JP2010195797A - 病原体によるｔ細胞共刺激経路の調節を阻害するための方法および組成物 - Google Patents

病原体によるｔ細胞共刺激経路の調節を阻害するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】病原体によるＴ細胞共刺激経路の調節を阻害するための方法および組成物の提供。
【解決手段】免疫調節ペプチドを用いた、超抗原とＣＤ２８ファミリーメンバーの二量体界面内の特異的部位との間の直接的相互作用の阻害、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなる特定のアンタゴニスト免疫調節ペプチド。該ペプチドはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含み、該ペプチドを含んでなる組成物および免疫関連疾患の処置のための方法。
【選択図】図１Ｅ

Description

本発明は病原体によるＴ細胞共刺激経路の調節を阻害するための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、超抗原とＣＤ２８ファミリーメンバーの二量体界面内の特異的部位との間の直接的相互作用を、前記二量体界面に由来するペプチドまたは前記二量体界面と特異的に結合するペプチドを用いて阻害することによる、発熱性外毒素によるＴ細胞共刺激経路、好ましくはＣＤ２８／Ｂ７経路の活性化の阻害に関する。本発明はさらに特異的アンタゴニスト免疫調節ペプチド、その組成物、および免疫関連疾患の処置のための方法も提供する。
発明の背景
本願に記載される刊行物は総て、その中に挙げられている総ての参照文献も含め、引用することによりそのまま本明細書の一部とする。
一連の発熱性外毒素は、超抗原毒素としても知られ、黄色ブドウ球菌(Staphylococu aureus)および化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)により産生される。黄色ブドウ球菌内毒素（ＳＥ）からなる外毒素は、摂取後の嘔吐および下痢によって現れる大多数のヒト食中毒症状の原因となる[Schlievert, J. Infect. Dis. 167:997 (1993)]。黄色ブドウ球菌は自然界に広く見られ、ヒトとの関連も多い。ＳＥファミリー内の５種類の主な血清学的タイプ（ＳＥＡ〜ＳＥＥおよびＳＥＧと表示）、ＳＥＢが最も優勢である[Marrack and Kappler, Science 248:705 (1990)]である。ＳＥＢはまた、外科術的または傷害的創傷感染、ならびに特に子供が攻撃されやすい、インフルエンザ患者の気道のウイルス感染を伴うことがある、非月経性毒性ショック症候群のヒト症例の主因と認識されている[Schlievert (1993)同書; Tseng et al., Infect. Immun. 63:2880 (1995)]。最も重度の形態の毒性ショック症候群はショックおよび死の原因となる[Murray et al., ASM News 61:229 (1995); Schlievert (1993)同書]。より一般には、ＳＥＡ〜ＳＥＥおよび毒性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）を含むブドウ球菌外毒素ファミリーのメンバーは毒性ショック症候群、アトピー性皮膚炎[Schlievert (1993) 同書]および川崎症候群[Bohach et al., Crit. Rev. Microbiol. 17:251 (1990)]に関連づけられている。
通常抗原の制限されている提示を迂回することにより、黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌によって産生される超抗原はほとんどの主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と直接結合し、抗原提示細胞によるプロセシングの必要なく、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のβ鎖の可変部分に特定のドメインを有する、事実上総てのＴ細胞を活性化させる[Scholl, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4210-4214(1989); Fraser, J.D. Nature 339(6221):221-3 (1989); Choi, Y. W. et al., Nature 346(6283):471-3 (1990); Janeway, C.A. Jr. et al., Immunol. Rev. 107:61-88(1989)]。この結果、毒性ショックの伝達物質であるＴヘルパー１（Ｔｈ１）サイトカインインターロイキン−２（ＩＬ２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子βの過剰な誘導が起こる[Marrack, P. and Kappler, J. Science 248:705-711 (1990a); Marrack, P. et al., J. Exp. Med. 171(2):455-64 (1990b); Miethke, T. et al., J. Exp. Med. 175(1):91-8 (1992); Hackett, S. P. and Stevens, D. L. J. Infect. Dis. 168:232-235 (1993); Arad, G. et al., Nat. Med. 6(4):414-21 (2000)]。このように超抗原は通常抗原と同じリガンドを用いるのであるが、違った様式で用いる[Sundberg, E. J. et al., Structure (Camb) 10:687-699 (2002a); Sundberg, E. J. et al., Curr. Opin. Immunol. 14:36-44 (2002b)]。発散性の超抗原によるヒトＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の誘導がこれらの毒素の致死的作用からマウスを保護する超抗原ミメティックペプチドにより阻害される[Arad (2000) 同書]。これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＴＣＲの結合部位から相当離れた超抗原の間で構造的に保存されているβ鎖ヒンジαヘリックスドメインと相同性を示す。このペプチドのアンタゴニスト活性は、それらの作用にとって決定的な新規な超抗原ドメインを同定した[Arad (2000)同書]。この発見は、超抗原が第三の受容体と結合するためにこのドメインを用いるかもしれないという可能性を浮上させた。
ＣＤ２８およびＢ７−２は通常抗原の主要な共刺激リガンドとして機能する［Lenschow, D. J. et al., Annu. Rev. Immunol. 14:233-58 (1996); Salomon, B. and Bluestone, J. A. Annu. Rev. Immunol. 19: 225-52 (2001); Acuto, O. and Michel, F. Nat. Rev. Immunol. 3(12):939-51 (2003)により概説されている］。本発明者らは、Ｔｈ１の活性化のシグナルを送達するには、超抗原がＣＤ２８と直接結合しなければならないことを示した［ＷＯ０３／０８４９９５］。シグナル伝達は各リガンドの接触領域のペプチドミメティック、すなわち超抗原のβ鎖ヒンジαヘリックスドメイン[Arad (2000)同書]およびホモ二量体形成界面を形成するＣＤ２８の２つの非連続ドメインにより遮断される。
ＣＤ２８は、遺伝子、すなわち、ＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球結合タンパク質４（ＣＴＬＡ４）（ＣＤ１５２）および誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）が強固に連鎖している共刺激リガンドのトリアッドに属す［Sharpe, A. H. and Freeman, G.J., Nat. Rev. Immunol. 2(2):116-26(2002); Carreno, B. M. and Collins, M. Annu. Rev. Immunol. 20:29-53 (2002)に概説されている］。Ｂ７ファミリー由来の、それらのコリガンドを介して、これらのタンパク質は通常抗原によるシグナル伝達を調節する共刺激受容体として機能する。ＣＤ２８はＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ４よってバランスがとられた生得的な免疫応答の重要な初期シグナルトランスデューサーとして作用する［Rudd, C. E. and Schneider H. Nat. Rev. Immunol. 3(7):544-56 (2003)に概説されている］。本発明は、そのβ鎖ヒンジαヘリックスドメインを介して、主要超抗原ブドウ球菌内毒素Ｂ（ＳＥＢ）はこの保存された受容体ファミリーの各メンバーと高い親和性で結合する。ＣＴＬＡ４[Schwartz, J. C. et al., Nature 410:604-608 (2001); Stamper, C. C. et al., Nature 410 (6828):608-11(2001)]または配列アラインメントにより推定されるようなＣＤ２８およびＩＣＯＳの二連二量体界面のいずれかの辺縁に由来するペプチドは、各共刺激受容体に独特ではあるが、ヒトＴｈ１サイトカイン遺伝子発現の超抗原により媒介される誘導を遮断し、ＳＥＢによる致死的投与からマウスを保護する強力なアンタゴニストである。これらのペプチドの作用様式は超抗原において、その結合部位をめぐってＣＤ２８と競合する。ＳＥＢはＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン遺伝子の活発な発現を誘導するが、Ｔｈ１応答の誘導だけがＣＤ２８のシグナル伝達に依存する。
ＣＤ２８に対する直接的結合が超抗原の毒性の基礎にある。本発明の発見は、超抗原がその絶対的受容体としての使用のための宿主の共刺激リガンドを取り込む生得的な免疫応答の破壊機構を明らかにする。この戦略は病原体によってもっと広く用いられる可能性がある。
従って、本発明の目的は、それを必要とする被験体において、病原体によるＴ細胞共刺激経路、好ましくはＣＤ２８／Ｂ７経路の活性化を阻害する方法を提供することである。このような方法は、前記病原体に由来する成分と、Ｔ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、前記Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する部位の直接的相互作用を阻害する物質の使用を基にしている。
本発明のもう１つの目的は、前記病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー、好ましくはＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの二量体界面内の結合部位の直接的相互作用を阻害する物質、好ましくはペプチドを提供することである。このようなペプチドが本発明により提供され、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなるペプチド、例えば配列番号９、１１、１２、１４、１５、１６、１７、５７および５８のペプチド、ならびにＴ細胞共刺激経路メンバー、例えば配列番号６、７、８および２５〜５６のペプチドの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列含んでなるペプチドを含む。
本発明のもう１つの目的は、病原体、特に超抗原外毒素により引き起こされる免疫関連疾患の処置の組成物および方法を提供することである。
本発明のこれら、およびその他の目的は説明が進めば明らかとなる。
第１の態様において、本発明は、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなるか、またはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる単離および精製されたペプチドに関する。
１つの実施形態によれば、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７Ｔ細胞共刺激経路、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路のいずれかであり得る。好ましくは、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７経路であり得、最も好ましくは、このＣＤ２８／Ｂ７経路メンバーはＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれかであり得る。
特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはＴ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドである。
１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドはＴ細胞共刺激経路メンバー、好ましくはＣＤ２８／Ｂ７ファミリーメンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなり得る。
より具体的には、本発明のペプチドは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳならびにＰＤ−１中の対応するドメインのいずれかの二量体界面の総てまたは一部に由来するアミノ酸配列を含んでなる。
１つの好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、ＣＤ２８内分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなり、その二量体界面は配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５および１１６〜１２１を含んでなる。より好ましくは、本発明のペプチドは配列番号９で示されるアミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰおよび配列番号１２で示されるアミノ酸配列ＳＰＭＬＶＡＹＤまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体に由来するアミノ酸配列を含んでなる。
本発明の特に好ましいペプチドはｐ１ＴＡと呼ばれ、配列番号９で示されるアミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
本発明のもう１つの特に好ましいペプチドはｐ２ＴＡと呼ばれ、配列番号１２で示されるアミノ酸配列ＳＰＭＬＶＡＹＤまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
あるいは、本発明のペプチドはＣＴＬＡ４分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなり、その二量体界面は配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなってよい。
より具体的には、このようなペプチドは配列番号１４で示されるアミノ酸配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰおよび配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＰＡＶＶＬＡＳＳ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなる。
よって、１つの特定の好ましいペプチドはｐ１ＴＢと呼ばれ、配列番号１４で示されるアミノ酸配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの好ましい特定のペプチドはｐ２ＴＢと呼ばれ、配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＰＡＶＶＬＡＳＳまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
さらにもう１つの選択肢では、本発明のペプチドはＩＣＯＳ分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなってよく、その二量体界面は配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４総てまたは一部を含んでなる。
より具体的には、本発明のペプチドは、配列番号１６で示されるアミノ酸配列ＹＥＳＱＬＣＣＱＬおよび配列番号１７で示されるアミノ酸配列ＧＥＩＮＧＳＡＮ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなってよい。
１つの特定の例はｐ１ＴＣと呼ばれるペプチドであり、配列番号１６で示されるアミノ酸配列ＹＥＳＱＬＣＣＱＬまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの特定の例はｐ２ＴＣと呼ばれるペプチドであり、配列番号１７で示されるアミノ酸配列ＧＥＩＮＧＳＡＮまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１配列のアミノ酸残基８〜１３および１１０〜１１６を含んでなる、ＣＴＬＡ４の二量体界面に相当するＰＤ−１分子中のドメインに由来するアミノ酸配列を含んでなる[Zhang, X. et al., Immunity 20:337-347 (2004)]。
より具体的には、本発明のペプチドはアミノ酸配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶ（配列番号５７で示される）、ＰＡＬＬＶＶＴＥ（配列番号５８で示される）およびそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなってよい。
本発明の特定の好ましいペプチドはとｐ１ＴＤ呼ばれ、配列番号５７で示されるアミノ酸配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
本発明のもう１つの特に好ましいペプチドはｐ２ＴＤと呼ばれ、配列番号５８で示されるアミノ酸配列ＰＡＬＬＶＶＴＥまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１のいずれかの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態によれば、本発明のペプチドは、配列番号６、７および８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含んでなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはｐｅ１２と呼ばれ、配列番号６で示されるアミノ酸配列ＳＨＦＴＨＮＲＨＧＨＳＴまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの特定のペプチドはｐｄ７と呼ばれる。このペプチドは、配列番号７で示されるアミノ酸配列ＷＨＡＨＰＨＫＫＰＶＶＡまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
さらにもう１つの例では、本発明のペプチドはｐｃ３と呼ばれ、配列番号８で示されるアミノ酸配列ＦＨＫＨＫＮＰＧＳＰＩＩまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
第二の態様によれば、本発明は、有効成分として本発明で定義されたような精製ペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、Ｔ細胞共刺激経路の調節のための組成物に関する。
本発明はさらに、それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための医薬組成物であって、有効成分として本発明のいずれかのペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態によれば、本発明は、発熱性外毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化を阻害するための組成物であって、毒性ショックから防御し、所望により発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起する組成物を提供する。本発明のこの組成物は、有効成分として本発明のいずれかの精製免疫調節ペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる。
１つの特に好ましい実施形態では、このような組成物は有効成分としてｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）からなる群から選択されるペプチドおよびそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなってよい。
第三の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてＴ細胞共刺激経路を調節するための方法であって、前記被験体にＴ細胞共刺激経路を調節し得る有効量の免疫調節ペプチドを投与する工程を含み、そのペプチドが、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなるか、またはＴ細胞共刺激経路メンバーもしくはそれを含んでなる組成物の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる方法に関する。
本発明はさらに、それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための方法であって、前記被験体に本発明により定義されたような有効量の免疫調節ペプチドを投与する工程を含む方法を提供する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明により定義されたいずれのペプチド、またはそのいずれかの組合せ、機能的断片、誘導体、コンジュゲートおよび組成物もこのような方法のために使用できる。
より具体的には、本発明の方法はｐ１２Ａ（配列番号１で示される）、ｐ１２Ｂ（ｐ１４Ａとも呼ばれる、配列番号３で示される）、ｐＴＡ（配列番号１１で示される）、ｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）からなる群から選択され得るペプチドおよびそのいずれかの組合せ、機能的断片誘導体および組成物を使用できる。
なおさらに、本発明はそれを必要とする被験体においてＴ細胞共刺激経路を調節するための本発明の免疫調節ペプチドの使用を提供する。
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための医薬組成物の製造のための本発明の免疫調節ペプチドの使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする被験体において病原体によるＴ細胞共刺激経路の活性化または調節を阻害するための方法に関する。本発明の本方法は、被験体に、前記病原体に由来する成分と、Ｔ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、前記Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する部位との直接的相互作用を阻害する阻害上有効な量の物質を投与する工程を含む。
１つの好ましい実施形態では、前記病原体に由来する成分、好ましくは超抗原と、Ｔ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位との間の直接的相互作用を阻害するために本発明の方法により用いられる物質は、本発明で定義されたようなペプチドであってよい。
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする被験体において病原体により引き起こされるＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する病理的疾患を処置するための方法に関する。このような方法は、被験体に、前記病原体に由来する成分と、Ｔ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、前記Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する部位との直接的相互作用を阻害する阻害上有効な量の物質、好ましくは本発明のいずれかのペプチドを投与する工程を含む。
なおさらに、本発明は、Ｔ細胞共刺激経路メンバーと特異的に結合し、かつ、発熱性外毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に拮抗することができ、所望により発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を惹起することができる試験物質をスクリーニングする方法であって、ａ．Ｔ細胞共刺激経路メンバーと結合する候補アンタゴニスト物質を得る工程；ｂ．工程（ａ）で得られた物質から、そのＴ細胞共刺激経路メンバーと超抗原との間の直接的相互作用を阻害する物質を選択する工程；およびｃ．超抗原により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に対する、工程（ｂ）で得られた物質の拮抗作用を判定する工程を含む方法に関する。
本発明を後記の図面を参照しながらさらに説明するが、これらは単に例であって、添付の特許請求項の範囲により定義されている本発明の範囲を限定するものではない。
発明の具体的説明
ＣＤ２８は通常抗原の共刺激リガンドとして働くことが知られている。本研究では、発明者らは、Ｔｈ１の活性化のシグナルを送達するために、超抗原がＣＤ２８と結合しなければならない。よって、以下の実施例によって示されるように、ＣＤ２８はＭＨＣクラスＩＩ分子とＴＣＲに加えて、第三の超抗原受容体として働く。
図６Ａは、ＣＤ２８中の超抗原に対する結合部位がＣＴＬＡ４とのアラインメントから推定される二連の二量体界面であることを示す。ＣＤ２８と結びつく超抗原ドメインはＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴＣＲ双方に対する結合部位から離れており、ＣＤ２８ファミリー分子との相互作用を受けやすくなっている（図１Ｅ）。このドメインは、細菌超抗原間で保存されているβ鎖ヒンジαヘリックスモチーフの少なくとも一部を含む[Arad (2000)同書]。
本発明者らによって示されたように、ＳＥＢはＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン遺伝子の活発な同時発現を誘導するが、Ｔｈ１応答の誘導のみがＣＤ２８シグナル伝達に依存する。従って、超抗原が、それが直接結合するそれらの絶対的受容体として用いるための宿主の共刺激リガンドを取り込むものと思われる。この戦略は病原体では、より広く用いられている可能性がある。Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体は微生物成分を認識し、それにより、生得的な免疫応答を活性化させる[Akira, S. et al. Nat. Immunol. 2:675-680 (2001); Janeway, C. A. Jr. and Medzhitov, R. Annu. Rev. Immunol. 20:197-216 (2002)により概説]。本研究では、本発明者らは、ＣＤ２８は共刺激リガンドとして働くだけでなく、細菌超抗原のセンサーとしても働くことを示す。
本発明は、超抗原とＣＤ２８の直接的結合が存在するという概念を支持するために独立した一連の証拠を提供する。ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）平衡結合分析は、ＣＤ２８がＳＥＢに、２８ｎＭの親和性で直接結合することを示した（図４Ａ）。可溶性ＣＤ２８はＳＥＢによるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの誘導を遮断した（図２Ｄ）。ＳＥＢのβ鎖ヒンジαヘリックス「アンタゴニストドメイン」と相同な超抗原ミメティックペプチドｐ１２Ｂ、およびＣＤ２８の推定ホモ二量体形成界面を形成する２つの非連続配列に相当するＣＤ２８ミメティックペプチドｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡ（それぞれ配列番号９および１２）は各々、 ヒトＰＢＭＣにおいて、超抗原により媒介されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を遮断し（図１Ｄ、６Ｇおよび６Ｈ）、ＳＥＢによる致死的抗原刺激からマウスを保護した（図７Ｂおよび７Ｃ）。
in vivoで有効なＳＥＢの新規なペプチドアンタゴニストは、ランダムファージディスプレーライブラリーから、単にＣＤ２８中の超抗原結合部位に対するそれらの親和性によって選択されたものである（図５）。さらに、ｐ１２Ｂは単独で、またはαＣＤ３との組合せで、αＣＤ２８によるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの誘導を遮断した（図３Ｂおよび３Ｃ）。従って、このペプチドは超抗原の不在下でＣＤ２８により媒介されるＴｈ１の活性化を遮断し、このことはそれがＣＤ２８と結合することを示唆する。実際、ＳＰＲの速度論では、ＣＤ２８はＳＥＢと同等の親和性でｐ１２ペプチドと結合した（図４Ｄ）。従って、ＳＥＢはＣＤ２８との結合のためにそのアンタゴニストドメインを用いる。
従って、第１の態様において、本発明は、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなる単離および精製されたペプチドに関する。あるいは、前記ペプチドは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる。
１つの実施形態によれば、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７Ｔ細胞共刺激経路、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路のいずれかであり得る。
好ましい実施形態では、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７経路であり得る。よって、このＣＤ２８／Ｂ７経路メンバーはＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれかであり得る。
特に好ましい一実施形態によれば、この経路メンバーはＣＤ２８分子であってよく、ＣＤ２８内の二量体界面は配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる。
もう１つの好ましい実施形態によれば、この経路メンバーはＣＴＬＡ−４分子であってよく、ＣＴＬＡ−４の二量体界面は配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる。
さらにもう１つの実施形態では、この経路メンバーはＩＣＯＳ分子であってよく、ＩＣＯＳ内の二量体界面は配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を含んでなる。
なおさらに、この経路メンバーはＰＤ−１分子であってよい。ＰＤ−１は単量体として知られているが、ＣＴＬＡ４の二量体界面と重複するＰＤ−１中のこれらのドメインも同様に折りたたまれている。
本明細書に記載のように、本発明のペプチドはＴ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドである。
１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドはＴ細胞共刺激経路メンバー、好ましくはＣＤ２８／Ｂ７ファミリーメンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなってよい。
より具体的には、本発明のペプチドは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１の二量体界面の総てまたは一部に由来するアミノ酸配列を含んでなる。
ＣＤ２８の構造はまだ解明されていないが、おそらくＣＴＬＡ４の構造と類似している（図６Ａ）[Schwartz (2001) 同書；Luhder (2003)同書]。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４は全体的な配列相同性を示し、それらのＢ７結合ドメインが同じであるが、おそらくはヘテロ二量体の形成を避けるために、ＣＴＬＡ４中の二量体界面を作り出す２つの配列が全く異なっいる[Schwartz (2001) 同書；Collins (2002)同書]。折りたたまれたＣＴＬＡ４タンパク質では、これらの離れた配列は並置されている（図６Ａ）。注目すべきは、実施例で示されるように、この対応するＣＤ２８ミメティックペプチドｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡは、ＳＥＢとほぼ等モル比で存在する場合、in vivoで防護効果があった。これらの結果は、本発明者らがＣＤ２８中の正確な超抗原結合部位を突き止め、この部位がｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡに見られる配列（それぞれ配列番号９および１２）から形成されるコンポジットであるという有力な証拠となる。単にそのＣＴＬＡ４とのアラインメントにのみ基づいてＣＤ２８に関して推定された二量体界面の各辺縁に由来するペプチドは、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１と同様に広く異なる超抗原の作用を遮断したが、このことは両者が受容体としてＣＤ２８を用いていることを示す。
ＣＤ２８は共刺激リガンドのトリアッド：ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳに属す。これらのタンパク質は最大３３％の同一性を示し、強固にクラスターを形成した遺伝子によりコードされている[Carreno and Collins (2002) 同書]。本発明者らは、ＳＥＢはそれらの各々と、同様の親和性で直接結合することを示した（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）。結合は各共刺激受容体の二量体界面において起こり、独特なものである。ＣＴＬＡ４における二連の二量体界面の各辺縁に由来する、またはアラインメントによりＩＣＯＳに関して推定されたペプチド（図６１）は、ＣＤ２８ミメティックペプチドｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡ同様、毒素に対して極めて低分子比率でＳＥＢによる致死的抗原刺激からマウスを保護する強力な超抗原アンタゴニストである（図７）。ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳは各々このドメインと実質的な親和性で直接結合する（図４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆ）ことから、明らかに、これらのアンタゴニストの作用様式は、アンタゴニストドメイン、すなわち、超抗原中のその結合部位をめぐってＣＤ２８と競合することである。
ＣＴＬＡ４の二連の二量体界面のアミノ酸配列、ならびにＣＤ２８[Schwartz (2001)同書]およびＩＣＯＳ（本研究）に関して推定されたものはヘテロ二量体の形成をおそらくは避けるために相同性を欠いている。本発明の機能分析は、各々超抗原との結合のためにこの界面を用いることを示す。明らかに、配列には違いがあるが、この３つの二量体界面は同様に折りたたまされている。超抗原のアンタゴニストドメインも同様に、配列が異なっているにもかかわらず、空間的な保存を示す。[Arad (2000) 同書]。従って、両セットのリガンド、受容体トリアッドおよび超抗原とも、構造的な特徴がこの接触面を作り出している。
共刺激受容体ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）の構造は解明されており、ＣＴＬＡ４の構造と重ね合わせることができ、それらのアミノ酸配列のアラインメントが可能である[Zhang (2004) 同書]。ＣＴＬＡ４の二量体界面に関連する配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰ（ｐ１ＴＢ、配列番号１４）およびＰＡＶＶＬＡＳＳ（ｐ２ＴＢ、配列番号１５）が、それぞれＰＤ−１配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶ（ｐ１ＴＤ、配列番号５７）およびＰＡＬＬＶＶＴＥ（ｐ２ＴＤ、配列番号５８）とともにアラインされている。ＰＤ−１は単量体であるが、ｐ１ＴＤおよびｐ２ＴＤと重複するＰＤ−１中のドメインは、ｐ１ＴＢおよびｐ２ＴＢと重複するＣＴＬＡ４中のドメインと同様に折りたたまされている[Zhang (2004) 同書]。従って、ＰＤ−１中のこれらの２つの非連続ドメインに由来するペプチドｐ１ＴＤおよびｐ２ＴＤは、超抗原中のＣＤ２８のための結合部位に関する潜在的競合因子であり、これは超抗原作用の阻害をもたらす。
特に好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１２で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列の残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなるＣＤ２８分子内の二量体界面に由来する。図６Ａで示され、配列番号１９で表されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列は ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１０７４７のヒトＣＤ２８配列の細胞外部分のみに相当することに着目すべきである。図６Ａで示されるように、推定ＣＤ２８二量体界面は、配列的にではなく位置的にＣＴＬＡ−４二量体界面に相当する（ＣＴＬＡ−４の１０〜１５番と１１５〜１２０番）。さらに、図６Ａで示されるヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ１７０６６のヒトＣＴＬＡ−４配列の細胞外部分のみに相当することにも着目すべきである。好ましくは、本発明のペプチドはＣＤ２８二量体界面および付加的なフランキング残基、すなわち、ＣＤ２８のアミノ酸残基８〜１５と１１６〜１２４を含んでなる。
本発明の特定の好ましいペプチドｐ１ＴＡと呼ばれ、配列番号９で示されるアミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
本発明のもう１つの特に好ましいペプチドはｐ２ＴＡと呼ばれ、配列番号１２で示されるアミノ酸配列ＳＰＭＬＶＡＹＤまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
あるいは、本発明のペプチドは、ＣＴＬＡ−４分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなってよく、その二量体界面は配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる。
より具体的には、このようなペプチドは配列番号１４で示されるアミノ酸配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰ、配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＰＡＶＶＬＡＳＳ、ならびにそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなる。
従って、１つの特定の好ましいペプチドはｐ１ＴＢと呼ばれ、配列番号１４で示されるアミノ酸配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの好ましい特定のペプチドはｐ２ＴＢと呼ばれ、配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＰＡＶＶＬＡＳＳまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
さらにもう１つの選択肢では、本発明のペプチドは、ＩＣＯＳ分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなってよく、その二量体界面は配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を 含んでなる。
より具体的には、本発明のペプチドは、配列番号１６で示されるアミノ酸配列ＹＥＳＱＬＣＣＱＬ、配列番号１７で示されるアミノ酸配列ＧＥＩＮＧＳＡＮ、ならびにそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなってよい。
１つの特定の例としてのペプチドはｐ１ＴＣと呼ばれ、配列番号１６で示されるアミノ酸配列ＹＥＳＱＬＣＣＱＬまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの特定の例はｐ２ＴＣと呼ばれるペプチドであり、配列番号１７で示されるアミノ酸配列ＧＥＩＮＧＳＡＮまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１配列のアミノ酸残基８〜１３および１１０〜１１６[Zhang (2000)同書]を含んでなる、ＣＴＬＡ４の二量体界面に相当するＰＤ−１分子中のドメインに由来するアミノ酸配列を含んでなる。
より具体的には、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶ（配列番号５７で示される）、ＰＡＬＬＶＶＴＥ（配列番号５８で示される）およびそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなってよい。
本発明の特定の好ましいペプチドはとｐ１ＴＤ呼ばれ、配列番号５７で示されるアミノ酸配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
本発明のもう１つの特に好ましいペプチドはｐ２ＴＤと呼ばれ、配列番号５８で示されるアミノ酸配列ＰＡＬＬＶＶＴＥまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
ＣＤ２８ファミリー分子のいずれの二量体界面に由来するペプチドも、二量体界面辺縁のいずれのアミノ酸配列の総てまたは一部を含んでなってもよいことに着目すべきである。従って、本発明のいずれのペプチドとＣＤ２８分子内の、対応する二量体界面との間の相同性または類似性も１０％〜１００％の相同性、好ましくは２０％〜９０％の相同性、最も好ましくは３０％〜８０％の相同性の範囲であり得る。
もう１つの特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１のいずれかの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる。
１つの好ましい実施形態では、このようなペプチドは、ＣＤ２８分子の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合することができ、その二量体界面は配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる。
あるいは、本発明のペプチドは、ＣＴＬＡ−４分子の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合することができ、その二量体界面は配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる。
さらにもう１つの選択肢では、本発明のペプチドは、ＩＣＯＳ分子の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合し、その二量体界面は配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を含んでなる。
本発明のペプチドは、配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６の総てまたは一部を含んでなり、ＣＴＬＡ４の二量体界面と同様に折りたたまれているＰＤ−１分子内の配列と結合し得るということをさらに認識すべきである。
ＳＥＢのドメイン番号に基づき、β鎖７内で始まる中央ターンを形成し、このβ鎖７を短いβ鎖８を介してαヘリックス４と接続し、αヘリックス４内で終わる発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインに由来するペプチド、例えばｐ１２Ａおよびｐ１２Ｂ（それぞれ配列番号１および３）はＣＤ２８ファミリー分子の二量体界面に特異的に結合するが、このようなペプチドは本願の範囲外である。しかしながら、これらのペプチドは以下に記載するように、本発明の方法のいくつかに用いることができる。
従って、好ましい実施形態によれば、 本発明は、ＣＤ２８ファミリーであるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＩＣＯＳの３つ総てのメンバーの二量体界面、ならびにＰＤ−１と結合するペプチドに関するが、ただし、このペプチドは、ＳＥＢのドメイン番号に基づき、β鎖７内で始まる中央ターンを形成し、このβ鎖７を短いβ鎖８を介してαヘリックス４と接続し、αヘリックス４内で終わる発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインに由来するものではない[Arad (2000)同書]。
実施例８および図５Ａに記載されているように、本発明者らは、ＣＤ２８の二量体界面を含んでなり、結合したファージをＳＥＢと置き換える、固定化ＣＤ２８上でファージディスプレーライブラリーのスクリーニングを行った。このスクリーニングでは、種々のペプチドが単離され、それらのアンタゴニスト活性に関してさらに分析した。従って、本発明のペプチドは配列番号６、７および８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含んでなる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはｐｅ１２と呼ばれ、配列番号で示されるアミノ酸配列ＳＨＦＴＨＮＲＨＧＨＳＴまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
もう１つの特定のペプチドはｐｄ７と呼ばれる。このペプチドは配列番号７で示されるアミノ酸配列ＷＨＡＨＰＨＫＫＰＶＶＡまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
さらにもう１つの例では、本発明のペプチドはｐｃ３と呼ばれ、配列番号８で示されるアミノ酸配列ＦＨＫＨＫＮＰＧＳＰＩＩまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する。
好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはいずれも、Ｔ細胞共刺激経路メンバー、好ましくはＣＤ２８分子と発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害することができる。従って、これらのペプチドは毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストとして働き、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護する。
本明細書において誘導体および機能的誘導体とは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーと病原体の成分、好ましくは外毒素との間の相互作用を阻害するするか、その外毒素により引き起こされる毒性ショックに対して防御免疫を惹起し、かつ／または毒素により媒介されるＴ細胞の活性化と拮抗する能力、またはＣＤ２８と超抗原との間の相互作用を阻害す能力、またはＴ細胞共刺激経路、好ましくはＣＤ２８／Ｂ７経路を調節する能力を妨げない、そのペプチドに対する挿入、欠失、置換および修飾を伴う配列番号６、７、８、９、１２、１４、１５、１６、１７および２５〜５８のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるペプチドを意味する（以下、「誘導体」と呼ぶ）。誘導体は前記超抗原と最小、例えば３０％未満といった相同性を維持していなければならない。
本明細書において「挿入」とは、本発明のペプチドに対する１〜５０アミノ酸残基の間、好ましくは２０〜１アミノ酸残基の間、最も好ましくは１〜１０アミノ酸残基の間の深を意味するものと理解すべきである。
本発明はまた本発明のペプチドのアミノ酸配列の総てまたは一部を含んでなるか、または本発明のペプチドのいずれかの基本ペプチド配列が約２〜約１００回繰り返されているより長いペプチドも含むと理解される。
直鎖ペプチド構造がないと、小数の潜在的コンホメーションだけしか活性でないので、ヒト血清中でプロテアーゼに攻撃されやすくなり、標的部位に対するそれらの親和性を引き下げる働きをする。よって、例えば本発明の種々のペプチドの異なる誘導体を作出することでアンタゴニストペプチド構造を至適化することが望ましい。
ペプチド構造を改良するためには、以下でさらに詳しく記載するが、本発明のペプチドをそれらのＮ末端からラウリル−システイン（ＬＣ）残基にわたって、および／またはそれらのＣ末端からシステイン（Ｃ）残基、もしくはそのペプチドを免疫用のアジュバントと結合するのに好適な他の残基にわたって結合させることができる。
本発明のペプチドならびにその誘導体は総て、正電荷を有しても、負電荷を有しても、あるいは中性であってもよい。さらにまた、それらは二量体、多量体の形態、または拘束のあるコンホメーションの形態であってもよく、これらは内部架橋、短い範囲の環化、延長またはその他の化学修飾によって得ることができる。
さらに、本発明のペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において種々の同一または異なるアミノ酸残基で延長してもよい。このような延長の一例として、ペプチドをそのＮ末端および／またはＣ末端において、天然に存在するアミノ酸残基であっても合成アミノ酸残基であってもよい同一または異なる疎水性アミノ酸残基で延長してもよい。好ましい合成アミノ酸残基はＤ−アラニンである。
このような延長のさらなる例は、そのＮ末端および／またはＣ末端の双方にシステイン残基を延長したペプチドにより示される。本来、このような延長は、ジスルフィド結合の形成によって起こるＣｙｓ−Ｃｙｓ環化によるコンホメーションの拘束をもたらし得る。
もう１つの例としては、Ｎ末端リシル−パルミトイルテールの組み込みが挙げられ、リシンがリンカーとして働き、パルミチン酸が疎水性アンカーとして働く。
さらにまた、これらのペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基であっても合成アミノ酸残基であってもよい芳香族アミノ酸残基により延長してもよい。好ましい芳香族アミノ酸残基はトリプトファンである。あるいは、これらのペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において、天然に存在する発熱性外毒素のアミノ酸配列の対応する位置に存在するアミノ酸で延長することもできる。
しかしながらやはり、本発明によれば、本発明のペプチドはそのＮ末端および／またはＣ末端において、天然に存在するアミノ酸残基でも合成アミノ酸残基でもない種々の同一または異なる有機部分で延長してもよい。このような延長の一例として、ペプチドをそのＮ末端および／またはＣ末端においてＮ−アセチル基で延長してもよい。
本発明によって用いられる、または本明細書で開示される総ての単一ペプチド配列に関して、本発明はそのペプチド鎖の配向が逆転し、総てのアミノ酸がＤ型に属す、対応する逆転配列を含む。
本発明はまた、配列番号６、７、８、９、１２、１４、１５、１６、１７、２５〜５６、５７および５８で示されるアミノ酸配列の一部または総てを含んでなる基本エピトープ配列、またはこれらのペプチドのいずれかの基本ペプチド配列が約２〜約１００回繰り返されている、より長いペプチドも包含するものと認識すべきである。
第二の態様によれば、本発明は、有効成分として本発明で定義された精製ペプチドまたはまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、Ｔ細胞共刺激経路を調節するための組成物に関する。
本発明はさらに、それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための医薬組成物であって、有効成分として本発明のペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる組成物を提供する。
本発明の組成物はまた、さらなる有効剤、例えばプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。
より具体的には、Ｔｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫関連疾患に関連する免疫疾患は例えば、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、狼瘡、グレーブス病および甲状腺炎）、悪性および非悪性増殖性疾患、移植片拒絶症および移植片対宿主病、ならびに発熱性外毒素、または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物に誘導される障害（毒性ショック、無能化および死、敗血性ショックおよび重度敗血症など）が挙げられる。
好ましい実施形態によれば、本発明は、発熱性外毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化を阻害するための組成物を提供する。該組成物は発熱性外毒素、または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導され得る毒性ショックから保護する。本発明の組成物は有効成分として本発明の精製免疫調節ペプチドのいずれか、またはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を、外毒素に誘導される、ＩＬ２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子によりコードされているＲＮＡの発現を阻害するのに有効な量で含んでなり、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる。
１つの特に好ましい実施形態では、このような組成物は有効成分としてｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）からなる群から選択されるペプチドおよびそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなってよい。
なおさらに、本発明は超抗原とＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１のいずれかにおける超抗原結合部位との間の直接的相互作用を阻害するための組成物に関する。この組成物は有効成分として単離および精製されたペプチドを、その相互作用を阻害するのに有効な量で含んでなる。
本発明の医薬組成物は適切な医療に従って投与および投薬することができる。投与は静脈、筋肉または皮下注射をはじめとする種々の方法で行うことができる。しかしながら、経口、直腸および鼻腔内投与などのその他の投与方法も可能である。
本発明の組成物は遊離形態で有効物質を含んでなってよく、処置する被験体にそのまま投与することができる。あるいは、有効分子の大きさにもよるが、投与前に担体と結合させるのが望ましい場合もある。治療用処方物は通常のいずれの投与処方物で投与してもよい。処方物は典型的には、上記で定義したような少なくとも一種の有効成分をその一種以上の許容される担体とともに含んでなる。
各担体は他の成分と適合可能であり、かつ、患者に害がないという点で医薬および生理学の両面で許容されなければならない。処方物は経口、直腸、鼻腔、または非経口（皮下、筋肉内、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）および皮内を含む）投与に好適なものを含む。これらの処方物は通常、単位投与形で提供することができ、製薬分野で周知のいずれの方法によって製造してもよい。被験体において所望の作用をもたらすのに必要な有効量を含むこのような総ての化合物の性質、アベイラビリティー、および供給源および投与は当技術分野で周知であり、ここでさらに述べる必要はない。
注射用に好適な医薬型としては、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調合用の無菌粉末が挙げられる。いずれの場合でも、形態は無菌でなければならず、シリンジでの取り扱いが簡単な程度の流動性がなければならない。これは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入から守られなければならない。
このような微生物作用の回避は種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物として用いることで注射組成物の長期吸収が得られる。
好適な注射溶液は、必要な量の有効化合物を、必要であれば、上記で列挙された種々の他の成分とともに好適な溶媒中に配合し、その後、濾過除菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の無菌有効成分を、基本分散媒と上記に列挙されたもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに配合することによって調製される。
無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め濾過除菌したその溶液から、有効成分と任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。
本発明の医薬組成物は一般に、緩衝剤、その浸透圧を調整する薬剤、および所望により当技術分野で公知の１以上の医薬上許容される担体、賦形剤および／または添加剤を福でなる。また、これらの本発明には補助的有効成分を配合することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えばレシチンなどの被覆材の使用、分散系の場合に必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により適切な流動性を維持することができる。
本明細書において「医薬上許容される担体」とは、溶媒、分散媒、被覆材、抗菌剤および抗真菌剤などのいずれか、および総てを含む。医薬上活性な物質のためのこのような媒体の使用は当技術分野で周知である。通常の媒体または薬剤が有効成分に不適合性ある場合を除き、治療組成物での使用が考えられる。
医薬組成物の製造は当技術分野で周知であり、多くの文献およびテキストに記載されている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990、特にその中の1521〜1712頁参照。
自己および非自己を識別する能力はおそらく最も基本的に重要な免疫調節の態様である。この特性は免疫認識および感染性の侵入者破壊に翻訳されるが、正常な宿主組織は触れられないままである。この選択性の高い応答は１０年来記載されてきた、複雑な一連のＴ細胞調節機構を特徴とする。
免疫応答の適合性を維持するようデザインされたこのような機構の１つは抗原特異的Ｔ細胞の効率的な活性化に２つの異なるシグナル、すなわち、Ｔ細胞受容体を介する抗原特異的シグナル（シグナル１）および可溶性因子または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の細胞表面分子により提供される非同族共刺激シグナル（シグナル２）を必要とする。これらの２つのシグナルの組み込みは細胞分裂ならびに免疫応答のエフェクターおよびレギュレーターの分化を誘発する。共刺激の重要な生物学的意味合いはさておき、共刺激遮断の効果は、その抗原特異的受容体がすでに結びついているＴ細胞、すなわち、すでにシグナル１を受容しているＴ細胞だけに限定されることから、共刺激シグナルの同定は臨床的介入上重要な意味合いを有する。よって、基本的に、Ｔ細胞共刺激を遮断すれば、関与する特定の抗原に関する実際の知識がなくとも、抗原特定期免疫応答ターゲッティング様式が得られる。実際、いくつかの場合では、共刺激経路アンタゴニストは自己免疫疾患および臓器移植片拒絶の進行を防ぐ抗原特異的耐性を誘導することができる。
よって、第三の態様では、本発明は、それを必要とする被験体においてＴ細胞共刺激経路を調節するための方法に関する。該方法は、被験体にＴ細胞共刺激経路を調節し得る有効量の免疫調節ペプチドを投与する工程を含み、このペプチドはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなる。あるいは、該ペプチドは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの、またはそれを含んでなる組成物の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる。
Ｔ細胞活性化におけるＣＤ２８／Ｂ７共刺激の決定的な重要性は自己免疫疾患の試験モデルにおいて共刺激の役割を調べる複数の研究につながった。初期の研究では、免疫時のＣＤ２８／Ｂ７共刺激の破壊は常にこの病態の重篤度の軽減と、いくつかの場合では疾病の完全な予防と関連していることが示された。例えば、多発性硬化症、心筋炎、関節炎、甲状腺炎および重症性筋無力症のマウスモデルにおいて、ＣＴＬＡ−４Ｉｇによる、またはいくつかの場合では抗Ｂ７ｍＡｂによるＣＤ２８／Ｂ７の遮断は疾病の重篤度を軽減した。
よって本発明はさらに、それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置する方法を提供する。該方法は、被験体にＴ細胞共刺激経路を調節し得る有効量の免疫調節ペプチド、またはそれを含んでなる組成物組成物を投与する工程を含み、このペプチドはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなる。あるいは、該ペプチドは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの、またはそれを含んでなる組成物の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる。
本明細書の目的で治療上「有効な量」とは、当技術分野で公知のような考慮により決定されるものである。この量は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１分子などのＴ細胞共刺激経路メンバーと、発熱性外毒素などの病原体の成分との間の直接的相互作用を阻害して、毒素により媒介されるＴ細胞の活性化と拮抗するのに十分なものでなければならない。
１つの実施形態によれば、本発明は、Ｔｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための方法に関する。該疾病の例は自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、狼瘡、グレーブス病および甲状腺炎）、悪性および非悪性増殖性疾患、移植片拒絶症および移植片対宿主病である。
本発明を記載するために本明細書に用いる「悪性増殖性疾患」、「癌」、「腫瘍」および「悪性腫瘍」とは総て等しく組織または器官の過形成に関するものである。この組織がリンパ系または免疫系の一部であれば、悪性細胞は循環細胞の非固形腫瘍を含み得る。他の組織または器官の悪性腫瘍は固形腫瘍を形成し得る。一般に、本発明の組成物ならびに方法は非固形腫瘍および固形腫瘍、例えば癌腫、黒色腫、白血病およびリンパ腫の処置に用い得る。
よって、好ましい実施形態によれば、本発明の免疫調節ペプチドまたはそれを含んでなる組成物は非固形癌、例えば、造血系悪性疾患（例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肥満細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および多発性骨髄腫などのあらゆる種類の白血病）の治療または抑制、ならびに唇および口腔、咽頭、喉頭、副鼻腔、主唾液腺、甲状腺、食道、胃、小腸、結腸、直腸結腸、肛門管、肝臓、胆嚢、肝外胆管、ファーター乳頭部、外分泌膵臓、肺、胸膜中皮腫、骨、軟組織肉腫、皮膚の癌腫および悪性黒色腫、乳房、外陰部、膣、子宮頚、卵巣、卵管、妊娠期栄養膜腫瘍、陰茎、前立腺、精巣、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、尿道、眼瞼の癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、ブドウ膜の悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩の肉腫、脳、脊髄、血管系、血管肉腫およびカポジ肉腫の腫瘍などの固形腫瘍の治療または抑制に使用できる。
特に好ましい実施形態によれば、本発明により定義されるいずれのペプチド、またはそのいずれの組合せ、機能的断片、誘導体、コンジュゲートおよび組成物のこのような方法に使用できる。
「アンタゴニストドメイン」（ｐ１２Ａおよびｐ１２Ｂ）に由来するペプチドもまた、本発明の方法によって使用できることに着目すべきである。
より具体的には、本発明の方法はｐ１２Ａ（配列番号１で示される）、ｐ１２Ｂ（ｐ１４Ａとも呼ばれる、配列番号３で示される）、ｐＴＡ（配列番号１１で示される）、ｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）からなる群から選択され得るペプチドおよびそのいずれかの組合せ、機能的断片誘導体および組成物を使用できる。
さらに、本発明は、それを必要とする被験体においてＴ細胞共刺激経路を調節するための組成物の製造を目的としす、Ｔ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドの使用を提供し、そのペプチドは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列またはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる。
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患の処置のための医薬組成物の製造を目的とする、Ｔ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドの使用に関する。このような組成物として用いられるペプチドは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列またはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなってよい。
特に好ましい実施形態によれば、このような組成物は、Ｔｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、狼瘡、グレーブス病および甲状腺炎）、悪性および非悪性増殖性疾患、移植片拒絶症および移植片対宿主病の処置に有用であり得る。
特の好ましい実施形態によれば、本明細書により定義されるいずれのペプチド、またはそのいずれの組合せ、機能的断片および誘導体も、このような組成物の製造に使用可能である。
特定の実施形態によれば、これらの組成物の製造に用いられるペプチドはｐ１２Ａ（配列番号１で示される）、ｐ１２Ｂ（ｐ１４Ａとも呼ばれる、配列番号３で示される）、ｐＴＡ（配列番号１１で示される）、ｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）ならびにそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体からなる群から選択し得る。
超抗原によるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴＣＲの結びつきは致死的毒性ショックを媒介するＴｈ１サイトカインの誘導には十分なものではない。ＳＰＲ親和性研究では、確かな言葉で、超抗原とＭＨＣＩＩまたはＴＣＲのいずれかとの相互作用が極めて弱いことが示されている[Seth (1994)同書; Redpath (1999) 同書]。これに対し、ＳＥＢのＣＤ２８に対する親和性ははるかに高く、この相互作用は安定な免疫シナプスの形成においての中枢的な役割を与える。この３つのリガンドを同時に結びつけることにより、超抗原はＴｈ１細胞に活性化シグナルを送達できる。超抗原のＣＤ２８への結合を妨げるペプチドミメティックはシナプス形成を損ない、Ｔｈ１応答の誘導を妨げる（図７Ｊ）。本発明の発見は、なぜこのアンタゴニストドメインの短いペプチドミメティックが有効な超抗原アンタゴニストであって、ＳＥＢのＴＣＲおよび／またはＭＨＣＩＩ結合部位のミメティックがＴｈ１応答を阻害することができないのかを説明している[Arad (2000)同書]。
ＣＤ２８細胞表面上のホモ二量体として存在するが、ＣＤ２８の、またＣＴＬＡ４の二量体形成はＢ７結合には必要なく、また、通常抗原によるシグナル伝達を誘発するのに十分なものでもない[Linsley, P. S. et al., J. Biol. Chem. 270(25):15417-24 (1995)]。唯一、単量体Ｂ７−２分子だけがＣＤ２８二量体と結びつくと考えられる[Collins (2002)同書]。ＳＥＢはＣＤ２８の細胞表面提示において一時的な変化を誘導し、それを推定ＣＤ２８二量体界面の１つの辺縁に特異的なαＣＤ２８ ｍＡｂに接近可能とする（図３Ａ、６Ａおよび６Ｂ）。αＣＤ２８単独でＴｈ１応答を誘発するという発見（図３Ｂ、３Ｃおよび６Ｂ）は、ＳＥＢによりシフト可能なＣＤ２８の接近性の状態の間に並行状態が存在することを示唆している（図３Ａ）。本発明者らは、ＳＥＢがその二量体界面の両辺縁においてＣＤ２８と結びつくことを示した。それは１つのＣＤ２８単量体と相互作用する場合、その超抗原は他の単量体と置き換わり、この時にαＣＤ２８に接近可能となる。
それらの収束進化の過程で、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌由来の超抗原毒素は、ＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の中でも、それらの機能にとって重要なヒト免疫系の受容体を認識するようにデザインされた構造を獲得した。さらに、個々の超抗原は、それらがこれら２つのリガンドと相互作用するような様式での広い多様性を示す[Sundberg(2002a)同書; Sundberg(2002b)同書]。これに対して、超抗原と第三の受容体ＣＤ２８との結合は親和性がより高いだけでなく、両分子において保存された構造を含み、ＴＳＳＴ−１をこのアンタゴニストドメインのミメティック [Arad (2000) 同書]、およびＣＤ２８の二量体界面のミメティックに対するＳＥＢと同様の感受性とする（図６Ｇおよび６Ｈ）。
ＣＤ２８は生得的な免疫性にとって初期のシグナルトランスデューサーとして独特の役割を有する。ＣＤ２８は構成的に発現し、Ｔｈ１応答の媒介に不可欠なものであるが、ＩＣＯＳはその後にＣＤ２８に依存して誘導され、主としてＴｈ２応答を促進する。その後の、これもまたＣＤ２８に依存的なＣＴＬＡ４の誘導は、これらの初期応答をシャットアウトする働きをする［Rudd and Schneider (2003)同書に概説］。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＳＥＢがＣＤ２８だけでなく、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ４にも結合する可能性を有するので、それはＣＤ２８を介して誘導されたＴｈ１応答を調節するために後者のリガンドを用い得るとの仮説を立てる。
ＣＤ２８コリガンドのＢ７−２は構成的に発現し、生得的な免疫応答の際に容易に誘導される[Sharpe and Freeman (2002)同書に概説]。ＳＥＢの作用は全面的にＢ７−２に依存する（図２Ａおよび２Ｂ）。ｓＢ７−２はＳＰＲ動態分析においてＳＥＢと、ｓＣＤ２８に対するものと類似の親和性で、しかし、低い結合力で直接結合する（図４）。超抗原によるＢ７−２およびＣＤ２８の同時結合はＢ７−２とＣＤ２８との結合を安定化させることから、大規模な共刺激を誘発することができる。本発明の結果は、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴＣＲに加えて、ＣＤ２８およびＢ７−２と直接結びつくことにより、超抗原が通常でない様式で４つのリガンド（抗原提示細胞由来の２つとＴ細胞由来の２つ）を補充して過剰なＴｈ１応答をもたらす、通常安定な免疫シナプスを作り出すという新規な概念につながる。
ＴＣＲを介するシグナル伝達はＣＤ２８により、Ｂ７−２依存的な様式で増幅される[Acuto and Michel (2003)同書参照]。免疫シナプス形成を模倣するためのＴＣＲとＣＤ２８を結びつける、Ｂ７−２またはαＣＤ２８と共同したαＣＤ３によるＩＬ２およびＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導は超抗原ミメティックペプチドｐ１２Ｂにより遮断される（図３Ｃおよび３Ｆ）。明らかに、シグナル伝達は主としてＣＤ２８の超抗原結合部位を介して起こり、それをｐ１２Ｂに対して感受性とする。ゆえに、ＣＤ２８におけるこの部位、すなわち、Ｂ７−２結合部位とは異なる二量体界面（図６Ａ）およびLuhder et al. [Luhder (2003)同書]により記載されたＣＤ２８６０−６５はＴＣＲシグナル伝達にとって重要である。
ＳＥＢによりＴｈ１サイトカイン遺伝子の誘導はＴｈ２サイトカインＩＬ４およびＩＬ１０の同時誘導により著しく弱められる（図１）。しかしながら、Ｔｈ１応答とは対照的に、超抗原によるＴｈ２サイトカイン応答の誘導は、ＣＤ２８を介するシグナル伝達を必要としない。αＣＤ２８またはｓＢ７−２はＩＬ１０を誘導することはできなかった（図３Ｄおよび３Ｇ）。Ｔｈ１応答が超抗原の、またはＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの可溶性リガンドまたはペプチドミメティックにより遮断された場合はいずれも、ＩＬ１０またはＩＬ４を介して測定されるＴｈ２応答は依然として変わらなかった。従って、超抗原アンタゴニストペプチドによるＣＤ２８依存性のＴｈ１応答の阻害はＴｈ２応答を完全なまま残し、防御免疫の同時誘導を伴う（図ＩＦ；[Arad (2000)同書]）。Ｔｈ１サイトカイン 遺伝子発現におけるＣＤ２８シグナル伝達のこの選択的必要条件は、この応答を調節に対してより感受性とする。これに対し、Ｔｈ２応答の活性化はこのＣＤ２８の必要条件を迂回するので、それほど厳格には制御されない。
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする被験体において、病原体によるＴ細胞共刺激経路の活性化または調節を阻害するための方法に関する。本発明の方法は、被験体に、該病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、該Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する結合部位の直接的相互作用を阻害する、阻害上有効な量の物質を投与する工程を含む。
好ましい実施形態によれば、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路のいずれかであり得る。好ましくは、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７経路であり得る。
もう１つの実施形態によれば、本発明は病原体によるＴ細胞共刺激経路の活性化を阻害するための方法に関する。病原体としては原核微生物、低級真核微生物、複合真核生物、ウイルス、真菌、プリオン、寄生虫、酵母および毒液が挙げられる。
原核微生物としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌、およびグラム不定菌、および細胞内菌などの細菌が挙げられる。本明細書で意図される細菌の例としては、トレポネーマ(Treponema)種、ボレリア(Borrelia)種、ナイセリア(Neisseria)種、レジュネラ(Legionella)種、ボルデテラ(Bordetella)種、エシェリキア(Escherichia)種、サルモネラ種(Salmonella)種、赤痢菌(Shigella)種、クレブシエラ(Klebsiella)種、エリシニア(Yersinia)種、ビブリオ(Vibrio)種、ヘモフィルス(Hemophilus)種、リケッチア(Rickettsia)種、クラミジア(Chlamydia)種、マイコプラズマ(Mycoplasma)種、ブドウ状球菌(Staphylococcus)種、連鎖球菌(Streptococcus)種、バチルス(Bacillus)種、クロストリジウム(Clostridium)種、コリネバクテリア(Corynebacterim)種、プロプリオにバクテリア種(Proprionibacerium)種、マイコバクテリア(Mycobacterium)種、ウレアプラズマ(Ureaplasma)種、およびリステリア(Listeria)種が挙げられる。
特定に好ましい種としては、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia Burgdorferi)、淋菌(Neisseria gonorrhea)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、大腸菌(Escherichia coli)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、ペスト菌(Yersinia pestis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、斑点熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、破傷風菌(Clostridium tetani)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、プロプリオニバクテリウム・アクネ(Proprionibacterium acnes)、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌(Mycobacterium leprae)およびリステリア菌(Listeria monocytogenes)が挙げられる。
低級真核生物としては、限定されるものではないが、ニューモシスティス・仮に(Pneumocystis carinii)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、コウジカビ属(Aspergillus)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、白癬菌属(Trichophyton)および小胞子菌(Microsporum)などの酵母または真菌が挙げられる。
複合真核生物の例としては、蠕虫、昆虫、クモ類、線虫、エモーブ(aemobe)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、膣トコもナス(Trichomonas vaginalis)、ブルセイ・ガンビア・トリパノソーマ(Trypanosoma brucei gambiense)、クルーズ・トリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、トキソブラズマ(Toxoplasma gondii)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)またはリーシュマニア(Leishmania)が挙げられる。
「ウイルス」とは、アデノウイルス、パポーバウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹、エプスタイン−バーウイルス、ＣＭＶ、ポックスウイルス：天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アルボウイルス、狂犬病ウイルス、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ ＩおよびＩＩ科のウイルスを含む、最も広い意味で用いる。
「真菌」とは、例えば、白癬、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリクム症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、およびカンジダ症などの疾病を引き起こす真菌が挙げられる。
寄生虫としては、限定されるものではないが、体細胞条虫、血液吸虫、組織回虫、アメーバ、ならびにプラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニアおよびトキソプラズマ種により引き起こされる感染体が挙げられる。
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌からなる群から選択される病原菌によるＴ細胞共刺激経路の活性化を阻害するのに特に有用である。
さらにもう１つの好ましい実施形態では、前記細菌の成分が超抗原であり、これは発熱性外毒素であり得る。好ましくは、この発熱性外毒素は細菌外毒素であってよく、最も好ましくは、この外毒素は黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌のいずれかによって産生されるものであり得る。本発明の方法によって処置し得る超抗原関連疾患は、特定の実施形態によれば、発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショック、無能化および死であり得る。
よって、このような病原体の好ましい成分は超抗原、好ましくは発熱性外毒素であり得る。
もう１つの好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、このような超抗原と、Ｄ２８／Ｂ７経路に属す分子内の特定の部位との結合を阻害する物質の使用に基づく。このような分子の例としては、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が挙げられる。
１つの特定の実施形態によれば、この超抗原結合部位は、配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなるＣＤ２８の二量体界面内にあってよい。
もう１つの実施形態によれば、この超抗原結合部位は、配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなるＣＴＬＡ−４分子の二量体界面内にあってよい。
あるいは、この超抗原結合部位は、配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の一部または総てを含んでなるＩＣＯＳ分子の二量体界面内であってよい。
あるいは、この超抗原結合部位は、配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１配列のアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６を含んでなるＣＴＬＡ４内の二量体界面に相当するＰＤ−１分子内のドメイン内にあってよい。
実施例によって示されるように、超抗原はＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの二量体界面内のその結合部位に特異的に結合する。図４は、この超抗原がＢ７−２分子内の未確認部位と結合することをさらに示している。
発明者らが示したように、ＣＤ２８ファミリーメンバーの二量体界面は発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインと特異的かつ直接結合する。好ましくは、この空間的に保存されているドメインはＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴＣＲのいずれの結合にも関与しない。最も好ましくは、この発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインは、ＳＥＢのドメイン番号に基づき、その内部にβ鎖７内で始まる中央ターンを形成し、このβ鎖７を短いβ鎖８を介してαヘリックス４と接続し、αヘリックス４内で終わる[Arad et al., (2000), (2001) 同書]。
１つの好ましい実施形態では、病原体、好ましくは超抗原に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位との間の直接的相互作用を阻害するために本発明の方法により用いられる物質は、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチド、あるいは、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドであってよい。
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、超抗原とＣＤ２８ファミリーメンバー、すなわちＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチドとの間の特異的相互作用を阻害するために使用できる。
もう１つの実施形態では、超抗原とＣＤ２８ファミリー分子のいずれかの二量体界面内の特定部位との直接的結合の阻害は、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドを用いて達成できる。
本方法によって用いられるペプチドは、ＣＤ２８ファミリーメンバーの二量体界面と結合するペプチドであり、ただし、このペプチドは、ＳＥＢのドメイン番号に基づき、その内部にβ鎖７内で始まる中央ターンを形成し、このβ鎖７を短いβ鎖８を介してαヘリックス４と接続し、αヘリックス４内で終わる、発熱性外毒素の空間的に保存されているドメインに由来するものではないことに着目すべきである。
特に好ましい実施形態によれば、本方法により用いられるペプチドは本発明で定義されたいずれのペプチドであってもよい。
好ましい実施形態によれば、本発明の方法により用いられるペプチドは、ＣＤ２８／Ｂ７ファミリー分子と前記発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害する。本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、該病原体成分（好ましくは該成分は発熱性外毒素である）の該Ｔ細胞共刺激経路メンバー（好ましくはＣＤ２８／Ｂ７ファミリーのもの）に対する結合阻害は、本発明の物質により、毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化との拮抗をもたらし、該発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫の間接的惹起ももたらし得る。より詳しくは、この結合は本発明で定義されたＣＤ２８内の超抗原結合部位により媒介される。
従って、毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストは、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護し、また、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を間接的に惹起することもできる。毒性ショックをもたらす細胞免疫応答を誘導する毒素の能力を遮断することで、本発明のアンタゴニストペプチドは、超抗原にそれ自体に対して向けられた強い体液性免疫応答を誘導させる。よって、処置された被験体はさらなる毒素の攻撃に対して防御免疫を獲得することができ、防御的抗毒素抗体を発達させることができる。このように、本発明のアンタゴニストペプチドは、発熱性外毒素により誘導される急性毒性ショックおよび例えば偶発的食中毒によるものであり得る有害な作用の応急処置に使用できる。さらにまた、それは上記のような毒性ショックに対する長期免疫を間接的に付与することもできる。
Ｔ細胞共刺激経路メンバー、例えばＣＤ２８と、病原体の成分、好ましくは超抗原との間の直接的相互作用を阻害するペプチドは例えば低い免疫原性と比較的急速なクリアランスを有するペプチドであるが、このようなアンタゴニストペプチドに対する抗体は検出されない。しかしながら、毒性ショックをもたらす細胞免疫応答を誘導する毒素の能力を遮断することで、このアンタゴニストペプチドはその超抗原にそれ自体に対して向けられる体液性免疫応答を誘導させる。これらの条件下で、超抗原はその固有のアジュバントとして働く。このように、超抗原に曝されている間、アンタゴニストペプチドにより致死的毒性ショックが妨げられる場合（ＣＤ２８−超抗原相互作用を阻害することによる）、処置された被験体は、異なる毒素によるものであってさえ、さらなる毒素の攻撃に対して防御免疫を獲得し、防御的抗毒素抗体を発達させることができる。従って、ＣＤ２８分子と超抗原毒素との間の直接的相互作用を阻害する本発明のペプチドの使用は、該発熱性外毒素により誘導される毒性ショックに防御免疫を間接的に惹起することができる。
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする被験体において病原体によって引き起こされるＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する病理的疾患を処置するための方法に関する。このような方法は、被験体に、その病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する部位との直接的相互作用を阻害する、阻害上で有効な量の物質を投与する工程を含む。
一実施形態によれば、本発明の方法は、悪性および非悪性増殖性疾患、および免疫関連疾患、例えば、炎症、自己免疫疾患、ならびにまた外毒素関連疾患の処置のために意図される。
炎症はいずれの炎症症状も含み、その炎症症状は慢性関節リウマチ、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流傷害、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸管炎症、硬変および炎症性腸疾患のいずれかであり得る。
もう１つの実施形態によれば、このＴ細胞共刺激経路はＣＤ２８／Ｂ７Ｔ細胞共刺激経路、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路、好ましくは、ＣＤ２８／Ｂ７経路のいずれかであり得る。
より詳しくは、このＣＤ２８／Ｂ７経路メンバーはＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれかであり得る。
一実施形態では、この経路メンバーはＣＤ２８分子であってよく、ＣＤ２８内の二量体界面は配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる。
もう１つの実施形態では、この経路メンバーはＣＴＬＡ−４分子であってよく、ＣＴＬＡ−４の二量体界面は配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ−４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる。
あるいは、この経路メンバーはＩＣＯＳ分子であってよく、ＩＣＯＳ内の二量体界面は配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を含んでなる。
あるいは、この経路メンバーはＰＤ−１分子であってよく、ＣＴＬＡ４内の二量体界面に相当するＰＤ−１分子内のドメインは配列番号５９で示されるアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６を含んでなる。
さらにもう１つの実施形態では、本発明の方法は、細菌病原体、ウイルス、真菌、プリオン、寄生虫、酵母および毒液などの病原体によって引き起こされる病態の処置を意図する。
特に好ましい実施形態では、このような病原体は黄色ブドウ球菌および化膿連鎖球菌からなる群から選択される病原菌であり得る。よって、Ｔ細胞共刺激経路メンバー内の特定の結合部位に特異的に結合する該細菌の成分は超抗原、好ましくは発熱性外毒素であってもよい。
より詳しくは、Ｔ細胞共刺激経路メンバー、好ましくはＣＤ２８分子と発熱性外毒素との間の直接的相互作用の阻害は外毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化の阻害、毒性ショックからの保護をもたらし、また、発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫の間接的惹起も誘導する。
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショック、無能化および死の処置に特に有用である。
「免疫学的に有効な量」とは、Ｔ細胞の活性化を遮断する抗体の産生、好ましくは発熱性外毒素により誘導されるＴｈ１応答を高め、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物 により誘導される毒性ショックに対する免疫を付与するのに十分な量を意味する。
本願のいたるところで用いられている毒素により媒介される活性化とは、発熱性外毒素またはそのような毒素の混合物により媒介されるＴ細胞の活性化を意味する。
本発明のアンタゴニストペプチドは、発熱性外毒素により誘導される急性毒性ショックおよび例えば偶発的食中毒によるものであり得る有害な作用の応急処置に使用できる。さらに、毒性ショックをもたらす細胞免疫応答を誘導する毒素の能力を遮断することで、このアンタゴニストペプチドはまた、超抗原にそれ自体に対して向けられた強い体液性免疫応答を誘導させ、従って、これらのペプチドはこのような毒性ショックに対する長期免疫を間接的に付与することもできる。
ヒトでは例えば、発熱性外毒素暴露による毒性ショックは、２つの異なる成分、ずなわち、（１）無能化および（２）死を有する。致死濃度より数ログ低い濃度であっても、発熱性外毒素は著しく無能化を引き起こし、高い罹患率を生じる[USAMRIID Manual, (1998) Eitzen, E. Pavlin, J. Cieslak, T. Christopher, G. Culpepper, R. eds. Medical Management of Biological Casualties Handbook. 3rd ed. Fort Detrick, Maryland: United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 1998]。例えば食中毒（集団食中毒であり得る）において見られる無能化応答は多数の人々に影響を及ぼす。さらに、この無能化応答は軍事的脅威および国家保安的驚異であり得る。
一実施形態によれば、本発明の方法は、病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位との間の直接的相互作用を阻害する物質として、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチド、あるいはまた、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドを用いる。
特に好ましい実施形態によれば、発熱性外毒素などの病原体とＣＤ２８ファミリーメンバーとの相互作用の阻害は、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチドによって実施可能である。
より詳しくは、このようなペプチドは、本発明で定義されたペプチドのいずれであってもよい。
よって、このような物質の１つの特定の例が本発明のさらなる態様により提供され、それは、Ｔ細胞共刺激経路メンバー、好ましくはＣＤ２８／Ｂ７経路分子の二量体界面に由来するアミノ酸配列を有する単離および精製されたペプチドに関する。
もう１つの実施形態によれば、病原体の成分とＴ細胞共刺激経路メンバーとの間の直接的相互作用の阻害は、本発明の方法により、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドを用いることで実施可能である。具体的には、このようなペプチドは、本発明で定義されたペプチドのいずれであってもよい。
特に好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって用いられるペプチドは、ＣＤ２８分子と発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害する。
もう１つの好ましい実施形態では、本発明の方法により用いられるペプチドは、毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストであり、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護する。
種々の投与方法は、本発明のペプチドまたは組成物を、それを必要とする被験体に送達するために使用できる。ペプチドは静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、経口（液体状、またはカプセル剤、丸剤、トローチ剤のような単位投与形として調製）で送達することができる。治療上有効とするには、ペプチドは、注射後、またはいっそうより好ましくは経口投与後に全身系でそれらの安定性を高めるように調製しなければならない。あるいは、本発明のペプチドはパッチ、軟膏またはクリームを用いた経皮送達によって送達してもよい。
本発明の医薬組成物は、局所的処置が望ましいか全身処置が望ましいかにより、また処置する領域によりいくつかの方法で投与することができる。投与は局所投与（眼球送達、ならびに膣および直腸送達をはじめとする粘膜送達）、例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアゾールの吸入または通気による肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、上皮および経皮投与、経口または非経口投与であってよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入、あるいは頭蓋内、例えば髄腔内または脳室内投与が挙げられる。
局所投与用の医薬組成物および処方物としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体および粉末が挙げられる。通常の医薬担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤などが必要である、または望ましい場合もある。が挙げられる。コーティングコンドーム、グローブなども有用である。
経口投与用の組成物および処方物としては、粉末または顆粒、水性または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合もある。
非経口、髄腔内、または脳室内投与用の組成物および処方物としては、緩衝剤、希釈剤、および限定されるものではないが、浸透促進剤などの他の好適な添加剤、担体化合物およびその他の医薬上許容される担体または賦形剤を含んでもよい無菌水溶液が挙げられる。
本発明の医薬組成物としては、限定されるものではないが、溶液、エマルション、およびリポソーム含有処方物が挙げられる。これらの組成物は、限定されるものではないが、調製済み液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとする種々の成分から作製できる。
単位投与形で便宜に提供可能な本発明の医薬製剤は、製薬業で周知の常法に従って調製できる。このような技術としては、有効成分と医薬担体または賦形剤とを会合させる工程を含む。一般に、これらの処方物は、有効成分と液体担体または微粉固形担体またはその両者を均一かつ緊密に会合させた後、必要であればその生成物を成形することによって製造される。
本発明の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸などの多くの可能な投与形のいずれに処方してもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として処方してもよい。水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめ、懸濁液の粘度を高める物質をさらに含んでもよい。懸濁液はまた、安定剤を含んでもよい。
本発明の一実施形態では、これらの医薬組成物はフォームとして処方および使用してもよい。医薬フォームとしては、限定されるものではないが、エマルション、マイクロエマルション、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの処方物が挙げられる。これらの処方物は、本来、基本的に同じであっても、最終生成物の成分およびコンシステンシーが異なる。このような組成物および処方物の調製は一般に医薬分野および処方分野の熟練者に公知であり、本発明の組成物の処方に適用することができる。
本発明により記載され、また、発明者らが最近示したように［ＷＯ０３／０８４９９５］、超抗原の細胞内標的はＣＤ２８である。
図４にて示されるように、本発明はさらに、ＣＤ２８ファミリーの３つのメンバー総てがｓＡｇと結合することを示す。この知見は、死および有毒な無能化（悪心、嘔吐および下痢によって現れる）など、超抗原により媒介される細胞免疫応答（特に、Ｔｈ１応答）の過剰刺激の毒性ショックまたはその他の結果を阻害するアンタゴニストのをデザインするための細胞薬物標的を提供する。最も重要には、本発明は今や、本明細書で例示されているようなアンタゴニストペプチドによるものであれ、分子または酵素またはタンパク質によるものであれ、超抗原とＣＤ２８受容体との間の相互作用の新規なアンタゴニストのデザインが可能である。本発明は、アンタゴニスト分子の結合のためのおとりとしてのＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＩＣＯＳ分子内の二量体界面に由来する本発明のペプチドの使用によって毒性ショックアンタゴニストの発見のための新たな戦略を提供する。これは、例えばランダムまたは特定ペプチドライブラリー由来のファージディスプレー、ペプチドライブラリーまたは環状ペプチドミメティクスライブラリーからのポジショナルスキャニングを通じて選択可能である。
よって、さらなる態様において、本発明は、Ｔ細胞共刺激経路メンバー、例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４分子のいずれかと特異的に結合し、かつ、発熱性外毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化と拮抗し得る試験物質のスクリーニング方法に関する。さらに、該試験物質は、発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を特異的かつ間接的に惹起し得る可能性がある。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）Ｔ細胞共刺激経路メンバーと結合する候補アンタゴニスト物質を得る工程；（ｂ）工程（ａ）で得られた物質から、そのＴ細胞共刺激経路メンバーと超抗原との間の直接的相互作用を阻害する物質を選択する工程；および（ｃ）超抗原により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に対する、工程（ｂ）で得られた物質の拮抗作用を判定する工程を含む。
ポジショナルスキャニングおよび環化化学によって作製されたアンタゴニストペプチドの高親和性結合のハイスループットスクリーニングの適用の鍵は高感度で便宜なスクリーニングアッセイの開発である。
超抗原により認識されるドメイン中のＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１のいずれかに対するそれらの親和性を介するアンタゴニスト物質の確固としたスクリーニングアッセイの開発がこのスクリーニング方法の第一工程となる。
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって用いられる候補アンタゴニスト物質は、
（ａ）本発明で定義された単離ペプチドのいずれかを含んでなる混合物を準備する工程；（ｂ）その混合物を結合にとって好適な条件下で試験物質と接触させる工程；および（ｃ）終点指標に対する試験物質の作用を決定し、それにより、その終点の変更がその試験物質とペプチドの結合の指標となる工程により得ることができる。
もう１つの実施形態によれば、本発明の方法によりスクリーニングされる候補物質は タンパク質に基づく、炭水化物に基づく、脂質に基づく、天然有機物に基づく、合成起源の有機物に基づく、無機物に基づく、およびペプチドミメティクスに基づく物質からなる群から選択される。
もう１つの実施形態では、この物質は、ペプチドのコンビナトリアルライブラリー、環状ペプチドミメティクスのライブラリー、およびランダムまたは特定ファージディスプレーライブラリーのポジショナルスキャニングのいずれかの産物であり得る。
もう１つの特に好ましい実施形態によれば、この候補アンタゴニスト物質は、毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に拮抗するその物質の能力、および所望により発熱性外毒素またはそのような発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を惹起するその能力を判定する方法により評価することができる。
特定の実施形態によれば、この終点指標は、視覚的に検出可能なシグナルをもたらす、抗ペプチド抗体と本発明のペプチドとの結合である。この抗体とペプチドとの結合の変更はこのようなシグナルの阻害または増強をもたらし、試験物質が本発明のペプチドと結合することを示し得る。
より詳しくは、各候補物質、または好ましくはペプチドをウェル中に置いてもよく、本発明のペプチドの直接的結合をそのペプチドに特異的な抗体によって検出するのが好ましい。プレート上での本発明のペプチドと候補アンタゴニストペプチドとの効率的な結合のための条件はｐＨ、塩およびバッファーの組成、ならびにＢＳＡなどの担体タンパク質の検討を含んで至適化できる。この確固としたスクリーニングにより、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８およびＰＤ−１のいずれかの二量体界面内の超抗原結合部位と結合する物質、好ましくはペプチドが得られる。
本発明のペプチドと結合する物質（特にペプチド）をプールし、その後、下記のようにアッセイする。
好ましい一実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法によって用いられるペプチドは、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するｐ１ＴＡと呼ばれるペプチドである場合、検出に用いるべき抗体は、R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USAのクローン３７４０７．１１１である、ＭＡＢ３４２と呼ばれるマウス抗ＣＤ２８モノクローナル 抗体であり得る。
あるいは、本スクリーニング方法に用いられるペプチドが、配列番号１２、１４、１５、１６、１７、５７および５８で示されるアミノ酸配列を有するｐ２ＴＡ、ｐ１ＴＢ、ｐ２ＴＢ、ｐ１ＴＣ、ｐ２ＴＣ、ｐ１ＴＤおよびｐ２ＴＤである場合、特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体を検出に用いるべきである。
本発明のスクリーニング方法のこの第一工程に用いられる抗ペプチド抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれかであり得る。タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製は、例えば、Immunology, Wiley and Sons Inc.のCurrent Protocolsの第２章に記載されている。
モノクローナル抗体は、免疫化動物、特にラットまたはマウスの脾臓またはリンパ節から採取したＢ細胞から、ハイブリッド細胞の増殖に好ましい条件下で不死化Ｂ細胞と融合させることで作製することができる。モノクローナル抗体を作製する技術は、上記ImmunologyのCurrent Protocolsの第２章など、多くの文献およびテキストに記載されている。
「抗体」とは、完全な分子、ならびに抗原と結合可能な、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などのそのフラグメントを含むものとする[Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)]。
本発明において有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２およびその他のフラグメントは、本明細書において完全抗体分子に関して開示された方法に従い、結合したＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１分子の検出および定量に使用できることが分かるであろう。このようなフラグメントは通常、パパイン（Ｆａｂフラグメント作製のため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの作製のため）を用い、タンパク質分解切断により作製される。
好ましい実施形態によれば、本発明の方法によるスクリーニングに好適な候補物質は、タンパク質に基づく、炭水化物に基づく、脂質に基づく、天然有機物に基づく、合成起源の有機物に基づく、無機物に基づく、およびペプチドミメティクスに基づく物質からなる群から選択される。
好ましくは、このような物質は、ペプチドのコンビナトリアルライブラリー、環状ペプチドミメティクスのライブラリー、およびランダムまたは特定ファージディスプレーライブラリーのポジショナルスキャニングのいずれかの産物であり得る。
特に好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって取得および選択される候補アンタゴニスト物質はペプチドであり得る。よって、コンビナトリアルファージライブラリーを用いてＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１受容体のいずれかに対してナノモルの親和性を有する超抗原アンタゴニストペプチドをスクリーニングすることができる。特定の、非限定的な例において、England BiolabsのＰｈＤ−１２ライブラリーが使用できる。
パンニングは二工程で行ってもよく、第一工程では、マイクロプレートに結合させた本発明のｐ１ＴＡ、ｐ２ＴＡ、ｐ１ＴＢ、ｐ２ＴＢ、ｐ１ＴＣ、ｐ２ＴＣ、ｐ１ＴＤおよびｐ２ＴＤから、ｐＨ２．２での溶出を用いて結合したファージを溶出させる。
これによりＣＤ２８の超抗原結合部位と結合する総てのファージが選択される。第二の工程では、上記のように選択されたファージをｐ１ＴＡ、ｐ２ＴＡ、ｐ１ＴＢ、ｐ２ＴＢ、ｐ１ＴＣ、ｐ２ＴＣ、ｐ１ＴＤおよびｐ２ＴＤに、またはｓＣＤ２８、ｓＩＣＯＳ、ｓＣＴＬＡ−４およびｓＰＤ−１に結合させ、過剰量の遊離ＳＥＢを用いて特異的に溶出させる。結合したファージを溶出させ、さらに２〜３回のパンニングを行う。次に、固定化したｐ１ＴＡ、ｐ２ＴＡ、ｐ１ＴＢ、ｐ２ＴＢ、ｐ１ＴＣ、ｐ２ＴＣ、ｐ１ＴＤ、ｐ２ＴＤ、ｓＣＤ２８、ｓＩＣＯＳ、ｓＣＴＬＡ−４、ｓＰＤ−１に対する、または超抗原結合部位を含むそのフラグメントに対するファージの直接的結合はファージＥＬＩＳＡにより検出し、プレート上のＭ１３に関してスコアリングすることができる。陽性ファージクローンを増幅し、配列決定した後、直鎖型のペプチドを合成する。
好ましくは上記のようにして得られた、本発明のペプチドと結合する、従って、ＣＤ２８内の超抗原結合部位に結合する候補アンタゴニスト物質は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１分子のいずれかと超抗原との間の相互作用を妨げるそれらの能力に関してさらに選択してもよい。
超抗原とＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１分子のいずれかとの間の相互作用を阻害する候補物質の能力を調べる１つの可能性のあるアプローチとして、ビオチニル化ＳＥＢ(Toxin Technologies)を用い、プレート上のＣＤ２８、ｓＩＣＯＳ、ｓＣＴＬＡ−４またはｓＰＤ−１との結合から標識ＳＥＢを解離させるペプチドの能力をアッセイするものがある。
本発明のスクリーニング方法により取得および選択された候補アンタゴニストペプチドを、ポジショナルスキャニングによりさらに分析およｂぎ改良してもよい。
ペプスキャンポジショナルスキャンでは、開始時の親和性は１０−３Ｍといった低いものであってよく、ペプチド長は１５残基が容易である。リードペプチドは、所定のタンパク質配列に由来するランダムコンビナトリアルライブラリーまたはペプチドライブラリーをはじめ、いずれのタイプのペプチドライブラリーに由来するものであってもよい。信頼できるシグナル／ノイズ比により、特異的な低親和性相互作用が検出できる。それは固相支持体上で使用することもでき[Schroeijers et al., Cancer Res. 60:1104-1110 (2000)]、またはそれらのペプチドを支持体から切り離した後に可溶形態で用いることもできる[Kast et al., Cell 59:603-614 (1989); Kast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:2283-2287 (1991); De Samblanx et al., Pept. Res. 9:262-268 (1996); Oosterom et al., J. Biol. Chem. 274:16853-16860 (1999)]。拘束あるポジショナルスキャニングでは、総ての候補ペプチドが非還元可能ループとして合成され、それを用いてリードペプチドの親和性がさらに改良される。従って、ペプチドを固相支持体に結合させるか（ペプスキャン−Ｉ）、または遊離の可溶性ペプチドとしてアッセイし（ペプスキャン−ＩＩ）、リードペプチドの親和性を至適化する。
候補アンタゴニストペプチドに対してアラニンスキャンを行って、受容体との結合にとって、またそれとは別にin vitroにおける超抗原アンタゴニスト活性にとって重要な残基を同定してもよい。in vitroアンタゴニスト活性は、下記の本発明のスクリーニング方法の評価工程に従って評価することができる。ペプチドはＮ末端アセチルおよびＣ末端ＣＯＮＨ２を用いて可溶形態で合成し、評価工程としてのＰＢＭＣを用いたin vitroアッセイにおいてのより高いプロテアーゼ耐性のためにフランキングＤ−アラニンを保持している。同定されたリードペプチドに対してさらに何回かのアラニンスキャンを行ってもよい。超抗原アンタゴニストドメインにおいてリシンも優勢であるので、同様にペプチドのリシンスキャンを行ってもよい。
アラニンスキャンによってアンタゴニスト活性に重要な残基が同定されれば、そのような２点を２０総てのアミノ酸の完全入れ替えペプスキャン（４００ペプチド）のために選択し、その後、さらに２点を同様にスキャンする（４００ペプチド）。ペプチドは最初は遊離可能な形態であるが、チップに固定する。ｓＣＤ２８、ｓＩＣＯＳ、ｓＣＴＬＡ−４またはｓＰＤ−１のいずれかと各ペプチドとの結合をこの受容体に対する市販のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによりスコアリングする。次に、陽性ペプチドを遊離させ、スクリーニングアッセイＥＬＩＳＡ形式（上記参照）における受容体の結合アッセイのため、また、ＰＢＭＣアッセイ（下記に詳説）におけるin vitroアンタゴニスト活性のための群にプールした後、これらの群をデコンヴォルーションする。段階的に、得られた改良型リードに対してさらなるポジショナルスキャニングを行う。全部で４回のポジショナルスキャニングを行い、その受容体に対して最大の親和性を有するペプチドに対してさらなる拘束のあるポジショナルスキャニングを行う。
環化スキャンでは、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＭＢＳ）エステルなどのリンカーを用い、その活性エステルを介して所定のペプチドのＮ末端と、およびそのマレイミド基を介してシステイン由来の遊離チオール基と反応させることができる。このシステインはこのペプチドの一部である。
ループスキャンでは、各ペプチドのＮ末端を、ＭＢＳを用い、同じウェルの底に個別に結合させたシステイン由来の遊離のＳＨ基と連結させればよい。このように、拘束されたループが形成される。
環状ペプチドミメティクスを個々に合成し、ＰＢＭＣでアンタゴニスト活性を評価する。
実施例８で示された本発明のスクリーニング方法により選択および同定された候補アンタゴニストは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１のいずれか内の超抗原結合部位と結合する物質であり、毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化と拮抗するその能力、および所望により発熱性外毒素またはこのような発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショック対する防御免疫を惹起するその能力をさらに評価しなければならないことに着目すべきである。
本発明のスクリーニング方法により単離された候補アンタゴニストを評価するために用いる試験系は、in vitro/ex vivo細胞培養、またはin vivo動物モデルであってよい。このような試験系は所望によりさらに、超抗原により誘導されるＴ細胞の活性化のため、また、候補アンタゴニストの拮抗作用を決定するため終点指標の検出のために好適な条件を提供する内因性および／または外因性の化合物を含んでなる。より具体的には、このＴ細胞はＴｈ１リンパ球であり、この活性化はＩＬ２および／またはＩＦＮ−γ遺伝子発現の誘導により決定される。
一実施形態によれば、評価のために本発明のスクリーニング方法により用いられる試験系は、内因的に発現されるＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１分子を含んでなるin vitro/ex vivo細胞培養物であり得る。特定の例では、試験系として用いられる細胞培養物は哺乳類ドナーから単離されたＰＢＭＣ培養物であってもよい。このような哺乳類は好ましくはヒトまたはアカゲザルのいずれかであり得る。
従って、この特定の試験系における終点指標は、視覚的に検出可能なシグナルをもたらす、超抗原により誘導されるＩＬ２および／またはＩＦＮ−γの発現であってもよい。よって、この終点の阻害または低下でさえも、超抗原とＣＤ２８分子との相互作用に特異的に拮抗および阻害する候補物質の能力の指標となる。このような阻害は毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化の拮抗をもたらす。超抗原により誘導されるＩＬ２および／またはＩＦＮ−γの発現は、例えば、定量的ドットブロットハイブリダイゼーションおよびＲＮアーゼ保護アッセイによって検出することができる。
以下の実施例により示すように、本発明者らは、細胞免疫応答に関与する総ての細胞サブセットを含む新たに単離された完全ヒトＰＢＭＣ標本における超抗原により誘導されるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの発現を阻害するアンタゴニストペプチドの能力に基づき、超抗原アンタゴニスト活性に関する有力なin vitroスクリーニング手段を開発した[Arad et al., (2000)同書]。本発明者らは、この系が、応答の調節不全を検出した種々の疾病におけるヒト免疫応答を密接に反映しており[Gerez et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 58:152-266 (1991); Gerez et al., Kidney International 40:266-272 (1991); Gerez et al., Clin. Exp. Immunol. 109:296-303 (1997); Kaempfer et al., J. Clin. Oncol. 14:1778-1786 (1996)]、従って、優れたサロゲートマーカーとなることを示した。このＰＢＭＣアッセイは、本発明者らにより、アンタゴニストペプチドｐ１２およびｐ１４の発見において[Arad et al., (2000), (2001)同書]、また、毒素アゴニスト活性の欠如を示すために効率的であることが分かった[Arad et al., (2000)同書]。従って、この系は、本発明のスクリーニング方法によって得られた候補アンタゴニスト物質のアンタゴニスト活性を評価するために効果的に用いることができる。
本発明者らは、少数の細胞において存在度の低いｍＲＮＡ種を定量する、ヒトＰＢＭＣにおいて誘導されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現を測定するための高感度定量法を考案した。この方法により、多数のサンプルの便宜な処理が見込め、それ自体、有効な毒素アンタゴニストをスクリーニングするのに好適である。さらに、これにより、何人かの異なるヒトドナーからのＰＢＭＣの応答を、多数のパラメータに関して一度に検討することが可能となる。これにより、再現性のある様式でアンタゴニスト活性を示すのに効果的な手段が作り出せる。ＩＬ２およびＩＦＮ−γタンパク質の測定はｍＲＮＡの測定より情報量が少ないが、これは、これらのタンパク質は誘導中に徐々にしか現れず、それらの細胞受容体に結合することによって隔離されるが、ｍＲＮＡは即座に発現し、性格にアッセイできるためである。ＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡを測定すれば、免疫刺激後数時間内でこれらの遺伝子の主要な応答に対する動的情報が得られる。これらのアッセイは広い範囲で直線的である。このような分析から得られた情報はＲＮアーゼ保護分析により確認される。
所望のアンタゴニストペプチドの必須の特性は、Ｔｈ２応答を完全なまま残すことである。これはまたバックアップのための必要条件でもあり、毒素により誘導されるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの発現がアンタゴニストペプチドにより阻害されるＰＢＭＣからの培養培地を用い、ＩＬ１０に関するＥＬＩＳＡによって試験することができる。
さらにもう１つの選択肢では、候補アンタゴニストを評価するために本発明のスクリーニング方法により用いられる試験系はin vivo系、特に動物モデルであり得る。
１つの特定の実施形態によれば、この動物モデルは、超抗原、好ましくは発熱性外毒素で抗原刺激したガラクトサミン感作マウスであり得る。このような試験系の終点指標は致死的毒性ショックからのマウスの保護および救済であり得る。該終点の増強は、超抗原とＣＤ２８分子との間の相互作用と特異的に拮抗および阻害する、発熱性毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化と拮抗する、毒性ショックから保護する候補物質の能力の指標となるか、また、発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を間接的に惹起する該候補の能力を示し得る。
もう１つの動物モデルとして、発熱性外毒素で抗原刺激したブタが挙げられる。このようなモデルでは、終点指標は毒性ショックおよび無能化から該ブタを保護および救済し得る。このような終点の増強は、超抗原とＣＤ２８分子との間の相互作用と特異的に拮抗および阻害する、発熱性毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化と拮抗する、毒性ショックおよび無能化から保護する、および所望により発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を惹起する該候補の能力の指標となる。
本発明はさらに、哺乳類被験体における超抗原関連疾患の処置のための治療組成物を製造する方法を提供する。この方法は、
（ａ）超抗原により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に拮抗することができ、かつ、好ましくはさらに発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を惹起することができるアンタゴニスト物質を同定する工程；および
（ｂ）そのアンタゴニスト物質を少なくとも１種の医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤および／または添加剤と混合する工程
を含む。
治療組成物を製造する方法によって用いられるアンタゴニスト物質は、好ましくは、実施例８によって例示されるような本発明のスクリーニング方法によって同定することができる。
開示および記載されている本発明は、本明細書に開示されている特定の例、方法工程、および組成に限定されるものではなく、このような方法工程および組成はある程度可変であると理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるので、本明細書で用いられる用語は、単に特定の実施形態を記載する目的で用いるものであって、限定を意図したものではないと理解すべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる単数形「a」、「an」および「the」は、そでないことが明示されない限り、複数の表現を含むことに注意しなければならない。
本明細書、ならびに以下に実施例および特許請求の範囲を通じ、特に断りのない限り、「comprise」、ならびに「comprises」および「complising」などの活用形は、示されている整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群の包含するが、他のいずれかの工程、または整数群もしくは工程群は包含しないことを意味すると理解される。
以下の実施例は本発明の態様を実施するにあたって本発明者らが採用した技術の代表例である。これらの技術は本発明の実施に好ましい実施形態の例であるが、当業者ならば、本開示に照らして、本発明の精神および意図される範囲を逸脱することなく、多くの改変をなし得ることが分かるものと思われる。
実験手順
ペプチド
ペプチドはフルオロニル−メトキシカルボニル化学を用いて合成し、切断し、その側鎖をトリフルオロ酢酸で脱保護した。ペプチドは高速液体クロマトグラフィーによれば、純度＞９５％であり、それらの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認した。ｐ１２ＣＣを除く総てのペプチドに、プロテアーゼ耐性をより高くするため、Ｄ−Ａｌａ残基を隣接させた。真性乱数発生器(http://www.random.org/)を用いてスクランブル配列を得た。
可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＢ７−２
マウス骨髄腫ＮＳ０細胞で発現させたｓＣＤ２８、ｓＩＣＯＳおよびｓＢ７−２(R & D Systems)は、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ付きヒトＩｇＧ １Ｆｃと融合させた成熟ヒトリガンドのそれぞれ１９〜１５２、２１〜１４１および２０〜２３９アミノ酸細胞外ドメインを含んでなるキメラジスルフィド結合ホモ二量体である。バキュロウイルスを用いてＳｆ２１細胞で発現させた担体フリーｓＣＴＬＡ４(R & D Systems)は、同様にヒトＩｇＧ １Ｆｃと融合させた成熟ヒトＣＴＬＡ４の細胞外３７〜１６２アミノ酸ドメインを含んでなるキメラジスルフィド結合ホモ二量体である。
細胞培養およびサイトカイン遺伝子発現の誘導
健康なヒトドナー由来のＰＢＭＣをFicoll Paque(Pharmacia)上で分離し、５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、４×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ ＭＥＭ非特定アミノ酸、１００ｍＭピルビンサンナトリウム、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール、１００ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５μｇ／ｍｌナイスタチンを添加したこの培地で培養した。ＳＥＢ(Department of toxinology, U. S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases)およびＴＳＳＴ−１(Sigma)を１００ｎｇ／ｍｌまで加えた。
ｍＲＮＡ分析
ＲＮアーゼ保護分析(Arad et al., 2000)、全ＲＮＡをトリゾール試薬(Invitrogen)を用い、３×１０７ヒトＰＢＭＣアリコートから抽出し、ｐＢＳ(Promega)に挿入したＤＮＡからin vitroにおいてα−［３２Ｐ］ＵＴＰを用いて転写したゲノムアンチセンスＲＮＡプローブと、４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。Ｔ７プロモーターから転写した６００−ｎｔ
ＩＬ２プローブはＩＬ２エキソン３およびイントロン３の一部と相補的であり、８Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲルにおいて、ＩＬ２ ｍＲＮＡで保護された１１７ｎｔのＲＮＡが得られる。Ｔ３プロモーターから転写した２７４−ｎｔ ＩＦＮ−γプローブはＩＦＮ−γエキソン３およびイントロン３の一部と相補的であり、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡで保護された１８３ｎｔのＲＮＡが得られる。１８Ｓ ｒＲＮＡおよびβ−アクチン ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡプローブはそれぞれ９０および４１５ｎｔを保護する。ＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの定量的ドットブロットハイブリダイゼーションのため、４×１０６ＰＢＭＣのアリコートを７．５Ｍグアニジウム−ＨＣｌ中で溶解した。１０×クエン酸ナトリウム溶液中、全ＲＮＡの４シリーズ二倍希釈液を、９６穴ドットブロット器具中のニトロセルロースシートに適用した。各シートを３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＥＬＩＳＡリーダーにて、６３０ｎｍでオートラジオグラムをスキャンした。一連の希釈液は広範囲にわたって直線的Ａ６３０応答を示した[Arad (2000)同書]。
表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）
ＳＥＢ、ｓＣＤ２８およびｐ１２ＣＣを、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中、１００μｇ／ｍｌまで希釈し、製造業者のキット(BIAcore)を用いたアミン−チオール結合によりＣＭ５センサーチップ(BIAcore)上に固定化した。可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、Ｂ７−２またはヒトＩｇＧ(Jackson Laboratories)を、物質輸送制限を示さない条件下、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０中、１０μｌ／分で注入した。親和性および動態分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトを用い、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置にて２５℃で行った。
ファージディスプレー
エピトープマッピングのため、Ｍ１３ＫＥ(New England Biolabs)中のＰｈＤ−１２コンビナトリアルファージディスプレーライブラリーを、製造業者の説明書に従い、固定化αＣＤ２８ ｍＡｂ（ＭＡＢ３４２、クローン３７４０７．１１１、R & D Systems）にてパンニングしたところ、ｓＣＤ２８との置換であった。４回目のパンニングからのファージをＥＣＬ−ｐｌｕｓメンブラン(Pharmacia)に固定化し、αＣＤ２８の結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ(Jackson Laboratories)で検出した。１９の異なるインサートの配列をギャップなしでＣＤ２８とともにアラインした。ＣＤ２８親和性セクションについては、同じライブラリーを固定化ｓＣＤ２８上でパンニングしたところ、ＳＥＢとの置換であった。
マウス致死率アッセイ
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０〜１２終； Harlan）を、ＳＥＢ(Sigma)および２０ｍｇＤ−ガラクトサミン(Sigma)の腹腔内注射によって抗原刺激した。存在すれば、抗原刺激の３０分後にアンタゴニストペプチドを腹膜内注射した。生存率をモニタリングした。生存力は２週間といった長い間、７２時間超で一定であった。マウスに関する実験は所内動物実験委員会により認可されたものである。
実施例１
ＳＥＢによるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの誘導はＴｈ２サイトカインの同時誘導により弱められる
超抗原により媒介される致死的毒性ショックが超抗原ミメティックペプチドにより妨げられる場合、マウスはさらなる毒素刺激に対する免疫を迅速に獲得し、広範囲の保護的Ａｂを生成した[Arad (2000)同書]。本発明者らは、このアンタゴニストペプチドが致死的ショックをもたらすＴｈ１応答の誘導を遮断する時、それはＴｈ２応答を完全なままとし、防御免疫の形成を可能とするものと推察した。実際、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（図１Ｄ）において、ＳＥＢにより、ＩＬ４およびＩＬ１０はＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現を強力に阻害するレベルまで、著しく阻害された。ＩＬ４またはＩＬ１０に対する中和Ａｂが存在する場合、４〜６時間内に、誘導されたＩＬ２ ｍＲＮＡの増幅率が上昇したが、イソ型適用対照ＩｇＧには効果はなかった（図１Ａ）。ＩＦＮ−γ遺伝子はＩＬ４またはＩＬ１０の枯渇に対して、誘導ｍＲＮＡ波の振幅および期間の増強ならびに早期発現を伴って、はるかに高く応答した（図１Ｂおよび１Ｃ）。このように、ＳＥＢなどの超抗原は過剰なＴｈ１サイトカイン遺伝子発現を誘導するが、それはＩＬ４およびＩＬ１０の同時誘導によって弱められるので、依然としてその全能力より低いままである。これらのＴｈ２サイトカインの早期発現は、超抗原に対する一次応答の必須部分をなす。
実施例２
超抗原ミメティックペプチドによるＴｈ１応答の選択的阻害
ヒトＰＢＭＣにおけるＴｈ１サイトカイン遺伝子の誘導は、ＳＥＢ１５０〜１６１（ＴＮＫＫＫＶＴＡＱＥＬＤ；「アンタゴニストドメイン」、配列番号２としても示される）に一部相同な超抗原ミメティックペプチドＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤ（ｐ１２Ａ、配列番号１としても示される）によって遮断可能である[Arad (2000)同書]。本発明者らは関連ペプチドＶＱＹＮＫＫＫＡＴＶＱＥＬＤ（ｐ１２Ｂ、配列番号３としても示される）を合成し、このＶＱはＳＥＢ１４８〜１４９と相同である。ｐ１２Ｂは、超抗原によるヒトＴｈ１サイトカイン遺伝子の誘導を阻害し、ＳＥＢによる致死的抗原刺激からマウスを保護するその能力において、ｐ１２Ａから区別できる［ＰＣＴ ＩＬ０３／００２７８］。ｐ１２ＢはＳＥＢにより媒介されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を遮断したが、ＩＬ４およびＩＬ１０の誘導は阻害しなかった（図ＩＤ）。この結果は再現性があり、ＳＥＢにより誘導されるＴｈ１およびＴｈ２応答の間の均衡がこのアンタゴニストペプチドによって調節されることを示している。
ＳＥＢの、ＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用はアンタゴニストドメインを接近可能なままとする（図１Ｅ）。ｐ１２Ｂ（配列番号３）のＴｈ１選択性を説明するため、本発明者らは、超抗原による、Ｔｈ２細胞ではなくＴｈ１細胞の活性化がさらなる受容体を必要とし、また、この受容体に対する超抗原の結合がこのアンタゴニストドメインを介して起こり、それをミメティックペプチドによる阻害に対して感受性とするという仮説を立てた（図１Ｆ）。
実施例３
ＳＥＢによるＴｈ１応答の誘導はＢ７−２に依存する
ＣＤ２８欠損マウスを用いた研究では、ＣＤ２８共刺激が超抗原の毒性に必要であることが示唆された[Saha, B. et al., J. Exp. Med. 183:2675-2680 (1996); Mittrucker, H. W. et al. J. Exp. Med. 183(6):2481-8 (1996)]。しかしながら、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）またはその双方がコリガンドとして関与するかどうかは解明されていない[Muraille, E. et al., Immunology 89:245-249 (1996); Krummel, M. F. et al., Int. Immunol. 8(4):519-23 (1996)]。ＳＥＢによるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導は抗Ｂ７−２によって遮断されたが、抗Ｂ７−１によっては遮断されなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。これに対し、ＩＬ１０の同時誘導はいずれかのｍＡｂに対して耐性があった（図２Ｃ）。これらの結果は再現性があり、通常抗原に関して[Carreno and Collins (2002)同書; Collins, A. V. et al., Immunity 17(2):201-10 (2002)に概説]、ＳＥＢによるＴｈ１応答の誘導はＢ７−２／ＣＤ２８を介したシグナル伝達に選択的に依存している。
実施例４
可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＢ７−２はＳＥＢによるＴｈ１応答の誘導を阻害する
Ｔｈ１応答に対するｐ１２Ｂ（配列番号３）の、また、抗Ｂ７−２の阻害効果の同様の選択性は、本発明者らに、ＳＥＢがそのアンタゴニストドメインを介してＣＤ２８またはＢ７−２と結びつく可能性を検討させるに至らせた。ＳＥＢによるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導は、その１５２アミノ酸の細胞外ドメイン（ｓＣＤ２８）を含んでなる可溶型のヒトＣＤ２８により阻害された（図２Ｄ）。これに対し、同じ細胞培養物におけるＳＥＢによるＩＬ１０の誘導は、本質的にｓＣＤ２８によっては影響されなかった（図２Ｅ）。ｓＣＤ２８単独ではこれらの遺伝子を誘導しなかった。ｓＣＤ２８は用量依存的にＩＬ２ ｍＲＮＡの誘導を阻害した（図２Ｆ）。ｓＣＤ２８同様、ｓＢ７−２はＳＥＢにより媒介されるＩＬ２ ｍＲＮＡの誘導を阻害した（図２Ｇおよび２Ｈ）が、ＩＬ１０の誘導は阻害しなかった（図２Ｉ）。これらの結果は、ＳＥＢが共刺激リガンドとしてＣＤ２８およびＢ７−２を用いることを示唆し得るが、本発明者らは、Ｔｈ１応答を惹起するために、ＳＥＢは一方または双方に直接結合し得るものと推測した。
ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８は構造的に相同で、同じＢ７コリガンドと相互作用して反対のシグナルを送達する[Collins (2002)同書; Sansom, D. M. et al., Trends Immunol. 24(6):314-9 (2003)に概説]。本発明者らは、ＳＥＢにより誘導されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現に対するｓＣＴＬＡ４の作用を調べた。ｓＣＴＬＡ４はこの発現を遮断した（図２Ｊ）が、ｓＣＤ２８とｓＢ７−２については、ＩＬ１０の誘導は完全なままであった（図２Ｋ）。ｓＣＴＬＡ４はこれまでに示唆されているように[Zhou, T. et al., Eur. J. Immunol. 24(5):1019-25 (1994)]、Ｂ７−２をめぐって競合することでＳＥＢの作用を阻害することができるが、本発明者らは、それがＳＥＢと結合することで、細胞表面ＣＤ２８および／またはＢ７−２を有する超抗原の相互作用を妨げるという可能性を考えた。
実施例５
ＳＥＢはＣＤ２８の表面接近性に一時的変化を誘導する
本発明者らは、次に、ＣＤ２８ ｍＡｂ（αＣＤ２８）またはポリクローナルＣＤ２８ Ａｂ（ＣＤ２８ Ａｂ）を用いて、ＳＥＢによる活性化の過程中のＣＤ４富化ヒトＰＢＭＣを染色した。ＣＤ２８に休止細胞および活性化細胞上のＣＤ２８ Ａｂに接近可能であったが、ＳＥＢによる誘導後６時間まで一時的にだけαＣＤ２８に対して利用可能となった（図３Ａ）。ゆえに、ＣＤ２８は細胞表面上で構成的に発現されるが、それはＳＥＢにより誘導されるエピトープ提示の一時的変化を受け、これはこれらのリガンドの間の機能的相互作用のさらなる証拠である。
実施例６
超抗原ミメティックペプチドはＣＤ２８を介したシグナル伝達を遮断する
他のリガンドとは独立に、Ｔｈ１サイトカイン遺伝子の活性化におけるＣＤ２８の役割を調べるため、本発明者らはαＣＤ２８単独でＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡを誘導した。この誘導は超抗原ミメティックペプチドｐ１２Ｂ（配列番号３、図３Ｂ）によって遮断された。αＣＤ２８とαＣＤ３の組合せは、いずれのｍＡｂ単独の場合よりも高い発現を惹起したが、この誘導はｐ１２Ｂにより実質的に完全に消失された（図３Ｃ）。これに対し、αＣＤ２８／αＣＤ３ＢによるＩＬ１０の誘導はｐ１２Ｂに対して耐性を示した（図３Ｄ）。このように、超抗原の不在下では、このアンタゴニストペプチドはＣＤ２８により導入されたＴｈ１応答に活性化を選択的に遮断した。予期されたようにαＣＤ２８はｓＣＤ２８と結合したが、ｐ１２Ｂとは結合できず（図３Ｅ）、このことはこのペプチドがＣＤ２８をめぐってαＣＤ２８と競合することを示す。
本発明者らは、次に、ＣＤ２８を介したＢ７−２のシグナル伝達に対するｐ１２Ｂの作用を調べた。ｓＢ７−２は早期に誘導され、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現を維持したが、このｐ１２Ｂにより阻害される誘導は２０時間までだけであった（図３Ｆ）。超抗原ミメティックペプチドはαＣＤ３による誘導を有意には阻害しなかったが、ｓＢ７−２とαＣＤ３の組合せによる誘導を無効とし、これはいずれのリガンド単独の場合よりも大きかった。αＣＤ２８またはｓＢ７−２はＩＬ１０を誘導することができず、αＣＤ３によるＩＬ１０の誘導は、αＣＤ２８またはｓＢ７−２によって増大せず、ｐ１２Ｂによって阻害もされなかった（図３Ｄおよび３Ｇ）。
これらの機能的研究は、ＩＬ１０の誘導はＣＤ２８には依存しないことを示す。これは、ＳＥＢにより媒介されるＩＬ１０の誘導が抗Ｂ７−２、ｓＢ７−２、ｓＣＤ２８およびｓＣＴＬＡ４に対して耐性であることの説明となる（図１Ｄおよび２）。ＣＤ２８を介したシグナル伝達は超抗原に対するＴｈ１応答に選択的に必要である。ＳＥＢの不在下であっても、この超抗原ミメティックペプチドはＣＤ２８により媒介されるＴｈ１の活性化を遮断したという発見は、本発明者らを、超抗原がＣＤ２８との結合のために相同なアンタゴニストドメインを用いるのかどうかを検討するに至らせた。
実施例７
ＳＥＢはそのアンタゴニストドメインを介してＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳと結合する
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡結合研究では、超抗原とＴＣＲまたはＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用は弱いもで、解離定数はマイクロモル範囲であることが示されている[Seth, A. et al., Nature 369: 324-327 (1994); Redpath, S. et al., J. Immunol 163:6-10 (1999)]。図４によって示されるように、ＳＥＢをＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定化した場合、可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳの直接的結合（ＫＤ値はそれぞれ２８、３１および２１ｎＭ）（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）が検出されたが、免疫グロブリン超ファミリーであるヒトＩｇＧの別のメンバーとの直接的結合は検出されなかった（示されていない）。このように、ＳＥＢは共刺激受容体ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳのトリアッドの各メンバーと、ＴＣＲまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に対するものよりも十分に高い親和性で直接結合する。
本発明者らは、次に、ｐ１２ＧＣＣ（末端システインを隣接させたｐ１２Ａ）を固定化した。このペプチドは、ヒトＰＢＭＣにおいてＳＥＢにより媒介されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を遮断する際、ｐ１２と同等の活性であった（示されていない）。可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳはｐ１２ＣＣと、それぞれ７６、３３および４２ｎＭのＫＤ値で直接結合した（図４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆ）。ｐ１２Ｂ（配列番号３）を固定化した場合にも同様の結果が得られた（示されていない）。ヒトＩｇＧに関しては結合は検出されなかった。ｐ１２ペプチドに対する親和性は完全なＳＥＢに対する親和性とは有意に異なっていた、本発明者らは、ＳＥＢがＣＤ２８との結合のためにそのアンタゴニストドメインを用いる。このドメインの超抗原機能における重要な役割に一致して、αｐ１２Ｂ Ａｂは、頂抗原の致死性に関する確立されたモデルであるＤ−ガラクトサミン感作マウス[Arad (2000) 同書]においてＳＥＢによる致死的抗原刺激に対して完全な保護を示した（図４Ｇ）。
ＣＤ２８コリガンドｓＢ７−２はまたＳＥＢとも、ＫＤ値２５ｎＭで直接結合した（図４Ｈ）。この親和性はｓＣＤ２８のＳＥＢに対する親和性（図４Ａ）およびｓＣＤ２８のｓＢ７−２に対する親和性（ＫＤ値１９ｎＭ；図４１）と同等であったが、会合・解離率は大きく、結合力の低さを証明している。Collins et al., [Collins (2002)同書]は、ｓＣＤ２８のｓＢ７−２に対するはるかに低い親和性を報告している（３７℃でＫＤ値２０μＭ）。もっともらしくは、この不一致は温度、ｓＣＤ２８の提示方法および用いる組換えｓＣＤ２８調製物の活性によるものである。これに対し、αＣＤ２８は、２ｎＭのＫＤ値で再現性よくｓＣＤ２８と結合する。
Ｔｈ１サイトカイン遺伝子発現分析の結果（図１Ｄ、２および３）は、ＳＥＢがＣＤ２８と直接相互作用すること、およびこの結合が超抗原のアンタゴニストドメインを介して起こるという知見によって容易に合致される。
実施例８
ＣＤ２８に対する親和性によるＳＥＢアンタゴニストペプチドの選択
超抗原とＣＤ２８の間の直接的相互作用に関する独立した証拠を得るため、本発明者らは、ＳＥＢを有する結合ファージを展示する、固定化ｓＣＤ２８上のランダムな１２マーのファージディスプレーライブラリーを繰り返しパンニングした。選択したファージの１０％を超えるものがｓＣＤ２８と強固に結合し（図５Ａ）、これらのファージから４０を超えるペプチドを単離した（配列番号２５〜５６で示される）。４つのファージに由来するペプチドのアゴニスト活性を分析した。ｐｅ１２（ＳＨＦＴＨＮＲＨＧＨＳＴ、配列番号６でも示される）は、なお超抗原アゴニスト活性を欠いたＳＥＢによるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を強く阻害し（図５Ｂ）、ＩＬ１０の誘導を阻害することはできず（図５Ｃ）；ｐｄ７（ＷＨＡＨＰＨＫＫＰＷＡ、配列番号７でも示される）（図５Ｅ）およびｐｃ３（ＦＨＫＨＫＮＰＧＳＰＩＩ、配列番号８でも示される）も同様にＴｈ１サイトカイン遺伝子の誘導を阻害したす（図５Ｆ）。これらのペプチドはin vivoでもＳＥＢアンタゴニスト活性を示した。それぞれＳＥＢの２倍および５倍モル過剰のみで、ｐｅ１２およびｐｃ３は、対照群では生存個体がなかった致死的抗原投与から８／１０および７／１０個体のマウスを保護した（図５Ｄ）。ペプチドｐｄ７もまた、ＳＥＢによる致死的抗原刺激からマウスを保護した（図５Ｇ）。ｐｅ１２、ｐｃ３およびｐｄ７単独では検出可能な毒性はなかった（図５Ｄおよび５Ｇ）。
このように、新規な超抗原アンタゴニストは、単にＣＤ２８におけるＳＥＢ結合部位に関するそれらの親和性によってランダムペプチド配列から選択することができる。
実施例９
二量体界面に対する、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４マップにおけるＳＥＢの結合部位
超抗原ミメティックペプチドｐ１２はＣＤ２８と結合する（図４Ｄ）ことから、ｐ１２Ｂ（配列番号３）がＴｈ１サイトカイン遺伝子発現に関するαＣＤ２８によるシグナル伝達を遮断したという知見（図３Ｈおよび３１）から、このペプチドがＣＤ２８中のそのエピトープをめぐってこのｍＡｂと競合することが示唆された。エピトープマッピングにより、配列番号９でも示される配列ＣＤ２８１１６〜１２４、ＨＶＫＧＫＨＬＣＰが定義されたが、ここでＨＶＫＧＫＨ（配列番号１０）はＣＴＬＡ４中の二量体形成ドメインＹＶＩＤＰＥ（配列番号１８でも示される）[Schwartz (2001)同書]（図６Ａ）に相当する。それらは相同性が高く、同様に折りたたまれていると考えられるが[Luhder, F. et al., J. Exp. Med. 197(8):955-66 (2003)]、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４配列はこのドメインならびに残基１０〜１５が異なり、この折りたたまれたＣＴＬＡ４タンパク質においては、これら２つのドメインは並置していて二量体界面を作り出している（図６Ａ、赤と緑）。残基９７〜１０５において保存されているＢ７結合ドメインはＣＴＬＡ４の反対側に位置し（図６Ａ、黄色）二量体界面を接近可能なものとしている。
このＣＤ２８エピトープマッピングを確認するため、本発明者らはペプチドＡ７ＨＶＫＧＫＨＬＣＰ（ｐＴＡ、配列番号１１でも示される）を合成した。ｓＣＤ２８同様、ｐＴＡはその誘導が初期に生じるものであれ後期に生じるものであれ、αＣＤ２８によるＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を排除した（図６Ｂ）。このことから、このｍＡｂが、最も可能性の高いところではＣＤ２８二量体界面の一部を含むＣＤ２８１１６〜１２４ドメインと結びつくという機能的証拠が得られる。
実施例１０
ＣＤ２８における推定二量体界面のペプチドミメティックは超抗原によるＴｈ１応答の誘導を遮断する
上記の結果は、Ｔｈ１応答を惹起するには、ＳＥＢはＨＶＫＧＫＨＬＣＰモチーフ（配列番号９）と重複する部位においてＣＤ２８と結合しなければならないということを意味する。ｓＣＤ２８（図２）同様、ｐＴＡはＳＥＢによるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を用量依存的に（図６Ｆ）遮断した（図６Ｃ）［ＷＯ０３／０８４９９５によって示されているように］。これに対し、それはＩＬ１０およびＩＬ４の誘導は完全なままとしたが（図６Ｄおよび６Ｅ）、これは超抗原ミメティックペプチドｐ１２ＢのＴｈ１特異性を反映している（図１および３）。本発明者らは次に、ＣＤ２８ミメティックペプチドＨＶＫＧＫＨＬＣＰ（ｐ１ＴＡ、配列番号９でも示される）およびＳＰＭＬＶＡＹＤ（ｐ２ＴＡ；ＣＤ２８８−１５、配列番号１２でも示される）を合成した［本発明者らのこれまでの出願に示されている、１６８２４ｗｏ、非公開］。単にエピトープマッピングに基づけば、ｐ２ＴＡはＳＥＢアンタゴニストとして機能するとは予測されなかった。本発明者らは、Ｔｈ１応答を誘導するためにこの超抗原がＣＤ２８に関して推定される二量体界面の両辺縁と接しなければならないとすれば、ｐ２ＴＡはアンタゴニストではないかと仮定した（図６Ａ）。実際、ｐ１ＴＡ（配列番号９）およびｐ２ＴＡ（配列番号１２）は各々ＳＥＢにより誘導されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現と拮抗した（図６Ｇ）。このｐ１ＴＡとｐ２ＴＡの組合せは有意にはより有効でなかった。無作為にスクランブルされた順序でｐ１ＴＡのアミノ酸を含むｐ１ＴＡはアンタゴニスト活性を欠いていた（図７Ａ）。これらの結果から、ＣＤ２８中の超抗原に対する機能的結合部位はｐ１ＴＡとｐ２ＴＡの配列からなえう混成物であるという有力な証拠が得られる。
細菌超抗原ファミリー内で、毒性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）は他のメンバーと最も著しく異なっており、ＳＥＢとの全配列相同性は６％に過ぎない。ＴＳＳＴ−１はそのアンタゴニストドメインＦＤＫＫＱＬＡＩＳＴＬＤ（配列番号１３でも示される）は、他の超抗原よりもＳＥＢドメインＴＮＫＫＫＶＴＡＱＥＬＤ（配列番号２でも示される）に対してはるかに低い配列相同性を示すが、このドメインはそれにもかかわらずやはり空間的保存を示す[Arad (2000)同書]。実際に、ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡはＴＳＳＴ−１によるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を阻害した（図６Ｈ）。従って、ｐ１２Ａ同様、ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡは超抗原アンタゴニストとして広域活性を示す。最も可能性の高いところでは、それらは超抗原中のアンタゴニストドメインをめぐって細胞表面ＣＤ２８と競合することで働く。
実施例１１
二量体界面由来のＣＤ２８ミメティックペプチドは致死的ショックからマウスを保護する
本発明者らは、ｐ１ＴＡ（配列番号９）およびｐ２ＴＡ（配列番号１２）がin vivoにおいてＳＥＢアンタゴニスト活性を阻害するかどうかを調べるためにマウスモデルを用いた。総ての対照（１０／１０）がＳＥＢにより死滅したが、ＳＥＢの少し前に一回量のｐ１ＴＡを投与した７／１０のマウスは生存した（図７Ｂ）。ｐ１ＴＡはＳＥＢの３．６倍過剰で存在する場合に７０％の保護を示した。これに対し、ｐ１ＴＡｓｃは保護を付与することができなかった。ＳＥＢの１２倍モル過剰で、ｐ１２Ｂもまた７０％の保護を与えた。ｐ２ＴＡは致死的ショックからマウスを保護したが、ｐ２ＴＡｓｃは保護しなかった（図７Ｃ）。一回量のｐ２ＴＡも投与したマウスでは８／１０が生存したのに対し、ＳＥＢ単独で抗原刺激した対照では３／１０しか生存しなかった。ｐ２ＴＡは、in vivoにおいてＳＥＢに対して０．８倍モル比の場合のみアンタゴニストとして効果的であった。これらの結果は再現性があった。ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡ単独では、それぞれ保護に必要であったものより２５倍および１２５倍高い濃度であっても検出可能な毒性がなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。
ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡの、毒素に対して極めて低モル過剰でＳＥＢにより誘導される致死的ショックからマウスを保護する能力およびＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの誘導を遮断する能力（図６Ｇおよび６Ｈ）は、推定ＣＤ２８二量体界面の２つの辺縁の各々が超抗原による有害なＴｈ１応答の活性化において重要な役割を果たすということを示している。
実施例１２
ＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳの二量体界面のペプチドミメティックはＳＥＢアンタゴニストである
ＳＥＢはＣＤ２８に結合するだけでなく、関連の受容体ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳにも結合する（図４）。本発明者らは、二量体界面でＣＴＬＡ４との相互作用も起こるかどうかを調べた。実際に、ＣＴＬＡ４二量体界面の２つの辺縁の各々に由来するペプチド、ＹＶＩＤＰＥＰＣＰ（ｐ１ＴＢ、配列番号１４でも示される）およびＰＡＶＶＬＡＳＳ（ｐ２ＴＢ、配列番号１５でも示される）は、ＩＬ２およびＩＦＮ−γ遺伝子の誘導を阻害したが、なお、ＩＬ１０の誘導を完全なままとする有力なＳＥＥアンタゴニストであった（図７Ｄおよび７Ｅ）。ｐ１ＴＢおよびｐ２ＴＢは、ＳＥＢに対して２倍モル過剰で存在する場合のみ、致死的抗原刺激からマウスを保護した（図７Ｆ）。
共受容体トリアッドの第三のメンバーであるＩＣＯＳ[Hutloff, A. et al., Nature 397(6716):263-6 (1999); Coyle, A. J. et al., Immunity 13(1):95-105 (2000)]は異なるコリガンドＩＣＯＳＬ［Sharpe and Freeman, (2002) 同書に概説］を用い、従って、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４とは異なる働きをするのが明らかである。図６Ｉに示されているように、本発明者らはヒトＩＣＯＳとＣＤ２８をアラインし、２つのペプチド、ＹＥＳＱＬＣＣＱＬ（ｐ１ＴＣ、配列番号１６でも示される）およびＧＥＩＮＧＳＡＮ（ｐ２ＴＣ、配列番号１７でも示される）を合成し、これらがＣＴＬＡ４／ＣＤ２８の二連の二量体界面に相当するのではないかという仮説を立てた。実際に、ｐ１ＴＣおよびｐ２ＴＣはＳＥＢに対するＴｈ１サイトカイン応答を阻害したが、ＩＬ１０の誘導は阻害せず（図７Ｇおよび７Ｈ）、超抗原による致死的抗原刺激からマウスを保護した（図７Ｉ）。
本発明者らは、ＳＥＢはＣＤ２８の（推定）二量体界面と直接結合するだけでなく、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの二量体界面と直接結合する能力を有すると結論付けた。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／ＩＣＯＳトリアッドの二量体界面に由来するペプチドは、全体としては相同性を欠いてはいるが、Ｔｈ１サイトカイン応答の誘導を遮断し、致死的毒性ショックから保護する有力な超抗原アンタゴニストである。このように、２つの異なるクラスのアンタゴニストペプチドは超抗原とＣＤ２８の直接的結合に関する重要な役割（すなわち、ＣＤ２８をめぐって超抗原と競合する超抗原ミメティックと、超抗原をめぐってＣＤ２８と競合する共受容体トリアッドのミメティック）を定義する（図７Ｊ）。
図１Ａ〜１Ｆ：超抗原ミメティックペプチドによるＴｈ１活性化の選択的阻害。図１Ａ：ＩＬ４とＩＬ１０の同時誘導による、ＳＥＢ誘導型のＩＬ２遺伝子発現の阻害。ヒトＰＢＭＣをヒトＩＬ４（αＩＬ４；Genzyme）（□）またはＩＬ１０（αＩＬ１０；Pharmingen）（△）に対するラット中和Ａｂを１：１０４倍希釈したものとともに、またはＳＥＢ（○）とともに、またはＳＥＢおよびイソ型適合抗ヒトＩｇＧ（●）、αＩＬ４（黒四角）もしくはαＩＬ１０（▲）とともにインキュベートした。ＩＬ２ ｍＲＮＡは実験手順に記載のように、ＩＬ２アンチセンスＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより定量した。なお、フィルムの黒化は６３０ｎｍで読みとった。オートラジオグラムは６時間のデータを示す。図１Ｂ、１Ｃ：ＩＬ４とＩＬ１０の同時誘導によるＳＥＢ誘導型のＩＦＮ−γ遺伝子発現の阻害。ＰＢＭＣを示されているようにＳＥＢとともに、またはＳＥＢ（−）を伴わずに、αＩＬ４またはαＩＬ１０とともにインキュベートし、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡを、読みとり対照としてはｒＲＮＡを用い、実験手順に記載のようにＲＮアーゼ保護分析により定量した。（Ｂ）と（Ｃ）は独立した実験を表す。図１Ｄ：ｐ１２ＢはＳＥＢにより媒介されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導は阻害するが、ＩＬ４およびＩＬ１０の誘導は阻害しない。ＰＢＭＣは１０ｐｇ／ｍｌのｐ１２Ｂの不在下（○）または存在下（●）ＳＥＢで誘導した。ＩＬ２ ｍＲＮＡおよびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡを、ロード対照としてアクチンｍＲＮＡを用い、ＲＮアーゼ保護分析により定量した。培地中のＩＬ４およびＩＬ１０はｂｙＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット(R & D Systems)により測定した。図１Ｅ：ＳＥＢ中のアンタゴニストドメイン。ＲａｓＭｏｌで作製したＳＥＢ構造（ｐｄｂ３ｓｅｂ．ｅｎｔ）において、１５０〜１６１ドメインはマゼンタのリボンとして示される。ＭＨＣ ＩＩと接しているアミノ酸側鎖を赤で示し、ＴＣＲと接しているものを緑で示してある[Papageorgiou, A. C. et al., J. Mol. Biol. 277:61-79(1998)]。図１Ｆ：検討仮説：新規な受容体は超抗原によるＴｈ１細胞の活性化に選択的に用いられる。Ｔｈ１細胞を活性化させるためには、超抗原をＭＨＣ ＩＩおよびＴＣＲと結びつける必要があるだけでなく、Ｔｈ２細胞の活性化には重要でない新規な受容体とも結びつけなければならない。アンタゴニストペプチドとこの受容体とが結合すると、Ｔｈ１細胞の活性化が選択的に遮断され、生存ならびにＴｈ２により媒介される防御免疫がもたらされる。明瞭にするために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＭＨＣ ＩＩは除いた。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）、ｓＡｇ（超抗原）、Ｎｏｖ． Ｒｅｃ．（新規な受容体）、Ｄｅａ．（死）、Ｓｕｒｖ．（生存）、Ｐｒｏｔ．Ｉｍｍ．（防御免疫）、Ａｎｔａ．（アンタゴニスト）。 図２Ａ〜２Ｋ：ＣＤ２８を介するＳＥＢシグナル。図２Ａ〜２Ｃ：抗Ｂ７−２ ｍＡｂはＳＥＢにより誘導されるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現を阻害するが、ＩＬ１０の発現は阻害しない。ＰＢＭＣをＳＥＢを伴わずに（□、△）または１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＢとともに（○、黒四角、▲）、ｍＡｂを伴わずに（○）または１：１０４希釈した抗Ｂ７−１（□、黒四角）もしくは抗Ｂ７−２（△、▲）(R & D Systems)とともにインキュベートした。ＩＬ２ ｍＲＮＡおよびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡは図１Ａと同様に分析した（ドットは８時間目の値を示す）。培地中のＩＬ１０はＥＬＩＳＡによりアッセイした。図２Ｄ〜２Ｋ：ＳＥＢによるＩＬ２ ｍＲＮＡ、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡおよびＩＬ１０の誘導に対するＣＤ２８、ｓＢ７−２およびｓＣＴＬＡ４の作用。図２Ｄ〜２Ｅ：ＰＢＭＣをＳＥＢ（○）、１μｇ／ｍｌ ｓＣＤ２８(R & D Systems)（△）または両者（●）で誘導し、ＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡは、ロード対照としてアクチンｍＲＮＡを用い、ＲＮアーゼ保護分析により測定し、ＩＬ１０はＥＬＩＳＡにより測定した。（図２Ｆ）ＰＢＭＣを１ｎｇ／ｍｌ ＳＥＢ単独とともに、またはｓＣＤ２８（μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、ＩＬ２ ｍＲＮＡを測定した。図２Ｇ〜２Ｉ ＰＢＭＣを１ｎｇ／ｍｌ ＳＥＢ単独とともに（○）または１００ｎｇ／ｍｌ ｓＣＤ２８（▲）もしくはｓＢ７−２（黒四角）とともにインキュベートし、図２ＧにおいてＩＬ２ ｍＲＮＡ（図２Ｈ）およびＩＬ１０を測定した。図２Ｊ〜２Ｋ：ＰＢＭＣをＳＥＢ単独（○）、または１０ｎｇ／ｍｌ ｓＣＤ２８（▲）もしくは１μｇ／ｍｌ ｓＣＴＬＡ４（黒四角）で誘導し、ＩＬ２ ｍＲＮＡ、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡおよびＩＬ１０を測定した。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、Ｕｎ．（ユニット）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）。 図３Ａ〜３Ｇ：超抗原ミメティックペプチドｐ１２ＢはＣＤ２８を介するシグナル伝達を阻害する。図３Ａ：ＳＥＢはＣＤ２８の細胞表面提示に変化をもたらす。ＣＤ４細胞はＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ(Stem Cell Technologies)を用いてＰＢＭＣから９０％まで濃縮し、４×１０６細胞／ｍｌの密度でＳＥＢとともにインキュベートし、示された時間にαＣＤ２８ ｍＡｂ(R & D Systems)（二次Ａｂ：Ｃｙ−２、緑；Jackson Laboratories）またはポリクローナルＣＤ２８ Ａｂ（二次Ａｂ：Ｃｙ−３、赤；Jackson Laboratories）で染色した。共焦蛍光顕微鏡を示す。Ｍｅｒ．（辺縁）、両Ａｂでの二重染色。図３Ｂ〜３Ｅ：ｐ１２はＢαＣＤ２８ ｍＡｂによるＴｈ１サイトカインの誘導を阻害する。図３Ｂ：ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのｐ１２Ｂの不在下または存在下で、２．５μｇ／ｍｌのαＣＤ２８とともにインキュベートし、ＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡを測定した。なお、アクチンｍＲＮＡ（示されていない）をロード対照として用いた。図３Ｃ〜３Ｅ：ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのｐ１２Ｂの不在下（▲）または存在下（●）で、２．５μｇ／ｍｌのαＣＤ２８（○）または０．１μｇ／ｍｌのαＣＤ３ ｍＡｂ(R & D Systems)（Ｄ）（□）または両者（▲、●）とともにインキュベートした。ＩＬ２ ｍＲＮＡ、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡおよびＩＬ１０を測定した。なお、アクチンｍＲＮＡ（示されていない）をロード対照として用いた。αＣＤ２８がｐ１２Ｂとは結合しないことを示すため、ｓＣＤ２８またはｐ１２Ｂを固定化し、αＣＤ２８の結合を、アルカリ性ホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ(Jackson Laboratories)を用い、ＥＬＩＳＡによりアッセイした（図３Ｅ）。図３Ｆ、３Ｇ：ｐ１２ＢはｓＢ７−２／αＣＤ３によるＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導を阻害する。ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのｐ１２Ｂの不在下（□、○、△）または存在下（黒四角、●、▲）で、０．１μｇ／ｍｌのαＣＤ３（□、黒四角）、１μｇ／ｍｌのｓＢ７−２（○、●）とともにインキュベートした。ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ、アクチンｍＲＮＡ およびＩＬ１０を測定した。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）、ｍＡｂ（モノクローナル抗体）、Ａｂ（抗体）、Ｂｏ．（結合）。 図４Ａ〜４Ｉ：ＳＥＢはそのアンタゴニストドメインを介してＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳと結合する。図４Ａ〜４Ｃ：０．２５μＭから二倍増までの範囲の濃度の可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの、固定化ＳＥＢに対する結合に関する相対的表面プラズモン共鳴応答の代表的特性を実験手順に記載のようにして求めた（６９５ＲＵ）。図４Ｄ〜４Ｆ：それぞれ０．１２５、０．０６３および０．０６３μＭから二倍増までの濃度の可溶性ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの、固定化ｐ１ＣＣに対する結合に関する相対的表面プラズモン共鳴応答の代表的特性（１，９５０ＲＵ）。図４Ｇ：ポリクローナルウサギ抗ｐ１２Ｂ Ａｂ（αｐ１２Ｂ；Genemed Synthesis）は致死的なＳＥＢ免疫刺激からマウスを保護する。５個体のマウス群を、２０μｇのＳＥＢで直接（○）、または２００μｌの非希釈αｐ１２Ｂの腹腔内注射から３０分後（●）に免疫刺激した。生存率が示されている。図４Ｈ：０．２５μＭから二倍増までの範囲の濃度のｓＢ７−２の、固定化ＳＥＢに対する結合に関する相対的表面プラズモン共鳴応答の代表的特性（６９５ＲＵ）。図４Ｉ：３１．２５ｎＭから二倍増までの範囲の濃度のｓＢ７−２の、固定化ｓＣＤ２８に対する結合に関する相対的表面プラズモン共鳴応答の代表的特性（３，４００ＲＵ）。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、ｓｅｃ（秒）、Ｒｅｓｐ．ｄｉｆｆ．（応答差）、Ｓｕｒｖ．（生存率）。 図５Ａ〜５Ｆ：新規なＳＥＢアンタゴニストペプチドはＣＤ２８に対する親和性により選択される。図５Ａ：ｓＣＤ２８と強固に結合するファージのスクリーニングアッセイ。ｓＣＤ２８に対するランダム１２−ｍｅｒファージディスプレーライブラリーのパンニングとＳＥＢによる置換を４回行った後、ファージをＥＣＬを含むメンブランに固定化し、ｓＣＤ２８の結合を、ｈＨＲＰ結合ｓＣＤ２８(R & D Systems)を用いて検出した。陽性対照はαＣＤ２８ ｍＡｂ（ｈｌ２）。陰性対照は挿入部を欠くファージ（ｈ５−ｈ７）。図５Ｂ、５Ｃ：ｐｅ１２のアンタゴニスト活性。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＢ（○）、１μｇ／ｍｌ ｐｅ１２（Ａ参照）または両者（●）で誘導した。ＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡおよびＩＬ１０を測定した。図５Ｄ：ｐｅ１２およびｐｃ３はＳＥＢによる死滅からマウスを保護する。１０個体のマウス群を、７．５μｇのＳＥＢ単独（□）または０．２μｇのｐｅ１２（●）もしくは０．５μｇのｐｃ３（△）（別のＥＣＬアッセイからのもの）で免疫刺激した。対照には、ＳＥＢを用いず、Ｄ−ガラクトサミンの注射３０分前に１μｇのｐｅ１２（○）またはｐｃ３（△）を与えた。生存率をモニタリングした。図５Ｅ：ｐｄ７のアンタゴニスト活性。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＢ、示されたｎｇ／ｍｌ濃度のｐｄ７、または両者で誘導した。ＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡを測定した。図５Ｆ：ｐｃ３のアンタゴニスト活性。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＢ、示されたｎｇ／ｍｌ濃度のｐｃ３、または両者で誘導した。ＩＬ２ ｍＲＮＡを測定した。図５Ｇ：ｐｄ７はＳＥＢにより死滅からマウスを保護する。１０個体のマウス群を６μｇのＳＥＢ単独（□）または０．５μｇのｐｄ７（▲）で抗原刺激した。対照には、ＳＥＢを用いず、Ｄ−ガラクトサミンの注射３０分前に２．５μｇのｐｄ７（△）を与えた。生存率をモニタリングした。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）、Ｓｕｒｖ．（生存率）。 図６Ａ〜６Ｉ：ＣＤ２８に関して推定される二量体界面のペプチドミメティックは超抗原アンタゴニスト。図６Ａ：ＣＴＬＡ４／Ｂ７−２複合体およびＣＴＬＡ４の二量体界面。ＲａｓＭｏｌで作製したＣＴＬＡ４／Ｂ７−２複合体のリボンダイアグラム（１１８５．ｐｄｂ；[Schwartz (2001)同書]において、下に示されているヒト（ｈ）およびネズミ（ｍ）ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の配列アラインメントのように、１つのＢ７−２モノマーはマゼンタ、他方はグレー、ＣＴＬＡ４は青、ＭＹＰＰＰＹ（配列番号２２）は黄色、ＹＶＩＤＰＥ（配列番号１８）（ＣＤ２８のＨＶＫＧＫＨ、配列番号１０）は赤、ＶＶＬＡＳＳ（配列番号２３）（ＣＤ２８のＭＬＶＡＹＤ（配列番号２４））は緑で示され、保存されている残基は太字で示される。図６Ｂ：αＣＤ２８によるＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導に対するｓＣＤ２８およびｐＴＡの作用。ヒトＰＢＭＣを２５０ｎｇ／ｍｌ αＣＤ２８ ｍＡｂ単独またはｓＣＤ２８もしくはｐＴＡで誘導した（μｇ／ｍｌ）。ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡを測定した。図６Ｃ〜６Ｆ：ｐＴＡはＳＥＢによるＴｈ１サイトカインｍＲＮＡの誘導に拮抗する。ＰＢＭＣをＳＥＢ単独（○）または０．１μｇ／ｍｌのｓＣＤ２８（●）または１０μｇ／ｍｌのｐＴＡ（▲）で誘導した。ＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡ、ＩＬ１０ならびにＩＬ４を測定した。また別の試験では（Ｆ）、ｐＴＡを増加濃度（μｇ／ｍｌ）で加え、ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡを測定した。６Ｇ、６Ｈ：ｐ１ＴＡおよびｐ２ＴＡはＳＥＢまたはＴＳＳＴ−１によるＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの誘導に拮抗する。（Ｇ）ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ単独、または０．１μｇ／ｍｌのｐ１ＴＡ、ｐ２ＴＡまたは両者で誘導した。（Ｈ）ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＳＴ−１(Sigma)単独、または示されているようなμｇ／ｍｌ濃度のｐ１ＴＡまたはｐ２ＴＡで誘導した。ＩＬ２およびＩＦＮ−γ ｍＲＮＡえお測定した。なお、アクチンｍＲＮＡ（示されていない）をロード対照として用いた。図６Ｉ：ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４とのＩＣＯＳの配列アラインメント。ヒト（ｈ）ＩＣＯＳ（受託番号ＡＡＨ２８００６）、ネズミ（ｍ）ＩＣＯＳ（受託番号ＮＰ＿０５９５０８）、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列が示されている。このＣＤ２８配列はナンバリングされている。ｈＩＣＯＳとｈＣＤ２８との間で保存されている残基は深青緑で示され、Ｂ７結合部位を黄色で示す。保存されている残基は太字で示されている。ＩＣＯＳとのアラインメントに用いられるＣＤ２８中のギャップはマゼンタで示されている。シアン色のＩＣＯＳ中の配列はＣＤ２８およびＣＴＬＡ４中の２つの二量体界面配列（赤および緑）と、対応するＣＯＳペプチドｐ１ＴＣはＣＤ２８ペプチドｐ１ＴＡおよびＣＴＬＡ４ペプチドｐ１ＴＢと並べ、対応するＩＣＯＳペプチドｐ２ＴＣはＣＤ２８ペプチドｐ２ＴＡとＣＴＬＡ４ペプチドｐ２ＴＢと並べてある。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）。 図７Ａ〜７Ｊ：ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳミメティックペプチドは致死的ショックからマウスを保護する。図７Ａ：ｐ１ＴＡのアンタゴニスト活性は配列特異的である。ＰＢＭをＳＥＢ単独または１μｇ／ｍｌのｐ１ＴＡもしくはそのスクランブル形態のｐ１ＴＡｓｃ（ＣＨＧＨＬＶＰＫＫ；配列番号４でも示される）で誘導した。ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡを測定した。図７Ｂ、７Ｃ：ＣＤ２８ミメティックペプチドはＳＥＢによる致死的抗原刺激からマウスを保護する。１０個体のマウス群を６μｇのＳＥＢ単独（□）またはｐ１ＴＡ（１μｇ）（▲）、ｐ１２Ｂ（５μｇ）（○）もしくはｐ１ＴＡｓｃ（１μｇ）（●）（図７Ｂ）、あるいは０．２μｇのｐ２ＴＡ（▲）もしくはそのスクランブル型のｐ２ＴＡｓｃ（ＡＳＭＤＹＰＶＬ；配列番号５でも示される）（●）（図７Ｃ）で抗原刺激した。対照には、ＳＥＢを用いず（△）、Ｄ−ガラクトサミンの注射３０分前に２５μｇのｐ１ＴＡ（図７Ｂ）またはｐ２ＴＡ（図７Ｃ）。図７Ｄ〜７Ｆ：ＣＴＬＡミメティックペプチドのアンタゴニスト活性。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌＳＥＢ単独（○）、または１μｇ／ｍｌのｐ１ＴＢ（▲）もしくはｐ２ＴＢ（黒四角）で誘導した。ＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡ、ならびにＩＬ１０を測定した。図７Ｇ〜７Ｉ：ＩＣＯＳミメティックペプチドのアンタゴニスト活性。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ単独（○）または１μｇ／ｍｌのｐ１ＴＣ（▲）もしくは０．１μｇ／ｍｌのｐ２ＴＣ（黒四角）で誘導した。ＩＬ２、ＩＦＮ−γおよびアクチンｍＲＮＡ、ならびにＩＬ１０を測定した。１０個体のマウス群を５μｇのＳＥＢ単独（○）、または２．５μｇのｐ１ＴＣ（●）および６μｇのＳＥＢ単独（△）または０．２μｐの２ＴＣ（▲）で免疫刺激した。図７Ｊ：超抗原によるＴｈ１細胞活性化のモデル。ＣＤ２８に対する超抗原の直接的結合が活性化に必要であり、各リガンドの接触領域のペプチドミメティック、すなわち、超抗原のアンタゴニストドメインおよびＣＤ２８の推定二量体界面の２つの辺縁（赤および緑）により遮断することができる。略号：Ｔ（時間）、ｈｒ．（時間）、ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）、Ｓｕｒｖ．（生存率）、ｓＡｇ（超抗原）、ｍｉｍ．Ｐｅｐ．（ミメティックペプチド）、Ｃｅ．（細胞）、ＡＰＣ（抗原提示細胞）。

Claims (100)

  1. Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなるか、またはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる単離および精製されたペプチド。
  2. 前記Ｔ細胞共刺激経路がＣＤ２８／Ｂ７Ｔ細胞共刺激経路、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路のいずれかである、請求項１に記載のペプチド。
  3. 前記Ｔ細胞共刺激経路がＣＤ２８／Ｂ７経路である、請求項２に記載のペプチド。
  4. 前記ＣＤ２８／Ｂ７経路メンバーがＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 前記ペプチドがＴ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
  6. 前記経路メンバーがＣＤ２８分子であり、ＣＤ２８内の二量体界面が配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる、請求項５に記載のペプチド。
  7. 前記経路メンバーがＣＴＬＡ４分子であり、ＣＴＬＡ４内の二量体界面が配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる、請求項５に記載のペプチド。
  8. 前記経路メンバーがＩＣＯＳ分子であり、ＩＣＯＳ内の二量体界面が配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を含んでなる、請求項５に記載のペプチド。
  9. 前記経路メンバーがＰＤ−１分子であり、二量体界面に相当するＰＤ−１中のドメインが配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６を含んでなる、請求項５に記載のペプチド。
  10. 前記ペプチドがＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
  11. 前記Ｔ細胞共刺激経路メンバーがＣＤ２８／Ｂ７ファミリーメンバーである、請求項１０に記載のペプチド。
  12. 前記ペプチドがＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの二量体界面に由来するアミノ酸配列と二量体界面に相当するＰＤ−１中のドメインを含んでなる、請求項１１に記載のペプチド。
  13. 前記ペプチドがＣＤ２８分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなり、その二量体界面が配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる、請求項１２に記載のペプチド。
  14. 前記ペプチドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰおよび配列番号１２で示されるアミノ酸配列ＳＰＭＬＶＡＹＤ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１３に記載のペプチド。
  15. 前記ペプチドがｐ１ＴＡと呼ばれ、配列番号９で示されるアミノ酸配列ＨＶＫＧＫＨＬＣＰ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項１４に記載のペプチド。
  16. 前記ペプチドがｐ２ＴＡと呼ばれ、配列番号１２で示されるアミノ酸配列ＳＰＭＬＶＡＹＤ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項１４に記載のペプチド。
  17. 前記ペプチドがＣＴＬＡ４分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなり、その二量体界面が配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５および１１５〜１２０を含んでなる、請求項１２に記載のペプチド。
  18. 前記ペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰおよび配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＰＡＶＶＬＡＳＳ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載のペプチド。
  19. 前記ペプチドがｐ１ＴＢと呼ばれ、配列番号１４で示されるアミノ酸配列ＹＶＩＤＰＥＰＣＰまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項１８に記載のペプチド。
  20. 前記ペプチドがｐ２ＴＢと呼ばれ、配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＰＡＶＶＬＡＳＳまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項１８に記載のペプチド。
  21. 前記ペプチドがＩＣＯＳ分子内の二量体界面に由来するアミノ酸配列を含んでなり、その二量体界面が配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を含んでなる、請求項１２に記載のペプチド。
  22. 前記ペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列ＹＥＳＱＬＣＣＱＬおよび配列番号１７で示されるアミノ酸配列ＧＥＩＮＧＳＡＮ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２１に記載のペプチド。
  23. 前記ペプチドがｐ１ＴＣと呼ばれ、配列番号１６で示されるアミノ酸配列ＹＥＳＱＬＣＣＱＬまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項２２に記載のペプチド。
  24. 前記ペプチドがｐ２ＴＣと呼ばれ、配列番号１７で示されるアミノ酸配列ＧＥＩＮＧＳＡＮまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項２２に記載のペプチド。
  25. 前記ペプチドが二量体界面に相当するＰＤ−１分子内のドメインに由来するアミノ酸配列を含んでなり、そのドメインが配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６を含んでなる、請求項１２に記載のペプチド。
  26. 前記ペプチドが、ＰＤ−１分子の、配列番号５７で示されるアミノ酸配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶおよび配列番号５８で示されるアミノ酸配列ＰＡＬＬＶＶＴＥ、またはそのいずれかの機能的断片および誘導体のいずれかに由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２５に記載のペプチド。
  27. 前記ペプチドがｐ１ＴＤと呼ばれ、配列番号５７で示されるアミノ酸配列ＲＶＴＥＲＲＡＥＶまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項２６に記載のペプチド。
  28. 前記ペプチドがｐ２ＴＤと呼ばれ、配列番号５８で示されるアミノ酸配列ＰＡＬＬＶＶＴＥまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項２６に記載のペプチド。
  29. 前記ペプチドが、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳのいずれかの二量体界面内のアミノ酸配列、ならびに二量体界面に相当するＰＤ−１中のドメインと特異的に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
  30. 前記ペプチドがＣＤ２８分子の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合し、その二量体界面が配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる、請求項２９に記載のペプチド。
  31. 前記ペプチドがＣＴＬＡ４分子の二量体界面内のアミノ酸配列を特異的に結合し、その二量体界面が配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる、請求項２９に記載のペプチド。
  32. 前記ペプチドがＩＣＯＳ分子の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合し、その二量体界面が配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４を含んでなる、請求項２９に記載のペプチド。
  33. 前記ペプチドが二量体界面に相当するＰＤ−１分子内のドメインに由来するアミノ酸配列と特異的に結合し、そのドメインが配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基８〜１３および１１０〜１１６を含んでなる、請求項２９に記載のペプチド。
  34. 前記ペプチドが配列番号６、７および８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３０に記載のペプチド。
  35. 前記ペプチドがｐｅ１２と呼ばれ、配列番号６で示されるアミノ酸配列ＳＨＦＴＨＮＲＨＧＨＳＴまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項３４に記載のペプチド。
  36. 前記ペプチドがｐｄ７と呼ばれ、配列番号７で示されるアミノ酸配列ＷＨＡＨＰＨＫＫＰＶＶＡまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項３４に記載のペプチド。
  37. 前記ペプチドがｐｃ３と呼ばれ、配列番号８で示されるアミノ酸配列ＦＨＫＨＫＮＰＧＳＰＩＩまたはそのいずれかの機能的断片および誘導体を有する、請求項３４に記載のペプチド。
  38. 有効成分として請求項１〜３７のいずれか一項で定義されたような精製ペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、Ｔ細胞共刺激経路の調節のための組成物。
  39. それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための医薬組成物であって、有効成分として請求項１〜３７のいずれか一項で定義されたような精製ペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
  40. 前記免疫疾患が自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性疾患、移植片拒絶症、ならびに発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物によって引き起こされる疾患のいずれかである、請求項３９に記載の組成物。
  41. 発熱性外毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化を阻害するための組成物であって、毒性ショックから防御し、所望により発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対して防御免疫を惹起し、有効成分として請求項１〜３１のいずれか一項で定義されたような精製ペプチドまたはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなり、所望により医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでなる、組成物。
  42. 前記ペプチドがｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）のいずれかにより示されるアミノ酸、ならびにそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体を含んでなる、請求項４１に記載の組成物。
  43. それを必要とする被験体においてＴ細胞共刺激経路を調節するための方法であって、前記被験体にＴ細胞共刺激経路を調節し得る有効量の免疫調節ペプチドを投与する工程を含み、そのペプチドが、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列、またはＴ細胞共刺激経路メンバーもしくはそれを含んでなる組成物の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる、方法。
  44. それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための方法であって、前記被験体にＴ細胞共刺激経路を調節し得る有効量の免疫調節ペプチドを投与する工程を含み、そのペプチドが、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列、またはＴ細胞共刺激経路メンバーもしくはそれを含んでなる組成物の二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる、方法。
  45. 前記免疫関連疾患が自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性疾患、ならびに移植片拒絶症のいずれかである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ペプチドが請求項１〜３７のいずれか一項で定義されたもの、またはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体である、請求項４３および４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ペプチドがｐ１２Ａ（配列番号１で示される）、ｐ１２Ｂ（ｐ１４Ａとも呼ばれる、配列番号３で示される）、ｐＴＡ（配列番号１１で示される）、ｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）ならびにそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. それを必要とする被験体においてＴ細胞共刺激経路を調節するための組成物の製造を目的とする、Ｔ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドの使用であって、そのペプチドが、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列、またはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる、使用。
  49. それを必要とする被験体においてＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する免疫疾患を処置するための医薬組成物の製造を目的とする、Ｔ細胞共刺激経路を調節し得る免疫調節ペプチドの使用であって、そのペプチドが、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するアミノ酸配列、またはＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる、使用。
  50. 前記免疫関連疾患が自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性疾患、ならびに移植片拒絶症のいずれかである、請求項４９に記載の使用。
  51. 前記ペプチドが請求項１〜３７のいずれか一項で定義されたもの、またはそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体である、請求項４８および４９のいずれか一項に記載の使用。
  52. 前記ペプチドがｐ１２Ａ（配列番号１で示される）、ｐ１２Ｂ（ｐ１４Ａとも呼ばれる、配列番号３で示される）、ｐＴＡ（配列番号１１で示される）、ｐ１ＴＡ（配列番号９で示される）、ｐ２ＴＡ（配列番号１２で示される）、ｐ１ＴＢ（配列番号１４で示される）、ｐ２ＴＢ（配列番号１５で示される）、ｐ１ＴＣ（配列番号１６で示される）、ｐ２ＴＣ（配列番号１７で示される）、ｐｅ１２（配列番号６で示される）、ｐｄ７（配列番号７で示される）、ｐｃ３（配列番号８で示される）、ｐａ２（配列番号２５で示される）、ｐｂ１１（配列番号２６で示される）、ｐｃ１１（配列番号２７で示される）、ｐｆ１１（配列番号２８で示される）、ｐｇ３（配列番号２９で示される）、ｐｂ１２（配列番号３０で示される）、ｐａ８．１（配列番号３１で示される）、ｐｂ３（配列番号３２で示される）、ｐｂ５（配列番号３３で示される）、ｐｂ１１（配列番号３４で示される）、ｐｆ３（配列番号３５で示される）、ｐｆ８（配列番号３６で示される）、ｐｅ６（配列番号３７で示される）、ｐｆ４（配列番号３８で示される）、ｐａ８．２（配列番号３９で示される）、ｐｂ３（配列番号４０で示される）、ｐｂ２（配列番号４１で示される）、ｐｃ２（配列番号４２で示される）、ｐｃ８（配列番号４３で示される）、ｐｃ９（配列番号４４で示される）、ｐｆ１２（配列番号４５で示される）、ｐｃ４（配列番号４６で示される）、ｐｅ１１（配列番号４７で示される）、ｐｂ５（配列番号４８で示される）、ｐｅ１１（配列番号４９で示される）、ｐｇ７（配列番号５０で示される）、ｐａ１２（配列番号５１で示される）、ｐｂ８（配列番号５２で示される）、ｐｂ１２（配列番号５３で示される）、ｐｃ８（配列番号５４で示される）、ｐｄ８（配列番号５５で示される）、ｐｇ６（配列番号５６で示される）、ｐ１ＴＤ（配列番号５７で示される）、ｐ２ＴＤ（配列番号５８で示される）ならびにそのいずれかの組合せ、機能的断片および誘導体からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. それを必要とする被験体において病原体によるＴ細胞共刺激経路の活性化を阻害するための方法であって、前記被験体に、その病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、そのＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する部位との直接的相互作用を阻害する、阻害上有効な量の物質を投与することを含む、方法。
  54. 前記Ｔ細胞共刺激経路がＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路のいずれかである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記Ｔ細胞共刺激経路がＣＤ２８／Ｂ７経路である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記病原体が細菌病原体、ウイルス、真菌、プリオン、寄生虫、酵母および毒液からなる群から選択される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記病原体が黄色ブドウ状球菌および可能連鎖球菌からなる群から選択される病原菌である、請求項５３に記載の方法。
  58. 前記病原体の成分が超抗原、好ましくは発熱性外毒素である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ＣＤ２８／Ｂ７経路メンバーがＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれかである、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記経路メンバーがＣＤ２８分子、ＣＤ２８内の二量体界面が配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５および１１６〜１２１を含んでなる、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記経路メンバーがＣＴＬＡ４分子であり、ＣＴＬＡ４内の二量体界面が配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ４アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を
    含んでなる、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記経路メンバーがＩＣＯＳ分子であり、ＩＣＯＳ内の二量体界面が配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４を含んでなる、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記経路メンバーがＰＤ−１分子であり、ＰＤ−１内の二量体界面に相当するドメインが配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６を含んでなる、請求項５９に記載の方法。
  64. 前記病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位との間の直接的相互作用を阻害する前記物質が、Ｔ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチドおよびＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドのいれかである、請求項５３に記載の方法。
  65. 前記物質がＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチドである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ペプチドが請求項１１〜２８のいずれか一項で定義されたものである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ペプチドがＣＤ２８分子と前記発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害する、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ペプチドが毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストであり、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護する、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記物質がＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドである、請求項６４に記載の方法。
  70. 前記ペプチドが請求項２９〜３７のいずれかで定義されたものである、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ペプチドが請求項３４〜３７のいずれかで定義されたものであり、ＣＤ２８分子と発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ペプチドが毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストであり、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護する、請求項７１に記載の方法。
  73. それを必要とする被験体において病原体により引き起こされるＴｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する病理的疾患を処置するための方法であって、前記被験体に、その病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位、すなわち、そのＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来する部位との直接的相互作用を阻害する、阻害上有効な量の物質を投与することを含む、方法。
  74. 前記病態が自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性疾患および移植片拒絶症のいずれかである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記Ｔ細胞共刺激経路がＣＤ２８／Ｂ７Ｔ細胞共刺激経路、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０、ＣＤ２／ＣＤ５８およびＬＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）共刺激経路のいずれかである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記Ｔ細胞共刺激経路がＣＤ２８／Ｂ７経路である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記病原体が細菌病原体、ウイルス、真菌、プリオン、寄生虫、酵母および毒液からなる群から選択される、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記病原体が黄色ブドウ状球菌および可能連鎖球菌からなる群から選択される病原菌である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記病原体の成分が超抗原、好ましくは発熱性外毒素である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記病態が発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショック、無能化および死のいずれかである、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ＣＤ２８／Ｂ７経路メンバーがＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれかである、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記経路メンバーがＣＤ２８分子であり、ＣＤ２８内の二量体界面が配列番号１９で示されるヒトＣＤ２８アミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１６〜１２１を含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記経路メンバーがＣＴＬＡ４分子であり、ＣＴＬＡ４内の二量体界面が配列番号２０で示されるヒトＣＴＬＡ４アミノ酸配のアミノ酸残基１０〜１５と１１５〜１２０を含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記経路メンバーがＩＣＯＳ分子であり、ＩＣＯＳ内の二量体界面が配列番号２１で示されるヒトＩＣＯＳアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜１５と１１９〜１２４の総てまたは一部を含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  85. 前記経路メンバーがＰＤ−１分子であり、ＰＤ−１内の二量体界面に相当するドメインが配列番号５９で示されるヒトＰＤ−１アミノ酸配列のアミノ酸残基８〜１３と１１０〜１１６を含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  86. 前記病原体に由来する成分とＴ細胞共刺激経路メンバー分子内の結合部位との間の直接的相互作用を阻害する前記物質がＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチド、およびＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドのいずれかである、請求項７３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記物質がＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面に由来するペプチドである、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ペプチドが請求項１１〜２８のいずれか一項で定義されたものである、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ペプチドがＣＤ２８分子と発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記ペプチドが毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストであり、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護する、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記物質がＴ細胞共刺激経路メンバーの二量体界面内のアミノ酸配列と特異的に結合するペプチドである、請求項８６に記載の方法。
  92. 前記ペプチドが請求項２９〜３７のいずれかに定義されたものである、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ペプチドが請求項３４〜３７のいずれか一項で定義されたものであり、ＣＤ２８分子と前記発熱性外毒素との間の直接的相互作用を阻害する、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記ペプチドが毒素により媒介されるＴリンパ球の活性化のアンタゴニストであり、発熱性外毒素または発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックから保護する、請求項９３に記載の方法。
  95. Ｔ細胞共刺激経路メンバーと特異的に結合し、かつ、発熱性外毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化と拮抗することができ、所望により発熱性外毒素または少なくとも２種の発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を惹起することができる試験物質をスクリーニングする方法であって、
    ａ．Ｔ細胞共刺激経路メンバーと結合する候補アンタゴニスト物質を得る工程；
    ｂ．工程（ａ）で得られた物質から、そのＴ細胞共刺激経路メンバーと超抗原との間の直接的相互作用を阻害する物質を選択する工程；および
    ｃ．超抗原により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に対する、工程（ｂ）で得られた物質の拮抗作用を判定する工程
    を含む、方法。
  96. 前記候補アンタゴニスト物質が
    ａ．請求項１〜３７のいずれか一項で定義された単離ペプチドを含んでなる混合物を準備する工程；
    ｂ．その混合物をこのような結合にとって好適な条件下で試験物質と接触させる工程；および
    ｃ．終点指標に対する試験物質の作用を決定し、それにより、その終点の変更がその試験物質とペプチドの結合の指標となる工程
    により得られる、請求項９５に記載の方法。
  97. 終点指標が視覚的に検出可能なシグナルをもたらす、抗ペプチド抗体と前記ペプチドとの結合である、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記候補物質がタンパク質に基づく、炭水化物に基づく、脂質に基づく、天然有機物に基づく、合成起源の有機物に基づく、無機物に基づく、およびペプチドミメティクスに基づく物質からなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記物質がペプチドのコンビナトリアルライブラリー、環状ペプチドミメティクスのライブラリー、およびランダムまたは特定ファージディスプレーライブラリーのポジショナルスキャニングのいずれかの産物である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記候補アンタゴニスト物質が毒素により媒介されるＴｈ１リンパ球の活性化に拮抗するその物質の能力、および所望により発熱性外毒素またはそのような発熱性外毒素の混合物により誘導される毒性ショックに対する防御免疫を惹起するその能力を判定する方法により評価される、請求項９９に記載の方法。
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