化ナノファイバ（図１、ステップ１〜２に示す）を得る必要がある。静電気引力により、例えば、β−メルカプトエチルアミン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリシン（ＰＬＬ）などでナノファイバ表面を官能化して正に荷電させることで達成でき、負に荷電した金属ナノ粒子または二元金属ナノ粒子を同様にして修飾することができる。

本明細書において、金属ナノ粒子（二元金属ナノ粒子を含む）は、Ａｕ、Ａｇ、もしくはＰｔからなるナノ粒子から選択されるか、または、Ａｇ被膜したＡｕ、Ａｇ被膜したＰｔ、Ａｕ被膜したＰｔ、もしくはＰｔ被膜したＡｕの二元金属ナノ粒子から選択される。これらのうち、二元金属のＡｇ被膜したＡｕを用いるのが最も好ましい。

ｐＨ反応性分子は、金属ナノ粒子または二元金属ナノ粒子を装着したナノファイバの金属ナノ粒子または二元金属ナノ粒子に吸着させる（図１、ステップ４を参照のこと）。本明細書において、ｐＨ反応性分子は、ビオチンフルオレセインまたは４−メルカプト安息香酸から選択される。これらのｐＨ反応性分子は、共有結合により、金属ナノ粒子表面に吸着させる。

例えば、本発明のナノスケールｐＨセンサの望ましい形態は、ナノ針またはナノ粒子である。

本発明のナノスケールｐＨセンサを用い、前記ステップ（ｉ）〜（ｖｉ）に従うことにより、ナノメートルスケール（すなわち、約３ｎｍ〜１００ｎｍ）の空間分解能で、試料中のｐＨ値を決定することができる。また、当然ながら、前記ステップ（ｉ）〜（ｖｉ）により、マイクロメートルスケールまたはミリメートルスケールの空間分解能で、試料中のｐＨ値を決定することもできる。

ステップ（ｉｉ）における定められた波長を有する光源として、レーザー光源を用いることができる。ステップ（ｉｉｉ）において発せられたＳＥＲＳシグナルを局所的に測定するために、各種の方法を適用することができる。１つの考えられる方法は、ｐＨ感受性ナノ針を作製することである。次いで、このナノ針を、（例えば、集束イオンビーム法を適用して）ナノメートルサイズのｐＨ感受性領域を有するナノ針（例えば、ナノチューブの１つの端部のみがｐＨ感受性に保持される）へと特異的に改変する。ナノ針のｐＨ感受性セグメントを、生細胞の異なる位置（例えば、輸送タンパク質、膜、細胞質、または核周囲の位置）に正確に制御し、局所的に決定されたｐＨ値に従って、局所的に発せられたＳＥＲＳシグナルをモニターすることができる。

添付図面を参照しながら、以下の実施例により、より具体的に本発明を説明する。

表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）反応性ナノスケールｐＨセンサの作製
二元金属ナノ粒子を、ビオチンフルオレセイン（ＢＦ）分子の吸着質層を有するＳＥＲＳ活性基質としてＳＷＣＮＴに装着した、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）反応性ナノスケールｐＨセンサは、以下の通りに作製された。（ＳＥＲＳ反応性）ナノスケールｐＨセンサの合成スキームを図１に示し、（ＳＥＲＳ反応性）ナノスケールｐＨセンサの概略構造を図２に示した。

（ａ）Ａｇ被膜したＡｕ粒子（二元金属粒子）の調製
クエン酸還元法により、１３ｎｍサイズの金コロイドを調製し、シードとして用いた。５ｍＬの金シード溶液を、３ｍＬの１０^−２ｍＭクエン酸と混合し、精製水により最終容量を５０ｍＬとした。溶液を磁気攪拌し、１００℃に加熱した。次いで、０．５ｍＬの１０^−２ｍＭ ＡｇＮＯ_３を滴下により添加した。２０分間の反応後に、溶液の色が、ピンク色から濃黄色に変化した。これを冷却し、目的のコロイド溶液が調製された。このＡｇ被膜したＡｕコロイドは、６カ月以上にわたり安定であった。

（ｂ）チオール官能化ＳＷＣＮＴ
１ｍｇの精製ＳＷＣＮＴ（ＳＥＳ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、９００−１３０１）を、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドによる１−ピレンブタン酸スクシンイミジルエステルの５ｍＭ溶液中に１時間浸漬したところ、ＳＷＣＮＴ側壁にピレン残基が結合した（図１、ステップ１）。次いで、スクシンイミジルエステル基が、β−メルカプトエチルアミンのアンカリングポイントとして働き、チオール官能化ＳＷＣＮＴを得た。その後、混合液を遠心分離し、純水によりすすぎ、遊離分子を除去した（図１、ステップ２）。

（ｃ）二元金属ナノ粒子を装着したＳＷＣＮＴ（ＳＥＲＳ活性基質）の作製
０．１ｍｇのチオール官能化ＳＷＣＮＴを超音波分解し、１５分間にわたり、１０ｍＬの純水溶液中に分散させた。上記で得られた１ｍＬの二元金属コロイドを、滴下によりＳＷＣＮＴ溶液に添加し、さらに５分間にわたり超音波分解した。１５，０００ｒｐｍで遠心分離し、純水で完全にすすいだ後、さらなる実験用として水中に再分散させた（図１、ステップ３）。

（ｄ）ＳＥＲＳ活性基質へのビオチン−４−フルオレセインの吸着（ＳＥＲＳ反応性ｐＨセンサ）
二元金属ナノ粒子を装着したＳＷＣＮＴを、１０^−５Ｍの最終Ａｕ濃度で希釈した。ビオチン−４−フルオレセインを、１０^−６Ｍの濃度までＳＷＣＮＴ溶液に添加し、１時間にわたり混合物を放置した。遠心分離し、純水で完全に洗浄して遊離ビオチン−４−フルオレセイン分子を除去した後、ＳＥＲＳ反応性ｐＨセンサを得た。ＡｕコロイドおよびＡｇ被膜したＡｕの二元金属コロイドへのビオチン−４−フルオレセインの吸着は、同じ方法、同じ濃度で達成した（図１、ステップ４、図２も参照のこと）。

上記のステップで得られた懸濁液の液滴を乾燥させ、電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて観察した。ＦＥ−ＳＥＭ画像を図３に示した。ＣＮＴの表面上で二元金属ナノ粒子を修飾し、ＳＥＲＳ活性基質として作用する小凝集物を形成する。

本発明のｐＨ感受性カーボンナノチューブを用いるｐＨ値の決定
実施例１で得られたナノスケールｐＨセンサのＳＥＲＳスペクトルを、以下の通りに、異なるｐＨにおいて得た。試料をカバーガラス基板に沈着させ、真空下で乾燥させた。各ｐＨでのラマンスペクトルを得る前に、１０分間にわたり、所望のｐＨ値を有する１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に試料を浸漬した。緩衝液のｐＨは、０．０１ｐＨ単位の精度まで調整した。次いで、上記基板全体を周囲の緩衝液中に浸漬する間、試料における５１４．３２ｎｍの波長による励起および４０μＷの電力を伴う、ＬａｂＲａｍ ＨＲ−８００ラマン顕微鏡（日本、Ｈｏｒｉｂａ ＆ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ社製）を用いて、ラマンスペクトルを記録した。走査データは、各ｐＨ値において、各試料における各点から収集した。各曲線は、５つの異なる粒子点の平均データであった。二元金属ナノ粒子で修飾したＳＷＣＮＴ、および、付着させたｐＨ反応性レポーターであるビオチンフルオレセインからのＳＥＲＳスペクトルの応答に関する情報は、酸性から塩基性に至るｐＨレベルで測定した。結果を図４に示す。

ｐＨ値が高値から低値に低下するとき、フルオレセインのイオン状態変化には、力の定数変化をもたらす１電子電荷の再分配が伴う。こうして、分子対称性の変化は、観察された振動スペクトルにおけるバンド強度の変化をもたらす。ＳＥＲＳスペクトルにおける最も顕著な特徴は、１６３６ｃｍ^−１におけるキサンテン環モードおよび１１８４ｃｍ^−１におけるフェノールのＣ−ＯＨベンドである。１６３６ｃｍ^−１における振動バンドの強度は、キサンテン部分のより対称的な構造により、ｐＨ値が上昇するのに応じて増大する。他方、１１８４ｃｍ^−１における振動バンドの強度は、ｐＨ値が上昇するのに応じて減少する。１６３６ｃｍ^−１および１１８４ｃｍ^−１におけるこのＳＥＲＳ強度比（Ｉ１６３６／１１８４）は、Ｉ１６３６／１１８４対ｐＨ値の標準曲線を用いて該比をｐＨ値に変換することにより、ｐＨ値を正確に決定するのに適切な尺度となる。図５は、得られたナノスケールｐＨセンサのｐＨ検量線を示す。

ｐＨ感受性ナノ針の調製
ｐＨ感受性ナノ針は、電気泳動法（Ｊ．Ｔａｎｇら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００３年、第１５巻、１３５２頁）により作製した。Ｔｉティップ（φ０．２５ｍｍ）は、まず、１１％ ＨＦ溶液により８Ｖで電解的に鋭利化させた後、１％ ＨＦ溶液による化学エッチングを施し、次いで、実施例１で得られたｐＨ感受性カーボンナノチューブ懸濁液の液滴内に浸漬した。懸濁液を微小電極に接続し、ＡＣバイアス印加（１ＭＨｚ、１０Ｖ）による電気泳動を行い、ｐＨ感受性ナノチューブを、Ｔｉティップの先端に付着させた。図６は、実施例３で得られたｐＨ感受性ナノ針のＳＥＭ画像を示す。

１つの考えられる適用例は、微小環境内、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内、または、細胞膜周囲におけるプロトン濃度の測定である。図７は、本発明のｐＨ感受性ナノ針を用いることによる、細胞膜周囲におけるｐＨ測定の概略を示す。

１ ナノスケールｐＨセンサ
１ａ ナノ針
２ カーボンナノチューブ
３ １−ピレンブタン酸スクシンイミジルエステル
３ａ ピレン残基
４ β−メルカプトエチルアミン
５ 金属ナノ粒子
５ａ Ａｇ
５ｂ 金コロイド
６ ビオチンフルオレセイン
６ａ ビオチン部
６ｂ フルオレセイン部
６ｃ ｐＨ反応性分子
６ｄ キサンテン部
７ ティップ
７ａ 先端
８ 細胞膜

R.J.Gillies, G.S. Karczmar, and Z.M. Bhujwalla: J. Magn. Reson. Imaging, 2002,vol.16 (4), 430-450 N.Nakayama-Ratchford, S. Bangsaruntip, X. Sun, K. Welsher, and H. Dai: J. Am.Chem. Soc., 2007, vol.129 (9), 2448-2449 X.Chen, A. Kis, A. Zettl, and C.R. Bertozzi: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007,vol.104 (20), 8218-8222 J.Kneipp, H. Kneipp, B. Wittig, and K. Kneipp: Nano Lett., 2007, vol. 7 (9),2819-2823

Claims (7)

1. ナノファイバと、前記ナノファイバ表面へと修飾された金属ナノ粒子と、前記金属ナノ粒子表面に吸着させたｐＨ反応性分子とを含んでいる表面増強ラマン散乱効果に基づくナノスケールｐＨセンサ。
2. 前記ナノファイバが、ナノチューブおよびナノワイヤからなる群から選択される、請求項１に記載のナノスケールｐＨセンサ。
3. 前記ナノチューブおよびナノワイヤが、炭素から作製される、請求項２に記載のナノスケールｐＨセンサ。
4. 前記金属ナノ粒子が、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ａｇ被膜したＡｕ、Ａｇ被膜したＰｔ、Ａｕ被膜したＰｔおよびＰｔ被膜したＡｕからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノスケールｐＨセンサ。
5. 前記ｐＨ反応性分子が、ビオチンフルオレセインおよび４−メルカプト安息香酸からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノスケールｐＨセンサ。
6. 前記ナノファイバが、ティップの先端に付着している、請求項１から５のいずれか一項に記載のナノスケールｐＨセンサ。
7. ナノメートルスケールの空間分解能で試料中のｐＨ値を決定する方法であって、
   以下のステップを含む方法：
   （ｉ）請求項１から請求項６のいずれか一項に記載のナノスケールｐＨセンサを、試料と接触させるステップと、
   （ｉｉ）定められた波長を有するレーザー光を、前記ナノスケールｐＨセンサに照射するステップと、
   （ｉｉｉ）前記ナノスケールｐＨセンサからのラマン散乱を、前記レーザー光の下で検出するステップと、
   （ｉｖ）測定されたラマン散乱のｐＨ依存的なピーク強度を計算し、２つのピークの比を標準検量線に照合するステップと、
   （ｖ）前記標準検量線から試料のｐＨ値を決定するステップと、
   （ｖｉ）前記ナノファイバ上のｐＨ感受性領域のサイズにより、ｐＨ測定の空間分解能を決定するステップ。