JP2010193875A

JP2010193875A - 遺伝子導入ベクターとしての非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０二重ベシクルの調製と遺伝子導入機能

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Publication number: JP2010193875A
Application number: JP2009072745A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Kato; 敬一加藤
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Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2010-09-09
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: JP6094022B2

Abstract

【課題】遺伝子導入に際して、導入効率の良い遺伝子ベクターを提供する。
【解決手段】ベシクルの中に遺伝子固定化小粒径ベシクルを抱えた、二重構造の、膜融合能に優れたＳｐａｎ８０ベシクルを用いた遺伝子ベクター。このベシクルを血中に投与すると、目的細胞まではＤＮａｓｅなどの攻撃から保護して、遺伝子を目的細胞表面まで送達する。さらに、そのベシクルが目的細胞と膜融合して、ベシクル内の遺伝子固定化小粒径ベシクルを細胞内に放出する。その小粒径ベシクルが細胞形質内で遺伝子ベクターの役割を果して、細胞核まで遺伝子を効率良く送達する、核内への遺伝子導入法。
【選択図】図５

Description

本発明は、カチオニックＳｐａｎ８０ベシクルからなる二重ベシクルを用いて、生体内遺伝子導入効率の良い遺伝子ベクターを開発し、その機能を解明する技術に関する。

遺伝子治療などの生体内遺伝子導入を試みるとき、血中に遺伝子ベクターを投与することになる。この場合ベクターに固定化された遺伝子は血中のＤＮａｓｅなどの攻撃を受け分解され易い。そのため従来のような、遺伝子をベクター表面に固定化したものは生体内では有効性が低下する。さらに、細胞形質内に導入された遺伝子ベクターは、血中での攻撃を受けるため、細胞形質内での遺伝子ベクターとしての機能が低下する。また、エンドサイトーシスで導入された遺伝子ベクターでは、その遺伝子活性も低下する。そのため血中、および細胞形質内で有効に機能するベクターの開発が望まれている。

特許公開２００３−００１０９７号公報

遺伝子導入に際して、導入効率の良い遺伝子ベクターを開発することを目的とする。
従来のリポソームを用いた遺伝子導入では、リポソームの外表面に遺伝子を固定化しているため、血中ではその遺伝子がＤＮａｓｅなどの攻撃を受け、活性劣化する。また目的細胞に取り込まれる場合のメカニズムはエンドサイトーシス（細胞貪食）であるため、細胞形質内で遺伝子が核まで送達される効率が悪い。このような状況下、効率の良い遺伝子ベクターの開発が望まれている。

遺伝子ベクターとして、ベシクル表面に遺伝子を固定化した小粒径ベシクルを内包させた、その内包ベシクルよりも大きい粒径の二重構造のベシクルを調製する。これらのベシクルにはカチオン界面活性を混合させ、カチオニックなベシクルとして用い、細胞への親和性を増強させた。この二重ベシクルは、膜融合能に優れたＳｐａｎ８０ベシクルが基本となっており、高効率の生体内遺伝子導入が期待できる。この二重ベシクルを血中に投与すると、目的細胞までは、内包遺伝子を血中のＤＮａｓｅなどの攻撃から保護して、遺伝子を目的細胞表面まで送達する。さらに、その二重ベシクルの外側のベシクルが目的細胞と膜融合して、ベシクル内に存在する遺伝子固定化小粒径ベシクルを細胞内に放出する。その放出された小粒径の遺伝子固定化ベシクルが細胞形質内で、遺伝子を核まで運ぶ遺伝子ベクターの役割を果して、細胞核まで遺伝子を効率良く送達して核内への遺伝子導入を図る。

生体内遺伝子導入において、血中と細胞形質内での、二段構えの遺伝子送達機能を有しており、さらに膜融合能、生体安全性に優れたＳｐａｎ８０のベシクルを用いているため。高効率で安全な遺伝子導入が実現できる。

使用した遺伝子種々のベシクル模型図プラスミド内包ベシクル（ＶＰ）の顕微鏡写真種々のベシクルによる相対遺伝子発現量のグラフ（ヒト骨肉腫細胞株（ＯＳＴ）の場合）種々のベシクルによる相対遺伝子発現量のグラフ（ヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞（ＥＲＭ５−１細胞）の場合）

１．使用した癌細胞
ＯＳＴ：ヒト骨肉腫細胞
ＥＲＭ５−１：ヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞
２．使用したベシクル
ＶＰＶ：プラスミド外付けベシクルを内包したベシクル
ＩＶＰＶ：プラスミド外付けベシクルを内包したイムノベシクル
ＶＰ：プラスミド内包ベシクル
ＰＶ：プラスミド外付けベシクル
ＶＶ：ベシクル内包ベシクル
３．使用した遺伝子：ｐＥＧＦＰＬｕｃ
４．ＩＡＯＥ：ＩｓｏｃｙａｎｉｃＡｃｉｄＯｃｔａｄｅｃｙｌＥｓｔｅｒ
５．ＤＯＴＡＰ：カチオニック脂質（化学式：Ｃ_４３Ｈ_８３ＮＯ_８Ｓ）

レポーター遺伝子として、遺伝子導入されるとルシフェラーゼを産性するｐＥＧＦＰＬｕｃを用いて、そのプラスミドを大腸菌で培養して増殖させた。一方、二段階乳化法により調製する、界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクルを基本として種々のベシクルを調製し、上記遺伝子のベクターとして用いた。このＳｐａｎ８０ベシクルには、膜強化剤として微量の大豆レシチンおよびコレステロールを混合し、さらにはカチオン界面活性剤であるＤＯＴＡＰを上記のＳｐａｎ８０中に２０ｗｔ％の割合で混合させ、カチオニックＳｐａｎ８０ベシクルとして用いた。このベシクルはエクストルダーによる粒径制御や二次乳化後の長時間撹拌により、そのベシクル粒径を約１５０ｎｍ以下にして小粒径のベシクルをまず調製した。
▲１▼この小粒径のカチオニックＳｐａｎ８０ベシクルの表面にｐ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎを媒体としてプラスミドを結合させた、いわゆるプラスミド外付けベシクル（ＰＶ）を調製した。▲２▼またカチオニックＳｐａｎ８０ベシクル内プラスミドを内包したベシクル（ＶＰ）も二段階乳化法により調製した。▲３▼さらに上記のＰＶを内包した遺伝子外付けベシクルを内包する二重ベシクル（ＶＰＶ）も調製した。▲４▼またこのＶＰＶベシクルの表面に抗体を固定化したＩＶＰＶを調製した。このような４種類のベシクルを用いて、二種の癌細胞に対する遺伝子導入実験を行った。使用した癌細胞はヒト骨肉腫細胞（ＯＳＴ）およびヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞（ＥＲＭ５−１）である。ＯＳＴ細胞の遺伝子導入実験に対しては、ＰＶ、ＶＰ、ＶＰＶの三種類のベクターを、また、ＥＲＭ５−１に対する遺伝子導入実験では、ＰＶ、ＶＰ、ＶＰＶＩＶＰＶの４種類を用いた。ＩＶＰＶの抗体にはＥＲＭ５−１を標的させるための抗ＥＧＦＲ抗体を用いた。
これらの実験から、二重ベシクルＶＰＶの内部に存在するＰＶが、ベシクルと細胞が融合した後、細胞形質内で核まで遺伝子を送達させるベクターとして機能し、遺伝子導入効率を上昇させることができることを実証した。

ＥＲＭ５−１細胞、ＯＳＴ細胞のメンテナンスは以下のように行った。
細胞が入った１０ｍｌシャーレの上澄みを除去し、５ｍｌの滅菌ＰＢＳで洗浄し、０．０２５％トリプシンを１ｍｌ添加後、細胞をインキュベーターに移し、約３０秒インキュベートする。
その後、血清をトリプシンと同量添加して、６ｍｌのＤＭＥＭ培地で細胞をはがし、遠心管に移して遠心処理する。（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）。その後、新しいシャーレに血清１ｍｌ、ＤＭＥＭ培地８ｍｌを添加する。遠心後、上澄みを除去し、希釈したい量の培地で沈殿した細胞を懸濁する。１ｍｌの細胞懸濁液を上記のシャーレに添加する。速やかにインキュベーターへ細胞を移す。

使用したプラスミドを図１に示す。プラスミド調製法は以下のように行った。▲１▼ （ＬＢ培地の調製法）ＮａＣｌ１ｇ、ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ、ポリペプトン２ｇ、蒸留水２００ｍｌを加え攪拌する。オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ）し、ある程度冷えたら冷蔵保存する。▲２▼ （５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンの調製）カナマイシン５００ｍｇ、蒸留水１０ｍｇをビーカーに測り取り、攪拌する。ドラフト内でシリンジに取り、フィルターを通して、１５ｍｌ遠心管（３本）に分けて凍結保存する。▲３▼ （寒天プレートの作成）ＬＢ培地３００ｍｌ、寒天４．５ｇを三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ）後、６５℃近傍で５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン６００μｌを加える。その溶液を１０ｍｌシャーレに約１０ｍｌずつ分注し、固まったら冷蔵保存する。▲４▼ （大腸菌の形質転換）試験管にＬＢ培地２ｍｌ、大腸菌培養液０．１ｍｌを入れる。３７℃で二時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）。この大腸菌１．５ｍｌをエッペンチューブに移し、遠心処理後（１２０００ｒｐｍ，３０秒）、上澄みを吸引除去して、５０ｍＭＣａＣｌ_２０．５ｍｌを加え、ボルテックスする。１００μｌをエッペンチューブに移し、目的のプラスミド１０μｌを加え、氷上に２０分間以上放置する。その後、試験管にＬＢ培地１ｍｌと７の大腸菌を入れ、３７℃で１時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）る。ＬＢプレートに２００μｌから全量をまき、コンラージ棒でプレート一面にぬる。▲５▼ （大腸菌培養）▲１▼１５ｍｌ遠心管にＬＢ培地２ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン４μｌを入れる。▲２▼前日培養したシャーレから大腸菌のコロニーをセルスクレーパを用いて取り、（▲１▼）の培地に加える。▲３▼３７℃で１０〜２０時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）。▲４▼ＬＢ培地２０ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン４０μｌを入れた１００ｍｌ三角フラスコに、（▲３▼）を加える。▲５▼３７℃で７〜８時間振盪する（１００〜１１０ｍｉｎ^−１）。▲６▼ＬＢ培地１０００ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン２ｍｌを入れた２Ｌ三角フラスコに、（▲５▼）を加える。▲７▼３７℃で１０〜２０時間振盪する。（１００〜１１０ｍｉｎ^−１）▲６▼ （Ｐｌａｓｍｉｄの調製）ＭａｘｉｐｒｅｐＫｉｔＰｒｏｔｃｏｌ（ＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔ，ｌｏｔＮｏ．４２１４７５３３）により、以下のようにした。▲１▼培養液を遠心管に移し、４℃で５０００×ｇ，１０分間遠心操作しバクテリア細胞を収集する。▲２▼遠心後、上澄みを棄て、バクテリアペレットを１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ１でペレットが無くなるまで懸濁する。▲３▼１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ２を添加後４〜６回静かに転倒混和して充分に混合し、５分間室温に放置する。▲４▼１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ３（４℃に冷却しておく）を添加後、直ちに４〜６回静かに転倒混和して充分に混合した後、２０分間氷上でインキュベートする。▲５▼４℃，７０００×ｇ以上で３０分間遠心操作する。遠心後、プラスミドＤＮＡ（上澄み液）を素早く回収する。▲６▼回収した上澄み液を４℃，７０００×ｇ以上で１５分間再度遠心操作する。プラスミドを含む上澄み液を素早く回収する。▲７▼１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＢＴを静置流出して平衡化しておいたＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００に回収した上澄み液を添加し、自然落下により樹脂に浸透させる。▲８▼ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００を２×３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＣで洗浄する。▲９▼１５ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＦでＤＮＡを溶出する。▲１０▼１０．５ｍｌの室温のイソプロパノールを添加し、よく混合した後、直ちに４℃、５０００×ｇ以上で６０分間遠心操作する。遠心後、上清を捨てる。▲１１▼ＤＮＡペレットを５ｍｌの室温７０％エタノールで洗浄し５０００×ｇ以上で６０分間遠心操作する。▲１２▼上清を捨て、５０００×ｇ以上で１分間遠心操作する。▲１３▼上清をピペットマンで慎重に取り除く。▲１４▼５〜１０分間放置し、ペレットを１００μｌのＴＥＢｕｆｆｅｒに溶解する。▲１５▼分光光度計によりＤＮＡ濃度を測定し、濃度を１ｍｇ／ｍｌになるように調整する。

種々のベシクルの調製法を以下に示す。なおここで調製した遺伝子ベクターとしてのベシクルの模型図を図２に示す。
▲１▼ Ｐｌａｓｍｉｄ内包ベシクルＶＰの調製＜内水の調整＞Ｐｌａｓｍｉｄ２０μｌ（濃度５００μｇ／ｍｌ）、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ７０μｌ、ＴＥｂｕｆｆｅｒ６０μｌを加えて、１５分間放置した。＜ベシクルの調製＞▲１▼茶瓶（１）にＳｐａｎ８０を５２．８ｍｇ，茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（コレステロール＋レシチンの量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼内水（Ｐｌａｓｍｉｄ溶液）を１５０μｌ入れながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、１５秒攪拌＋１５秒休みを８セット。）▲５▼茶瓶（１）をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加える。（ナスフラスコの壁面についた物を割り箸で落とし分散させる。）▲７▼ホモジナイザーで分散させる。（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）▲８▼先程の茶瓶（２）に移し変え、撹拌子を入れて一昼夜冷蔵庫で撹拌する。＜ベシクルの精製＞▲１▼瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼遠心管に３ｍｌのベシクル溶液を移し変える。▲３▼ベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除く。

▲２▼ Ｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクル（ＰＶ）の調製＜ベシクルの調製＞▲１▼茶瓶（１）にＳｐａｎ８０を５２．８ｍｇ、茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（コレステロール＋レシチンの量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする。）▲４▼内水（ＴＥｂｕｆｆｅｒ）を１５０μｌ入れながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、１５秒攪拌＋１５秒休みを８セット。）▲５▼茶瓶（１）をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加える。（ナスフラスコの壁面についた物を割り箸で落とし分散させる。）▲７▼ホモジナイザーで分散させる。（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）▲８▼先程の茶瓶（２）に移し変え、撹拌子を入れて一昼夜冷蔵庫で撹拌する（こうして長時間撹拌することにより、ベシクル粒径が約３０〜１５０ｎｍの小粒径のベシクルが調製される）。▲９▼より小さいベシクルを調製するときは、１００ｎｍのメンブランを用いたエクストルダーを用いて、この小粒径ベシクルの粒径制御をして、約１００ｎｍのほぼ均一な小粒径ベシクルを調製した。＜ベシクルの精製＞▲１▼茶瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼遠心管に３ｍｌのベシクル溶液を移し変える。▲３▼ベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，４ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除く。▲５▼Ｐｌａｓｍｉｄ４．２μｌ，Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ１５μｌ、精製したベシクル１０μｌをエッペンチューブに加え、１５分間放置する。こうしてＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅを結合媒体として、ベシクルに、Ｐｌａｓｍｉｄを結合させてＰＶを調製する。

▲３▼ Ｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクル内包ベシクル（ＶＰＶ）の調製＜ベシクルの調製＞▲１▼茶瓶（１）にＳｐａｎ８０を５２．８ｍｇ，茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（コレステロール＋レシチンの量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする。）▲４▼内水（ｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクル）を１５０μｌ入れながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、１５秒攪拌＋１５秒休みを８セット。）▲５▼茶瓶（１）をヘキサンで洗いながら、すり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加える。（ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸で落とし分散させる。）▲７▼ホモジナイザーで分散させる。（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）▲８▼先程の茶瓶（２）に移し変え、３時間撹拌して、ヘキサンを完全除去し、一昼夜冷蔵庫で保存する（こうして比較的大粒径のＶＰＶベシクル（平均粒径で３００ｎｍであるが、マイクロサイズのベシクルも生成する）が調製される）。＜ベシクルの精製＞▲１▼茶瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼遠心管に３ｍｌのベシクル溶液を移し変える。▲３▼ベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除く。＜二重ベシクルの確認＞▲１▼このようにして調製したベシクルの顕微鏡写真を図３に示すが、大粒径ベシクル内に小粒径ベシクルが存在している様子が確認できる。実際には、蛍光物質ＦＩＴＣを内包させたナノサイズベシクルを調製して、それを大粒径ベシクルに内包させた。蛍光測定により、そのナノサイズベシクルが大粒径ベシクルに内包されている事を確認した。

▲４▼ Ｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクル内包イムノベシクル（ＩＶＰＶ）の調製＜ＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ調製＞▲１▼エッペンチューブにｐｒｏｔｅｉｎＡ１００μｌ，Ｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ１００μｌを入れ攪拌する。▲２▼別のエッペンチューブにＩＡＯＥ１０ｍｇ，Ｎ−Ｎジメチルホルムアミド１〜２滴を入れ、（▲１▼）を５０μｌ加える。▲３▼湯槽上で２時間放置する（３０分毎に攪拌）。＜ベシクル調製＞▲１▼茶瓶（１）にＳｐａｎ８０を１３２ｍｇ，茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を４８ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にｐＨ９．０Ｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌ，ＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ５０μｌを加え撹拌子を入れて撹拌する。▲３▼茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ２６．４ｍｇ、コレステロール６ｍｇ，レシチン１２ｍｇ，ヘキサン３．０ｍｌを加える。（コレステロール＋レシチンの量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする。）▲４▼内水を３００μｌ入れながらマイクロホモジナイザーで攪拌する。（回転数２００００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）▲５▼茶瓶（１）をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液、調整したＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎを加える。（ナスフラスコの壁面についた物を割り箸で落とし分散させる。）▲７▼ホモジナイザーで分散させる。（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）▲８▼先程の茶瓶（２）に移し変え、３時間撹拌してヘキサンを除去する。▲９▼一昼夜冷蔵庫内で保存し、残ったヘキサンを除去する。＜ベシクルの精製＞▲１▼瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼遠心管に３ｍｌのベシクル溶液を移し変える。▲３▼ベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除く。▲５▼ＥＧＦＲ抗体を７５μｌ加え、冷蔵庫内で４８時間放置する。

ＥＲＭ５−１細胞およびＯＳＴ細胞への遺伝子導入をする方法を以下に示す。
▲１▼ （遺伝子外付けベシクル（ＰＶ）の場合）▲１▼遺伝子導入実験を行う前日に、６穴プレートに約２×１０^５個／ｍｌに調整したＥＲＭ５−１細胞をプレーティングしておく。▲２▼Ｐｌａｓｍｉｄ４．２μｌ，Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ１５μｌ，ＤＭＥＭ培地１．５ｍｌを混合し、１５分間室温に放置する。（３穴あたり）▲３▼１５分間放置後、ＤＯＴＡＰを混入させたベシクル６μｌを添加し、１５分間室温に放置する。▲４▼１日前にプレーティングしておいたＥＲＭ５−１細胞をＰＢＳで一回洗浄し、３の細胞培養液を１穴あたり０．５ｍｌ添加する。▲５▼３７℃、５％ＣＯ_２下で３時間保温後、液を全て吸い、ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、さらに２４時間培養する。▲２▼ （ＰＶ以外のベシクルは下記の方法によった）▲１▼遺伝子導入実験を行う前日に、１２穴プレートに約２×１０^５個／ｍｌに調整したＥＲＭ５−１細胞を１ｍｌずつプレーティングする。▲２▼プレートの上澄みを除去しＰＢＳで洗浄後、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を０．５０ｍｌ入れ、濁度調製した各ベシクルサンプルを２５μｌ添加する。▲３▼３時間後、液を全て吸い、ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間インキュベートする。▲３▼ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙ（ｐＥＧＦＰ−ｌｕｃ）▲１▼各ｗｅｌｌをＰＢＳで二回洗浄後Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ５００μｌ加える。▲２▼セルスクレーパーで回収した細胞溶解液を１．５ｍｌチューブにいれ氷上におく。▲３▼ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒＪＮＲを立ち上げ、基質投入管を蒸留水で洗浄後、基質でリンスする。▲４▼サンプルを遠心処理（１３０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ）し、上澄みを９６ｗｅｌｌプレートに２０μｌずつ加え波長５６２ｎｍでルミネセンサーにより発光量を測定する。

上記のようにして行ったＯＳＴ細胞への遺伝子導入実験の結果を図４に、またＥＲＭ５−１への遺伝子導入の結果を図５に示す。図４では、二重ベシクルのＶＰＶの遺伝子導入はＶＰの約４倍、ＰＶの約４０倍になり、二重ベシクルＶＰＶの遺伝子ベクターとしての優位性が示された。一方、ＥＲＭ５−１細胞では、二重ベシクルＶＰＶの遺伝子導入はＶＰの約２．７倍、ＰＶの１．５倍となり、やはりＶＰＶの優位性が示された。さらには、外側のベシクルに抗体を取り付けたＩＶＰＶではＶＰＶの約２．８倍となり、抗体固定化の効果が明らかになった。

Claims

ベシクル表面に遺伝子を固定化したベシクルを、さらにベシクルの中に内包した二重ベシクルが、遺伝子導入ベクターとして効率が良いこと。
この二重ベシクルの内部ベシクルが、細胞形質内で二段目の遺伝子ベクターとして働くこと
ベシクルの主成分がＳｐａｎ８０であるため、このベシクルが膜融合により遺伝子導入すること。