JP2010162031A - カンプトテシン類の制癌剤に対する薬剤耐性を獲得した癌細胞の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特に副作用が重篤で、癌患者に投与する頻度が高い制癌剤として、カンプトテシン類の薬剤耐性癌細胞株と親癌細胞株における遺伝子増幅または欠失を解析することにより、癌細胞の薬剤耐性獲得に関連する新たな遺伝子マーカーとして、ABCB6遺伝子、ABCB10遺伝子、ABCE1遺伝子、BCL2L2遺伝子、BCL2L10遺伝子、および、BCL2L1遺伝子からなる群のABCトランスポーター系遺伝子またはBCL2ファミリー遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、当該被験癌細胞における、カンプトテシン類の制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出し得る。
【選択図】なし
Description
上記に列挙した制癌剤のうち、「カンプトテシン類」としては、カンプトテシンの他に、カンプトテシン誘導体として、第一製薬が開発したDX−8951、イタリア・メナリーニ社が開発したT−0128、イギリス・スミスクライン・ビーチャム社が開発した塩酸ノギテカンが挙げられる。「シスプラチン類」は、白金製剤(プラチナを含有する)ともいい、シスプラチン、ビンブラスチン、カルボプラチンが挙げられる。「エトポシド類」として、エトポシドの他に、エトポシド誘導体として、日本化薬が開発したNK611(エトポシド誘導体錠)が挙げられる。「シトシンアラビノシド類」として、シトシンアラビノシドの他に、シトシンアラビノシド誘導体として、そのフッ素化誘導体であるゲムシタビンが挙げられる。
この態様の本検出方法は、それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照DNAと薬剤耐性の獲得を検出する対象となる被験癌細胞のDNAを、上記DNA定着基盤上において同時に接触させてハイブリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、被験DNAの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する、薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法である。
これらのDNA検出法に用いるDNA定着基盤(本発明は、当該DNA定着基盤をも提供する発明である)に定着させるヒトDNAは、選択する検出法に応じて選択することが可能である、すなわち、本検出方法の態様として、DNAチップ法を行う場合には、cDNAまたは合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。また、CGH法を行う場合には、ゲノムDNAが挙げられる。
上述したDNA定着基盤を用いて、被験DNAの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する場合、特定領域のゲノムDNA等の断片が、好適には網羅的に定着している本定着基盤に、それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照ゲノムDNA等(正常細胞または正常組織のゲノムDNA等)と被験ゲノムDNA等(薬剤耐性を獲得しているか否かを検出する対象となる癌細胞または癌組織のゲノムDNA等)を同時に接触させてハイブリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、被験ゲノムDNA等の特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する検出方法である。
Subtractive CGH法は親株のゲノムとそれから誘導した薬剤耐性細胞のゲノム各領域のコピー数を比較し、差し引くことにより遺伝子の増幅の度合いと欠失を定量的に算出する方法である。本法を用いて、親株と比較して23種類の薬剤耐性癌細胞で見出された遺伝子の増幅・欠失の変化を表1に示した。
ABCトランスポーターをコードするヒト遺伝子として48種類がこれまで知られている(Dean,M.,Hamon,Y.and Chimini,G.:The human ATP−binding cassette(ABC) transporter superfamily,J.Lipid Res.,42,1007−1017,2001)。ここで試験した薬剤耐性細胞中では20種類のABCトランスポーター遺伝子が増幅していた。その中で、17種類の遺伝子の増幅をFISH法で確認した。
BCL2遺伝子、BCL2L1(BCLXL)遺伝子、BCL2L2(BCLW)遺伝子、BCL2A1遺伝子、MCL1遺伝子及びBCL2L10遺伝子の各遺伝子群はBCL2ファミリーに属し、抗アポトーシスの作用を有する制御蛋白質である(Gross,A.,McDonnell,J.M.,and Korsmeyer,S.J.:BCL−2 family members and the mitochondria in apoptosis,Genes Dev.13,1899−1911,1999)。
制癌剤によるアポトーシスの誘導に対するBCL2L2遺伝子発現の影響を検討した。ヒト卵巣癌SKOV3細胞とエトポシド耐性卵巣癌SKOV3/VP細胞を100μg/mlのVP−16存在下で24時間培養し、caspase−3の活性化に伴うアポトーシスを測定した。その結果、カスパーゼ活性は親株と比較するとエトポシド耐性SKOV3/VP細胞では約1/2に低下した(図4A)。次に、BCL2L2遺伝子の役割を解析するために、BCL2L2のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理し、BCL2L2遺伝子発現を抑制した条件でVP−16の影響を検討した。トランスフェクション試薬(Oligofectamine)単独、BCL2L2のセンスオリゴヌクレオチド(スクランブル配列のコントロールオリゴヌクレオチド)は影響しないが、BCL2L2のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加するとBCL2L2遺伝子発現が低下した(図4B)。この条件でSKOV3/VP細胞のエトポシド(VP−16)に対する感受性が増大した(図4C)。従って、BCL2ファミリー遺伝子の増幅がカスパーゼ活性を低下させ、制癌剤耐性を誘導しているといえる。
シトシンアラビノシド耐性白血病K562/AC細胞はデオキシシチジンキナーゼ(DCK)遺伝子が局在するクロモソーム4qの領域を欠失、カンプトテシン耐性大腸癌HT−29/CPT細胞はトポイソメラーゼ1(TOP1)が局在するクロモソーム20qを欠失する。一方、TOP2Aが局在するクロモソーム17q21−22の領域は5種類のエトポシド(VP−16)耐性細胞では増幅・欠失は認められない(表1)。シトシンアラビノシド(Ara−C)、カンプトテシン(CPT)及びエトポシド(VP−16)耐性細胞で、FISH法を用いてDCK遺伝子、TOP1遺伝子、TOP2A遺伝子のコピー数を求め、リアルタイム逆転写−PCR法によりそれらの発現レベルを測定した(表3)。
ABCトランスポーターファミリーに属するABCA3遺伝子、ABCB1遺伝子、ABCB6遺伝子、ABCB8遺伝子、ABCB10遺伝子、ABCB11遺伝子、ABCC1遺伝子、ABCC4遺伝子、ABCC9遺伝子、ABCD3遺伝子、ABCD4遺伝子、ABCE1遺伝子及びABCF2遺伝子はそれぞれBACクローン、RP11−304L19、RP11−212B1、RP11−803J6、RP11−606P1、RP4−613A2、RP11−704B8、RP11−516F7、RP11−124D15、RP11−729I10、RP11−272P3、RP5−919J22、RP11−543H9及びRP4−548D19に含まれている。BCL2ファミリーに属するBCL2L2遺伝子、MCL1遺伝子及びBCL2L10遺伝子はそれぞれBACクローン、RP11−124D2、RP11−243G22及びRP11−337B11に含まれる。これらのBAC DNAを4塩基認識酵素RsaIで消化した後アダプターを加えてライゲーションを行った。その後、アダプターの配列をプライマーに用いてPCRを行い、遺伝子増幅を行った(この増幅工程を無尽蔵化と言う)。コントロールDNAとして、上記以外の5種類のBAC DNA(RP11−98A20、RP11−252O11、RP11−357G3、RP11−196F4及びRP11−736A8)を無尽蔵化して調製した。
Claims (12)
- 被験癌細胞における、ABCA3 遺伝子、ABCB6遺伝子、ABCB8遺伝子、ABCB10遺伝子、ABCC4遺伝子、ABCC9遺伝子、ABCD3遺伝子、ABCD4遺伝子、ABCE1遺伝子、ABCF2遺伝子、BCL2L2、BCL2L10、BCL2L1、および、BCL2A1からなる群のABCトランスポーター系遺伝子またはBCL2ファミリー遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、当該被験癌細胞における制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出する、検出方法。
- ABCA3遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCB6遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCB8遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCB10遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCC4遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCC9遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCD3遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCD4遺伝子の増幅がアドリアマイシンに対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCE1遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ABCF2遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、BCL2L2遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類、エトポキシド類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、BCL2L10遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、BCL2L1遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類、エトポシド類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標である、請求項1記載の検出方法。
- 検出方法を、CGH法、フローサイトメトリー法、ELISA法、DNAチップ法、または、定量PCR法により行う、請求項1または2の検出方法。
- 検出方法をCGH法またはDNAチップ法により行う、請求項1または2記載の検出方法。
- CGH法またはDNAチップ法に用いる基盤が、ABCA3遺伝子、ABCB6遺伝子、ABCB8遺伝子、ABCB10遺伝子、ABCC4遺伝子、ABCC9遺伝子、ABCD3遺伝子、ABCD4遺伝子、ABCE1遺伝子、ABCF2遺伝子、BCL2L2遺伝子、BCL2L10遺伝子、BCL2L1遺伝子、および、BCL2A1遺伝子からなる群のABCトランスポーター系遺伝子またはBCL2ファミリー遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子を含有するDNAの定着基盤である、請求項4記載の検出方法。
- 上記DNAの定着基盤が、さらに、ABCB1 遺伝子、ABCC1遺伝子、ABCB11遺伝子、BCL2遺伝子、MCL1遺伝子、BCLXL遺伝子、DCK1遺伝子、TOP1遺伝子、および、TOP2A遺伝子からなる群のABCトランスポーター系遺伝子、BCL2ファミリー遺伝子またはDNA合成関連遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子を含有するDNA定着基盤である、請求項5記載の検出方法。
- それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照DNAと薬剤耐性の獲得を検出する対象となる被験癌細胞のDNAを、上記DNA定着基盤上において同時に接触させてハイブリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、被験DNAの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する、請求項4〜6のいずれかに記載の薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法。
- 上記DNA定着基盤に定着されるDNAと被験DNAと対照DNAが、ゲノムDNAである、請求項7記載の薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法。
- ABCA3 遺伝子、ABCB6遺伝子、ABCB8遺伝子、ABCB10遺伝子、ABCC4遺伝子、ABCC9遺伝子、ABCD3遺伝子、ABCD4遺伝子、ABCE1遺伝子、ABCF2遺伝子、BCL2L2遺伝子、BCL2L10遺伝子、BCL2L1遺伝子、および、BCL2A1遺伝子からなる群のABCトランスポーター系遺伝子またはBCL2ファミリー遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子を含有するDNAが定着している、DNAの定着基盤。
- さらに、ABCB1遺伝子、ABCC1遺伝子、ABCB11遺伝子、BCL2遺伝子、MCL1遺伝子、BCLXL遺伝子、DCK1遺伝子、TOP1遺伝子、および、TOP2A遺伝子からなる群のABCトランスポーター系遺伝子、BCL2ファミリー遺伝子またはDNA合成関連遺伝子から選ばれる1種以上の遺伝子を含有する複数種類のDNAが定着している、請求項8記載のDNAの定着基盤。
- 基盤に定着させる複数種類のDNAが、ゲノムDNA、cDNA、または、合成オリゴヌクレオチドである、請求項9または10記載のDNAの定着基盤。
- 複数種類のDNAがゲノムDNAであり、かつ、当該ゲノムDNAが、BAC DNA、YAC DNA、または、PAC DNAの遺伝子増幅産物である、請求項11記載のDNAの定着基盤。
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