JP2010145985A - 空間光変調器を用いた広視野超解像光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】位相照明機能を持つ光学顕微鏡とその方法を提供する。
【解決手段】光源１１０は空間パターンを持つ光ビームを形成することで、複数個の位相における各位相でサンプル１６０を連続照明する。ディテクター１７０は第一距離分解能と第一方位分解能において、サンプルの第１映像を探知し、各映像と照明する複数個の位相における個別位相は相対関係にある。プロセッサ１８０は第一映像を処理することで強力な切片映像サンプルを作成する。さらにプロセッサは第二距離分解能において、第二映像を現すデータを形成する。その後、スペクトル分析を行い第二方位分解能において強化したサンプル１６０の切片映像データを形成する。
【選択図】図１

Description

本発明は顕微鏡システムとその使用方法に関するもので、特に広視野超解像光学切片の顕微鏡システムとその使用方法に関する。

非近接場光学顕微鏡技術分野において、「空間分解能」の極限を突破することがこれまでの重要な課題だった。現在、空間分解能を備え超解像力を用いた非近接場光学顕微鏡の技術には、誘導放出制御(Stimulated Emission Depletion, STED)顕微鏡技術、光活性化極限顕微鏡法(Photoactivated Localization Microscopy, PALM法)及びSTORM光学技術(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)といったものが挙げられ、これらはすべて走査光学系により映像を形成するものである。

前記技術を用いて形成されるシステムは非常に複雑で多くのコストがかかり、かつ立体映像が必要になると映像取り込みに要する時間が非常に長くなる。また再起アルゴリズムを用いて光学映像の回折効果を低めながら空間分解能を高めることができるため、このような技術はコントラストの高い映像上での分解能を高めることが可能となる。しかしながら、これは解析処理の集計・計算に時間がかかりすぎる上、動態映像の一部における観察分解能を高め、解析処理の集計・計算を行おうとするとさらに長い時間が必要となった。

また、Pattern Excitationとも称される構成照射(Structured Illumination)は、別の超解像光学技術である。通常光学顕微鏡の入射光は二次元網状パターンによって調節され、それぞれ垂直光軸のx方向とy方向に向かって、当該網状パターンをそれぞれ違う位置に移動させ、少なくとも５枚の映像を取得した後、さらに方程式を用いて方位分解能の回折限界を突破した顕微鏡映像を読み取る。そのメリットは走査機構を使わずとも、従来の広視野光学系を用いて直接映像を取得できることにある。再起アルゴリズムに比べて映像を収集・計算する時間がさらに短縮される。このような技術は線形光学または非線形光学の方法により励起を行うことができる。このほか、液晶空間光変調器（Spatial light modulator,SLM）により調節する照射機能搭載の超解像全反射蛍光顕微鏡を提出した人もいるが、当該照射して二次元像を取得する電子顕微鏡技術では光学切片(Optical Sectioning)の効力を証明するに至っていない

さらに、液晶空間光変調器（Spatial light modulator,SLM）を用いて一次元的に調整した広視野光学切片顕微鏡の技術についても提出した。これは差動測定のコンセプトを利用したもので、広視野光学切片顕微鏡の距離分解能をナノメートルサイズにまで改善することができ、さらに再起アルゴリズムを使えばその方位分解能を向上させることも可能である。ただ、一次元的に調節した広視野光学切片顕微鏡では方位分解能を直接引き上げるには至っていない。

本発明は光学の映像処理方法である。当該方法には、複数個の位相における各位相上で、空間パターンによりサンプルを連続照明し、第一の距離分解能と第一の方位分解能においてサンプルの第一映像データを取得し、さらに各映像は照明した複数個の位相における個別の位相と相対関係があり、情報を処理して得たデータによって切片映像サンプルを強化することが含まれる。さらに情報を処理して得たデータには、第一の距離分解能を上回る第二の距離分解能において第二の映像データと、第二の映像データにおいてスペクトル解析を行い、第一の方位分解能を上回る第二の方位分解能において強化した切片映像データサンプルを示す取得データが含まれる。

本発明は第一の映像に係る各映像に基づき、照明した個別の位相で数学の方法により第一の映像を組み合わせることで第二の映像を形成した。

第二の映像の一部である各映像に対して、フーリエ分析を施し、空間周波数において当該映像のスペクトルを形成した。かつ各映像のスペクトルを組み合わせ、切片映像サンプルを強化した複合スペクトルを形成した。複合スペクトルを使用することで逆フーリエ変換を示し切片映像サンプルを強化した。

ある実施例では各映像スペクトルの個別部分を組み合わせ、空間パターンの物理の特性に基づき、第二の映像の一部スペクトルをベクトルによって決められるスペクトルの原点に移動させた。空間パターンの物理の特性にはパターンの周期性が含まれる。

ある実施例では当該空間パターンは一次元空間において周期性を表した。別の実施例では、当該空間パターンは二次元空間または多次元空間において周期性を示した。

光軸に垂直な平面上に、空間パターンの周期性に基づき、線形光学の方法を用いて一定位置の各位置に空間パターンを移動させた。または、サンプルを照明して，而在光軸に垂直な平面上に当該パターンを一連の角度に対し各角度で回転させた。

またある実施例では光をサンプルの第１の深度まで集束させ、第１の深度においてサンプルの切片映像を形成した。しかも、連続して光をサンプルの一連の深度にまで集束させることで、各個別の深度においてサンプルの一連の切片映像を形成した。

本発明は光学の映像処理方法に関するものである。空間パターンを持つ光源形成が可能で、複数個の位相にある各位相においてサンプルを連続照明できる。第１の距離分解能と第１の方位分解能上において、サンプルに係る第一の映像のディテクターが探知できる。プロセッサにより第一の映像をキャッチ・処理することで、サンプルである切片映像を強化する。特に当該プロセッサを設定することで第一の映像を処理し、第１の距離分解能を上回る第二の距離分解能において、第二の映像データを形成し、第二の映像データにおいてスペクトル解析を行うことで、第１の方位分解能を上回る第二の方位分解能において、強化したサンプルの切片映像となるデータを形成した。

本発明はサンプルに係る第１の深度において光ビームを集束する光学コンポーネントが含まれる。

本発明は光学コンポーネントを接合するコントローラが含まれ、かつ当該モジュールは当該光学コンポーネントを制御することで、サンプルに係る第二の深度において光ビームを集束する。当該コントローラは圧電タイプの位置決め装置付きのものとする。

本発明は一次元空間において第１の周期性を持つシャドーマスクが含まれ、当該シャドーマスクは二次元空間において第二の周期性を持つことができる。

本発明に係る光源は当該シャドーマスクのモジュールにより照明の位相を調節し変更させることができるシャドーマスクを接合するモジュレーターを含む。当該シャドーマスクのモジュールにはシャドーマスクの位置と方向が含まれる。

当該プロセッサのさらなる構成は、第一の映像に係る各映像がそれぞれ対応する照明の個別位相に基づき計算し、第一の映像を組み合わせることで第二の映像を形成することができる。第二の映像の一部に係る各映像について、プロセッサを用いてフーリエ分析を行い、空間周波数において当該映像に係るスペクトルを形成する。プロセッサを用いて組み合わせたスペクトルに係る各個別部分において、強化したサンプル切片映像に係る複合スペクトルを形成する。さらにプロセッサにより複合スペクトルに逆フーリエ変換を行うことで切片映像を強化する。

光源自体のモジュールは当該空間パターンを形成できるもので、当該光源には可動の二次元光学パターンを形成するLEDアレイ結構が含まれる。

単一光変調器を用いて照明光の空間位相を調節すると、三次元空間において広視野光学顕微鏡の解析率の改善につながる。高速スイッチング技術を使って光を変調させようとすると、映像読み取り速度は超解像の映像を読み取るとき同様速くなる（１秒ごとに５枚分のパターン映像の読取可）。

本発明において著述するシステムと方法は、従来の蛍光顕微鏡を含み、容易に低コストで各光学設備への導入ができる。このほか、１個以上の励起光源をシステムにもインストールできる。このように細胞機能の研究応用に極めて役立つと考えられる。かつサンプルの超解像映像を高速で取得できるため、細胞内における構造物の動態分析にも活用できる。

本発明は高速フーリエ変換（FFT）と代数計算を行うことで、単独のプロセッサを用いて映像情報を処理するものである。当該単独プロセッサはほかのソフトウエアに比べて迅速に映像処理ができ、かつPCIカード（PCI）と同じようにパソコンに組み込んで使用することが可能である。

以下、本発明を図に示した実施形態を用いて詳細に説明する。

照射機能を搭載する光学顕微鏡の実施例の説明図である。 図１で示した光学顕微鏡を用いて映像処理したときのフロー図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した二次元周期性を持つパターン例の図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した二次元周期性を持つパターン例の図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した二次元周期性を持つパターン例の図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した二次元周期性を持つパターン例の図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した二次元周期性を持つパターン例の図である。 平面上に図３Ａの二次元周期性を持つ光学の映像を投影した図である。 図４Ａを、二次元周期性を持つパターンを空間周波数に変換したスペクトル映像である。 図３Ａの二次元周期性を持つパターンの切片映像M_X-である。 空間周波数内にあるM_X-のスペクトル映像M_X-(k_-u,k_y)である。 4枚のスペクトル偏移映像M_x＋−(k_x,k_y)とMy_＋−(k_x,k_y)により発生した複合スペクトル映像である。 平面上に投影し再生した二次元周期性を持つパターンの映像である。 均一照射の下で撮影した100ナノメートル（nm）の蛍光ボール２個の映像である。 750nmの二次元周期性を持つ網状パターンの構造照明器具の下で再建した蛍光ボール2個の超解像映像である。 図５Ａにおける点線の第一の強度分布曲線（点線）に沿った図と図５Ｂにおける点線の第二強度分布曲線（実線）に沿った図である。 750nmの周期性を持つ網状パターンを用いてそれぞれ異なる横向きの位置から記録した3個のボールの映像である。 750nmの周期性を持つ網状パターンを用いてそれぞれ異なる横向きの位置から記録した3個のボールの映像である。 光軸に沿って７５０nmの周期性を持つ網状パターンを用いた状況の下で得た第一の強度分布曲線（点線）図と500nmの周期性を持つ網状パターンを用いて得た第二の強度分布曲線（実線）図である。 中倍率域（20ｘ）の対物レンズに均等に光を照射した状況の下での纖維母細胞におけるアクチンフィラメント（F-actin)の映像（NA=0.4）である。 高倍率域（100ｘ） の対物レンズに均等に光を照射した状況の下での図７Ａの正方形の点線で囲んでエリアの詳しい映像（NA=1.3）である。 高倍率域（100ｘ） の対物レンズの構成照明の下、同じエリアで撮影した詳しい映像（NA=1.3）である。 高倍率域（100ｘ） の対物レンズの構成照明の下、同じエリアで撮影した詳しい映像（NA=1.3）で、図７Ｃから縦方向に500nm移動させた位置の映像である。 図７Ｂの点線に沿った第一の強度分布曲線（点線）図と、図７Ｃの点線に沿った第二の強度分布曲線（実線）図である。 図１に示すように図８は光学顕微鏡で撮影した別の実施例の図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した一次元周期性を持つ別のパターンの図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した一次元周期性を持つ別のパターンの図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した一次元周期性を持つ別のパターンの図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した一次元周期性を持つ別のパターンの図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した一次元周期性を持つ別のパターンの図である。 図２のフロー図に基づき、配列位相の下で変調した一次元周期性を持つ別のパターンの図である。

図１は照射機能付きの光学顕微鏡100に係る具体的な実施例である。光学顕微鏡100には従来の顕微鏡同様、光ビーム112を形成する光源110と光ビーム112を処理したい映像サンプル160に反射させるビームスピリッター140のコンポーネントから構成される。光学コンポーネントには光ビーム112をサンプル160における選択した映像平面上に合わせる対物レンズ150が付いている。サンプル160が反射（または発射）した光はまず対物レンズ150に当たり、かつビームスピリッター140を通過してディテクター170（例CCDカメラなど）に探知される。ディテクター170で探知された光信号を電気信号に変換し、プロセッサ180（コンピュータなど）に伝送することでサンプル160を数値化した映像を形成する。

ポジショニングステージ162上にサンプル160（または対物レンズ150）を取り付け、横方向と縦方向において線形移動させることができる。ここでいう「横方向」とは光の伝搬に沿った光軸方向（図１のz軸参照）のことをいい、これに対し「縦方向」とは通常光軸と垂直に交わる平面（x-y-平面参照）のことをいう。「厚切片」サンプル160（1 μｍ以上の物体）につき、サンプル160と対物レンズ150の間においてzの距離を調整することでさまざまな深度においてサンプルの切片映像を形成する。これを顕微鏡における光学の切片力ともいう。

従来の広視野顕微鏡における空間分解能では、回折限界の限制を受ける。ここでいう「空間分解能」または「光学の分解能」とは、映像処理システムにおいて、光学コンポーネント解析に係り映像処理するサンプルのセグメント力をいう。つまり「空間分解能」とはサンプルにおける２つの分解し得ない（解析可能な）ポイントが無理やり分けられてできた最小の空間の距離のことである。従って「微大な」または「強化」された空間分解能の映像処理システムはサンプル内では「微小」の構造を呈するか、または微小空間距離を分別できる隣接ポイントとして認識できる。

広視野顕微鏡における空間分解能を改善する方法としては、サンプルの空間変調パターン照明が挙げられる。後述するように基本的には調和した空間周波数に対しミキシングを実施した。

具体的な実施例において、光変調器120と光源110を空間パターン（実質のな周期性を持つ空間パターン）に提供し、パターン光ビーム112を通してサンプル160上に投影した。光変調器120の実施例は、シャドーマスク130（二次元柵状形式）とコントロールユニット（未表示）を用いてシャドーマスクの空間結構を調節することで、パターン光ビーム112の空間位相を分段または連続変化させることを含む。シャドーマスク130は局部的に一次元または多次元的周期性（図１に示す光ビーム112と垂直に交わる平面上に沿ったp_xとp_yの軸運動）を有することで、線形方法または回転方法によりシャドーマスク130の空間構造を変えることができる。

ここでは理論制限について触れていないため、少なくとも後述部分に基づき、照射機能付き顕微鏡100に関する分解能の強化力について検討する。

I₀は対物レンズ150の焦点上にある均一照射の強度、M₀は均一照射により形成された一般映像のサンプルと仮設する。現在、空間周波数（逆格子空間ともいう）においてフーリエ変換によりサンプルについて検討する。各光学システムにおいて、光学伝達関数（OTF）に基づき，遮断周波数閾値を下回るサンプルの空間周波数だけがシステムを通過する。従って、光学システムにより形成される映像M₀に含まれるのは、転換された空間帯（「通過帯域」）におけるサンプルから発信される光学情報のみである。つまり、この通過帯域外のサンプル情報はいったんM₀で失われてしまうと回復することができない。

変調した二次元（2D）空間パターンがサンプル上に投影された時の焦点面における構成照射の強度Ｉ(x,y)は以下の通りである。：

前記nがガラス屈折率である場合、αは光ビームと光学システムの光軸に挟まれた角であり、Λは照明の真空波長である。

構成照射の結果、現在サンプルの映像M(x,y)は以下のように表示される。

構成照射の主な効果は空間周波数の一定外の高周波域を通して光学システムの通過域帯に移入することで、映像M(x,y)で再構築し、従来広視野顕微鏡では取り込めない情報を回復させ、光学システムの空間分解能を改善させる。

図２は実施例のフロー200である。顕微鏡100を用いて三次元（3D）サンプルの光学切片を作成した。このフローを利用することで横方向と縦方向において従来の広視野顕微鏡を上回る分解能を持つサンプルの縦方向の切片映像を取得することができた。

ステップ210。まず「関心領域」（ROI）を探し出し映像処理を施す。通常サンプル160で選択したzの深度において二次元（x- とy-）区域で当該「関心領域」を設定する。サンプル160上の縦方向と横方向において、ポジショニングステージ162を動かすように対物レンズ150を移動させ入射光ビームを当該「関心領域」まで集束させる。

ステップ220：一連の空間位相の各位相において光学パターンによりサンプル160を連続照明する。本実施例において当該光学パターンはシャドーマスク130を貫通する光ビーム112によって形成し、かつp_x軸とp_y軸に沿ってシャドーマスク130を線形移動させることで光学パターンの空間位相を調整した。

例えば、図３Ａ〜図３Eでは、１シリーズの５つの空間位相上に二次元（2D）周期性を持つ光学パターンを表した。図３Ａでは光学パターンの中心を原点に置き、かつ当該線と距離をそれぞれp_x軸とp_y軸に沿って置き、T_xとT_yにおける空間周期において重ね合わせた。本実施例ではT_xとT_yの構造は同じである。別の実施例では2つの方向の各方向において特別な局部的周期性により二次元光学パターンの構造を設定した。

図3Bと図3Cでは、光学パターンをそれぞれ負の方向と正の方向に置き、p_x軸に沿って120°（またはT/3）偏移させた。これと同様に図３Ｄと図３Ｅでも光学パターンをそれぞれ負の方向と正の方向に置き、p_ｙ軸に沿って120°（またはT/3）偏移させた。

図３Ａ〜図３Eでは５つのパターン空間の位相常数をΦ_ｍｎで表した。Φ_ｍｎ＝（２Π／3)(m,n)、そのうち(m,n)はそれぞれ= (0,0)、(1,0)、(2,0)、(0,1)、、(0,2)とした。

ステップ230：構成照射の下、ディテクター170を用いてサンプル160で「関心領域」を持つ５枚の映像を連続獲得した。各映像とも表示することができ、かつ照明した５つの空間位相における各位相を形成した。方程式(3)に基づき、位相Φ_ｍｎ上において取得した１枚の映像ＭΦｍｎを以下の通り示した。

このステップにおいて得た映像ＭΦｍｎの方位分解能と距離分解能は従来の広視野顕微鏡による分解能と比較することができる。

ステップ240：処理して得た５枚の映像ＭΦｍｎは、リアル空間において縦方向の切片映像を形成した。特に本実施例における照明で用いた特殊な位相常数につき５枚の映像から得ることができる。以下にM₀を示す。

前述のように当該四枚の縦方向の切片映像Ｍｘ_＋−とＭｙ_＋−に関する各映像から従来の広視野顕微鏡の距離分解能を大きく上回る距離分離能を提供することができた。なお、Neil, et al.氏が1997年12月15日発行の雑誌『Optics Letters』にて発表した「従来の顕微鏡において構造光を用いて取得する光学切片法」の記述を参考とした。

ステップ270：偏移させた４枚の当該スペクトル映像を処理することで、複合スペクトルM_superを形成する。例えば、偏移させたスペクトル映像の個別部分を「ステッチング」することで、１枚の多層構造のスペクトル映像を構築した。比較的良好な多重構造スペクトル映像を構築する過程において、顕微鏡に係る光学伝達関数による引き起こされる信号衰退をカバーした。

ステップ280：当該複合スペクトルにおいて逆フーリエ変換を行い、１枚の「関心領域」の超解像映像M_superを再構築した。ステップ250〜ステップ280のスペクトル解析を通して再構築した超解像映像M_superは、縦方向の切片映像ＭＸ_＋−とＭＹ_＋−の方位分解能を上回った。要するに、超解像映像M_superは時によって切片映像を強化したものとみなされ、当該横方向と縦方向においても従来の広視野顕微鏡の分解能を上回る分解能を備えている。

ステップ290：「関心領域」に係る超解像映像M_superを得た後、縦方向においてサンプル160を移動させたときの増量/減量見通しなどそれぞれ深度の違うZにおいて次の「関心領域」サンプルを選んだ。このように、それぞれ深度の違うzにおいてステップ220〜ステップ280を何度も繰り返すことにより深度zにおいてサンプルの超解像映像を連続形成した。

本実施例において、一連の方法により三次元サンプルの光学切片を描写した。特に次の深度である照明ステップ220に入る前に、別の深度を選定しステップ280で完成したサンプルを再構築した。別の実施例において、独自に映像を処理して取得したステップ220〜ステップ230と、映像分析であるステップ240〜ステップ280を並行して実施した。例えば、先に継続した状況の下で、サンプルの深度を用いて５枚の映像グループを取得し、すぐその後のステップにおいて映像のスペクトル解析を取得する。

図4A〜図4Fでは上述のステップ200をさらに詳しく説明したものである。手間を省くために図３Ａの二次元光学パターンを平面上に投影し、映像処理を行った。

図４Ａは図３Ａの二次元光学パターンを示したもので、すでに平面上に投影された映像ＭΦ００（ステップ230で取得したもの）である。

図４Ｃでは二次元光学パターンを平面上の縦方向に投影した切片映像M_X-（ステップ240で取得）を表す。

次に前記システム及びその使用方法に係るフローの実施例を記載する。ある実施例においては構成照射の結果と均一照射を比較することで構成照射の強化効果を説明する。

図５Ａ〜図５Ｃでは直径100-nmの蛍光灯のサンプルにつき、光学顕微鏡100を用いて映像処理をしたものである。当該蛍光灯の発射波長は約560 nmである。当該発射波長の下での均一照射に係る理論方位分解能の限界は約263 nmであった。その結果、100-nm蛍光灯に係る均一照射の映像に約280 nmの幅を観測した。ここでいう「幅」とは映像における個別粒子がガウス分布（Gaussian）で強度に分布された時の半値幅（FWHM）を指す。

図５Ａは均一照射の下での２個の100-nm蛍光灯の映像である。図５Ｂは焦点面において750-nmの周期性を持つ二次元網状パターンの構成照射の下での２個の蛍光灯の超解像映像である。図５Ｃは２個の蛍光灯の強度分布曲線で、点線は図５Ａの点線に沿ったサンプルの曲線であり、実線は図５Ｂの点線に沿ったサンプルの曲線である。

図５Ｃに基づき、２つの強度分布曲線の「半値幅」は、図５Ａにおける均一照射映像の方位分解能は約325 nmだった。これを比較してみると、図５Ｂにおける構成照射映像の方位分解能は約180 nmであったことから、分解能の改善率は約２倍である。

図６Ａ〜図６Ｃはｚ軸に沿って３個の200-nm蛍光灯を走査し、照射機能を有する顕微鏡100に係る距離分解能を推算したものである。第１の実施例においては縦方向と横方向の強度変化が近くなりすぎるのを避けるため、比較的直径の大きい蛍光灯を選んだ。物体の成像が光学システムの方位分解能より極めて小さいとき、通常このような状況が起こることがある。

それぞれ違う周期を有する２つの網状パターン縦方向の強度曲線を測定した。図６Ｃにおいて点線の曲線は750 nmサイクルの網状パターン（焦点面で測定）をサンプル上に投影して得たデータで、実線の曲線は500 nmサイクルの網状パターンをサンプル上に投影して得たデータである。実線の曲線の「半値幅」は約290 nmで210 nmの距離分解能（約0.38Λ）に相当する。

図６Ａと図６Ｂは750-nmサイクルの網状パターンを用いたもので、それぞれ違う２つの横方向の位置において記録した蛍光灯の映像である。この２枚の映像から方位分解能が改善されたことがわかる。要するにこの３個の蛍光灯ははっきりと解析することができ、かつサンプルが焦点面から離れると蛍光灯の強度は弱まった。

ここで注意すべきことは500-nmの網状パターンを用いて取得した縦方向の強度曲線のサイドローブがピーク強度の20％に達したことである。これは恐らく対物レンズの縱方向の色差がもたらしたものと考えられる。重ね合わせたサンプルに対して、このようなサイドローブは映像品質に影響を及ぼす可能性があり、ある実施例においては、細胞などの生物的サンプルの構造上で750-nm網状パターンを観察すると、よりよい結果が得られるだろう。ある応用においてはaxial apodizing filtersなどのフィルタ技術を用いてパターンを変調することでサイドローブの大きさを少なくすることができる。

前記光学顕微鏡100と使用するフローは細胞における構造物の観察や重なり合った細胞の観察といった生物的応用にも使うことができる。

図７Ａ〜図７Ｅは各種映像を処理した条件の下で取得した固定の纖維母細胞におけるアクチンフィラメント（F-actin)（Alexa Fluor 488 phalloidin染色体を使用）の蛍光映像である。

図７Ａは均一照射の下におけるアクチンフィラメントの映像である。当該映像は0.4の開口数（NA）を有する低拡大率（20x）の対物レンズの下で取得したものである。この映像からは数個の重なり合った細胞におけるアクチンフィラメントが認められた。

図７Ｂは均一照射の下で、図７Ａのある区域（正方形の点線で囲んだ区域）の拡大映像である。当該映像は1.3の開口数を有する高拡大率（100x）対物レンズの下で取得したものである。

図７Ｃと図７Ｂは同じ区域を有するものの、構成照明の下で取得した映像である。図７Ｄは図７Ｃと同じ区域を有し、かつ対物レンズを縦方向に500 nm移動させた後に取得した焦点を外した映像である。図７Ｃにおいて、改善された方位分解能により図７Ｂの不鮮明だった数個のフィラメントの映像が鮮明に認められた。このように、当該技術を用いれば、正確に細胞骨格及び/または別の細胞内における構造物を定量化することができる。このほか、図７Ｄの強度からは図７Ｃを下回る現象が起こったことからも本発明に係る切片効果には関連性があることがうかがえる。

図７Ｅは図７Ｂ（点線の強度曲線）と図７Ｃ（実線の強度曲線）に沿って描かれた点線による強度分布曲線である。２つの当該分布曲線に基づいてアクチンフィラメントの幅がそれぞれ約330 ｎｍ及び約200 ｎｍであることが確認できた。これは構成照射と均一照射を相互比較した状況の下で、構成照射生物サンプルにおいてさらに微小な構造を表示できることを実証した。

以下に前記システムと方法に係る別の具体的な実施形態について著述する。

図８は光学顕微鏡800の別の具体的な実施例を示した図である。当該實施形態において、空間光変調器には照明光を二次元で調整するポラライザー822に接合する反射シリコン液晶（LCoS）パネル824が付いている。反射シリコン液晶パネル824は1024 x 768画素から組成され、かつその画素の大きさは11.3 ×11.3 μｍ２である。二次元反射シリコン液晶パネル 824においてリフレッシュ速度を60ヘルツにまで高めて駆動信号に急変させることでサンプル860上にある枠組みの変調パターンに移して投影する。

光源810（50 mW、475 nmのダイオード励起されたダイオード励起よる固体レーザー）により光ビームを発生させ、空間フィルタ812を通過しレンズ814を通して直径約8 mmの「最大半値幅」まで拡大することで空間光変調器820を照明する。さらに空間光変調器 820上にある網状パターンをレンズ880と対物レンズ850を通してサンプル860上に投影した。（1.3の 開口数を有する油浸対物レンズ）。サンプル860はCCDカメラ870により取得した映像である。ピエゾトランスデューサー852を対物レンズ650上に接合することで焦点面とサンプル860の相対高度をコントロールした。

再度図１を参照すると。光源110を適用した別の実施形態には各種ランプ（LEDランプやキセノンランプなど）とレーザー（単一波長レーザーと多重波長レーザー）が含まれる。このほかにも、出力する強度・波長・方向など光ビーム112の特性をコントロールするレンズ・ミラー・フィルター（未表示）などの光学コンポーネントが含まれる。ディテクター170の実施形態にはCCDカメラと別のCMOSディテクターが含まれる。

シャドーマスクのほかにも光源本体から発生するパターンにより光の変調を行うこともできる。例えば、LEDアレイを構築し、その力を利用して可動の二次元網状パターンを作成した。

空間パターンは各種利用が可能である。例えば、対称周期構造または非対称周期構造を持つ的一次元正弦波パターンまたは二次元正弦波パターンを使うこともできる。これと同時に光学パターンを介して簡単に空間位相のモジュール化を変更することも可能である。

図９Ａ〜図９Ｆでは一次元（1D）格子を用いた空間位相をモジュール化した実施形態である。当該実施形態において一次元格子を一連の角位置まで回転させ、それぞれの角位置で一連の空間位相に対応させた。

空間パターン形成には別の方法も考え得る。ある実施形態においてレーザースペックル技術により空間パターンを形成できた。例えば、あるすりガラスまたはを光照明ルートに沿って設置することで斯固定したスペックルパターンを形成することができ、当該パターンを照明サンプルとして使用した。ある状況においては当該スペックルパターンを用いて多数のフレーム処理を行うことで、分解能を強化した切片映像を取得することができた。

本発明はコンピュータプログラム製品においオペレーションと信号処理を実行することができ、プログラマブルプロセッサと方法を用いて機械読み取り可能な記憶媒体を実行することができ、データを入力した後、プログラマブルプロセッサを経由してデータを出力することができる。本発明は一個または多数の空間光変調器、ディテクター、光源、プロセッサ、システム、別のコンポーネントによりコンピュータプログラムのコントローラに接続して実行することができ、本発明に係るプログラマブルシステムには少なくともデータ受信と伝送と指定されたプログラマブルプロセッサ、データ記憶システム、入力装置と出力装置が含まれる。

尚、本発明は前記実施例になんら限定されるものでなく、本発明を逸脱しない範囲において様々な様態で実施しうることはいうまでもない。これに対し、その目的は本発明を申請する特許範囲において、様々な変更の可能性や一致性が包括されることを希望するものである。従って、本発明に係る申請特許範囲は前記記載に基づき、おおまかに解釈したものであり、すべての変更の可能性と一致性が含まれるものである。

100光学顕微鏡
110光源
112光ビーム
140ビームスピリッター
150対物レンズ
160サンプル
162ポジショニングステージ
170ディテクター
180プロセッサ
650対物レンズ
810光源
812空間フィルタ
814レンズ
820空間光変調器（Spatial light modulator,SLM）
880レンズ
850対物レンズ
860サンプル
870CCDカメラ
852ピエゾトランスデューサー（PZT)

Claims (24)

1. 少なくとも複数個の各位相上に空間パターンを連続照明したサンプルがあり、
   それにより取得したデータは当該サンプルの第１の映像を示し、第一距離分解能と第一方位分解能において、各映像と当該照明した複数個の位相の各位相と関係があり、
   当該取得データを処理することで当該サンプルの切片映像を強化するもので、それには当該取得データを処理することで、当該第一距離分解能を上回る当該第二の距離分解能において、第２の映像となるデータを発生させたものと、
   第２の映像となる当該データを利用して、スペクトル解析を行うことで、当該第一方位分解能を上回る第二方位分解能において、当該サンプルの当該切片映像を強化したデータを形成することを含むことを特徴とする光学的な映像形成方法。
2. 前記取得データを処理して形成する第２の映像データには、第１の映像の各映像と関係のある当該照明した各位相に基づき、当該第１映像を組み合わせて算定することにより作成した当該第２の映像を含むことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
3. 前記取得データを処理して形成する第２の映像データに対して行うスペクトル解析には、第２映像の各映像の一部に対してフーリエ分析を行うことで、空間周波数において当該映像スペクトルを形成させることを含むことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
4. 前記第２の映像データに対して行うスペクトル解析には、スペクトルの各個別部分を組み合わせることで当該サンプルに対し切片映像を強化した複合スペクトルを形成させることを含むことを特徴とする請求項３で記載する光学的な映像形成方法。
5. 前記スペクトルを組み合わせて示す当該各個別部分には、当該空間パターンの物理の特性に基づき、当該第２の一部のスペクトルを転移させることで、ベクトルを用いてスペクトルの原点を決定することを含むことを特徴とする請求項４で記載する光学的な映像形成方法。
6. 前記空間パターンの物理の特性には、当該空間パターンの周期性を含むことを特徴とする請求項５で記載する光学的な映像形成方法。
7. 前記第２の映像データに対し行うスペクトル解析には、逆フーリエ変換により当該切片強化映像を作成した上、当該複合スペクトルを処理することを含むことを特徴とする請求項４で記載する光学的な映像形成方法。
8. 前記空間パターンは一次元空間において周期性を示すことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
9. 前記空間パターンは二次元空間において周期性を示すことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
10. 前記複数個の位相の各位相において空間パターンを連続照明したサンプルには、垂直方向の光軸の平面上で当該空間パターンの周期性に基づき決められる一定位置の各位置まで当該空間パターンを直線移動させることを含むことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
11. 前記複数個の位相の各位相において空間パターンを連続照明したサンプルには、垂直方向の光軸の平面上で一連の角度の各角度で当該空間パターンを回転させることを含むことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
12. 前記複数個の位相の各位相において空間パターンを連続照明したサンプルには、当該サンプルの第１の深度まで当該照明を集束し、当該第１の深度において当該サンプルの一連の切片映像を作成することを含むことを特徴とする請求項１で記載する光学的な映像形成方法。
13. 前記映像形成方法には、当該サンプルの一連の深度にまで当該照明して連続集束することで、各深度において当該サンプルの一連の切片映像を作成することを含むことを特徴とする請求項１２で記載する光学的な映像形成方法。
14. 少なくとも空間パターンとの間に光ビームを形成し、複数個の位相の各位相においてサンプルを連続照明する光源があり、
    第一距離分解能と第一方位分解能からなる第１の映像である当該サンプルを探知し、各映像と当該照明する複数個の個別位相と相対するディテクターと、
    当該第１の映像を処理することで当該サンプルの切片映像を強化したものを形成するプロセッサで、そのプロセッサは当該第１の映像を処理することで当該第１距離分解能を上回る第２距離分解能において当該サンプルの切片映像を強化したものを形成するモジュールと、当該第二映像データ上でスペクトル解析を行った場所において当該第１方位分解能を上回る第２方位分解能において当該サンプルの切片映像を強化したデータを形成するモジュールからなる光学的な映像形成方法。
15. 前記光学コンポーネントにより当該光ビームを当該サンプルの第１深度に集束すること含むことを特徴とする請求項１４で記載する光学的な映像形成方法。
16. 前記当該光学コンポーネントに接合し、当該光ビームを集束し、当該サンプルの第２の深度まで当該モジュールをコントロールすることを含むことを特徴とする請求項１５で記載する光学的な映像形成方法。
17. 前記当該コントローラに圧電タイプの位置決め装置を含むことを特徴とする請求項１６で記載する光学的な映像形成方法。
18. 前記当該光源に一次元空間において第一の周期性を持つシャドーマスクを含むことを特徴とする請求項１４で記載する光学的な映像形成方法。
19. 前記当該シャドーマスが二次元空間において第二の周期性を持つシャドーマスクを含むことを特徴とする請求項１８で記載する光学的な映像形成方法。
20. 前記当該光源にさらに当該シャドーマスクに接合した上、当該照明の当該位相を調節することによって当該シャドーマスクのモジュールを変える変調器を含むことを特徴とする請求項１８で記載する光学的な映像形成方法。
21. 前記当該シャドーマスクのモジュールに当該シャドーマスクの位置を含むことを特徴とする請求項２０で記載する光学的な映像形成方法。
22. 前記当該シャドーマスクのモジュールに当該シャドーマスクの方向を含むことを特徴とする請求項２０で記載する光学的な映像形成方法。
23. 前記当該プロセッサはさらに当該第一映像を計算し組み合わせることで当該第二映像を作成し、当該第１映像に基づき照明した各映像の当該個別位相と、
    当該第二映像の一部の各映像に対し、フーリエ分析を行い空間周波数において当該映像のスペクトルを形成し、
    当該スペクトルの各個別部分を組み合わせ、当該サンプルの当該切片映像を強化した複合スペクトルを形成し、
    逆フーリエ変換を用いて当該切片映像を強化したものを作成し、当該複合スペクトルを処理することを含むことを特徴とする請求項１４で記載する光学的な映像形成方法。
24. 前記当該光源にはＬＥＤアレイ構造により可動な光パターンを形成することを含むことを特徴とする請求項１４で記載する光学的な映像形成方法。