JP2009161427A - ナノスケールｐＨセンサー - Google Patents

Abstract

【課題】新しいタイプの蛍光色素修飾ｐＨ感受性ナノチューブ／ナノワイヤであって、生理学的に重要な範囲のｐＨを、感度高く、かつ、確実に検出するためのナノチューブ／ナノワイヤを提供する。
【解決手段】蛍光色素分子（ＤＨＰＤＳ）が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤを調製し、ナノチューブ／ナノワイヤに結合された蛍光色素を更に電子供与性の分子で被覆する。この電子供与性の分子は、蛍光色素分子に電子を供与又は転移させ、エステル加水分解を阻害し、蛍光色素分子の安定性が改善する。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光色素で化学修飾されたｐＨ感受性ナノチューブもしくはナノワイヤ（本明細書では以後、ナノスケールｐＨセンサーという。）に関するものである。また、本発明は、このナノスケールｐＨセンサーを用いて行なう、サンプル中のｐＨをナノメータスケールの空間分解能で測定する方法にも関する。

細胞膜を横切るプロトン濃度又はプロトン濃度勾配の測定は、基礎的な生物プロセスを理解する上で重要であり、疾患処置法の開発と密接な関連がある。細胞のようなミクロ環境中のプロトン濃度の測定には、高い空間分解能が必須である。マウスにおける腫瘍増殖の診断では、細胞内及び細胞外のｐＨを測定するために、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）が広く利用されている（非特許文献１参照）。ＭＲＳは、化学的ミクロ環境を知るために有益ではあるが、その空間分解能は０．１〜１ｍｍである。ミクロ環境はもっと小さなスケールで存在するものと推定され、そのことはミクロ環境における（プロトン）化学的な濃度測定技術をより高分解能化する必要があることを提起している。カーボンナノチューブ（ＣＮＴｓ）は興味深い１Ｄナノ材料であり、そして、マクロ分子としてのナノチューブを探究するため、また生物研究や臨床研究に広範な応用を可能にするため、種々の機能が開発されている。カーボンナノチューブは、細胞内構造の撹乱を最小限に抑えつつ細胞膜からその内部へ貫通させ得る理想的なナノスケールのニードルであることを、Ｃｈｅｎらは示している（非特許文献３参照）。

蛍光プローブは、例えば、個々の生きた細胞あるいは人体のような、化学的に特異で複雑な環境における情報を、非侵襲的に提供できる。この方法の空間分解能は、蛍光検出に用いる光学顕微鏡の回折限界によって制限を受ける。Ｄａｉらは、ポリエチレングリコレート（ＰＥＧ）化されたフルオレッセインを単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）に非共有的に吸着させ、ＳＷＣＮＴを機能化した（非特許文献２参照）。この試みは、ｐＨ依存性の光学的性質をＳＷＣＮＴに与えるために行なわれた。しかしながら、物理的に吸着した色素分子は、その弱い吸着相互作用の結果として、特に高めのｐＨにおいてＳＷＣＮＴから離脱する。これは、色素分子とＳＷＣＮＴ間の相互作用がＯＨ⁻の存在によって弱められるからである。

R.J. Gillies, G.S. Karczmar, and Z.M. Bhujwalla: J. Magn. Reson. Imaging, 2002, vol.16(4), 430-450 N. Nakayama-Ratchford, S. Bangsaruntip, X. Sun, K. Welsher, and H. Dai: J. Am. Chem. Soc., 2007, vol.129 (9), 2448 -2449 X. Chen, A. Kis, A. Zettl, and C.R. Bertozzi: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, vol.104 (20), 8218-8222

非共有結合で付着した上記ＰＥＧ化フルオレッセインのＳＷＣＮＴｓからの顕著な離脱の問題は、蛍光色素が恐らく細胞に有害であるために、実際の応用の妨げになるであろう。更に、ＰＥＧ化フルオレッセインには、ｐＨに依存して強度が変化する蛍光ピークがたった一つしかなく、都合がよいものではない。センサー色素が不均等な速度で離脱すれば、細胞内のｐＨ値を反映させることはできないであろう。
本発明の目的は、新しいタイプの蛍光色素修飾ｐＨ感受性ナノチューブ／ナノワイヤ（ｐＨセンサー）であって、生理学的に重要な範囲のｐＨを、感度高く、かつ、確実に検出するための「ナノスケールｐＨセンサー」を提供することである。

〔発明の概要〕
上記目的を達成するために、我々はカーボンナノチューブに種々の蛍光色素をどのように共有結合で結合させるか、また、結合させた蛍光色素の機能をどのようにして安定化させ維持するかを検討した。そして、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、先ずは、蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤを提供する（「第１の発明」）。

本発明は、ｐＨ感受性の、蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤであって、前記蛍光色素分子は更に電子供与性分子で被覆されているナノチューブもしくはナノワイヤも提供する（「第２の発明」）。

また更には、本発明は、サンプル中のｐＨを、ナノメータ・スケールの空間分解能で測定する方法で、以下の工程を含む方法も提供する（「第３の発明」）。
（i）ｐＨ感受性の蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤであって、前記蛍光色素分子は更に電子供与性分子で被覆されているナノチューブもしくはナノワイヤを、サンプルに接触させる；
（ii）そのｐＨ感受性ナノチューブもしくはナノワイヤを、所定の波長λex₁ を有する光及びλex₂ を有する光で順に励起する；
（iii）励起波長に応じて生じる蛍光を、λ_measureの蛍光ピーク波長において局所的に測定する；
（iｖ）所定の波長λex₁ 及びλex₂ での光励起によって生じる蛍光強度の比を計算する；
（ｖ）予め作成した標準較正曲線から、サンプルのｐＨを求める；
（ｖi）用いたナノチューブもしくはナノワイヤのｐＨ感受性領域の大きさによって、ｐＨ測定の空間分解能を求める。

第１の発明の、蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤは新規である。これは、ｐＨ感受性を有する、蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブ／ナノワイヤ、すなわち、第２の発明のナノスケールｐＨセンサーを実現するためには必須のものである。
第２の発明の、強靭なナノスケールｐＨセンサーは、第３の発明の方法と同様に新規である。このナノスケールｐＨセンサーを用い、あるいは、この方法を適用することにより、生理的範囲（ｐＨ５．６〜ｐＨ８．２）で、サンプル中のｐＨ値をナノメータスケールの空間分解能で検出（又は決定）できる。

〔発明の更に詳しい説明〕
上で述べたように、第１の発明は、蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤである。
ここで、「ナノチューブもしくはナノワイヤ」は、炭素、ボロンニトリド、酸化タングステン（ＷＯｘ、2 < x < 3）、又は酸化亜鉛（ＺｎＯ）のような種々の材料でつくられたナノチューブもしくはナノワイヤから選ばれる。中でも、カーボンナノチューブは代表的な材料として選ばれる。
カーボンナノチューブは、炭素に基づく物質の同素体（allotrope）の一つである。これは、炭素から構成される径が２ｎｍ〜１００ｎｍのシリンダー状分子であり、グラファイト・シートを丸めた形状を有している。カーボンナノチューブとして、単層カーボンナノチューブも多層カーボンナノチューブもいずれも使用でき、また、フラーレン（Ｃ_６０、Ｃ_７２、もっと大きなフラーレン分子）も使用できる。中でも、多層カーボンナノチューブが最も好ましく用いられる。
ここで、蛍光色素分子はそのピーク強度がｐＨ依存性である二つ以上の蛍光ピークをもつ種々の分子から選ばれる。例えば、６，８−ジヒドロキシ−１，３−ピレンジスルフォネート（ＤＨＰＤＳ）、フルオレッセイン イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及び１−ヒドロキシピレン−３，６，８−トリスルフォネート（ＨＰＴＳ）が選ばれる。

蛍光色素分子は、リンカー分子を介してナノチューブ／ナノワイヤに共有結合で結合されている（図１の工程２−３参照）。リンカー分子は適当な鎖長さでその末端にＮＨ_２及び／又はＣＯＯＨ基を持つ分子、例えば、１２−アミノドデカン酸（１２ＡＡ）やポリ−Ｌ−リジンから選ばれる。

蛍光色素分子だけが結合されたナノチューブ／ナノワイヤは、ナノメータスケールの空間分解能でのｐＨ値の測定に使用できない。ＤＨＰＤＳのような蛍光色素分子は、強く電子を引きつけてカーボンナノチューブに対してエステル結合を形成するために、合成したナノチューブ若しくはナノワイヤの機能構造部は加水分解を受けやすく、不安定になりやすい。
このような問題を避けるために、ナノチューブ／ナノワイヤに結合された蛍光色素（例えば、ＤＨＰＤＳ）を更に電子供与性の分子（例えば、亜鉛フタロシアニン）で被覆する。この電子供与性の分子は、蛍光色素分子（例えば、ＤＨＰＤＳ）に電子を供与し、そのことにより分子周辺の電子雲が均等化される結果、エステル加水分解が阻害され、蛍光色素分子の安定性が改善する（図３参照）。
適切な電子供与性の分子としては、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）が好ましく用いられる。ＺｎＰｃのほかにも、他の金属フタロシアニン（CoPc, NiPc, CuPc, GaPc, SnPc）やフタロシアニン誘導体を使うこともできる。

蛍光色素で機能化されたナノチューブ／ナノワイヤを電子供与性分子で被覆するには、蛍光色素で機能化されたナノチューブ／ナノワイヤを電子供与性分子の溶液に混ぜて、加えた電子供与性分子が蛍光色素で機能化されたナノチューブ／ナノワイヤに物理的に付着するまで、数時間、インキュベート・混合する。

本発明のｐＨ感受性ナノチューブ若しくはナノワイヤ（ナノスケールｐＨセンサー）の有望な形状の一つはナノニードルである。他の有望な形状はナノ粒子である。

上記工程（ｉ）−（ｖi）に従って、我々はサンプル中のｐＨ値をナノメータ・スケール（すなわち、約３ｎｍ〜１００ｎｍ）の空間分解能で決定できる。当然ながら、我々は上記工程（ｉ）−（ｖi）に従って、サンプル中のｐＨ値をマイクロメータ又はミリメータ・スケールの空間分解能でも決定できる。
工程（ii）における所定波長λex₁ 及びλex₂ の光源としては、レーザ光源や、（キセノンランプのような）ハロゲンランプを用いてフィルターされた単色光源を使用することができる。
工程（iii）において、生じた蛍光を局所的に測定するためには、種々の方法を用いることができる。一つの可能な方法は、ｐＨ感受性ナノニードルを作製することである。この場合、上記ナノニードルは、例えば、ＦＩＢ技術を応用して、ナノメータサイズのｐＨ感受性セグメントを有するナノニードルへと特異的に改変される（例えば、ナノチューブの一端だけにｐＨ感受性を持たせる）。我々は、このナノニードルのｐＨ感受性セグメントを、生細胞の異なる位置へと正確に操作し（例えば、転移タンパク質の周りの位置、膜、細胞質あるいは核小体）、局所におけるｐＨ値を測定するために、局所的に発生した蛍光をモニターすることができる。

添付図面を参照しながら、以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
＜実施例１＞ 蛍光色素分子の６，８−ジヒドロキシ−１，３−ピレンジスルフォン酸二Ｎａ塩（ＤＨＰＤＳ）が共有結合しているｐＨ感受性カーボンナノチューブの合成。
本発明のナノスケールｐＨセンサーの中間体である「蛍光色素分子（ＤＨＰＤＳ）が共有結合で結合しているｐＨ感受性カーボンナノチューブ」は、次のようにして調製した（図１、工程１〜３参照）。

（工程１）カルボキシル機能化カーボンナノチューブの調製：
還流している硝酸／硫酸混液（硝酸：硫酸の比率＝３：１）１０ｍＬ中に、ＣＶＤ多層カーボンナノチューブ（ＳＥＳリサーチ、９００−１２０１）を１時間懸濁し、多層カーボンナノチューブの表面を改質し、その後、純水で洗浄し、クリーンな環境下にて乾燥した。

（工程２）カルボキシル機能化カーボンナノチューブにリンカー分子の１２−アミノドデカン酸（１２ＡＡ）を共有結合で結合させる工程：
こうして得られた（カルボキシル機能化）多層カーボンナノチューブ２ｍｇを、ｐＨ５．６の１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に分散し、２ｍＭのＥＤＣ〔１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〕及び５ｍＭのＮＨＳ〔Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド〕中で３０分間インキュベートし、アミノ活性型カーボンナノチューブを得た。その懸濁液を遠沈し、ｐＨ５．６の１０ｍＭリン酸塩緩衝液で十分に洗浄した。次に、その活性型カーボンナノチューブを過剰の１２ＡＡと共に１時間インキュベートすることによって、リンカー分子の１２ＡＡ（ポリマーを含み、一個のヒドロキシ基及び一個のアミノ基をもつ分子）を、多層カーボンナノチューブの表面に取り付けた。それから、そのナノチューブの懸濁液を遠沈し、ＤＭＦで洗浄した。

（工程３）リンカー分子（１２ＡＡ）のカルボキシル基とヒドロキシ基含有ｐＨ感受性色素分子（ＤＨＰＤＳ）の共有結合反応：
工程２で得られたカーボンナノチューブの液に、ＤＭＦに溶かしたＥＤＣ（終濃度：２ｍＭ）及びＤＭＡＰ（終濃度：０．２ｍＭ）と共に、ＤＨＰＤＳ（６，８−ジヒドロキシ−１，３−ピレンジスルフォン酸二Ｎａ塩）（終濃度：０．１ｍＭ）を加えた。その混合液を５分間超音波処理し、室温で一晩撹拌した。こうして、蛍光色素のＤＨＰＤＳが共有結合したカーボンナノチューブを得ることができた（図３も参照のこと）。

＜実施例２＞ ｐＨ感受性の、蛍光色素分子（ＤＨＰＤＳ）が共有結合しているカーボンナノチューブであって、その蛍光色素分子は更に電子供与性分子（亜鉛フタロシアニン）で被覆されているカーボンナノチューブの合成。
（工程４）
実施例１の工程３で得られたカーボンナノチューブを、ＴＨＦ中の０．２ｍＭ亜鉛フタロシアニンに加え、カーボンナノチューブを分散させるために超音波処理した。６０℃で少なくとも６時間インキュベートし、その後、混合物を遠沈し、エタノールで洗浄した。こうして、ナノスケールｐＨセンサー、すなわち、ｐＨ感受性の、蛍光色素分子（ＤＨＰＤＳ）が共有結合しているカーボンナノチューブであって、その蛍光色素分子は更に電子供与性分子（亜鉛フタロシアニン）で被覆されているカーボンナノチューブを得た（図１の工程４及び図３参照）。

上の工程で得られた懸濁液の一滴を、図２に示されるように電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて観察した。亜鉛フタロシアニンの吸収（被覆）の後、多層カーボンナノチューブの側壁にいくつかの明らかな層が観察され、その層は被覆前の多層カーボンナノチューブには観察されなかったものである。つまり、これは固定化された亜鉛フタロシアニン分子であろう。

＜実施例３＞ ｐＨ感受性のカーボンナノチューブ若しくはカーボンナノワイヤに及ぼす電子供与性分子（ＺｎＰｃ）の被覆の安定化効果。
実施例２で得られたナノスケールｐＨセンサーの水溶液の蛍光スペクトルを図４（横軸は励起波長を示し、縦軸は５００ｎｍにおける蛍光強度を示す）に示した。ここで、（ａ）及び（ｂ）は、各々、水洗前に取られたデータ及び水洗後に取られたデータに対応している。この図から、ＤＨＰＤＳ分子は十分な水洗の後も、カーボンナノチューブに非常に安定的に結合していることが分かるが、これはそれら（リンカー分子と蛍光色素分子）の間のエステル結合が亜鉛フタロシアニン被覆によって安定化されていることを示すものである。

実施例１で得られた、蛍光色素分子が共有結合で結合しているｐＨ感受性カーボンナノチューブ（すなわち、更に電子供与性分子（ＺｎＰｃ）で被覆しなかった「蛍光色素分子が共有結合で結合しているｐＨ感受性カーボンナノチューブ」）の水溶液の蛍光スペクトルを図５に示した。ここで、（ａ）及び（ｂ）は、各々、水洗前及び水洗後に取ったデータに対応する。この結果は、ＤＨＰＤＳがカーボンナノチューブから洗い出されたとみることができ、このことは、それらのあいだのエステル結合が容易に加水分解されたことを示している。

＜実施例４＞ 本発明のｐＨ感受性カーボンナノチューブを用いたｐＨ値の測定。
実施例２で得られたナノスケールｐＨセンサーの蛍光発光スペクトルを、以下のようにして種々の異なるｐＨの下で採った。
異なるｐＨ値をもつ１０ｍＭリン酸塩緩衝液を用いて、ナノスケールｐＨセンサーの懸濁液を調製した。そのセンサーを波長４０５ｎｍ及び４６０ｎｍのレーザ光で励起した。図６に示されるように、５００ｎｍにおいて蛍光発光のピークが記録された。
局所的なｐＨの変化が、水酸基にプロトンを付加し、あるいは水酸基からプロトンを取り去る。このことは、波長４０５ｎｍ及び４６０ｎｍのレーザ光によって励起された５００ｎｍでの蛍光発光強度の比率（Ｆ４６０／４０５）変化をもたらす。この比率は、ｐＨ値を正確に求めるために好適な指標であり、図７に示すようなｐＨ ｖｓ 比率（Ｆ４６０／４０５）の標準曲線を用い、ｐＨ値に対する比率へと変換して求める。

＜実施例５＞ ｐＨ感受性ナノニードルの作製
ｐＨ感受性ナノニードルは、電気分解法（J. Tang et al., Adv. Mater. 2003, vol.15, p.1352）によって作製した。チタンチップ（径０．２５ｍｍ）を先ず、１１％フッ酸溶液によって８Ｖで電気化学的に尖らせ、続いて１％フッ酸溶液によって化学的にエッチングし、それから、これをｐＨ感受性カーボンナノチューブ懸濁液滴中に浸漬させた。その懸濁液を微細電極に繋ぎ、ＡＣバイアス負荷（１ＭＨｚ、１０Ｖ）のもとに電気泳動を行い、チタンチップの先端にｐＨ感受性ナノチューブを付着させた。図８に、得られたｐＨ感受性ナノニードルのＳＥＭ像を示す。

産業上の利用性もしくは有用性

一つの可能な応用は、ミクロ環境、すなわち、イン・ビトロ又はイン・ビボでの細胞内や細胞膜周囲におけるプロトン濃度の測定である。図９は、本発明のｐＨ感受性ナノニードルを用いたときの、細胞膜周囲のｐＨ測定を示す模式図である。ＺｎＰｃのような良好な電子供与性を有する分子は、その疎水性のゆえに、細胞質膜、リボソーム小室及びミトコンドリアに局在する傾向にあり、そのことが、親水性材料に比べ、ｐＨ感受性ＭＷＣＮＴの細胞膜内への輸送を容易にしている。

本発明のナノスケールｐＨセンサーの合成スキーム。 本発明のナノスケールｐＨセンサーのＳＥＭ像。 実施例２で得られたナノスケールｐＨセンサーの電子移動を説明する模式図。 実施例２で得られたナノスケールｐＨセンサーの水溶液中における蛍光スペクトル。（ａ）：水洗前、（ｂ）：水洗後。横軸は励起波長を意味し、縦軸は５００ｎｍにおける発生蛍光強度を意味する。 実施例１で得られた「蛍光色素が共有結合で結合のｐＨ感受性カーボンナノチューブ」の水溶液中における蛍光スペクトル（図４と比較せよ）。（ａ）：水洗前、（ｂ）：水洗後。横軸は励起波長を意味し、縦軸は５００ｎｍにおける発生蛍光強度を意味する。 実施例２で得られたナノスケールｐＨセンサーの、異なるｐＨ緩衝液サンプル中における蛍光スペクトル。横軸は励起波長を意味し、縦軸は５００ｎｍにおける発生蛍光強度を意味する。 実施例２で得られたナノスケールｐＨセンサーのｐＨ検量曲線。λex₁：４０５ｎｍ、λex₂：４６０ｎｍ。 本発明のナノニードルとしてのナノスケールｐＨセンサーのＳＥＭ像。 本発明のｐＨ感受性ナノニードルを用いたときの、細胞膜周囲のｐＨ測定を示す模式図。

符号の説明

１１：１２−アミノドデカン酸（１２ＡＡ）のようなリンカー分子。
１２：例えば、６，８−ジヒドロキシ−１，３−ピレンジスルフォン酸二Ｎａ塩（ＤＨＰＤＳ）のような、（ＯＨ基、ＮＨ_２基又はＣＯＯＨ基をもっている）ｐＨ応答性蛍光分子。
１３：亜鉛フタロシアニンのような電子供与性分子。

Claims (8)

1. 蛍光色素分子が共有結合しているナノチューブもしくはナノワイヤ。
2. 請求項１のナノチューブもしくはナノワイヤにおいて、前記ナノチューブもしくはナノワイヤはカーボンナノチューブから選ばれたナノチューブもしくはナノワイヤ。
3. ｐＨ感受性の、蛍光色素分子が共有結合しているナノチューブもしくはナノワイヤであって、前記蛍光色素分子は更に電子供与性分子で被覆されているナノチューブもしくはナノワイヤ。
4. 請求項３のｐＨ感受性のナノチューブもしくはナノワイヤにおいて、前記電子供与性分子は亜鉛フタロシアニンから選ばれたナノチューブもしくはナノワイヤ。
5. 請求項４のｐＨ感受性のナノチューブもしくはナノワイヤにおいて、前記ナノチューブもしくはナノワイヤはカーボンナノチューブから選ばれたナノチューブもしくはナノワイヤ。
6. 請求項５のｐＨ感受性のナノチューブもしくはナノワイヤにおいて、その形状はナノニードルであるナノチューブもしくはナノワイヤ。
7. サンプル中のｐＨを、ナノメータ・スケールの空間分解能で測定する方法で、以下の工程を含む方法：
   （i）ｐＨ感受性の蛍光色素分子が共有結合で結合しているナノチューブもしくはナノワイヤであって、前記蛍光色素分子は更に電子供与性分子で被覆されているナノチューブもしくはナノワイヤを、サンプルに接触させる；
   （ii）そのｐＨ感受性ナノチューブもしくはナノワイヤを、所定の波長λex₁ を有する光及びλex₂ を有する光で順に励起する；
   （iii）励起波長に応じて生じる蛍光を、λ_measureの蛍光ピーク波長において局所的に測定する；
   （iｖ）所定の波長λex₁ 及びλex₂ での光励起によって生じる蛍光強度の比を計算する；
   （ｖ）予め作成した標準較正曲線から、サンプルのｐＨを求める；
   （ｖi）用いたナノチューブもしくはナノワイヤのｐＨ感受性領域の大きさによって、ｐＨ測定の空間分解能を求める。
8. サンプル中のｐＨを、ナノメータ・スケールの空間分解能で測定する請求項７の方法において、前記ナノチューブもしくはナノワイヤはカーボンナノチューブから選んだ方法。