JP2010195733A - Novel peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、並びにそれらを含有する組成物に関する。本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、線維芽細胞由来エラスターゼの活性を阻害するために、及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰｓ)の活性を阻害するために有益に利用され得る。 The present invention relates to a novel peptide having a specific amino acid sequence or a derivative thereof, or a salt thereof, and a composition containing them. The peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof can be beneficially used to inhibit the activity of fibroblast-derived elastase and / or to inhibit the activity of matrix metalloproteinases (MMPs).
従来、動物の結合組織には、その主要成分として、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ラミニンなどが含まれていることが分かっている。 Conventionally, it has been found that animal connective tissue contains collagen, elastin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, laminin and the like as main components.
エラスチンは、黄色いランダムコイル型の線維状タンパク質から構成され、２倍近い長さに引き伸ばしても緩めると元に戻るという、ゴムのような強力な弾力性を有することで知られている。このエラスチンは、結合組織において、架橋したコラーゲンをバネのようにして支え、伸び縮みの原動力となり、皮膚の弾力やハリなどを保つのに大きな働きをしている。生体内においてエラスチンは、皮膚の真皮、靭帯、腱、血管壁など伸縮性の必要な器官に広く分布しており、これらの器官で弾力性を与えるのに非常に重要な役割を担っている。 Elastin is composed of a yellow random coil type fibrous protein, and is known to have a strong elasticity like rubber, which is restored to its original shape when loosened even when stretched to nearly twice the length. This elastin supports the cross-linked collagen like a spring in the connective tissue, serves as a driving force for expansion and contraction, and plays a major role in maintaining the elasticity and elasticity of the skin. In vivo, elastin is widely distributed in organs that require elasticity, such as the dermis, ligaments, tendons, and blood vessel walls of the skin, and plays an extremely important role in providing elasticity in these organs.
しかしエラスチンは、加齢や紫外線、活性酸素、ストレスなどにより徐々にその量が減少してしまうことが知られている。そしてこの減少は、本来あるべき弾力性を徐々に失わせ、皮膚などにおいてシワやたるみを生じさせ、老化の大きな一因となることが分かっている。また、正常エラスチンの欠乏は動脈硬化などの血管系疾患の一因となり得ることも知られている。 However, it is known that the amount of elastin gradually decreases due to aging, ultraviolet rays, active oxygen, stress and the like. And this decrease is known to gradually lose the elasticity it should have, causing wrinkles and sagging in the skin and the like, which is a major cause of aging. It is also known that normal elastin deficiency can contribute to vascular diseases such as arteriosclerosis.
エラスチンを分解して減少させるエラスターゼ(エラスチン分解酵素)のうち、皮膚の真皮マトリックスに存在するエラスチンの分解に関与するエラスターゼとしては、好中球由来のエラスターゼと線維芽細胞由来のエラスターゼがよく知られている。その中でも、線維芽細胞由来のエラスターゼは、皮膚の弾力性維持にかかわる弾性繊維を構成するエラスチンを分解することが知られているため、その活性を阻害することにより高い抗シワ効果が得られることとなる。 Among the elastases that degrade and reduce elastin (elastin degrading enzymes), neutrophil-derived elastase and fibroblast-derived elastase are well known as elastases involved in the degradation of elastin present in the dermal matrix of the skin. ing. Among them, elastase derived from fibroblasts is known to degrade elastin that constitutes elastic fibers involved in maintaining the elasticity of the skin, so that its anti-wrinkle effect can be obtained by inhibiting its activity It becomes.
これまでにも、線維芽細胞由来エラスターゼの活性を阻害する物質についての研究がなされており、例えば、ショウキョウエキスなどの植物又はその抽出物などが用いられ得ることが知られている(例えば、特許文献１参照)。 So far, studies have been made on substances that inhibit the activity of fibroblast-derived elastase, and for example, it is known that plants such as a pepper extract or an extract thereof can be used (for example, (See Patent Document 1).
また近年、皮膚の老化には、マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰｓ)が深く関与していることが指摘されている。ＭＭＰｓは、種々の細胞外マトリックスを基質とするタンパク質分解酵素であり、その基質特異性からコラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロメライシン群、膜型ＭＭＰ群、及びその他の群(例えば、マトリライシン等)に大きく分類される。 In recent years, it has been pointed out that matrix metalloproteinases (MMPs) are deeply involved in skin aging. MMPs are proteolytic enzymes that use various extracellular matrices as substrates. Due to their substrate specificity, MMPs are classified into collagenase group, gelatinase group, stromelysin group, membrane-type MMP group, and other groups (for example, matrilysin). Broadly classified.
コラゲナーゼ群に含まれるＭＭＰｓとしては、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３などが挙げられる。なかでもＭＭＰ−１は、真皮マトリックスの主要構成成分であるタイプＩコラーゲンを含む複数種のコラーゲンなどを分解することで知られ、皮膚の老化に大きな影響を与えるとされている。従って、このＭＭＰ−１の活性を阻害することができる物質は、コラーゲンの分解を抑制でき、皮膚の老化を防止することができる。また近年、紫外線をあびることにより皮膚の線維芽細胞内のＭＭＰ−１発現量が増大することが分かってきており、ＭＭＰ−１は光老化の原因物質としても注目されつつある。従って、ＭＭＰ−１活性を阻害できる物質は、光老化も効果的に防止できると考えられる。また、コラーゲンの減少は角膜潰瘍等の角膜障害、リウマチ、関節炎、変形性関節炎、骨関節炎等の関節障害、炎症性疾患等の様々な疾患を引き起こすことが知られているため、コラーゲンの分解を抑制することは、これらの予防及び／又は治療にも有用とされている。 Examples of MMPs included in the collagenase group include MMP-1, MMP-8, and MMP-13. Among them, MMP-1 is known to degrade a plurality of types of collagen including type I collagen, which is a main component of the dermis matrix, and is said to have a great influence on skin aging. Therefore, a substance capable of inhibiting the activity of MMP-1 can suppress collagen degradation and prevent skin aging. In recent years, it has been found that the expression level of MMP-1 in the fibroblasts of skin is increased by exposure to ultraviolet rays, and MMP-1 is attracting attention as a causative agent for photoaging. Therefore, it is considered that a substance capable of inhibiting MMP-1 activity can effectively prevent photoaging. Collagen degradation is also known to cause various diseases such as corneal disorders such as corneal ulcers, rheumatism, arthritis, osteoarthritis, joint disorders such as osteoarthritis, and inflammatory diseases. Suppression is also useful for these prevention and / or treatment.
またゼラチナーゼ群に含まれるＭＭＰｓとしては、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９などが挙げられる。これらＭＭＰ−２やＭＭＰ−９は、細胞外マトリックスの構成成分であるゼラチンや、タイプＩＶコラーゲン、タイプＶコラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチンなどの多数の基底膜構成成分を分解することが知られている。基底膜は表皮の最下層で新しい細胞を次々と生み出す源であるため、基底膜構成成分の減少や変性により生じる基底膜構造の変化は、皮膚の弾力やハリなどに大きな影響を与えることとなる。従って、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９の活性を阻害することができる物質もまた、皮膚の老化防止に大きく役立つこととなる。 Examples of MMPs included in the gelatinase group include MMP-2 and MMP-9. These MMP-2 and MMP-9 are known to degrade many basement membrane components such as gelatin, which is a component of the extracellular matrix, type IV collagen, type V collagen, elastin, laminin, fibronectin and the like. Yes. Since the basement membrane is the source of new cells one after another in the lowermost layer of the epidermis, changes in the basement membrane structure caused by the reduction or degeneration of basement membrane components will have a major impact on the elasticity and firmness of the skin. . Therefore, substances capable of inhibiting the activity of MMP-2 and MMP-9 are also greatly useful for preventing skin aging.
これまでにも、ＭＭＰｓ活性に対して阻害作用を有する物質について研究がなされており、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９に対して阻害作用を有する物質として、例えば、種々の植物エキスなどが知られている(例えば、特許文献２〜４参照)。
So far, substances having an inhibitory action on MMPs activity have been studied. Examples of substances having an inhibitory action on MMP-1, MMP-2 and MMP-9 include various plant extracts and the like. Is known (for example, see
しかし、植物エキスなどの従来の線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害剤やＭＭＰｓ活性阻害剤は、皮膚への浸透性の面等から十分な効果を与えるものとは言い難いものである。また植物エキスは、原料となる植物の栽培環境や、植物から抽出する際の抽出条件の相違などで、品質に差が生じる場合があるなど、得られる効果の再現性の面等からも満足な効果が得られるとは言い難い。 However, it is difficult to say that conventional fibroblast-derived elastase activity inhibitors and MMPs activity inhibitors such as plant extracts give sufficient effects in terms of skin permeability. Plant extracts are also satisfactory in terms of the reproducibility of the effects obtained, such as differences in quality due to differences in the cultivation environment of the plant as the raw material and the extraction conditions when extracting from the plant. It is hard to say that an effect is obtained.
本発明の課題は、かかる従来技術の問題に鑑み、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有する、更なる有用な新規物質を提供することである。とりわけ本発明は、生体への吸収性又は皮膚への浸透性の観点から、また安定した品質を提供できるように均質物の製造容易性の観点から、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有する比較的低分子の新規物質を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a further useful novel substance having a fibroblast-derived elastase activity inhibitory action and / or an MMPs activity inhibitory action in view of such problems of the prior art. In particular, the present invention has a fibroblast-derived elastase activity inhibitory action and / or from the viewpoint of absorbability into the living body or permeability into the skin, and from the viewpoint of ease of production of a homogenate so as to provide stable quality. It is an object of the present invention to provide a novel substance having a relatively low molecular weight that has an MMPs activity inhibitory action.
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチドが、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a novel peptide having a specific amino acid sequence has a fibroblast-derived elastase activity inhibitory action and / or an MMPs activity inhibitory action. The invention has been completed.
即ち、本発明は、
〔１〕 式(I)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２ (I：配列番号１)
(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３ (II：配列番号２)
(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ (III：配列番号３)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、
〔２〕 Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ (III：配列番号３)
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、
〔３〕 Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(配列番号４)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩、
〔４〕 Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(配列番号５)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
〔５〕 Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(配列番号６)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。
〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有してなる組成物
に関する。
That is, the present invention
[1] Formula (I):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Xaa 1 -Xaa 2 (I: SEQ ID NO: 1)
(Wherein Xaa 1 and Xaa 2 are each independently an arbitrary amino acid)
A peptide comprising the amino acid sequence represented by formula (II):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Xaa 3 (II: SEQ ID NO: 2)
(Wherein Xaa 3 represents any amino acid)
A peptide comprising the amino acid sequence represented by formula (III):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (III: SEQ ID NO: 3)
A peptide consisting of an amino acid sequence represented by: a peptide selected from the group consisting of:
[2] Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (III: SEQ ID NO: 3)
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by
[3] A peptide consisting of an amino acid sequence represented by Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 4), a derivative thereof, or a salt thereof,
[4] A peptide comprising the amino acid sequence represented by Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Val-Asp (SEQ ID NO: 5), a derivative thereof, or a salt thereof.
[5] A peptide comprising the amino acid sequence represented by Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Leu-Tyr (SEQ ID NO: 6), a derivative thereof, or a salt thereof.
[6] The present invention relates to a composition comprising the peptide according to any one of [1] to [5] or a derivative thereof or a salt thereof.
本発明により、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用を有する新規の有用な物質が提供される。また本発明により、ＭＭＰ−１活性阻害作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、及び／又はＭＭＰ−９活性阻害作用を有する新規の有用な物質が提供される。本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、生体内においてエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分の分解を抑制でき、それにより、シワやたるみなどの皮膚の老化を効果的に予防・改善することができ、若々しい肌を維持するためなどに有益に利用され得る。 According to the present invention, a novel useful substance having an inhibitory action on fibroblast-derived elastase activity is provided. The present invention also provides a novel useful substance having an MMP-1 activity inhibitory action, an MMP-2 activity inhibitory action, and / or an MMP-9 activity inhibitory action. The peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof can suppress degradation of elastin, collagen, and other basement membrane components in vivo, thereby effectively preventing and improving skin aging such as wrinkles and sagging. And can be beneficially used to maintain youthful skin.
本発明のペプチドは、式(I)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２ (I：配列番号１)
(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３ (II：配列番号２)
(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ (III：配列番号３)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれる。なお、アミノ酸の一文字略号により、配列番号１で表わされるペプチドはＴＷＳＬＰＸ１Ｘ２、配列番号２で表わされるペプチドはＴＷＳＬＰＸ３、配列番号３で表わされるペプチドはＴＷＳＬＰという場合がある。
The peptide of the present invention has the formula (I):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Xaa 1 -Xaa 2 (I: SEQ ID NO: 1)
(Wherein Xaa 1 and Xaa 2 are each independently an arbitrary amino acid)
A peptide comprising the amino acid sequence represented by formula (II):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Xaa 3 (II: SEQ ID NO: 2)
(Wherein Xaa 3 represents any amino acid)
A peptide comprising the amino acid sequence represented by formula (III):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (III: SEQ ID NO: 3)
It is selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences represented by The peptide represented by SEQ ID NO: 1 is sometimes referred to as TWSLPX 1 X 2 , the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is sometimes referred to as TWSLPX 3 , and the peptide represented by SEQ ID NO: 3 is sometimes referred to as TWSLP.
配列番号１におけるＸａａ１及びＸａａ２(Ｘ１及びＸ２)は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す。該アミノ酸は、好ましくはα−アミノ酸であり、より好ましくは遺伝的にコードされるα−アミノ酸である。好ましくは、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、及びＬｅｕからなる群より選ばれ、なかでも、Ｘａａ１−Ｘａａ２がＴｒｐ−Ｔｙｒである場合(配列番号４：一文字略号ＴＷＳＬＰＷＹ)、Ｖａｌ−Ａｓｐである場合(配列番号５：一文字略号ＴＷＳＬＰＶＤ)、若しくはＬｅｕ−Ｔｙｒである場合(配列番号６：一文字略号ＴＷＳＬＰＬＹ)が好ましい。また上述の他に、本願効果を奏し得る限り限定されるものではないが、配列番号４におけるＴｒｐ−Ｔｙｒ(ＷＹ)、配列番号５におけるＶａｌ−Ａｓｐ(ＶＤ)、又は配列番号６におけるＬｅｕ−Ｔｙｒ(ＬＹ)のアミノ酸配列において１又は２個のアミノ酸を保存的置換したもの、より好ましくは１個のアミノ酸を保存的置換したものも好ましい例として挙げることができる。 Xaa 1 and Xaa 2 (X 1 and X 2 ) in SEQ ID NO: 1 each independently represent any amino acid. The amino acid is preferably an α-amino acid, more preferably a genetically encoded α-amino acid. Preferably, it is selected from the group consisting of Trp, Tyr, Val, Asp, and Leu, and in particular, when Xaa 1 -Xaa 2 is Trp-Tyr (SEQ ID NO: 4: one letter abbreviation TWSLPWY), it is Val-Asp. The case (SEQ ID NO: 5: single letter abbreviation TWSLPPVD) or the case of Leu-Tyr (SEQ ID NO: 6: single letter abbreviation TWSLPLY) is preferable. In addition to the above, it is not limited as long as the effect of the present application can be achieved, but Trp-Tyr (WY) in SEQ ID NO: 4, Val-Asp (VD) in SEQ ID NO: 5, or Leu-Tyr in SEQ ID NO: 6 A preferred example is a conservative substitution of 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence (LY), more preferably a conservative substitution of 1 amino acid.
配列番号２におけるＸａａ３(Ｘ３)は、任意のアミノ酸を示し、具体的には、上記Ｘａａ１及びＸａａ２と同様のアミノ酸が例示される。なかでも、Ｘａａ３は、配列番号４におけるＴｒｐ−Ｔｙｒ(ＷＹ)、配列番号５におけるＶａｌ−Ａｓｐ(ＶＤ)、又は配列番号６におけるＬｅｕ−Ｔｙｒ(ＬＹ)のアミノ酸配列から１個のアミノ酸を欠失させた残り、即ち、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、及びＬｅｕからなる群より選ばれるものが好ましく、これらのアミノ酸を保存的置換したものも好ましい例として挙げることができる。 Xaa 3 (X 3 ) in SEQ ID NO: 2 represents an arbitrary amino acid, and specific examples thereof include the same amino acids as those of Xaa 1 and Xaa 2 described above. Among these, Xaa 3 lacks one amino acid from the amino acid sequence of Trp-Tyr (WY) in SEQ ID NO: 4, Val-Asp (VD) in SEQ ID NO: 5, or Leu-Tyr (LY) in SEQ ID NO: 6. The lost residues, that is, those selected from the group consisting of Trp, Tyr, Val, Asp, and Leu are preferred, and conservative substitutions of these amino acids can also be mentioned as preferred examples.
本明細書において用語「アミノ酸の保存的置換」とは、以下の表１の各群内におけるアミノ酸間の置換をいう。 As used herein, the term “amino acid conservative substitution” refers to a substitution between amino acids in each group of Table 1 below.
上述のようなペプチドのうち、より確実に高い本願効果を得るためには、本発明のペプチドは、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ(一文字略記：ＴＷＳＬＰ、配列番号３)、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＷＹ、配列番号４)、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＶＤ、配列番号５)、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＬＹ、配列番号６)であることが好ましい。 Among the peptides as described above, in order to obtain the effect of the present application more reliably, the peptide of the present invention includes Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (one letter abbreviation: TWSLP, SEQ ID NO: 3), Thr-Trp- Ser-Leu-Pro-Trp-Tyr (one letter abbreviation: TWSLPWY, SEQ ID NO: 4), Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Val-Asp (one letter abbreviation: TWSLPPV, SEQ ID NO: 5), Thr-Trp-Ser- Leu-Pro-Leu-Tyr (one letter abbreviation: TWSLPLY, SEQ ID NO: 6) is preferred.
本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドのアセチル誘導体、パルミトイル誘導体、ミリスチル誘導体、アミド誘導体、アクリル誘導体、ダンシル誘導体、ビオチン誘導体、リン酸誘導体、サクシニル誘導体、アニリド誘導体、ベンジルオキシカルボニル誘導体、ホルミル誘導体、ニトロ誘導体、スルフォン誘導体、アルデヒド誘導体、環状化誘導体、グリコシル誘導体、モノメチル誘導体、ジメチル誘導体、トリメチル誘導体、グアニジル誘導体、アミジン誘導体、マレイル誘導体、トリフルオロアセチル誘導体、カルバミル誘導体、トリニトロフェニル誘導体、ニトロトロポニル誘導体、又はアセトアセチル誘導体が挙げられる。この中でもパルミトイル誘導体は、細胞への浸透性が高くなることが期待されるので好ましく、またＮ末端のアセチル誘導体、Ｃ末端のアミド誘導体、Ｃ末端のメチル誘導体は、末端からペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性を有し、生体中における安定性が高くなることが期待されるので好ましい。 In the present specification, the term “peptide derivative” means, for example, acetyl derivative, palmitoyl derivative, myristyl derivative, amide derivative, acrylic derivative, dansyl derivative, biotin derivative, phosphate derivative, succinyl derivative, anilide derivative, benzyl of peptide. Oxycarbonyl derivatives, formyl derivatives, nitro derivatives, sulfone derivatives, aldehyde derivatives, cyclized derivatives, glycosyl derivatives, monomethyl derivatives, dimethyl derivatives, trimethyl derivatives, guanidyl derivatives, amidine derivatives, maleyl derivatives, trifluoroacetyl derivatives, carbamyl derivatives, trimethyl derivatives Examples thereof include nitrophenyl derivatives, nitrotroponyl derivatives, and acetoacetyl derivatives. Among these, palmitoyl derivatives are preferable because they are expected to have high cell permeability, and N-terminal acetyl derivatives, C-terminal amide derivatives, and C-terminal methyl derivatives are exopeptidases that degrade peptides from the terminal. It is preferable since it is expected to have high stability in the living body.
本明細書において、「塩」とは、ペプチド又はその誘導体の薬理学的に許容される任意の塩(無機塩及び有機塩を含む)をいい、例えば、ペプチド又はその誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、有機酸塩(酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等)等が挙げられ、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩及び酢酸塩である。 As used herein, the term “salt” refers to any pharmacologically acceptable salt (including inorganic salts and organic salts) of a peptide or a derivative thereof, such as a sodium salt or a potassium salt of a peptide or a derivative thereof. , Calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, organic acid salt (acetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, succinate, fumaric acid Salt, propionate, formate, benzoate, picrate, benzenesulfonate, etc.), preferably ammonium salts, hydrochlorides, sulfates and acetates, more preferably ammonium salts. And acetate.
本発明のペプチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、本発明のペプチドは、化学合成方法(例えば、固相法(例えば、Ｆｍｏｃ法)、液相法等)により合成されてもよく、また遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。なお本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもよいが、好ましくはＬ−体である。 The peptides of the present invention can be produced by methods known in the art. For example, the peptide of the present invention may be synthesized by a chemical synthesis method (for example, a solid phase method (eg, Fmoc method), a liquid phase method, etc.), or may be produced by a method such as gene recombinant expression. . The amino acid constituting the peptide of the present invention may be L-form or D-form, but is preferably L-form.
さらに本発明のペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによっても調製することも出来る。また、プロテアーゼ処理後には、当該分野で公知の手段によって精製することにより、目的のペプチドを得てもよい。 Furthermore, the peptide of the present invention can also be prepared by cutting out a peptide comprising the target amino acid sequence from the protein amino acid sequence containing the target amino acid sequence by a known means such as protease treatment. In addition, after the protease treatment, the target peptide may be obtained by purification by means known in the art.
本発明のペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、本発明のペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。 Derivatives of the peptides of the present invention can be made by methods known in the art. Moreover, the salt of the peptide of this invention can be easily produced by those skilled in the art by any method known in the art.
以上のようにして得られた本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、線維芽細胞由来のエラスターゼ活性を阻害してエラスチンの分解を抑制するために、及び／又はＭＭＰｓ活性を阻害してコラーゲンやその他の基底膜構成成分の分解を抑制するために使用することができる。対象となるＭＭＰｓは、特に限定されないが、好ましくはコラゲナーゼ群及びゼラチナーゼ群に属するＭＭＰｓであり、より好ましくはＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９である。 The peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof obtained as described above inhibits elastin activity by inhibiting fibroblast-derived elastase activity and / or inhibits MMPs activity. It can be used to suppress degradation of collagen and other basement membrane components. The target MMPs are not particularly limited, but are preferably MMPs belonging to the collagenase group and the gelatinase group, and more preferably MMP-1, MMP-2 and MMP-9.
本発明はまた、前記ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を含むことを特徴とする組成物を提供する。かかる特徴を有することにより、該組成物は例えば、医薬、食品、化粧料又は飼料として、さらに研究試薬や検査試薬として好適に使用され得る。 The present invention also provides a composition comprising the peptide or a derivative thereof or a salt thereof. By having such characteristics, the composition can be suitably used, for example, as a medicine, food, cosmetics or feed, and further as a research reagent or a test reagent.
医薬としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する疾患の予防剤及び／又は治療剤が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、動脈硬化等の血管系疾患用の予防剤及び／又は治療剤として、リウマチ、変形性関節症、骨関節炎等の関節疾患用の予防剤及び／又は治療剤として、角膜潰瘍などの角膜疾患用の予防剤及び／又は治療剤として、紫外線曝露、加齢、活性酸素、ストレス等に因る皮膚のシワ若しくはタルミの予防剤及び／又は治療剤として、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防剤及び／又は治療剤として、好適に使用され得る。 Examples of the medicament include a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases caused by reduction or degeneration of elastin, collagen and / or other basement membrane constituents in mammals including humans. Specifically, the composition of the present invention is used as a prophylactic agent and / or therapeutic agent for vascular diseases such as arteriosclerosis, and / or as a prophylactic agent for joint diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis and osteoarthritis. As a therapeutic agent, as a prophylactic agent and / or therapeutic agent for corneal diseases such as corneal ulcers, as a prophylactic and / or therapeutic agent for skin wrinkles or tarmi due to ultraviolet exposure, aging, active oxygen, stress, etc. It can be suitably used as a prophylactic and / or therapeutic agent for reduction in skin elasticity or elasticity.
食品としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する状態の予防用及び／又は改善用の食品が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、動脈硬化等の予防用及び／又は改善用の食品として、関節痛等の予防用及び／又は改善用の食品として、肌の美容用の食品として、紫外線曝露、加齢、活性酸素、ストレス等に因る皮膚のシワ若しくはタルミの予防用及び／又は改善用の食品として、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防用及び／又は改善用として、好適に使用され得る。なお、食品としての本発明の組成物、即ち、本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩を配合した食品は、上記効用を有する保健機能食品や健康食品として、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する状態の予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、具体的には、動脈硬化等の予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、関節痛等の予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、肌の美容のために用いられるものである旨の表示を付して、皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防及び／又は改善のために用いられるものである旨の表示を付して、提供され得る。ここで、保健機能食品とは、厚生労働省の定める保健機能食品を意味し、栄養機能食品及び特定保健用食品を含む。 Examples of the food include food for preventing and / or improving a state caused by reduction or degeneration of elastin, collagen and / or other basement membrane constituents in mammals including humans. Specifically, the composition of the present invention is used as a food for prevention and / or improvement of arteriosclerosis, as a food for prevention and / or improvement of joint pain, as a food for skin beauty, Suitable as a food for preventing and / or improving skin wrinkles or talmi caused by UV exposure, aging, active oxygen, stress, etc. Can be used. The composition of the present invention as a food, that is, a food containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is used as a health functional food or health food having the above-mentioned effects, for example, mammals including humans. With an indication that the animal is used for the prevention and / or improvement of a condition caused by reduction or degeneration of elastin, collagen and / or other basement membrane components in animals, specifically, With an indication that it is used for prevention and / or improvement of arteriosclerosis, etc., with an indication that it is used for prevention and / or improvement of joint pain, etc. Elasticity of the skin with an indication that it is used for skin beauty, and an indication that it is used for prevention and / or improvement of skin wrinkles or tarmi Young You are denoted by the prevention and / or indication is intended to be used for the improvement to decrease the firmness can be provided. Here, the health functional food means health functional food defined by the Ministry of Health, Labor and Welfare, and includes nutritional functional food and food for specified health use.
化粧料としては、例えば、紫外線曝露、加齢、活性酸素、ストレス等に因る皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のための化粧料、皮膚の弾力性若しくはハリの低下に対する予防及び／又は改善のための化粧料として、好適に使用され得る。 Cosmetics include, for example, cosmetics for prevention and / or improvement of skin wrinkles or saggings caused by UV exposure, aging, active oxygen, stress, etc. Or it can be used suitably as cosmetics for improvement.
飼料としては、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等の家畜や、イヌ、ネコ等のペット動物におけるエラスチン、コラーゲン及び／又はその他の基底膜構成成分の減少や変性などに起因する状態の予防用及び／又は改善用の飼料が挙げられる。具体的には、本発明の組成物は、動脈硬化等の血管系疾患用の予防用及び／又は改善用の飼料として、リウマチ、変形性関節症、骨関節炎等の関節疾患用の予防用及び／又は改善用の飼料として、角膜潰瘍などの角膜疾患用の予防用及び／又は改善用の飼料等として、好適に使用され得る。 Examples of feed include a state caused by a decrease or degeneration of elastin, collagen and / or other basement membrane components in livestock such as cattle, pigs, chickens, sheep and horses, and pet animals such as dogs and cats. Examples include feed for prevention and / or improvement. Specifically, the composition of the present invention is used as a feed for prevention and / or improvement for vascular diseases such as arteriosclerosis and for prevention of joint diseases such as rheumatism, osteoarthritis, osteoarthritis and the like. As a feed for improvement, it can be suitably used as a feed for prevention and / or improvement for corneal diseases such as corneal ulcers.
また本発明の組成物は、エラスターゼやＭＭＰｓの活性に関連する状態などを解明するための実験用研究試薬又は検査試薬などとしても好適に使用され得る。 The composition of the present invention can also be suitably used as an experimental research reagent or a test reagent for elucidating a state related to the activity of elastase and MMPs.
本組成物中の前記ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩の含有量は、ペプチド等の種類、組成物の剤型等によっても異なるが、一般には、高い線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用とそれに伴う皮膚老化防止効果等を得る観点から、好ましくは0.0001〜70重量％、より好ましくは0.001〜50重量％、さらに好ましくは0.001〜20重量％、さらにより好ましくは0.01〜10重量％である。 The content of the peptide or a derivative thereof or a salt thereof in the present composition varies depending on the type of peptide, the dosage form of the composition, etc., but generally has a high fibroblast-derived elastase activity inhibitory action and / or From the viewpoint of obtaining MMPs activity inhibitory action and accompanying skin aging prevention effect, etc., preferably 0.0001 to 70% by weight, more preferably 0.001 to 50% by weight, still more preferably 0.001 to 20% by weight, and even more preferably 0.01 to 10%. % By weight.
本発明の組成物は、前記ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩の他に製剤分野や食品分野等において通常使用される担体、基剤、及び／又は添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合して調製することができる。 The composition of the present invention is a range that achieves the object of the present invention by using carriers, bases, and / or additives that are usually used in the fields of pharmaceutical preparations, foods, etc. in addition to the peptides or derivatives thereof or salts thereof. It can mix | blend suitably and can prepare.
担体としては、例えば、糖類(例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等)、セルロース類(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、結晶性セルロース等)、水難溶性ガム類(例えば、アラビアガム、トラガントガム等)、架橋ビニル重合体、脂質類等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。 Examples of the carrier include saccharides (e.g., mannitol, lactose, dextran, etc.), celluloses (e.g., hydroxypropylcellulose, methylcellulose, crystalline cellulose, etc.), poorly water-soluble gums (e.g., gum arabic, tragacanth, etc.), cross-linking Vinyl polymers, lipids and the like can be used alone or in combination of two or more.
基剤としては、例えば、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。 As the base, for example, water, fats and oils, mineral oils, waxes, fatty acids, silicone oils, sterols, esters, metal soaps, alcohols and the like may be used alone or in combination of two or more. .
添加剤としては、例えば、界面活性剤、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、ビタミン類、アミノ酸類、着色剤、香料等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。 Examples of additives include surfactants, solubilizing components, emulsifiers, oils, stabilizers, thickeners, preservatives, binders, lubricants, dispersants, pH adjusters, humectants, UV absorbers. , Chelating agents, percutaneous absorption enhancers, antioxidants, disintegrating agents, plasticizers, buffering agents, vitamins, amino acids, coloring agents, fragrances and the like may be used alone or in combination.
さらに本発明の組成物には、必要に応じて他の有用な作用を付加するために、皮膚に対して有効な作用を有する他の有用成分、例えば、美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、ニキビ改善成分、コラーゲン等の生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等を１種又は２種以上組み合わせて配合されてもよい。 Further, the composition of the present invention may have other useful components having an effective action on the skin, for example, a whitening component, an anti-inflammatory component, an antibacterial component, Cell activation component, astringent component, antioxidant component, acne improving component, biological component synthesis promoting component such as collagen, blood circulation promoting component, moisturizing component, anti-aging component, etc. .
本発明の組成物は、外用剤(医薬及び化粧料を含む)、内服剤(医薬、食品及び飼料を含む)等の任意の剤型であり得、皮膚の老化症状に対してより直接的に高い効果を発揮させるためには、好ましくは外用剤として使用され得る。 The composition of the present invention can be in any dosage form such as external preparations (including pharmaceuticals and cosmetics), internal preparations (including pharmaceuticals, foods and feeds), and more directly against skin aging symptoms. In order to exhibit a high effect, it can be preferably used as an external preparation.
外用剤としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状(基材担持)、エアゾール状、スプレー状等の任意の形態で使用され得る。 As an external preparation, for example, it can be used in any form such as liquid, emulsion, cream, lotion, paste, mousse, gel, sheet (substrate-supported), aerosol or spray.
化粧料としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、オイル、パック等の基礎化粧料、又はファンデーション、頬紅、口紅等のメーキャップ化粧料、さらに洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料、入浴剤等の任意の形態で使用され得る。 Cosmetics include, for example, basic cosmetics such as lotions, emulsions, creams, oils, packs, makeup cosmetics such as foundations, blushers, lipsticks, and other cleansing agents such as facial cleansers, cleansings, body cleansing agents, and bathing agents. Etc. may be used in any form.
内服剤としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤(ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む)、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、ゼリー剤等の任意の形態で使用され得る。 Examples of the internal medicine include tablets, pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), gels, It can be used in any form such as liposomal agent, extract agent, tincture agent, lemonade agent, jelly agent and the like.
また食品とする場合には、パン、麺、惣菜、食肉加工食品(例えば、ハム、ソーセージなど)、水産加工食品、調味料(例えば、ドレッシングなど)、乳製品、菓子(例えば、ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリームなど)、スープ、ジュースなどの任意の一般の食品形態としても提供され得る。このような形態にする場合、本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、目的とする食品の性質等に依存して、当業者に公知の方法により適宜配合され得る。 In the case of food, bread, noodles, side dishes, processed meat foods (e.g., ham, sausage, etc.), processed fishery products, seasonings (e.g., dressing, etc.), dairy products, confectionery (e.g., biscuits, candy, Jelly, ice cream, etc.), soups, juices and the like can be provided in any common food form. In such a form, the peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof can be appropriately blended by a method known to those skilled in the art depending on the properties of the target food.
飼料としては、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。また、研究試薬や検査試薬としても、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。 The feed is not particularly limited because it can be used in any form. Moreover, since it can be used in arbitrary forms as a research reagent and a test reagent, there is no limitation in particular.
本発明の組成物は、線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害作用及び／又はＭＭＰｓ活性阻害作用を有することにより、皮膚真皮細胞外マトリックスに存在するエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分などの分解を阻害して、生体内における正常なエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分の量が低下するのを防ぎ、皮膚の老化を防止するためなどに有益に使用され得る。 The composition of the present invention has a fibroblast-derived elastase activity inhibitory action and / or MMPs activity inhibitory action, thereby inhibiting the degradation of elastin, collagen, other basement membrane components, etc. present in the dermal extracellular matrix. Thus, it can be beneficially used to prevent the amount of normal elastin, collagen, and other basement membrane constituents in the living body from being reduced, and to prevent skin aging.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１(ペプチドの調製)
１−１．ペプチドの合成
(１) Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ(一文字略記：ＴＷＳＬＰ、配列番号３)
(２) Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＷＹ、配列番号４)
(３) Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＶＤ、配列番号５)
(４) Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ(一文字略記：ＴＷＳＬＰＬＹ、配列番号６)
上記４種のペプチドを、ペプチド自動合成装置(Applied Biosystems社製、Peptide Synthesizer, ABI 433A)をその使用説明書に従って使用し、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。次いで、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することにより、被験ペプチドを調製した。
Example 1 (Preparation of peptide)
1-1. Peptide synthesis
(1) Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (one letter abbreviation: TWSLP, SEQ ID NO: 3)
(2) Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Trp-Tyr (one letter abbreviation: TWSLPWY, SEQ ID NO: 4)
(3) Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Val-Asp (one letter abbreviation: TWSLPVD, SEQ ID NO: 5)
(4) Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Leu-Tyr (one letter abbreviation: TWSLPLY, SEQ ID NO: 6)
The above four peptides were synthesized by a solid phase synthesis method by Fmoc method using an automatic peptide synthesizer (Applied Biosystems, Peptide Synthesizer, ABI 433A) according to the instruction manual. Then, the test peptide was prepared by purifying by removing unreacted substances by preparative HPLC.
１−２．合成ペプチドの純度検定
得られた精製物を、それぞれ以下の分析条件に従って分析用逆相高速液体クロマトグラフィーに付したところ、ＴＷＳＬＰペプチドについては12.9分、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドについては20.0分、ＴＷＳＬＰＶＤペプチドについては12.4分、ＴＷＳＬＰＬＹペプチドについては21.0分に単一の鋭いピークが示され、純度はいずれも95％以上の高純度であることが確認された。
＜分析条件＞
カラム：Inertsil ODS-3(内径：4.6mm、長さ：250mm)、GL Sciences社製
移動相：溶媒Ａ(0.1％トリフルオロ酢酸水溶液)
溶媒Ｂ(0.1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル)
グラジエント〔0分(溶媒Ｂ＝20％)〜40分(溶媒Ｂ＝50％)〕
流速：1.0mL／分
検出法：波長220nmにおける吸光度
1-2. Purity test of synthetic peptide Each of the obtained purified products was subjected to analytical reversed-phase high performance liquid chromatography according to the following analysis conditions. As a result, the TWSLP peptide was 12.9 minutes, the TWSLPWY peptide was 20.0 minutes, and the TWSLPVD peptide was 12.4 minutes. For the TWSLPLY peptide, a single sharp peak was shown at 21.0 minutes, and the purity was confirmed to be high purity of 95% or more.
<Analysis conditions>
Column: Inertsil ODS-3 (inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm), mobile phase manufactured by GL Sciences: Solvent A (0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution)
Solvent B (0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile)
Gradient [0 min (solvent B = 20%) to 40 min (solvent B = 50%)]
Flow rate: 1.0 mL / min Detection method: Absorbance at a wavelength of 220 nm
実施例２(線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害効果の測定)
正常ヒト線維芽細胞を、0.1％Triton X-100／0.2M Tris-HCl緩衝液中で超音波破砕して、線維芽細胞由来エラスターゼの酵素液を調製した。基質としては5mM N-Suc-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide/N/methyl-pyrrolidoneを用いた。
Example 2 (Measurement of inhibitory effect on fibroblast-derived elastase activity)
Normal human fibroblasts were sonicated in 0.1% Triton X-100 / 0.2M Tris-HCl buffer to prepare an enzyme solution of fibroblast-derived elastase. As a substrate, 5 mM N-Suc-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide / N / methyl-pyrrolidone was used.
先ず、所定濃度(0.1、1mg／mLの各濃度)に調製した各被験ペプチド溶液50μL、基質溶液100μL及び酵素液50μLを、96ウェルプレートの各ウェルに添加し、37℃で２時間インキュベートした。反応終了後、405nmの吸光度をプレートリーダーにて測定した。コントロール(ペプチド溶液未添加群)のエラスターゼ活性を100％とし、その比から各ペプチドの各濃度における活性阻害の程度を調べた。 First, 50 μL of each test peptide solution, 100 μL of substrate solution, and 50 μL of enzyme solution prepared to predetermined concentrations (0.1 and 1 mg / mL concentrations) were added to each well of a 96-well plate and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the absorbance at 405 nm was measured with a plate reader. The elastase activity of the control (peptide solution non-added group) was set to 100%, and the degree of activity inhibition at each concentration of each peptide was examined from the ratio.
この結果を図１に示す。図１に示されるように、いずれの被験ペプチドも線維芽細胞由来エラスターゼ活性を著しく阻害する効果を有することが明らかとなった。 The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, it was revealed that any of the test peptides had an effect of significantly inhibiting fibroblast-derived elastase activity.
実施例３(ＭＭＰ−１活性阻害効果の測定)
ＭＭＰ−１ Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery キット(ＢＩＯＭＯＬ社製)を用いて、実施例１にて調製した(１)〜(３)の被験ペプチドのＭＭＰ−１活性阻害効果を評価した。本キットは、発色性基質であるthiopeptolideがＭＭＰ−１による切断を受けた際生じる412nmの吸収を測定し、被検薬が非存在下の状態と比較することにより、被験薬の阻害率を測定するものである。すなわち、所定濃度(1mg／mL)に調製したペプチド溶液20μL、ＭＭＰ−１溶液(765mU／μL)20μL及びAssay buffer50μLを、96ウェルプレートの各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベートした。反応終了後、各ウェルに発色性基質10μLを添加し、予め37℃に保温したプレートリーダーにセットした。その後、１分毎に412nmにおける吸収を計１０分間測定し、単位時間あたりの吸光度の増加率から、1mg／mLのペプチド濃度での反応速度(Ｖ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)を算出した。コントロール(ペプチド未添加群)に関しても、反応速度(Ｖ ｃｏｎｔｒｏｌ)を算出し、その比を利用して1mg／mLのペプチド濃度における阻害率(％)を、以下の式（ａ）により算出した。
阻害率（％）＝{１−（Ｖ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／Ｖ ｃｏｎｔｒｏｌ）}×１００
式（ａ）
Example 3 (Measurement of MMP-1 activity inhibitory effect)
The MMP-1 activity inhibitory effect of the test peptides (1) to (3) prepared in Example 1 was evaluated using the MMP-1 Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery kit (manufactured by BIOMOL). This kit measures the absorption at 412 nm that occurs when thiopeptolide, a chromogenic substrate, is cleaved by MMP-1, and measures the inhibition rate of the test drug by comparing it with the absence of the test drug To do. Specifically, 20 μL of peptide solution, 20 μL of MMP-1 solution (765 mU / μL) and 50 μL of assay buffer prepared to a predetermined concentration (1 mg / mL) were added to each well of a 96-well plate and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, 10 μL of a chromogenic substrate was added to each well and set in a plate reader kept at 37 ° C. in advance. Thereafter, the absorption at 412 nm was measured every minute for a total of 10 minutes, and the reaction rate (V inhibitor) at a peptide concentration of 1 mg / mL was calculated from the rate of increase in absorbance per unit time. For the control (peptide non-added group), the reaction rate (V control) was calculated, and the inhibition rate (%) at the peptide concentration of 1 mg / mL was calculated by the following formula (a) using the ratio.
Inhibition rate (%) = {1- (V inhibitor / V control)} × 100
Formula (a)
上記試験の結果、1mg／mL濃度において、ＴＷＳＬＰペプチドは23％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドは73％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＶＤペプチドは26％の阻害率を示すことが明らかとなり、なかでもＴＷＳＬＰＷＹペプチドが著しく高い阻害作用を示すことが認められた。 As a result of the above test, it was revealed that at the concentration of 1 mg / mL, the TWSLP peptide showed an inhibition rate of 23%, the TWSLPWY peptide showed an inhibition rate of 73%, and the TWSLPVD peptide showed an inhibition rate of 26%. It was found that the TWSLPWY peptide showed a remarkably high inhibitory action.
実施例４(ＭＭＰ−２活性阻害効果の測定)
ＭＭＰ−２ Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery キット(ＢＩＯＭＯＬ社製)を用いて、実施例１にて調製した(１)〜(３)の被験ペプチドのＭＭＰ−２活性阻害効果を、実施例３においてＭＭＰ−１溶液(765mU／μL)20μLを用いる代わりに、ＭＭＰ−２溶液(765mU／μL)20μLを用いて、実施例３と同様にして評価した。
Example 4 (Measurement of MMP-2 activity inhibitory effect)
The MMP-2 activity inhibitory effect of the test peptides (1) to (3) prepared in Example 1 using the MMP-2 Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery kit (manufactured by BIOMOL) Evaluation was carried out in the same manner as in Example 3 using 20 μL of MMP-2 solution (765 mU / μL) instead of using 20 μL of -1 solution (765 mU / μL).
上記試験の結果、1mg／mL濃度において、ＴＷＳＬＰペプチドは17％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドは46％の阻害率を示し、ＴＷＳＬＰＶＤペプチドは10％の阻害率を示すことが明らかとなった。以上より、ＭＭＰ−２活性阻害作用についても、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドが特に高い阻害作用を示すことが認められた。 As a result of the above test, it was revealed that at the concentration of 1 mg / mL, the TWSLP peptide showed 17% inhibition rate, the TWSLPWY peptide showed 46% inhibition rate, and the TWSLPVD peptide showed 10% inhibition rate. From the above, it was confirmed that the TWSLPWY peptide also showed a particularly high inhibitory action for the MMP-2 activity inhibitory action.
実施例５(ＭＭＰ−９活性阻害効果の測定)
ＭＭＰ−９ Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery キット(ＢＩＯＭＯＬ社製)を用いて、実施例１にて調製した(２)の被験ペプチドのＭＭＰ−９活性阻害効果を、実施例３においてＭＭＰ−１溶液(765mU／μL)20μLを用いる代わりに、ＭＭＰ−９溶液(765mU／μL)20μLを用いて、実施例３と同様にして評価した。
Example 5 (Measurement of MMP-9 activity inhibitory effect)
The MMP-9 activity inhibitory effect of the test peptide of (2) prepared in Example 1 using the MMP-9 Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery kit (manufactured by BIOMOL) was compared with the MMP-1 solution ( Instead of using 20 μL of 765 mU / μL, evaluation was performed in the same manner as in Example 3 using 20 μL of MMP-9 solution (765 mU / μL).
上記試験の結果、1mg／mL濃度において、ＴＷＳＬＰＷＹペプチドは29％の阻害活性を示すことが明らかとなり、ＭＭＰ−９活性阻害作用をも示し得ることが認められた。 As a result of the above test, it was clarified that the TWSLPWY peptide showed 29% inhibitory activity at a concentration of 1 mg / mL, and it was confirmed that it could also show MMP-9 activity inhibitory action.
以下に製剤実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。 Formulation examples are given below, but the present invention is not limited to these examples.
製剤実施例１：乳液
〔組成〕 〔比率〕
ＴＷＳＬＰペプチド ０．０１
ＬＥＨＡペプチド＊ ０．０１
加水分解エラスチン ０．０１
アスコルビン酸グルコシド ２．０
スクワラン ２．０
流動パラフィン ５．０
セタノール ０．５
モノステアリン酸グリセリル ２．０
ＰＯＥ（２５）セチルエーテル ２．０
グリセリン ４．０
１,３-ブチレングリコール ６．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
ｐＨ調整剤 適量
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
計 １００．０重量％
＊Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａのアミノ酸配列を有するペプチド。
Formulation Example 1: Emulsion [Composition] [Ratio]
TWSLP peptide 0.01
LEHA peptide * 0.01
Hydrolyzed elastin 0.01
Ascorbic acid glucoside 2.0
Squalane 2.0
Liquid paraffin 5.0
Cetanol 0.5
Glyceryl monostearate 2.0
POE (25) cetyl ether 2.0
Glycerin 4.0
1,3-butylene glycol 6.0
Carboxyvinyl polymer 0.2
pH adjuster appropriate amount preservative appropriate amount perfume appropriate amount purified water appropriate amount
Total 100.0% by weight
* A peptide having the amino acid sequence of Leu-Glu-His-Ala.
製剤実施例２：クリーム
〔組成〕 〔比率〕
ＴＷＳＬＰＶＤペプチド ０．０１
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物＊＊ ０．５
パルミチン酸レチノール ０．１４
ワセリン １．０
スクワラン ５．０
流動パラフィン １０．０
ステアリン酸 １．５
ステアリルアルコール ２．０
モノステアリン酸グリセリル ２．０
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル ３．０
グリセリン ６．０
１,３-ブチレングリコール ８．０
カルボキシビニルポリマー ０．４
ｐＨ調整剤 適量
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
計 １００．０重量％
＊＊ダイズタンパク質をサーモリシン（EC3.4.24.4）で分解した後に得られる多種多様なペプチドを実質的に全て含んだ状態のもの：平均分子量1500（ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）法による測定）。
Formulation Example 2: Cream [Composition] [Ratio]
TWSLPVD peptide 0.01
Thermolysin degradation product of soy protein ** 0.5
Retinol palmitate 0.14
Vaseline 1.0
Squalane 5.0
Liquid paraffin 10.0
Stearic acid 1.5
Stearyl alcohol 2.0
Glyceryl monostearate 2.0
POE (20) cetyl ether 3.0
Glycerin 6.0
1,3-butylene glycol 8.0
Carboxyvinyl polymer 0.4
pH adjuster appropriate amount preservative appropriate amount perfume appropriate amount purified water appropriate amount
Total 100.0% by weight
** In the state containing substantially all of a wide variety of peptides obtained after digesting soybean protein with thermolysin (EC 3.4.24.4): average molecular weight 1500 (measured by gel permeation chromatography (GPC) method).
製剤実施例３：化粧水
〔組成〕 〔比率〕
ＴＷＳＬＰＷＹペプチド ０．００５
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノイソステアリン酸エステル ０．３
コハク酸 ０．２
コハク酸ナトリウム ０．５
エデト酸三ナトリウム ０．０５
１,３-ブチレングリコール ６．０
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
計 １００．０重量％
Formulation Example 3: Lotion [Composition] [Ratio]
TWSLPWY peptide 0.005
Sodium hyaluronate 0.1
POE (20) sorbitan monoisostearate 0.3
Succinic acid 0.2
Sodium succinate 0.5
Edetate trisodium 0.05
1,3-butylene glycol 6.0
Preservative appropriate amount Fragrance appropriate amount Purified water appropriate amount
Total 100.0% by weight
製剤実施例４：乳液
〔組成〕 〔比率〕
ＴＷＳＬＰＷＹペプチド ０．０１
加水分解エラスチン ０．０１
オトギリソウ抽出物（エラスターゼ阻害剤） １．０
スクワラン ２．０
流動パラフィン ５．０
セタノール ０．５
モノステアリン酸グリセリル ２．０
ＰＯＥ（２５）セチルエーテル ２．０
グリセリン ４．０
１，３−ブチレングリコール ６．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
キサンタンガム ０．２
ｐＨ調整剤 適量
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
計 １００．０重量％
Formulation Example 4: Emulsion [Composition] [Ratio]
TWSLPWY peptide 0.01
Hydrolyzed elastin 0.01
Hypericum extract (elastase inhibitor) 1.0
Squalane 2.0
Liquid paraffin 5.0
Cetanol 0.5
Glyceryl monostearate 2.0
POE (25) cetyl ether 2.0
Glycerin 4.0
1,3-butylene glycol 6.0
Carboxyvinyl polymer 0.1
Xanthan gum 0.2
pH adjuster appropriate amount preservative appropriate amount perfume appropriate amount purified water appropriate amount
Total 100.0% by weight
製剤実施例５：飲料
〔組成〕 〔比率〕
ＴＷＳＬＰペプチド ０．０１
フィッシュコラーゲンペプチド ０．５
ビタミンＢ２ ０．００５
ビタミンＣ ０．５
エリスリトール １０．０
酸味料 １．０
甘味料 １．０
香料 ０．０１
精製水 残量
計 １００．０重量％
Formulation Example 5: Beverage [Composition] [Ratio]
TWSLP peptide 0.01
Fish collagen peptide 0.5
Vitamin B2 0.005
Vitamin C 0.5
Erythritol 10.0
Acidulant 1.0
Sweetener 1.0
Fragrance 0.01
Purified water remaining
Total 100.0% by weight
製剤実施例６：内服用錠剤
〔組成〕 〔比率〕
ＴＷＳＬＰＷＹペプチド ４．０
全トランスレチノール ０．０４
ビタミンＢ１ ０．８
ビタミンＢ２ ０．４
香料 ０．５
甘味料 ０．５
ショ糖脂肪酸エステル ３．０
マルチトール ９０．７６
計 １００．０重量％
Formulation Example 6: Tablets for internal use [Composition] [Ratio]
TWSLPWY peptide 4.0
All-trans retinol 0.04
Vitamin B1 0.8
Vitamin B2 0.4
Fragrance 0.5
Sweetener 0.5
Sucrose fatty acid ester 3.0
Maltitol 90.76
Total 100.0% by weight
本発明のペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、生体内においてエラスチン、コラーゲン、その他の基底膜構成成分の分解を抑制でき、それにより、シワやたるみなどの皮膚の老化を効果的に予防・改善することができ、若々しい肌を維持すること等のために有益に利用され得る。 The peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof can suppress degradation of elastin, collagen, and other basement membrane components in vivo, thereby effectively preventing and improving skin aging such as wrinkles and sagging. Can be beneficially utilized for maintaining youthful skin, etc.
配列表の配列番号１は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号２は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号３は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号４は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号５は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
配列表の配列番号６は、線維芽細胞エラスターゼ活性及び／又はＭＭＰｓ活性に対する阻害作用を有するペプチドである。
SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a peptide having an inhibitory effect on fibroblast elastase activity and / or MMPs activity.
Sequence number 3 of a sequence table is a peptide which has an inhibitory action with respect to a fibroblast elastase activity and / or MMPs activity.
SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is a peptide having an inhibitory effect on fibroblast elastase activity and / or MMPs activity.
Sequence number 5 of a sequence table is a peptide which has the inhibitory effect with respect to a fibroblast elastase activity and / or MMPs activity.
SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is a peptide having an inhibitory effect on fibroblast elastase activity and / or MMPs activity.
Claims (6)
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２ (I：配列番号１)
(式中、Ｘａａ１及びＸａａ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、式(II)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３ (II：配列番号２)
(式中、Ｘａａ３は、任意のアミノ酸を示す)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、及び式(III)：
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ (III：配列番号３)
で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、からなる群より選ばれるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。 Formula (I):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Xaa 1 -Xaa 2 (I: SEQ ID NO: 1)
(Wherein Xaa 1 and Xaa 2 are each independently an arbitrary amino acid)
A peptide comprising the amino acid sequence represented by formula (II):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro-Xaa 3 (II: SEQ ID NO: 2)
(Wherein Xaa 3 represents any amino acid)
A peptide comprising the amino acid sequence represented by formula (III):
Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (III: SEQ ID NO: 3)
A peptide selected from the group consisting of a peptide consisting of the amino acid sequence represented by
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩。 Thr-Trp-Ser-Leu-Pro (III: SEQ ID NO: 3)
Or a derivative thereof, or a salt thereof.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009044325A JP2010195733A (en) | 2009-02-26 | 2009-02-26 | Novel peptide |
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|---|---|
| JP2010195733A true JP2010195733A (en) | 2010-09-09 |
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| Country | Link |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008074840A2 (en) * | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders |
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2009
- 2009-02-26 JP JP2009044325A patent/JP2010195733A/en not_active Ceased
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008074840A2 (en) * | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders |
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