JP2010145410A

JP2010145410A - 乳房、前立腺および卵巣の癌の予測のための、Ｓｈｃタンパク質に関連する方法および組成物

Info

Publication number: JP2010145410A
Application number: JP2010000265A
Authority: JP
Inventors: Raymond A Frackelton; エー・レイモンド・フラッケルトン; Pamela A Davol; パメラ・エー・ダボル
Original assignee: Roger Williams General Hospital
Current assignee: Roger Williams General Hospital
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2010-01-04
Publication date: 2010-07-01
Also published as: AU2003228225A1; AU2003228225B2; JP4694786B2; US20040033542A1; CA2477953A1; WO2003073821A2; JP2005531293A; EP1654377A2; EP1654377A4; WO2003073821A3; US7910314B2

Abstract

【課題】乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的かどうかを決定する方法を提供する。
【解決手段】乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法である。さらに該方法がｐ６６−Ｓｈｃの量のみが決定される方法である。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

本出願は、２００２年３月１日に出願された米国仮出願番号６０／３６０，７５８の優先権を主張するものであり、この出願の内容は本明細書中に参照によって援用される。

本明細書に記載される発明は、国防総省乳癌助成金番号（ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＧｒａｎｔＮｕｍｂｅｒｓ）ＢＣ９８０４１５およびＤＡＭＤ１７−９９−１−９３６３の基になされた研究の過程で達成された。

［発明の背景］
本出願の全体を通して、様々な文献が角形括弧（ｂｒａｃｋｅｔｓ）内のアラビア数字により参照される。これら文献の完全なる書誌的事項は、本明細書の「参照文献」に記載される。これら文献の開示の全体が本明細書中で参照されることにより本出願に援用され、本明細書に記載され主張される発明の発明時における、技術の状況をより完全に説明する。

患者の外科的な及びアジュバント治療（ａｄｊｕｖａｎｔｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の強度（ｖｉｇｏｒ）および程度を知るための、良好な予後の指標（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）が緊急に必要とされている（特に初期ステージの、節ネガティブ（ｎｏｄｅｎｅｇａｔｉｖｅ）な乳癌［１］、および初期の前立腺癌の患者に関して）。

攻撃的な表現型に関連する乳癌マーカーの１つはＥｒｂＢ２であり、これは成長因子レセプタのＥＧＦファミリーのメンバーである［２］。

節ポジティブな患者におけるＥｒｂＢ２の高発現は、一般的に不良な（ｐｏｏｒ）短期の臨床転帰［３−５］を予測する。

また、最近の乳癌（ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓ）の研究は、付加的な成長因子レセプター、例えば、他のメンバーの、ＥＧＦレセプターファミリー；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及びそのレセプター、ｃ−Ｍｅｔ；ＩＧＦ−１及びそのレセプター；ＦＧＦｓ及びそのレセプター；乳房由来成長因子（ｍａｍｍａｒｙ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）（ＭＤＧＦ−１及びそのレセプター）；並びに非レセプター型チロシンキナーゼｃ−ＳｒｃおよびＢｒｋの関与を指摘している［６に総説が記載されている、さらに７、８−１０を参照されたい］。攻撃的な乳癌に関するマーカーとして利用されることに加えて、これらの成長因子レセプターは、攻撃的な表現型に関して重要で機能的な役割を有していると思われる。これが真実である範囲内で、腫瘍細胞（ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ）における成長因子レセプターのシグナル伝達の総計（ｓｕｍｔｏｔａｌ）の測定値（ｍｅａｓｕｒｅｓ）は、外科的、放射線および化学内分泌（ｃｈｅｍｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）アジュバント治療をガイドする、緊急に必要とされている正確な予測能力（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｂｉｌｉｔｙ）を提供し得る。

ＥｒｂＢ２は、１８５，０００分子量の膜貫通性の糖蛋白質であり、細胞外のリガンド結合ドメインおよびチロシンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインを有している［１１］。

ＥｒｂＢ２を他の受容体型チロシンキナーゼと区別する特徴は、リガンドの非存在下でさえも、過剰発現させた場合に活性を有することである［１２］。この理由から、高レベルのＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現する細胞は、血清の非存在下で増殖し、また頻繁に形質転換するように思われる［１３］。機構的に、過剰発現は、安定なレセプター二量体を形成させる［１４］。

対照的に、大抵の他の成長因子レセプターは、最初に彼らのリガンドと結合してから、増殖性に二量体化できる［１５］。二量体化は、レセプターチロシンキナーゼを活性化させる。また、ＥｒｂＢ２は、彼らがリガンドと結合した後に、他のファミリーメンバーと活性型のヘテロダイマーを形成できる［１２］。例えば、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバー、ＨＥＲ−３およびＨＥＲ−４は、ＨＲＧ／ＮＤＦ〔ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）およびｎｅｕ分化因子〕リガンドと結合し、そしてＥｒｂＢ２をトランスモジュレーション（ｔｒａｎｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を介して活性化する［１６−１８］。同様に、ＥｒｂＢ２は、ＥＧＦに結合したＥＧＦレセプターとヘテロダイマーを形成して、ＥｒｂＢ２チロシンキナーゼを活性化する［１２］。

活性化されたＥｒｂＢ２チロシンキナーゼは、特定のチロシン残基を自身でリン酸化する。いくつかの「二次メッセンジャー」タンパク質は、彼らのＳＨ２およびＰＴＢドメインを介して、レセプターのリン酸化されたチロシンを認識して結合する［１９−２１］。多くのそれらのタンパク質は、次にレセプターによってチロシンリン酸化され、このことによりシグナル伝達カスケードが活性化され、伝搬される。それらの二次メッセンジャーの１つは、アダプタータンパク質Ｓｈｃであり、これはシグナルをＲａｓに伝達することを援助するように思われ、これにより最終的にはＤＮＡ合成および細胞増殖にシグナルを伝達する（図１を参照されたい）［２２，２３］（さらに報告によると、シグナルをＭｙｃに［２４，２５］およびＰＩ３’キナーゼ［２６］に伝達する）。前記レセプターは、Ｓｈｃのチロシン３１７をリン酸化し、これは次にＧｒｂ２−ＳＯＳ複合体により認識される。結果として、ＳＯＳは、細胞膜に移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ）し、このことによりＲａｓを活性化する能力を促進するように思われる［２７−３４］。Ｒａｓへのシグナル伝達経路は、乳癌に由来する多くの細胞株において構成的に活性化されることが示されている［３５−３８］。更に、Ｓｈｃに対する抗体、Ｓｈｃアンチセンス、および様々なＳｈｃドミナントネガティブ構築物を微量注射した研究は、ＥＧＦレセプター、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＩＧＦ−１およびＨＧＦからのシグナル伝達が機能的なＳｈｃに依存することを示している［８，２２，３９−４２］。Ｓｈｃの３つのアイソフォームが存在する、即ちそれぞれ６６、５２および４６ｋＤａのｐ６６、ｐ５２およびｐ４６である［２１，２３，４３］。ｐ６６Ｓｈｃアイソフォームは独特なＮ末端ドメイン（ＣＨ２）を具備しており、これはｐ５２またはｐ４６のＳｈｃアイソフォームでは発見されていない［２３］。ｐ５２およびｐ４６Ｓｈｃとは対照的に、ｐ６６Ｓｈｃは、ＭＡＰキナーゼ・シグナル伝達カスケードを活性化しなく、むしろ実際には成長因子のｃ−ｆｏｓを活性化する能力を阻害する［４４］。

現在、国立癌研究所は、９５以上の臨床試験を開始または計画しており、これらの試験は多数のチロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）を用いたもので、この阻害物質はＨｅｒ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦレセプターまたは任意の他の数個のレセプターおよび非受容体型チロシンキナーゼに特異的なものである。しかしながら、これらの試験は一般的に、どの患者が任意の単一ＴＫＩまたはＴＫＩｓの組み合わせに反応すると思われる腫瘍を有することを予測する、臨床家の能力の欠如により大きく妨げられている。

［発明の概要］
本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＳｈｃ）の量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率（ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｐ６６−ＳｈｃｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＳｈｃ）および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率（ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＳｈｃｔｏｐ６６−Ｓｈｃ）を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々における、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、被験者の一次治療（ｐｒｉｍａｒｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ）後に前記腫瘍の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）を患う尤度（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞（ｃａｎｃｅｒｏｕｓｃｅｌｌｓ）に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々におけるｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々における、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、Ｐ６６−Ｓｈｃに対して及びリン酸化したＳｈｃに対して特異的に結合する分離された抗体、並びにリン酸化Ｓｈｃに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、並びにリン酸化Ｓｈｃに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。

更に本発明は、本発明の方法を実施するためのキットであって、（ａ）ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｂ）リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｃ）既知の標準を産生するための試薬、および（ｄ）使用説明書を含むキットを提供する。

更に本発明は、ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法であって、本発明のハイブリドーマを培養することと、およびそのように産生されたモノクローナル抗体を回収することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法であって、本発明のハイブリドーマを培養することと、およびそのように産生されたモノクローナル抗体を回収することと、を含む方法を提供する。

更に本発明は、腫瘍をチロシンキナーゼ阻害物質を用いて良好に治療できるとの尤度を決定するための方法を提供し、該方法は：
（ａ）前記腫瘍からの細胞の第一サンプルを前記チロシンキナーゼ阻害物質と、前記サンプルにおいてチロシンリン酸化Ｓｈｃの形成が可能であろう条件下で（前記チロシンキナーゼ阻害物質の非存在下において）、接触させることと；
（ｂ）前記サンプルに存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと；および（ｃ）工程（ｂ）で決定されたチロシンリン酸化Ｓｈｃの量と前記腫瘍からの細胞の第二サンプル（前記チロシンキナーゼ阻害物質と接触していない）に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃの量とを比較することと（ここで、前記第二サンプルに存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃの量が前記第一と比較して多いことが、前記腫瘍を前記チロシンキナーゼ阻害物質で良好に治療できるとの尤度を示す）、を含む方法。

最後に本発明は更に、本発明の方法を実施するためのキットであって、別々のコンパートメントに、（ａ）チロシンリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｂ）チロシンリン酸化Ｓｈｃと結合する抗体の量を測定するための試薬、および（ｃ）使用説明書を含むキットを提供する。

［発明の詳細記載］
定義
「攻撃的（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）」は、腫瘍に関して、被験者において再発する素因（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を有することを意味する。「攻撃的」は、腫瘍細胞に関して、係る細胞が再発する素因を有する腫瘍に由来する細胞であることを意味する。

「量（Ａｍｏｕｎｔ）」は、細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃの何れかに関して、（ａ）分子、モルまたは重量を単位容積または細胞あたりで測定した絶対的な量、或いは（ｂ）指定の（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ）相対的な量（例えば、数的な評点０から５により指定された）を意味する。

「抗体」は、例示により（ｂｙｗａｙｏｆｅｘａｍｐｌｅ）、天然および非天然の双方の抗体を含む。具体的には、本用語は、ポリクローンナルおよびモノクローナル抗体、およびその断片を含む。

さらにまた、本用語は、キメラ抗体および完全に合成した抗体（ｗｈｏｌｌｙｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、およびその断片（例えば、抗原結合性の断片）を含む。

「既知の標準（ＫｎｏｗｎＳｔａｎｄａｒｄ）」は、本発明のコンテキストにおいて、適用できる場合には、ｐ６６−Ｓｈｃおよびリン酸化Ｓｈｃに関する、１以上の量、比率、または分布を意味する。好ましくは、既知の標準は、攻撃的な腫瘍および非攻撃的な腫瘍に特有の、量、比および／または分布を反映する。既知の標準を作出するための試薬は、限定されず、攻撃的であると知られている腫瘍からの腫瘍細胞、非攻撃的であると知られている腫瘍からの腫瘍細胞、および選択可能なものとして、標識した抗体を含む。

「ｐ６６−Ｓｈｃ」は、Ｓｈｃと称されるアダプタタンパク質の６６ｋＤアイソフォームを意味する。

「リン酸化Ｓｈｃ（ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＳｈｃ）」は、少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖がリン酸化された、「Ｓｈｃ」と称されるアダプタタンパク質を意味する。好ましくは、Ｓｈｃのチロシン残基がリン酸化される（「チロシンリン酸化Ｓｈｃ」）。かかる残基には、例えば、チロシン残基３１７が含まれる。

「一次治療（ＰｒｉｍａｒｙＴｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、腫瘍を患う被験者の初期の治療（ｉｎｉｔｉａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を意味する。一次治療は、限定されず、外科的処置（ｓｕｒｇｅｒｙ）、放射線照射（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）、ホルモン治療、化学療法、免疫療法、血管性の治療（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｔｈｅｒａｐｙ）、およびバイオモジュレーター（ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）を介した治療を含む。

「再発（Ｒｅｃｕｒ）」は、腫瘍に関して、被験者における前記腫瘍からの癌性細胞の再成長（ｒｅｇｒｏｗｔｈ）を意味する（該被験者は前記腫瘍に関する一次治療を処置されている）。

「被験者」は、任意の動物（例えば、哺乳類）を意味し、マウスおよびヒトを含むが限定されない。

「腫瘍細胞」は、腫瘍内の又は腫瘍に由来する癌性細胞を意味する。腫瘍細胞は、他の、腫瘍に存在する非癌性細胞（例えば、血管細胞（ｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌｓ））と区別される。

「チロシンキナーゼ阻害物質（Ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、チロシンキナーゼの機能を阻害する薬剤（ａｇｅｎｔ）を意味する。チロシンキナーゼ阻害物質は、限定されず、グリベック（ＳＴ１５７１，イマチニブ，ｃｇｐ５７１４８Ｂ）、ＯＳＩ−７７４、ＰＰ１、ＰＰ２、ＳＵ６６５６、ＳＵ４９８４、ＳＵ９５１８、ＳＵ５４１６、ゲニステイン、ハーバマイシンＡ（ＨｅｒｂａｍｙｃｉｎＡ）、ＰＫＣ４１２、トリホスチン（Ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎｓ）、ＣＩ−１０３３、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ５１３０３２、ＡＧ１２６、ＡＧ１４７８、ＡＧ８７９、ＡＧ９５７、ＺＭ３９９２３、ＺＭ４４９８２９、イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）、ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エモジン（Ｅｍｏｄｉｎ）、アーブスタチン（Ｅｒｂｓｔａｔｉｎ）、Ｂ４６、ニゲリシン（Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）、ＰＴＫ７８７（ノバルティスによる）、ＰＫＩ１１６（ノバルティスによる）、キナゾロン（Ｑｕｉｎａｚｏｌｏｎｅ）ファミリー、ジアニリノフタリミデス（Ｄｉａｎｉｌｉｎｏｐｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、ＴＫ１３７、ＰＤＩ１６６、ＣＰ−３５９，７４４、ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、フェノクソジオール（Ｐｈｅｎｏｘｏｄｉｏｌ）、ＧＷ５７２１６、ＺＤ６４７４、ＵＣＮ−０１およびラベンダスチンＡ（ＬａｖｅｎｄｕｓｔｉｎＡ）を含む。

［発明の態様］
本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＳｈｃ）の量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

本発明の方法の一態様において、ｐ６６−Ｓｈｃの量のみが決定される。本発明の方法の更なる態様において、リン酸化Ｓｈｃの量のみが決定される。本発明の方法の別の態様において、ｐ６６−Ｓｈｃおよびリン酸化Ｓｈｃの双方の量が決定される。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

本発明の方法の一態様において、前記腫瘍細胞はヒト腫瘍細胞である。本発明の方法の別の態様において、前記腫瘍細胞は被験者（該被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない）から取得される。本発明の方法の更なる態様において、前記腫瘍細胞は、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、または卵巣腫瘍細胞である。

本発明の方法の一態様において、前記の決定する工程は、ｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化ｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む。本発明の方法の別の態様において、前記の決定する工程はフローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む。本発明の方法の更なる態様において、前記腫瘍細胞は分離される。本発明の方法の更なる態様において、前記腫瘍細胞は腫瘍サンプル内に存在する。

更に本発明は、被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々におけるｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。

一態様において、前記被験者はヒトである。別の態様において、前記被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない。更なる一態様において、前記腫瘍細胞は、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞または卵巣腫瘍細胞である。

一態様において、前記の決定する工程は、ｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する、検出可能な抗体の使用を含む。別の態様において、前記の決定する工程は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む。更なる一態様において、前記腫細胞は組織サンプル内に存在する。

更に本発明は、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、被験者の一次治療（ｐｒｉｍａｒｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ）後に前記腫瘍の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）を患う尤度（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を決定する方法であって、前記腫瘍の癌性細胞（ｃａｎｃｅｒｏｕｓｃｅｌｌｓ）に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法を提供する。

一態様において、前記被験者はヒトである。別の態様において、前記被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない。更なる態様において、前記腫瘍細胞は、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、または卵巣腫瘍細胞である。

一態様において、前記の決定する工程は、ｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む。別の態様において、前記の決定する工程は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む。更なる一態様において、前記腫瘍細胞は組織サンプル内に存在する。更なる一態様において、前記一次治療は、外科的処置、放射線照射、ホルモン治療および化学療法からなる群から選択される治療を含む。

更に本発明は、ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合する単離された抗体、およびリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する単離された抗体を提供する。

一態様において、前記抗体はポリクローナルである。別の態様において、前記抗体はモノクローナルである。更なる一態様において、前記抗体は、検出可能な成分（ａｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｍｏｉｅｔｙ）で標識される。更なる態様において、前記検出可能な成分は、蛍光標識、放射性原子、化学発光標識、常磁性イオン、ビオチンまたは二次的な酵素または結合工程を介して検出できる標識である。一態様において、前記抗体は、ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−４１０９のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体である。

更に本発明は、ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。

一態様において、前記ハイブリドーマは、ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−４１０９を有する。更に本発明は、リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。

一態様において、前記腫瘍は、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、または卵巣腫瘍である。別の態様において、前記腫瘍からの細胞のサンプルは、被験者（該被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない）から取得される。別の態様において、前記被験者はヒトである。別の態様において、前記腫瘍細胞は、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、または卵巣腫瘍細胞である。

一態様において、チロシンリン酸化Ｓｈｃの量を決定することは、チロシンリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む。更なる一態様において、前記抗体は、検出可能に標識される。別の態様において、チロシンリン酸化Ｓｈｃの量を決定することは、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む。更なる一態様において、前記の腫瘍細胞のサンプルは、組織サンプル内に存在する。

更に本発明は、本発明の方法を実施するためのキットであって、別々のコンパートメント、（ａ）チロシンリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｂ）チロシンリン酸化Ｓｈｃと結合する抗体の量を測定するための試薬、および（ｃ）使用説明書を含むキットを提供する。

本発明の方法に関連する上記に記載した様々な態様の各々は、必要な変更を加えて本発明のキットに対しても適用される。

本発明は、以下の例で説明される。この例は、本発明の理解を助けるために記載される。しかし、本願の特許請求の範囲に記載される本発明が限定されることを意図していなく、また限定されると解釈されるべきでもない。

図１は、Ｓｈｃアダプタータンパク質を活性化する（およびｐ６６Ｓｈｃによりフィードバック阻害される）シグナル伝達経路を示す。図２は、ＨＢＬ−１００クローン〔形質移入されて、構成的に野生型のＰ５２Ｓｈｃ−Ｇｓｔ融合タンパク質（ＷＴＳｈｃ２６）またはドミナント・ネガティブＴｙ３１７−変異体ｐ５２Ｓｈｃ−Ｇｓｔ融合タンパク質（ｄｎＳｈｃ１７）を発現する〕が、前記融合タンパク質においてチロシン残基（３１７および／または２３９／２４０）のリン酸化の増加（内在性のＳｈｃタンパク質と比較して）を実証したことを示す。図３は、Ｒ５８抗体がＳｈｃタンパク質のリン酸化チロシン３１７残基に対して特異的であることを示す。ＥＧＦ−非刺激のｗｔｓｈｃ２６クローンにおけるＳｈｃ検出の欠除は、αＲ５８が活性化されたチロシンリン酸化型のＳｈｃのみを認識することを示している。さらにまた、ＥＧＦ−刺激されたｓｈｃ１７クローン〔該クローンは、チロシン（３１７）リン酸化部位のみを欠損している、（これらの細胞におけるｄｎＳｈｃの相対発現レベルに関しては図２を参照されたい）〕においてＳｈｃを検出する能力をαＲ５８が有していないことは、αＲ５８がホスホチロシン単独に対するものでないことを示している。図４は、ホスホ−特異的な抗体のＳｈｃに対する及びＰ６６−アイソフォーム特異的な抗体のＳｈｃに対する免疫組織化学的な特異性を示す。パラフィン包埋され、ホルマリン固定された乳癌からの切片を、上部パネルでは抗−ＰＹ−Ｓｈｃ（第一カラム）、抗−Ｓｈｃタンパク質（第二カラム）、および抗−ＰＹ（第三カラム）で、指摘したとおり、競合するＰＹ−Ｓｈｃペプチドまたはホスホチロシンアナログ（フェニルホスフェート）非存在下または存在下で染色した。下部パネルにおいて、異なる検体からの切片を、免疫前（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）の免疫グロブリン（免疫前）またはｐ６６Ｓｈｃに特異的な我々のウサギ抗体（抗−ｐ６６Ｓｈｃ）で染色した。図５は、ウサギ抗体＃４０５が特異的に６６−ｋＤａＳｈｃアイソフォームを免疫沈降することを示す。ウサギ抗体＃４０５（レーンＩＰ：αｐ６６）は、ｐ５５ＳｈｃをＨＢＬ−１００細胞の界面活性剤抽出物から免疫沈降させるが、しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（６６−ｋＤａＳｈｃアイソフォームの発現を欠く）からは免疫沈降させない。ＩＰ−ＲαＳｈｃとラベルされたレーンにおいて、全Ｓｈｃタンパク質がｐａｎ−Ｓｈｃ−特異的抗体を用いて免疫沈降された。ブロットはｐａｎ−Ｓｈｃ特異的抗体でプローブ（ｐｒｏｂｅｄ）された。図６は、Ｐ６６−アイソフォーム特異的なウサギ・ポリクローナル抗体のＳｈｃに対する免疫組織化学的な特異性を示す。パラフィン包埋され、ホルマリン固定された乳癌標本からの切片を、免疫前（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）の免疫グロブリン（免疫前）またはｐ６６Ｓｈｃに特異的な我々のウサギ抗体（抗−ｐ６６Ｓｈｃ）で染色した。図７は、６６−ｋＤａＳｈｃアイソフォームに対するモノクローナル抗体の、細胞抽出物からｐ６６Ｓｈｃを免疫沈降させる能力に関するスクリーニングを示す。ハイブリドーマ培養上清からのモノクローナル抗体を、１０μｌのウサギ抗マウスＩｇＧ（重および軽鎖特異的な）抗体（該抗体は、シアン臭化物−活性化セファロースビーズと共有結合性に連結されている）から構成される免疫吸着剤と、各々反応させた。これらのビーズ（およびポジティブコントロールとして、プロテインＡ−セファロース４Ｂ−ＣＬビーズと共有結合によって連結させたｐａｎ−Ｓｈｃウサギ抗体、「ＲαＳｈｃ」とラベルしたレーンを参照されたい）を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（我々が改変して正常レベルのヒトｐ６６Ｓｈｃを発現させた）の界面活性剤抽出物からタンパク質を免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳＰＡＧＥで分離し、ＲαＳｈｃで免疫ブロットし、化学発光により視覚化した。６６−ｋＤａの位置、およびポジティブコントロールにおいて、５２−および４６−ｋＤａＳｈｃタンパク質が示される。ＲαＳｈｃ免疫吸着剤（しかしハイブリドーマ免疫吸着剤はされない）はジメチルピメリミデートで共有結合性にクロスリンクされており、それゆえにハイブリドーマレーンにおける、ＩｇＧ重鎖非特異的染色およびバックグランド・バンドが確認される。２つのハイブリドーマ（これらはＥＬＩＳＡによりＧＳＴ−無関係タンパク質（ＣＨ１）１Ａ１０αＧＳＴａｂｄ５Ｃ５αＧＳＴに対して強く反応した）が、ｐ６６Ｓｈｃを免疫沈降しなかったことに注意。図８は、ＰＹ−Ｓｈｃの免疫組織化学的な染色に関するスコアリングシステムを示す。図９は、乳癌の免疫組織化学的染色に関するスコアリングシステムの例を示す。乳癌標本を、ＰＹ−Ｓｈｃまたはｐ６６−Ｓｈｃに特異的なウサギ抗体と反応させ、図８のとおりＣＳＡキット（ＤＡＫＯより）を用いてヘマトキシリンカウンター染色した。図１０は、カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）プロットにより示される、乳癌を有する９７女性の総研究集団の「故障寿命（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）」（または疾患再発）を示す。プロットをＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃマーカーのゼロ化値に対して調整することによって、これらのマーカーによりＡＪＣステージ０〜４の乳癌と最初に診断された女性における疾患再発の殆どが説明されるように思われる。図１１は、カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）プロットにより示される、乳癌を有する９７女性の総研究集団の「故障寿命」（または疾患再発）を示す。上部パネル：Ｐｙ−Ｓｈｃスコアを低（＜０．３３）および（＞＝０．３３）に二分化することによって、再発性疾患のリスクは、高いレベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において明らかに増加し、低い腫瘍レベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において減少する。下部パネル：Ｓｈｃ比インデックスを低（＜０．６５）および高（＞＝０．６５）に二分化することによる類似性、再発性疾患のリスクは、高いレベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において明らかに増加し、低い腫瘍レベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において減少する。図１２は、カプラン・マイヤープロットにより示される、早期のＡＪＣステージ０、およびステージ１の乳癌を有する女性の「故障寿命」（または疾患再発）を示す。上部パネル：ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃマーカーのゼロ化値に対して調整することによって、これらのマーカーにより早期ステージの乳癌と診断された患者における疾患再発リスクの殆どが説明されるように思われる。下部パネル：Ｓｈｃ比インデックスを低（＜０．６５）および高（＞＝０．６５）に二分化することによって、再発性疾患のリスクは、高いレベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において明らかに増加し、低い腫瘍レベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において減少する。図１３は、カプラン・マイヤープロットにより示される、リンパ節ネガティブ（ｌｙｍｐｈ−ｎｏｄｅｎｅｇａｔｉｖｅ）な乳癌を有する女性の「故障寿命」（または疾患再発）を示す。上部パネル：ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃマーカーのゼロ化値に対して調整することによって、これらのマーカーにより節ネガティブな乳癌と診断された患者における疾患再発リスクの殆どが説明されるように思われる。下部パネル：Ｓｈｃ比インデックスを低（＜０．６５）および高（＞＝０．６５）に二分化することによって、再発性疾患のリスクは、高いレベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において明らかに増加し、低い腫瘍レベルのＰＹ−Ｓｈｃを有する患者において減少する。

［例］
例１
材料および方法
ロジャーウイリアムス癌センターデータベースおよび腫瘍登録所（ｔｕｍｏｒｒｅｇｉｓｔｒｙ）の１２年にわたる臨床転帰（ｃｌｉｎｉｃａｌｏｕｔｃｏｍｅ）の遡及研究（少なくとも５年追跡を含む）において、疾病の再発に関連した１０％の死亡率がステージ１乳癌（ｎ＝２１２患者）と診断された患者において観察された。従って、攻撃的な、早期段階の乳癌を低浸潤性（ｌｅｓｓｉｎｖａｓｉｖｅ）の病変（ｌｅｓｉｏｎｓ）と識別し得る分子マーカーの必要性は明白であり、次に外科的およびアジュバントの治療オプションへと導かれる。９８の保存された（ａｒｃｈｉｖａｌ）、ホルマリン固定された診断上の乳房腫瘍バイオプシー（ステージ０からステージ４の患者）における、リン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ：活性化された、アダプタタンパク質、チロシンキナーゼシグナル伝達および腫瘍形成を促進する）およびｐ６６−Ｓｈｃ（Ｓｈｃアイソフォーム、このシグナルカスケードを阻害する）の免疫組織化学的な染色により、正の直線的な相関がＰＹ−Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する染色強度と患者ステージとの間に認められた（ｒ＝０．４；ｐ＜０．０００１）；高いＰＹ−ｓｈｃ／低いｐ６６−Ｓｈｃが診断時の進歩した（ａｄｖａｎｃｅｄ）疾病ステージに対応している。ＰＹ−Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を、ステージ１の乳癌（ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ）患者の原発性腫瘍において分析し、次に患者の転帰（５ｙｒ追跡）を遡及的に比較した場合、疾患の再発（０．６６±０．０３；ｎ＝３０）がない患者からランダムに選択した腫瘍に対する比率は、疾患が再発した患者と比較して有意に低かった（０．９０±０．０７；ｎ＝８）（ｐ＜０．００５）。ＰＹ−Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率が、生存可能な予後マーカーとして、攻撃的な初期ステージの乳癌を同定するために利用し得ることを、これらの研究は示唆している。

乳癌におけるＥｒｂＢ２および他の過剰発現された成長因子レセプターの機能的役割の解明に着手するために、Ｓｈｃを介したシグナル伝達経路が構成的に活性であるかどうかが問われた。チロシンリン酸化ｐ５２ＳｈｃのレベルとＥｒｂＢ２のレベルとの間に強い正の相関が認められた（ｒ＝０．９１；ｐ＜０．００２）。３つの乳癌細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＺＲ−７５−１）は、低から中等度のレベルのＥｒｂＢ２を発現するが、自己分泌ＥＧＦ／ＴＧＦ−αループ［４５，４６］または幹細胞因子（ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ）自己分泌ループ［４７］を有し、中程度に上昇したレベルのチロシンリン酸化Ｓｈｃ（ＰＹ−Ｓｈｃ）を提示した。ＨＢＬ−１００およびＨＳ−５７８Ｂｓｔ（非形質転換の乳房上皮細胞株）には、わずかなＰＹ−Ｓｈｃを有することが証明されている［３８］。

従って、乳癌細胞におけるＰＹ−ｐ５２Ｓｈｃのレベルは、全体の成長因子受容体活性の優れた指標であるように思われ、不良な乳癌の予後に関する有用なマーカーであろう。

予想外に、全細胞株は同等の全量のｐ５２およびｐ４６のＳｈｃを有していたにもかかわらず、阻害性のＳｈｃアイソフォーム（ｐ６６）の量は、ＥｒｂＢ２発現のレベルと逆に関連していた（ｒ＝−０．８６，ｐ＝０．００１３）［３８］、また同様にＥｒｂＢ２活性化、ＰＹ−ｐ５２Ｓｈｃのレベルと、および増殖に関するＰＹ−ｐ５２Ｓｈｃ経路に依存したレベルと逆に関連していた。

このことは興味深い可能性を示唆していた、即ちｐ６６Ｓｈｃが、ＰＹ−ｐ５２／ｐ４６経路に依存してＭＡＰキナーゼ、ｃ−ｆｏｓ、並びにおそらくはｃ−ＭｙｃおよびＰＩ３’キナーゼが活性化する乳癌に対して、抗癌遺伝子（ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）または腫瘍抑制因子として機能することである。実際、乳癌細胞にｐ６６Ｓｈｃを発現させることにより、それらの腫瘍形成性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）を強く阻害することが最近発見された。従って、低い細胞レベルのｐ６６Ｓｈｃは、不良な乳癌の予後に対する有用なマーカーとなり得る。

乳癌において幾つかの活性化した成長因子シグナル伝達系が関与しているとの上述の多くの証拠があるので、またこれらのシグナル伝達系の各々に共通する生命過程（ｖｉｔａｌｓｔｅｐ）がアダプタータンパク質（Ｓｈｃ）のチロシンリン酸化（活性化）であるので、活性化されたＳｈｃは不良な臨床予後の有用な指標であろうとの仮説が立てられた；この指標はＥｒｂＢ２過剰発現よりも更に有用な指標であろうと思われる、この理由はＳｈｃが活性ＥｒｂＢ２が存在する乳癌においてのみならず、他のチロシンキナーゼ（例えば、ＩＧＦ−１受容体、ｃ−Ｍｅｔ、および他のＥＧＦ受容体ファミリーメンバー）により増殖に駆り立てられたであろう乳癌においても活性化されるからである。

さらに、Ｓｈｃの推定上の抗発癌性（ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）アイソフォーム（ｐ６６）の細胞レベル間（ＰＹ−ｐ５２Ｓｈｃの細胞レベルとを比較した）に強い負の相関が認められたので、ｐ６６Ｓｈｃの低い細胞レベルは（特にＰＹ−Ｓｈｃの高い細胞レベルと相関（ｃｏｕｐｌｅｄ）させた場合に）、不良な臨床予後に対する有用な指標となるだろうとの仮説が立てられた。

また、Ｓｈｃチロシンリン酸化およびｐ６６Ｓｈｃ阻害性効果（ｐ６６Ｓｈｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓ）は、成長因子シグナル伝達カスケードにおける早い段階で生じる。最終的に攻撃的な疾患となる運命にある、多くの早期の段階の乳癌は、上昇したレベルのＰＹ−Ｓｈｃを提示するだろう（たとえＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ−１／２）カスケードを介した下流のシグナル伝達、増殖および他の予後のマーカーがまだ低い値であったとしても）。この概念と一致して、成長因子レセプターおよびＳｈｃが活性化されるが、Ｅｒｋ−１／２が活性化されない場合に出現する多くの例が存在する［４８−５１］。以上のように、高い相対的量のＰＹ−Ｓｈｃ／ｐ６６Ｓｈｃは、早期ステージ／節ネガティブな乳癌を有する女性における不良な予後の特に有用な指標となり得る。実際、以下に記載されるとおり、この現象は真実であることが認められた。

抗血清およびモノクローナル抗体の開発
ＰＹ［３１７］−Ｓｈｃに対するウサギ抗体：ニュージーランド・ホワイトラビットをＮ−アセチル化チロシンリン酸化Ｓｈｃペプチド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＳｈｃｐｅｐｔｉｄｅ）で免疫した既知の方法（ｇｉｖｅｎｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）にしたがって、リサーチジェネティックス（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）がＮ−アセチル−ＬｅｕＰｈｅＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒ（［Ｐ］Ｔｙｒ）ＶａｌＡｓｎＶａｌＧｌｎＡｓｎＬｅｕＣｙｓ（ヒトＳｈｃアミノ酸３１１から３２３に対応し、付加されたシステインＣ−末端をキャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）とのマレイミド・カップリングを促進するために有している）。ペプチド−ＫＬＨをフロイントアジュバントに乳化させ、全体で０．１ｍｇのペプチドをニュージーランド・ホワイトラビットの複数の背側領域に注射した。ウサギを２週のインターバルで再免疫し、各免疫の後に１週間飼育し、そして１０週後に終了した。抗体を、Ｓｈｃホスホペプチドにおける免疫特異的なアフィニティークロマトグラフィーにより精製し（共有結合によりウルトラリンクヨードアセチルマトリックス（ピアス）に連結させた、製造者の指示に従って実施した）、０．２３ＭグリシンＨｃｌ緩衝剤（ｐＨ２．８）で溶出し、１／１０容積の１ＭＴＲＩＳ（シグマ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ｐＨ９．０でｐＨを中和した。

全ての免疫したウサギから採取された抗体は、免疫ペプチド（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ）に対するＥＬＩＳＡアッセイで高い力価を示し（データ示さず）、また免疫沈降によりＳｈｃに対する明瞭な特異性を示した（データ示さず）。ウサギ＃５８からの抗体は、Ｓｈｃのチロシンリン酸化した形態のみを認識するように思われた。このことは、若干の＃５８の特異性がホスホチロシン単独に向けられていたことを示唆しており、＃５８は他のＰＹタンパク質（例えば、ＥｒｂＢ−２）を免疫沈降しなかった。加えて、強力なホスホチロシンアナログである、１ｍＭソジュウムフェニルホスフェート（ｓｏｄｉｕｍｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、＃５８のＳｈｃを免疫沈降する能力に最小の効果を示し、対照的に１ｍＭソジュウムフェニルホスフェートは、４Ｇ１０モノクローナル抗体のホスホチロシンに対してのＰＹ−Ｓｈｃおよび他のＰＹタンパク質（例えば、ＰＹ−ＥｒｂＢ−２およびＰＹ−ＥＧＦ受容体）を免疫沈降する能力を完全にブロックした。

この抗体の優れた特異性を更に評価した（最初にウエスタンブロット法によって）。この目的のためにＨＢＬ−１００乳房上皮細胞株を使用した、この株は、野生型ＧＳＴ−ヒト組換え型のＰ５２Ｓｈｃ融合タンパク質（クローン２６）、ドミナントネガティブなＧＳＴ−ヒト組換え型のｐ５２Ｓｈｃ融合タンパク質（３１７チロシンがフェニルアラニンに変異させてある）（クローン１７）、または空のベクターコントロール（クローン９）の何れかを発現するように改変されている［４２］。図２で確認できるとおり、ｗｔ−Ｓｈｃまたはｄｎ−Ｓｈｃの何れかの発現は、内在性のｐ４６、Ｐ５２、およびｐ６６Ｓｈｃタンパク質のチロシンリン酸化を誘導するＥＧＦの能力を殆ど完全にブロックした。その代わり、ＥＧＦとの反応において、野生型ＧＳＴ−Ｓｈｃは高度にチロシンリン酸化され（残基２３９および３１７において）、またｄｎ−Ｓｈｃは軽度にチロシンリン酸化され（残基２３９のみにおいて、この構築物中の３１７チロシン残基はフェニルアラニンに変異させてあるので）、更にこれら発現された組換え型のＳｈｃタンパク質の双方は、ＥＧＦ誘導性のチロシンリン酸化ＥＧＦレセプターと密接に相互作用している。これらの細胞は、それゆえ、ウサギ＃５８抗体の優れた特異性を免疫沈降で及び免疫細胞化学で試験するための素晴らしい基本型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅｓ）であった。というのも、ウサギ＃５８抗体は実際にＰＹ３１７Ｓｈｃに特異的である場合、ＥＧＦ刺激したクローン２６細胞からチロシンリン酸化ｗｔ−ＧＳＴ−Ｓｈｃのみを免疫沈降することが期待されるからである。実際、このことは事実であった（図３）。ウサギ＃５８抗体は、チロシン（２３９，３１７）リン酸化ｗｔ−ＧＳＴ−Ｓｈｃタンパク質をＥＧＦ−刺激されたクローン２６細胞から免疫沈降させたが、チロシン（２３９）リン酸化ｄｎ−ＧＳＴ−ＳｈｃＹ３１７Ｆタンパク質をクローン１７細胞から免疫沈降しなかった。多様なコントロールにより、ウサギ＃５８結合が免疫ペプチドにより完全に阻害されること、また前記抗体がＥＧＦに反応してチロシンリン酸化される他のタンパク質と結合しないことが示された。

重要なこととして、ウサギ＃５８抗体が同様の特異性をＰＹ３１７Ｓｈｃに対して有することが、ＥＧＦ刺激したクローン２６およびクローン１７細胞の免疫細胞化学染色によって示された（図３、下部のパネル）。

早期の免疫ブロット実験によってＰＹ−Ｓｈｃを含有することが知られていた、乳癌細胞株を、Ｙ−Ｓｈｃに対するウサギ＃５８抗体が陽性染色するかどうかの確定が必要であった。また、顕著なレベルのＰＹ−Ｓｈｃを含有する細胞株（免疫ブロットにより）の全ては、ウサギ＃５８抗体によって強い免疫細胞化学的な染色を呈した（データ示さず）。対照的に、非形質転換型の乳房上皮細胞株（Ｈｓ−５７８Ｂｓｔ）および１つの乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、顕著なレベルのチロシンリン酸化Ｓｈｃを欠乏しており（免疫ブロットによる）、ＰＹ−Ｓｈｃ特異的なウサギ＃５８抗体でも染色されなかった。

この特徴は、保存され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された標本の免疫組織化学的な染色でも同様であった。免疫組織化学的な染色における＃５８ＰＹ−Ｓｈｃ抗体の特異性および有用性を、ヒトの乳房腺癌（ｂｒｅａｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）の切片で評価した（図４）。

抗−ＰＹ−Ｓｈｃは、癌性の腺性組織（ｃａｎｃｅｒｏｕｓｇｌａｎｄｕｌａｒｔｉｓｓｕｅ）を強く染色した（図４Ａ）、また期待したとおり、染色は免疫したＰＹ−ペプチドにより著しく阻害された（図４Ｂ）、しかし部分的な拮抗薬（ホスホチロシン・アナログ、フェニルホスフェート）によっては僅かに阻害されるのみであった（図４Ｃ）。対照的に、ｐａｎ−Ｓｈｃ抗体（タンパク質主鎖に対する）での染色はＰＹペプチドにより阻害されなかった（図４Ｄ，Ｅ）、一方、対照的に、純粋な抗ホスホチロシン染色は完全にフェニルホスフェートによって阻害された（図４Ｆ，Ｇ）。乳癌の免疫組織化学的な評価の詳細を以下に記載する。

ｐ６６Ｓｈｃ（ＣＨ２ドメイン）に対して特異的なウサギ抗体
リサーチジェネティックス（ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ）と契約して親水性のペプチド、ＳｅｒＧｌｙＳｅｒＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｅｕＰｒｏＳｅｒＰｒｏＳｅｒＡｌａＳｅｒＳｅｒＬｅｕが合成された、このペプチドはｐ６６Ｓｈｃ_{１−１１０} ＣＨ２ドメインに由来する。このペプチドは、キャリアタンパク質（ＫＬＨ）に連結され、これを使用してニュージーランド・ホワイトラビットを免疫した、この免疫は標準の１０週の免疫化／チャレンジ・プロトコール（上記で詳細に説明したとおりの）を使用して実施された。１０週間で採取した抗血清を、免疫ペプチドに対する反応性に関して試験した（固相ＥＬＩＳＡにおいて）。ウサギ＃４０５からの抗血清を、免疫ペプチドと反応させた（約１／５０００の力価）。ペプチド特異的な抗体をウサギ＃４０５抗血清から親和性精製した、この際に免疫ペプチド（共有結合性にウルトラリンクヨードアセチルマトリックス（ピアス）に付着させた、製造者の指示にしたがって行った）を用い、０．２３ＭグリシンＨｃｌ緩衝剤（ｐＨ２．８）で溶出して、１／１０容積の１ＭＴＲＩＳ（シグマ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ｐＨ９．０中でｐＨを中和した。精製抗体を、ヒト組換え型ＧＳＴ−ｐ６６ＳｈｃＣＨ２ドメイン〔ＧＳＴおよびｐ６６Ｓｈｃの最初の１１０アミノ酸（これらのアミノ酸はｐ５２Ｓｈｃアイソフォームと比較してｐ６６Ｓｈｃにおいてユニークである）から構成された融合タンパク質〕を認識する能力に関して試験した。ヒト組換え型Ｇｓｔ−ｐ６６Ｓｈｃ_{１−１１０} 細菌性の発現ベクターを、Ｐｒｏｆ．Ｐｅｌｉｃｃｉ（Ｍｉｌａｎ，イタリア）から入手した。我々は、このタンパク質を、大腸菌で発現させ、グルタチオン親和性マトリックスを用いて親和性精製した。ＳＤＳＰＡＧＥ分析およびクーマシーブルー染色によって、精製タンパク質が３つの主要なバンドからなることが示され、融合タンパク質の予想された分子量付近のバンドに、より早く移動するバンド、より遅く移動するマイナーバンド群を伴っていた。ＧＳＴに対する抗体での免疫ブロットは、全てのバンドがＧＳＴを含有することを示した。

ウサギ＃４０５は、最も早く移動した種以外の全てと反応した（データ示さず）。このことは、最も早く移動したバンドはＧＳＴのみ（またはＧＳＴおよびｐ６６ＣＨ２の小さい領域であって、免疫化に使用されたｐ６６エピトープを含有しないもの）を含有することを意味していると解釈された。他のバンド（予想された分子サイズ付近の）は、インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）ＧＳＴ−ｐ６６ＳｈｃＣＨ２融合タンパク質および本タンパク質のタンパク分解性の断片（ｃｌｉｐｓ）であると思われ、最高の分子量を有するタンパク質は、まず確実にＧＳＴ混合性のジスルフィド反応により生じた、ＧＳＴ−ｐ６６ＳｈｃＣＨ２およびそのタンパク分解性断片の二量体である（未発表の観察）。従って、小さいＣＨ２ペプチドに対して産生された抗血清は全ＣＨ２ドメインを認識するのみならず、これをイムノブロット上で実施することが可能で、相対的に特異的であるように思われる（それはＧＳＴのみのバンドと反応しない）。

ウサギ＃４０５抗体の特異性を更に試験するため、それがｐ６６Ｓｈｃを特異的に免疫沈降するかが問われた。これを試験するために、我々は我々の以前の所見を利用した（図２を参照されたい）、即ち、乳房上皮細胞線（ＨＢＬ−１００）が正常なレベルのｐ６６Ｓｈｃを含有しており、これはｐ５２Ｓｈｃのレベルに匹敵するものであること、他方で、乳癌株化細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）は検出可能なｐ６６Ｓｈｃを欠損していることである。ウサギ＃４０５抗体は、ｐ６６Ｓｈｃタンパク質のみをクリーンに及び明瞭に（ｃｌｅａｎｌｙａｎｄｃｌｅａｒｌｙ）沈降させた（図５）。優れた特異性の分析により、ウサギのポリクローナル抗体はｐ６６Ｓｈｃタンパク質の脱リン酸（セリン３６）型を優先的に認識することが示唆された。

ＨＢＬ−１００およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の免疫細胞化学的な染色により、ウサギ＃４０５抗体がＨＢＬ−１００細胞におけるｐ６６Ｓｈｃをも特異的に検出できることが明らかとなった（データ示さず）。

＃４０５抗体の特徴は、保存され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された乳癌標本の免疫組織化学的な染色でも同様であった。典型的な例（図６）は、乳房腫瘍細胞がｐ６６Ｓｈｃに関して強く染色されること、より豊富なリンパ性の浸潤細胞（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｓ）は完全に染色性を失っていることを示している。（造血系の成熟細胞がｐ６６Ｓｈｃを失っていることは周知である）。もしこの全体の腫瘍が抽出され、Ｓｈｃに関して免疫ブロットされた場合、浸潤性のリンパ球が多量なので、腫瘍細胞がｐ６６Ｓｈｃを失っていると不正確に結論づけるであろう、従って免疫組織化学的な分析によるｐ６６Ｓｈｃを評価する我々のアプローチの重要性が強調される。これがＰＹ−Ｓｈｃ染色に関して観察された際に、プレ免疫血清は如何なる非特異的なバックグランド染色も生じなかった（図６、プレ−免疫）。ｐ６６Ｓｈｃに関する乳癌の免疫組織化学的な評価の詳細を以下に記載する。

ｐ６６ＳｈｃＣＨ２ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体
発現され、精製され、そして品質を調節されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｓｔ）−ｐ６６ＳｈｃＣＨ２融合タンパク質（上記を参照されたい）を使用して、１０ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した（５０ｇを４０１のＴｉｔｅｒｍａｘ（Ｃｙｔｒｅｘ），アジュバント中に）。何回かのブースト後に２匹のマウスは高い力価の抗体を産生し、これらの抗体は、ＥＬＩＳＡによりＣＨ２ドメインを認識し、乳房細胞の洗剤抽出物からのｐ６６Ｓｈｃを特異的に免疫沈降して免疫ブロットし、ｐ６６Ｓｈｃを特異的に乳癌の免疫組織化学的な分析において認識した。少なくとも１月の休養後、これらのマウスのうち１匹をｄａｙ−４に４０μｇの可溶性ＧＳＴ−ＣＨ２（アジュバントなし）で免疫し、また他のマウスをｄａｙ−３に４０μｇの可溶性ＧＳＴ−ＣＨ２を静脈内注射して免疫した。次にｄａｙ０に、前記マウスを安楽死（二酸化炭素吸入により）させ、彼らの脾臓を無菌的に摘出し、脾臓細胞を回収し、Ｘ８−６５３骨髄腫融合パートナーと融合させた、この際、ハイブリドーマ・キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造者の指示に従って実施した。ｄａｙ１に、細胞を１０、１００ｍｍの組織培養プレートに播種した（このプレートはメチルセルロース含有培地にアミノプテリン選択薬を含有させたものを含んでいる）。１２日後、各プレートは約４００個のクローンを含んでいた。

８から１０プレートから９６０クローンを採取し、そして９６ウェルの液体培養に移した。培養の３−４日後、上清の培養液をＥＬＩＳＡで試験して、組換え型のＧＳＴ−ＣＨ２に対する反応性を、ＧＳＴを含有する無関係の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＨ１）に対する反応性と比較した。９０のハイブリドーマの上清（ＧＳＴ−ＣＨ２に対して最大の反応性を有するが、無関係のＧＳＴ−ＣＨ１に対しては僅かな反応性を有するか又は反応性を有さない）を、免疫ブロットによって及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞のクローン（改変されて正常なレベルのｐ６６Ｓｈｃを発現する）からの免疫沈降によって、ｐ６６Ｓｈｃを特異的に認識する能力に関して更に様々に試験した。

６つのハイブリドーマ抗体は、特異的にｐ６６Ｓｈｃを免疫ブロットした；少なくとも８は、特異的にＳｈｃを免疫沈降した（図８を参照されたい）。これらの抗体の６つを試験したところ、少なくとも４つ（クローン６Ｅ１２、６Ｇ９、７Ｃ１０、および８Ｃ６）はｐ６６Ｓｈｃを乳癌切片の免疫組織化学的染色において認識し、１つの抗体（８Ｃ６）はポリクローン性のウサギ抗ｐ６６（図６に示された）と匹敵する染色性を有することが明らかとなった。また、８Ｃ６モノクローナル抗体は、ｐ６６Ｓｈｃを免疫沈降（図７）および免疫ブロットすることに関して最も効率的な抗体であり、ｐａｎ−Ｓｈｃの市販の抗体に匹敵する又は該抗体よりも良い抗体である。アイソタイプ分析により、全ての効果的なハイブリドーマがＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａであることが示された（例えば、６Ｇ９および８Ｃ６はＩｇＧ２ａである）、それゆえに彼らはプロテインＡと非常に強く結合するという、精製のために及び多様な免疫学的なアッセイ／手順に使用するために非常に有用な性質を具備している。前記モノクローナル抗体を、過成長したハイブリドーマ培養上清から、プロテインＡセファロース４Ｂ−アフィニティークロマトグラフィーを用いた当業者に周知の標準法で精製した。

他のモノクローナル抗体は８Ｃ６により認識されないｐ６６Ｓｈｃ上の異なるエピトープを認識する限り、前記抗体の貯蔵（ｐｏｏｌｉｎｇ）により免疫組織化学的な分析に関する特別な利点が提供され、係る抗体の貯蔵により付加的な（ａｄｄｉｔｉｖｅ）シグナルが提供され且つアッセイ感受性が増加する。更に、未変性の細胞抽出物において、いくつかのエピトープはｐ６６Ｓｈｃと結合する細胞タンパク質により隠されてかもしれない：従って機構的な研究として、他のエピトープに対する抗体によって、ｐ６６Ｓｈｃのサブポピュレーション（これは係る他のタンパク質と相互作用する）を免疫沈降することが可能であろう。

Ｒα Ｓｈｃ抗体（この抗体は、全てのリン酸化または非リン酸化したＳｈｃアイソフォームを認識する）、および４Ｇ１０モノクローナル抗体（この抗体はホスホチロシンを認識する）を、アップステートバイオテクノロジー（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入した。

細胞
ＨＢＬ−１００細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［ＡＴＣＣ］，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、非腫瘍化のヒト乳房上皮細胞株であり、高レベルのＥＧＦレセプターを発現する。ＨＢＬ−１００／ｗｔＳｈｃ２６およびＨＢＬ−１００／ｄｎＳｈｃ１７は、それぞれ野生型ｐ５２^Ｓｈｃ−ＧＳＴまたはドミナントネガティブ変異体ｐ５２^ＳｈｃＹ３１７Ｆ−ＧＳＴの何れかのｃＤＮＡ（構成的なＥＦ１αプロモータにより駆動される発現を伴う）を保持するｐＥＢＧベクターでのリポフェクタミン・プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ− Ｐｌｕｓ）トランスフェクションの後にＧ４１８で選択圧をかけて得られた［方法の詳細に関しては、４２を参照されたい］。ＳＫＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（ＡＴＣＣ）は、形質転換した上皮細胞株であり、ＥＧＦ受容体ファミリーのＥｒｂＢ２メンバーを過剰発現するヒト乳癌に由来し、それゆえに構成的にチロシンリン酸化したＳｈｃを有している。ＳＫＢＲ３は、非常に少量のｐ６６Ｓｈｃ、並びに正常な量のｐ５２およびＰ４６Ｓｈｃを発現しており；ＭＤＡ−ＭＢ−４５３はｐ６６ ^Ｓｈｃアイソフォームを発現していない。これらの細胞株の全ては、１０％ウシ胎児血清（ギブコ）、およびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ１Ｘ抗生物質（ギブコ）を添加したＩＭＤＭ（ギブコ）中で、３７℃、５％二酸化炭素、加湿した大気中で培養された。

抗体に対するＥＬＩＳＡ
イミュンロン（Ｉｍｍｕｎｌｏｎ）ＩＩマイクロタイターウェルを、ＰＹ−Ｓｈｃまたはｐ６６^ＳｈｃＣＨ２ペプチド（１μｇ／５０μｌｌ）でＰＢＳ中でコートし、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中で）でブロックし、次に各々試験するウサギ抗体またはモノクローナル抗体と、ホースラディッシュペルオキシダーゼをウサギ免疫グロブリンに対するロバ抗体（または必要に応じて、ウサギ抗マウス免疫グロブリンに）に連結した抱合体と、そして最終的に色素生産性ＨＲＰ基質であるＯ−フェニレンジアミン（Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）と逐次インキュベーションした。ＡＢＳ４５０ｎｍをモニターした。

免疫沈降および免疫ブロット
細胞を、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌで１０または２０ｍｉｎ）で指摘のとおりに刺激するか又は刺激せず、次に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で緩衝剤（プロテアーゼ、キナーゼおよびホスファターゼ阻害物質を含有している）中で抽出した［３８］。

タンパク質を、ＳｈｃまたはＰＹに対する、新しい抗体または市販の抗体の何れかで免疫沈降した。これらの抗体をプロテインＡ−セファロース４Ｂ−ビーズ（シグマ）に前結合（ｐｒｅ−ｂｏｕｎｄ）させ、次にジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）でクロスリンクして安定化させた［３８］。免疫沈降したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、そして特定の抗体で免疫ブロットした。結合した抗体を、次に増強化学発光（ＥＣＬ，アマシャム）により検出した。

免疫細胞化学
細胞をチャンバースライドに播種し、約６０−６５％コンフルエンスに達するまでインキュベーションした。細胞を、いくつかのチャンバーをＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌで２０ｍｉｎ）で刺激する前に、フェノールレッド非含有培地中で血清飢餓させた。

細胞をＰＢＳでリンスし、次に１０％緩衝ホルマリンで１０分間固定した。免疫細胞化学的な染色を、製造者にしたがって、触媒シグナル増幅（ＣＳＡ；ＣａｔａｌｙｚｅｄＳｉｇｎａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ペルオキシダーゼ・システム（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて、ＣＳＡアンシリアリー（Ａｎｃｉｌｌｉａｒｙ）システム（ＤＡＫＯ）で標的捕獲（ＴａｒｇｅｔＲｅｔｒｉｅｖａｌ）した後に実施した。一次抗体：ＭαＰｔｙｒ（５μｇ／ｍｌ）；ＲαＳｈｃ（５μｇ／ｍｌ）；ウサギ＃５８免疫前（Ｐｒｅ−Ｉｍｍｕｎｅ）（７０μｇ／ｍｌまたは７μｇ／ｍｌ）；ウサギ＃５８（１０μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ）；ウサギ＃４０５ｐ６６−免疫前（８０μｇ／ｍｌまたは８μｇ／ｍｌ）；およびｐ６６に対するウサギ＃４０５抗体（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌ）を、バックグランド減少コンポーネント（ＢａｃｋｇｒｏｕｎｄＲｅｄｕｃｉｎｇＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ；ＣＳＡアンシリアリーシステム）に希釈し、個々の細胞サンプルを１ｈ室温でインキュベートした。一次抗体を、ビオチン化ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ、又はＨＲＰを抱合させた二次抗体のうちの１つで１５−３０分間インキュベーションすることにより検出した。

腫瘍組織および患者試験集団（ｔｈｅＰａｔｉｅｎｔＳｔｕｄｙＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ）
保存され、ホルマリン−固定され、パラフィン包埋された未染色の標本を、ロジャーウイリアムス癌センター腫瘍登録所の情報に基づいて病理学部から入手し、患者の記録とクロス・チェックした。１９９０から１９９５に乳癌と診断された、９７個体の以前に未治療の患者から摘出された腫瘍を、遡及研究（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｓｔｕｄｙ）に利用した。研究集団は、６３ｙｒｓの年齢の中央値を診断時に有し、６患者はＡＪＣステージ０（ＤＣＩＳ）、３９はＡＪＣステージ１、４３はＡＪＣステージ２、５はＡＪＣステージ３、および４はＡＪＣステージ４疾患を有する患者から構成され、５．９年の平均追跡時間（ｍｅａｎｆｏｌｌｏｗ−ｕｐｔｉｍｅ）を有し、５年以前に疾患が再発した患者は除外されている。外科的処置に加えて、患者は引き続いて、多様な、放射線治療、ホルモン、タキソールまたは化学療法を受けた。転移性疾患ではない９３の患者のうち、６４は腫瘍細胞に関して節ネガティブであった。全体で、１７患者が再発性疾患（ｒｅｃｕｒｒｉｎｇｄｉｓｅａｓｅ）を生じ、そのうち１５はＡＪＣステージ＜４であった。

免疫組織化学
我々の腫瘍登録所を介して同定された、保存され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された腫瘍標本を、回収し、５ミクロンの切片に切断し、スライド上にマウントし、キシレンおよびエタノールを用いて脱パラフィン処理し、そしてＰＹ−Ｓｈｃまたはｐ６６Ｓｈｃに対する我々のポリクローン性のウサギ抗体（またはｐ６６Ｓｈｃに対するモノクローン性のマウス抗体）で触媒シグナル増幅（ＣＳＡ）ペルオキシダーゼ・システム（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて、ＣＳＡアンシリアリーシステム（ＤＡＫＯ）での標的捕獲および内在性のペルオキシダーゼ消光した後に染色した（キットの指示に従って）。

一次抗体：ＭαＰｔｙｒ（５μｇ／ｍｌ）；ＲαＳｈｃ（５μｇ／ｍｌ）；αＲ５８免疫前（Ｐｒｅ−Ｉｍｍｕｎｅ）（７０μｇ／ｍｌまたは７μｇ／ｍｌ）；αＲ５８（１０μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ）；αｐ６６−免疫前（８０μｇ／ｍｌまたは８μｇ／ｍｌ）；およびαｐ６６（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌ）を、バックグランド減少コンポーネント（ＣＳＡアンシリアリーシステム）に希釈し、個々の細胞サンプルを１ｈ室温でインキュベートした。

一次抗体を、ビオチン化ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ、又はＨＲＰを抱合させた二次抗体のうちの１つで１５−３０分間インキュベーションすることにより検出した。抗原−抗体シグナルを、抗原部位でのジアミノベンチジン（ＤＡＢ）沈殿により検出した。

免疫組織化学的な評点システムには、腫瘍性の腺性組織の染色強度（強度＝Ｉ，０−５スケール）、および６つの可能性のある強度の各々で染色される腺性組織のトータルフラクション（分布＝Ｄ，０−１０スケール，ここで１０＝腫瘍組織の１００％，５＝５０％，ｅｔｃ）の推定が含まれる。全体の腫瘍組織に関して平均的な染色強度に達するまで、染色強度の積（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及びそれらの個々の分布の合計をとり、次に結果を最終インデックス（ｆｉｎａｌｉｎｄｅｘ；ＤＩ）に達するまで測定（ｓｃａｌｅｄ）する（該インデックスは０から１の範囲を取りうる）。式は、即ち：
ＤＩ＝｛［（強度スコア＋分布スコア／２）］／Ｘ｝／１０、ここで：強度スコア＝１から５（０＝ネガティブ、バックグランド染色のみ）
１＝低レベル、点状（ｐｕｎｃｔａｔｅ）および非均質（ｎｏｎ−ｕｎｉｆｏｒｍ）の染色パターン
２＝低レベル、点状および均質の染色パターン
３＝低レベル、均等に分布した（ｅｖｅｎｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ）細胞染色パターン
４＝中程度レベル、均等に分布した（ｅｖｅｎｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ）細胞染色パターン
５＝高レベル、均等に分布した（ｅｖｅｎｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ）細胞染色パターン
分布スコア＝管領域染色ポジティブ（ｄｕｃｔａｌｒｅｇｉｏｎｓｔａｉｎｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅ）（１０＝１００％；５＝５０％，ｅｔｃ．）
Ｘ＝異なる強度スコアを有する領域の数
（例えば：［（５＋２／２）＋（４＋５／２）＋（２＋３／２）／３］／１０＝０．５３、これは５の強度で染色されたバイオプシーの２０％、４の強度で染色された５０％、および２の強度で染色された３０％を意味する）
ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃ染色の指標の双方が独立したマーカーとして使用できるのみならず（以下のデータを参照されたい）、上記で議論した生化学的な機能から、任意の特定の腫瘍における（または、更に好ましくは、腫瘍は不均一なので、任意の１細胞における）ＰＹ−Ｓｈｃのｐ６６Ｓｈｃに対する相対的な染色レベルにより、腫瘍の潜在的な攻撃性に関する更に有用な指標が提供されるだろうことが期待された。結果的に、これはＰＹ−Ｓｈｃのｐ６６Ｓｈｃに対する指標の比率を計算することにより与えられた。

全範囲の染色強度に関するスコアリングシステム（ｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）の例は、前立腺癌標本およびＰＹ−Ｓｈｃ染色を用いて図８に示される。具体例として、相対的なＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃ染色（乳癌を有する２患者における）を図９に示す。

Ｓｈｃマーカーの予後の有用性（早期ステージの及びノンディゲネーティブ（ｎｏｎｄｅｎｅｇａｔｉｖｅ）な乳癌）
ＡＪＣステージ０から４の乳癌を有する患者から構成される試験集団の予備的分析我々の研究集団（彼らのうち１７が再発性疾患を生じた）における９７患者に関するＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６の染色指標の分析によって、有意な可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）が明らかとなったが、疾患が再発した患者と疾患が再発しなかった患者とに対する値の間に明らかな差が存在していた（特に比（Ｒａｔｉｏ）インデックスに関して）（表１）。

カプラン・マイヤー（Ｋ−Ｍ）「生存」曲線〔「疾患再発（ＤｉｓｅａｓｅＲｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）」曲線、全ての統計分析は「インタークーラースタータ（ＩｎｔｅｒｃｏｏｌｅｒＳｔａｔａ）」統計ソフトウェア（ＳｔａｔａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅＳｔａｔｉｏｎ，Ｔｘ）を用いて実施された〕は、全体で２６％の再発を５年間の追跡で示した（図１０）。Ｃｏｘ比例ハザード分析（ＣｏｘＰｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌＨａｚａｒｄｓａｎａｌｙｓｉｓ）は、優れたモデル適合（ｍｏｄｅｌｆｉｔｓ）を示し、それは２７のハザード比率（ＨａｚａｒｄｓＲａｔｉｏ）を有するＰＹ−Ｓｈｃ指標を有し（０．００５の高度に有意なＰ＞｜Ｚ｜）、ｐ６６−Ｓｈｃは、０．３４（Ｓｈｃタンパク質のバイオロジーから予測されたものとほとんど同じ）のネガティブな（＜１）ハザード比率に対してある傾向（しかし、有意なＰ値ではない）を有していた。Ｓｈｃ比インデックスは、１．８９のポジティブな危険率（ＨａｚａｒｄｓＲａｔｉｏ）を有していた（０．０１６の有意なＰ値を有する）。実際、カプラン・マイヤー曲線をＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃのゼロ化値（ｚｅｒｏｉｎｇｖａｌｕｅｓ）に対して数学的に調整することによって、腫瘍再発の理論的なリスクが事実上（ｖｉｒｔｕａｌｌｙ）除外される（２６％から３．６％に、図１０を参照されたい）。

ＰＹ−Ｓｈｃ値を低（＜０．３３）または高（＞＝０．３３）およびＳｈｃ比インデックスを低（＜０．６５）および高（＞＝０．６５）に二分化（Ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｚｉｎｇ）した結果、劇的に異なるＫ−Ｍプロットが作成された（図１１）。

二分化されたＰＹ−Ｓｈｃ「生存（Ｓｕｒｖｉｖａｌ）」曲線のＬｏｇランク試験（Ｒａｎｋｔｅｓｔ）比較によって、高いＰＹ−Ｓｈｃ患者が非常に有意に高い比率の疾患再発を（低いＰＹ−Ｓｈｃ集団と比較して）実際に有していることが明らかとなった〔Ｐ＞Ｘ^２０．０１（Ｐ＞Ｘ^２ｏｆ０．０１）〕。高比率（ＨｉｇｈＲａｔｉｏ）の患者に関して、同様の結論に達した。低いＰＹ−Ｓｈｃおよび低い比率の患者は、高いＰＹ−Ｓｈｃ（２８％）および高い比率（３４％）の患者と比較して、非常に低い割合で再発性疾患を患う（それぞれ９％および７％、表２を参照されたい）。

早期のＡＪＣステージ０およびステージ１の疾患を患う患者
１００，０００以上の女性が、２００２年に早期ステージの乳癌（ステージ０またはステージ１）と診断されると推定される。この大きく臨床的に問題のあるグループの女性に関して信頼できる予後マーカーは存在しないので、ＡＪＣステージ０および１の癌（４５被験者において１０例の再発性疾患）の亜集団におけるＳｈｃマーカーの予測値（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｖａｌｕｅ）が確定された。

ステージ０、１患者のＫ−ＭプロットをＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃのゼロ化値に対して調整することによって、腫瘍再発の理論的なリスクが再び大きく減らされた（３７％から２．３％、図１２を参照されたい）。Ｃｏｘ比例ハザード分析は、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃに対して優れたモデル適合およびＰ値を示し、また極度に有意なＳｈｃ比インデックスを示した｛５．０（Ｐ＞０．００１）表３を参照されたい｝。ハザード比率は、ＰＹ−ＳｈｃおよびＳｈｃ比インデックスに関して１．０よりも非常に大きく、このことはＰＹ−ＳｈおよびＳｈｃ比インデックスの増加している値が疾患再発の非常に増加しているリスクと関連していることを示している。逆に、ハザード比率は、ｐ６６−Ｓｈｃに関して１．０よりも非常に低く、このことはｐ６６−Ｓｈｃの減少している値が疾患再発の非常に増加しているリスクと関連していることを示している。

また、これらの初期のＡＪＣステージ患者（該患者に関して、良好な予後の指標が利用可能ではない）に関してさえ、再発性疾患の割合は低いＳｈｃ比（６％再発）を有する患者においては全体集団（２２％再発）と比較して非常に低かったが、高いＳｈｃ比を有する患者は再発性疾患の非常に高い割合（６２％再発）を全体集団（２２％、表４を参照されたい）と比較して有していた。低および高Ｓｈｃ比のグループへと二分化された「生存」曲線のＬｏｇランク試験（図１２）によって、高いＳｈｃ比を有する患者に関する再発性疾患の高度なリスク（低いＳｈｃと比較して）（６２％ｖｓ．６％）が、非常に有意であった（Ｐ＞Ｃｈｉ^２０．０００７）ことが明らかとなった。

節ネガティブな乳癌を有する患者
さらに大きい割合の乳癌患者（全てのステージ０、１、多数のステージ２および少数のステージ３患者から構成される）は、局所のリンパ節に検出可能な程度に伝播していない疾患を有している（節ネガティブな患者）。これらの患者はエストロゲン受容体の状態、腫瘍サイズおよび相対的に低リスク群および高リスク群への組織学的グレードに基づいて細分されるが［１］、異なるリスク群分類は非常に不十分な予測の手段（ｔｏｏｌ）を提供する。以上のことから、患者（６１患者、そのうち１３が再発性疾患を発症した）のこのサブセットにおけるＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃレベルを分析した。これらの節ネガティブ患者のＫ−ＭプロットをＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃのゼロ化値へと調整することによって、腫瘍再発の理論的な割合が３０％から４．６％（図１３）へと大きく減少し、このことは腫瘍再発の多くが高くなったＰＹ−Ｓｈｃおよび低下したｐ６６−Ｓｈｃレベルによると説明できることを示唆している。Ｓｈｃ比インデックスのＣｏｘ比例ハザード分析は、優れたモデル適合（Ｃｈｉ^２＝６．２，確率＞Ｃｈｉ^２０．０１３）および高度に有意な（Ｐ＞０．００５）ハザード比率（３．２）（表５を参照されたい）を示した。

さらにまた、これらの節ネガティブ患者（該患者に関して、良好な予後の指標は利用可能ではない）に関してさえ、低いＳｈｃ比の患者は再発性疾患の非常に低い割合（８．５％再発）を全体集団（２１％再発）と比較して有していたが、高いＳｈｃ比の患者は再発性疾患の非常に高い割合（５６％再発）を全体集団と比較して有していた。

二分化されたＳｈｃ比「生存」曲線のＬｏｇランク試験比較（図１３）は、非常に有意な高い比率の疾患再発率が高いＳｈｃ比（５６％，９／１６患者）を有する患者間に存在することを示しており、それは低いＰＹ−Ｓｈｃ比を有する患者間に存在する値よりも高かった｛８．５％，４／４９患者，Ｘ^２＝１６．３，確率＞Ｘ^２＜＜０．００１〔Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＞Ｘ^２ｏｆ＜＜０．００１〕｝。

我々の節ネガティブな患者を最近定義された「一致した低リスク（ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＬｏｗＲｉｓｋ）」および「一致した高リスク」群へとカテゴリー化することによって、一致したリスク分類および二分化された低および高Ｓｈｃ比分類の能力を、腫瘍再発を正確に予想すること及び腫瘍再発の予想に不正確に失敗することに関して比較した。図１４に示されるとおり、再発性疾患を、どの患者が罹患して、どの患者が罹患しないかを一致した分類（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は予測することができなかった。対照的に、Ｓｈｃ比インデックスは、患者を低および高リスク群に正確に分類した。

低いＳｈｃ比の群の患者は僅か１３％の再発性疾患の発生率を有していた、一方で高いＳｈｃ比の群の患者は６０％の再発性疾患の発生率を有していた。

対照的に、一致したパネル分類（ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｎｅｌ’ｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は非常に不十分であり：その「低リスク」群において、（数において少ないのではあるが）その７患者のうち３患者が再発性疾患を有していた（４３％）、一方、その「高リスク」群において、その３９患者のうち１０患者が再発性疾患を有していた（２６％）。

要約すると、Ｓｈｃマーカーの使用（ＰＹ−Ｓｈｃまたはｐ６６Ｓｈｃの測定を単独で、しかし、好ましくは比率として共に使用して）によって、これまで不可能であった技術が提供され、乳癌患者を、再発性疾患を罹患する非常に高い尤度（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を有する乳癌患者と再発性疾患を罹患する非常に低い尤度を有する乳癌患者とに類別（ｃａｔｅｇｏｒｉｚｅ）する。何百何千の女性の各人に対する、臨床上の影響力およびクォリティーオブライフの改善は莫大なものであろう。現状で集中的な（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）アジュバント治療を推奨された多くの女性に関して、その病的状態（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）および費用を抑制することができるであろう、一方、再発性疾患を罹患する他の患者（この患者等は現在不適切に集中的なアジュバント治療を推奨されていないので）は、これからは自身のＳｈｃマーカーのレベルに基づいて、集中的なアジュバント治療が推奨されるであろう。

Ｓｈｃマーカーの適切な有用性（ｌｉｋｅｌｙｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ）は、乳癌における詳細に説明された有用性を超えて、前立腺癌および多くの他の癌にも同様に明らかに拡大される。前立腺癌におけるＳｈｃマーカーの予備的な調査は、我々が予想したとおり、強度における有意な可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）および他のマーカー（それ自身は前記疾患のステージと単に相関する）での不整合（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｃｅ）、を実証する。

例２
乳癌は、女性が診断されるもっとも一般的な癌であり、米国単独で毎年約２００，０００の新しい症例が発症している［１］。乳癌の最初の発生、同様にその攻撃性の程度は、多様な成長因子及びそのレセプター（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、他のＥＧＦレセプターファミリーメンバー、およびＩＧＦ−１）からの、インテグリンからの、及びＧタンパク質共役型レセプターからのシグナル伝達によって部分的にコントロールされる。実質的に全てのこれらのシグナルには、１以上のチロシンキナーゼが関与している。

現在、国立癌研究所は、９５以上の臨床試験を開始または計画しており、これらの試験は多数のチロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）を用いたもので、この阻害物質はＨｅｒ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦレセプターまたは任意の他の数個の受容体および非受容体型チロシンキナーゼに特異的なものである。しかしながら、これらの試験は一般的に、どの患者が任意の単一の又は組み合わせのＴＫＩｓに反応すると思われる腫瘍を有することを予測する、臨床家の能力の欠如により大きく妨げられている。

Ｓｈｃチロシンリン酸化は、本質的に悪性の表現型に関与し、また攻撃的な腫瘍のレポーターとして機能するので、我々はＰｙ−ＳｈｃがＴＫＩｓの抗腫瘍有効性のインビトロ予言者として使用できることを予測する。係るアッセイは、開発（フェーズ２および３の臨床試験）および究極的なチロシンキナーゼ阻害物質（乳癌を治療するための）の使用の双方に対して大きな影響力を有しているだろう。臨床家は、乳癌に対するアジュバント治療を合理化（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）でき、それに反応する可能性のある患者の腫瘍にだけ、それを投与できる。このアッセイは前立腺、卵巣、および他の癌に同様に有用であると思われる。

材料および方法
ヒト乳癌細胞におけるＳｈｃチロシンリン酸化が、組織培養における効果的なＴＫＩｓへの短時間（＜２ｈｒ）の曝露によって阻害できることが以前から示されている［５４，１６］。ヒトの乳房腫瘍に関して、係るアッセイは、摘出した原発腫瘍を１８ｇ針でコアリングすること及びそのコアを０．５ｍｍのディスクにスライスすることを含むだろう。ディスクはＨａｎｋ’ｓ溶液でリンスされ、９６ウェル組織培養プレートのウェル中に配置され、このウェルの各々には１以上のＴＫＩ（１００μｌのＨａｎｋｓ中）が含有されており、約２ｈｒｓ、３７°Ｃで５％Ｃ０２チャンバー中で処理されるだろう。組織のディスクは、次に回収され、固定され、パラフィン包埋され、そしてＰＹ−Ｓｈｃの定量的な免疫組織化学的な染色に対して処理されるだろう。腫瘍ＰＹ−Ｓｈｃのレベルを減少させるＴＫＩｓの能力は、これらのＴＫＩｓに対する腫瘍の感受性と相関することが予測される。

例３
発明の付加的な態様
免疫学に基づくアッセイ
（ａ）免疫組織化学的なアッセイ（このアッセイでは、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃが２色染色システムを用いて同時に検出される）。

（ｂ）免疫組織化学的なアッセイ（このアッセイでは、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃが免疫蛍光タグおよび蛍光顕微鏡を用いて、別々に又は同時に検出される）。

（ｃ）ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃ（腫瘍細胞から抽出された）の免疫ブロット。

この方法は、原理的に望ましく、実際にはホストのストローマ細胞、非癌性の腺性組織および免疫細胞の浸潤物によって、腫瘍におけるＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃの見積もりが大きく歪む場合に望ましい。例えば、リンパ系の浸潤細胞ではｐ６６Ｓｈｃが欠乏し、また腫瘍（例えば、図６に示される）は、免疫ブロットによって、ｐ６６Ｓｈｃが非常に欠乏しているように思われるが、実際には腫瘍細胞自身ではｐ６６Ｓｈｃが豊富である。

（ｄ）ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ、サンドイッチおよび競合タイプ
サンドイッチＥＬＩＳＡでは、ｐａｎ−抗−Ｓｈｃを腫瘍抽出の捕獲抗体として使用できる、次にＰＹ−Ｓｈｃ特異的およびｐ６６Ｓｈｃ特異的な抗体を検出に関して使用できる。或いは、前記抗体を逆の順序（ｏｒｄｅｒ）で使用できる。

（ｅ）フローサイトメータによるアッセイ、このアッセイでは、腫瘍細胞は互いに及びストローマと、当業者に既知の通常の酵素処理（例えば、ディスパーゼ、コラゲナーゼ処理など）を用いて分離されるだろう、次に随意に腫瘍細胞はストローマ細胞から分離され（密度遠心分離、例えば）、前記細胞は固定および透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｉｎｇ）（７０％エタノールなどの標準の処理を用いて）され、次にＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃに関して一色または二色で、蛍光性タグ化された一次または二次抗体（またはビオチン／アビジンシステムなど）で染色され、および随意的に乳房（癌）細胞に特異的な（例えば、ＭＵＣ−１）第三の抗体（直接的または間接的に第三のフルオロフォアでタグ化された）が添加される。１、２または３色のフローサイトメトリー分析により、個々の細胞において、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６−Ｓｈｃレベルを定量化できた。

（ｆ）更なる態様は、Ｙ３１７チロシンリン酸化部位よりもむしろ（或いは前記部位に加えて）、ＳｈｃにおけるＹ２３９および／またはＹ２４０のチロシンリン酸化部位に対するＰＹ−Ｓｈｃ抗体を用いた免疫アッセイである。

（ｇ）上記「ｃ」に記載されたものに類似する免疫アッセイであるが、ｐａｎ−Ｓｈｃ抗体での免疫沈降、および引き続くホスホチロシンに対するｐａｎ−特異的な抗体（例えば、上述の４Ｇ１０モノクローナル抗体）での免疫ブロットを組み合わせたもの。

ＰＹ−ＳｈｃおよびＰ６６Ｓｈｃに対する非免疫学的なアッセイ
（ａ）新規方法が最近開発され、その方法は個々のタンパク質の量、および更には特定のアミノ酸が翻訳後修飾されたタンパク質の量さえも定量する能力を有する。

最近記載された、そのような方法の１つは、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間マススペクトロメトリー（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ）［５２，５３］である。

単一細胞ＭＡＬＤＩＴＯＦは、個々の腫瘍細胞における又は腫瘍細胞のグループにおけるＰＹ−Ｓｈｃ（Ｐ［３１７］Ｙ−Ｓｈｃ、Ｐ［２３９，２４０］Ｙ−Ｓｈｃ、または双方）およびｐ６６Ｓｈｃの量を連続的に決定できた。

（ｂ）上記「ｃ」および「ｇ」に記載されたものに類似するブロッティングアッセイであるが、ＰＹ−Ｓｈｃに対して特異的なリガンド（例えば、これに限定されないが、アダプタタンパク質Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメイン）を用いたもの。このアッセイにおいて、Ｓｈｃは、腫瘍細胞抽出物から、ｐａｎ−Ｓｈｃ抗体を用いて免疫沈降されるだろう、次にリガンド（Ｇｒｂ２−ＳＨ２ドメイン）によりプローブ（ｐｒｏｂｅ）されるだろう。ＰＹ−Ｓｈｃに結合したリガンドの一定量を、ブロット上に局在化でき、そしてＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインと反応する試薬を用いることによって定量できた。この試薬は、Ｇｒｂ２−ＳＨ２ドメインに対するＨＲＰタグ化抗体（ＨＲＰ−ｔａｇｇｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）、同様にＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインと融合または連結されたタグ化された人工的なエピトープ（例えば、ＧＳＴ、ＦＬＧ、ＨＩＳ、またはビオチン）に対する抗体であってもよい。

或いは、前記Ｇｒｂ２−ＳＨ２ドメインは、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）またはアルカリホスファターゼなどのレポーター酵素と直接連結し得る。

ＰＹ−ＳｈｃおよびＰ６６Ｓｈｃ並びに他の変異体に関するアッセイの組み合わせにより、細胞の遺伝子／タンパク質が増幅または活性化された。

ある種の癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）／発癌性タンパク質（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ）による腫瘍性転化（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、少なくともＲａｓ／ＭＡＰキナーゼに対するＰＹ−Ｓｈｃシグナル伝達経路の活性化を要求しないと信じられている。

このような変化には、構成的に活性なＲａｓタンパク質を産生するＲＡＳ遺伝子の変異が含まれるであろう。

このことが乳癌において発生する頻度は相対的に低いが、このようなＲａｓの変異または別の非Ｓｈｃ依存的な活性化（例えば、活性化したプロテインキナーゼＣによる）によって、ＰＹ−Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃマーカーにより検出されるとは思われない攻撃的な乳癌のいくつかを説明できた。

同様に、ｃ−Ｍｙｃの過剰発現または活性化によって、Ｓｈｃ経路とは独立に細胞増殖を生じさせることができた。以上のように、Ｍｙｃレベル／活性における変化によっても、Ｓｈｃマーカーにより検出されるとは思われない攻撃的な乳癌のいくつかを説明できた。

従って、Ｓｈｃマーカーに関するアッセイに対して異常なＲａｓおよびＭｙｃレベル／活性の免疫組織化学的な又はインサイチュー（ｉｎ−ｓｉｔｕ）ＰＣＲに基づく検出を付加することにより、患者が再発性疾患の高リスク群に指定される精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）が更に改善されることが期待できる。

［参照文献］

Claims

乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法。
請求項１に記載の方法であって、ｐ６６−Ｓｈｃの量のみが決定される方法。
請求項１に記載の方法であって、リン酸化Ｓｈｃの量のみが決定される方法。
請求項１に記載の方法であって、ｐ６６−Ｓｈｃおよびリン酸化Ｓｈｃの双方の量が決定される方法。
乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍細胞が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が被験者（該被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない）から取得される方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が乳房腫瘍細胞である方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が卵巣腫瘍細胞である方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記の決定する工程が、ｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記の決定する工程がフローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が分離される方法。
請求項１または５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が組織サンプル内に存在する方法。
被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法。
請求項１５に記載の方法であって、ｐ６６−Ｓｈｃの量のみが決定される方法。
請求項１５に記載の方法であって、リン酸化Ｓｈｃの量のみが決定される方法。
請求項１５に記載の方法であって、ｐ６６−Ｓｈｃおよびリン酸化Ｓｈｃの双方の量が決定される方法。
被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法。
被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々におけるｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法。
被験者における、乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々における、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、前記腫瘍が攻撃的であるかどうかを決定することと、を含む方法。
請求項１５、１９、２０または２１に記載の方法であって、前記被験者がヒトである方法。
請求項１５、１９、２０または２１に記載の方法であって、前記被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない方法。
請求項１５、１９、２０、または２１に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が乳房腫瘍細胞である方法。
請求項１５、１９、２０、または２１に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である方法。
請求項１５、１９、２０、または２１に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が卵巣腫瘍細胞である方法。
請求項１５、１９、２０または２１に記載の方法であって、前記の決定する工程が、ｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む方法。
請求項１５、１９、２０または２１に記載の方法であって、前記の決定する工程がフローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む方法。
請求項１５、１９、２０または２１に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が組織サンプル内に存在する方法。
乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定する方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在するｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法。
請求項３０に記載の方法であって、ｐ６６−Ｓｈｃの量のみが決定される方法。
請求項３０に記載の方法であって、リン酸化Ｓｈｃの量のみが決定される方法。
請求項３０に記載の方法であって、ｐ６６−Ｓｈｃおよびリン酸化Ｓｈｃの双方の量が決定される方法。
乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定するための方法であって、前記腫瘍の癌性細胞に存在する、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法。
乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々におけるｐ６６−Ｓｈｃおよび／またはリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと、およびそのように決定された量を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法。
乳房、前立腺、または卵巣の腫瘍を患っていると診断された被験者に関して、前記被験者の一次治療後に前記腫瘍の再発を患う尤度を決定するための方法であって、前記腫瘍に存在する複数の癌性細胞の各々における、ｐ６６−Ｓｈｃのリン酸化Ｓｈｃに対する比率および／またはリン酸化Ｓｈｃのｐ６６−Ｓｈｃに対する比率を決定することと、およびそのように決定された比率を既知の標準と比較して、再発の尤度を決定することと、を含む方法。
請求項３０、３４、３５、または３６に記載の方法であって、前記被験者がヒトである方法。
請求項３０、３４、３５、または３６に記載の方法であって、前記被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない方法。
請求項３０、３４、３５、または３６に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が乳房腫瘍細胞である方法。
請求項３０、３４、３５、または３６に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である方法。
請求項３０、３４、３５、または３６に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が卵巣腫瘍細胞である方法。
請求項３０、３４、３５または３６に記載の方法であって、前記の決定する工程が、ｐ６６−Ｓｈｃまたはリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む方法。
請求項３０、３４、３５または３６に記載の方法であって、前記の決定する工程がフローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む方法。
請求項３０、３４、３５または３６に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が組織サンプル内に存在する方法。
請求項３０、３４、３５または３６に記載の方法であって、前記一次治療が、外科的処置、放射線照射、ホルモン治療および化学療法からなる群から選択される治療を含む方法。
ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合する単離された抗体。
リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する単離された抗体。
請求項４６または４７に記載の抗体であって、前記抗体がポリクローナルである抗体。
請求項４６または４７に記載の抗体であって、前記抗体がモノクローナルである抗体。
請求項４６または４７に記載の抗体であって、前記抗体が検出可能な成分で標識された抗体。
請求項５０に記載の抗体であって、前記検出可能な成分が、蛍光標識、放射性原子、化学発光標識、常磁性イオン、ビオチンまたは二次的な酵素または結合工程を介して検出できる標識である抗体。
請求項４６に記載の抗体であって、ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−４１０９のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体。
ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
請求項５３に記載のハイブリドーマであって、ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−４１０９のハイブリドーマ。
リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
請求項１、５、１５、１９、２０、２１、３０、３４、３５または３６に記載の方法を実施するためのキットであって、（ａ）ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｂ）リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｃ）既知の標準を産生するための試薬、および（ｄ）使用説明書を含むキット。
ｐ６６−Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法であって、請求項５３のハイブリドーマを培養することと、およびそのように産生されたモノクローナル抗体を回収することと、を含む方法。
リン酸化Ｓｈｃと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法であって、請求項５５のハイブリドーマを培養することと、およびそのように産生されたモノクローナル抗体を回収することと、を含む方法。
腫瘍をチロシンキナーゼ阻害物質を用いて良好に治療できるとの尤度を決定するための方法であって：
（ａ）前記腫瘍からの細胞の第一サンプルを前記チロシンキナーゼ阻害物質と、前記サンプルにおいてチロシンリン酸化Ｓｈｃの形成が可能であろう条件下で（前記チロシンキナーゼ阻害物質の非存在下において）、接触させることと；
（ｂ）前記サンプルに存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃの量を決定することと；および
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたチロシンリン酸化Ｓｈｃの量と前記腫瘍からの細胞の第二サンプル（前記チロシンキナーゼ阻害物質と接触していない）に存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃの量とを比較することと（ここで、前記第二サンプルに存在するチロシンリン酸化Ｓｈｃの量が前記第一と比較して多いことが、前記腫瘍を前記チロシンキナーゼ阻害物質で良好に治療できるとの尤度を示す）、を含む方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記腫瘍が、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、または卵巣腫瘍である方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記腫瘍からの細胞のサンプルが、被験者（該被験者のリンパ節には腫瘍細胞が存在しない）から取得される方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記被験者がヒトである方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が乳房腫瘍細胞である方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が卵巣腫瘍細胞である方法。
請求項５９に記載の方法であって、チロシンリン酸化Ｓｈｃの量を決定することが、チロシンリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体の使用を含む方法。
請求項６６に記載の方法であって、前記抗体が検出可能に標識された方法。
請求項５９に記載の方法であって、チロシンリン酸化Ｓｈｃの量を決定することが、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学の使用を含む方法。
請求項５９に記載の方法であって、前記の腫瘍細胞のサンプルが組織サンプル内に存在する方法。
請求項５９に記載の方法を実施するためのキットであって、別々のコンパートメントに、（ａ）チロシンリン酸化Ｓｈｃと特異的に結合する検出可能な抗体、（ｂ）チロシンリン酸化Ｓｈｃと結合する抗体の量を測定するための試薬、および（ｃ）使用説明書を含むキット。