JP2010133965A - 結核菌に特異的なｔ細胞（ｃｄ８＋）を検出するための方法 - Google Patents
結核菌に特異的なｔ細胞（ｃｄ８＋）を検出するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】結核菌のエピトープを特定し、このエピトープに相当するペプチドから成る抗結核菌ワクチンを提供する。
【解決手段】アミノ酸配列（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチドが、T細胞（CD8）を特異的に刺激して、顕著に高いIFN-γ量を与えることを見出した。この発見を元に、ＭＰＢ／ＭＰＴ５１分子に特異的なＴ細胞(ＣＤ８）を検出する。
【選択図】なし
【解決手段】アミノ酸配列（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチドが、T細胞（CD8）を特異的に刺激して、顕著に高いIFN-γ量を与えることを見出した。この発見を元に、ＭＰＢ／ＭＰＴ５１分子に特異的なＴ細胞(ＣＤ８）を検出する。
【選択図】なし
Description
この発明は、結核菌に特異的なＴ細胞(ＣＤ８ ＋ )を検出するための方法に関する。
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に有効なワクチンとして知られているＢＣＧにはいくつかの問題点が指摘されていることから、成分ワクチンとしてペプチドから成る結核菌に有効なワクチンを探索する試みが多く成されている（特許文献1等）。
この結核菌の抗原として、Ag85A、Ag85BなどのAg85ファミリータンパク質はMycobacteriaに共通する主要なタンパク質であり、有効な感染防御抗原として働くことが知られている。
結核菌やBCGから分離されたタンパク質であるMPB/MPT51分子はこのファミリーに属し、その配列が解明されており（非特許文献1）、結核菌の防御抗原として機能する結果が得られている（非特許文献２）。
発明者らは、既にＤＮＡワクチンを用いてこのMPB/MPT51のＴ細胞エピトープを同定することを試みているが（非特許文献３）、エピトープは同定されておらず、より正確な同定が望まれていた。
この結核菌の抗原として、Ag85A、Ag85BなどのAg85ファミリータンパク質はMycobacteriaに共通する主要なタンパク質であり、有効な感染防御抗原として働くことが知られている。
結核菌やBCGから分離されたタンパク質であるMPB/MPT51分子はこのファミリーに属し、その配列が解明されており（非特許文献1）、結核菌の防御抗原として機能する結果が得られている（非特許文献２）。
発明者らは、既にＤＮＡワクチンを用いてこのMPB/MPT51のＴ細胞エピトープを同定することを試みているが（非特許文献３）、エピトープは同定されておらず、より正確な同定が望まれていた。
本発明は、結核菌のエピトープを特定し、このエピトープに相当するペプチドから成る抗結核菌ワクチンを提供することを目的とする。
本発明者らは、DNAワクチンを用いてMPB/MPT51分子内のT細胞エピトープの固定を試みてきている（非特許文献３）。しかし、エピトープとして有効なアミノ酸数は８〜10といわれており、今まで同定したと考えられたエピトープはこれより遥かに大きく、より正確にエピトープを同定することが求められていた。
本発明者らは、DNAワクチンを用いてMPB/MPT51分子内のT細胞エピトープの固定を試みてきている（非特許文献３）。しかし、エピトープとして有効なアミノ酸数は８〜10といわれており、今まで同定したと考えられたエピトープはこれより遥かに大きく、より正確にエピトープを同定することが求められていた。
本発明者らは、BCG由来のMPB51分子の発現プラスミドpCI-MPB51を作成し、これでマウスを免疫し、この免疫マウス脾細胞を、結核菌又はBCGの一部分に相当するアミノ酸数が約２０の合成ペプチドと共培養して、IFN-γ量を測定した。更に、このIFN-γ産生量の多いペプチド中のアミノ酸数が約１０の合成ペプチドを用いてCD8+又はCD4+T細胞についてフローサイトメトリーを行った。その結果、T細胞（CD8+）を特異的に刺激してIFN-γを産生させるペプチド断片を特定することに成功した。この結果、顕著に高いIFN-γ量を与えるこのアミノ酸数が１０のペプチドは、免疫マウス脾細胞に含まれるT細胞（CD8+）を特異的に刺激してIFN-γ量を増大させたものであるため、このT細胞（CD8+）のエピトープに相当するものと考えられる。
本発明者らは、上記の実験の結果、アミノ酸配列（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチドが、T細胞（CD8+）を特異的に刺激して、顕著に高いIFN-γ量を与えることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、（ａ）又は（ｂ）のペプチドである。
（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチド
（ｂ）（ａ）のペプチドのアミノ酸配列においてＣ末端を除く１又は２のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、T細胞（CD8+）に対して免疫活性を示すペプチド
即ち、本発明は、（ａ）又は（ｂ）のペプチドである。
（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチド
（ｂ）（ａ）のペプチドのアミノ酸配列においてＣ末端を除く１又は２のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、T細胞（CD8+）に対して免疫活性を示すペプチド
配列番号1で表されるアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチドは、結核菌やBCGから分離されたタンパク質であるMPB/MPT51分子の部分であり、T細胞（CD8+）を特異的に刺激しIFN-γを産生するため、このT細胞（CD8+）のエピトープであると結論される。従って、このペプチドを抗結核菌ワクチンとして用いることができる。
このペプチドを、必要に応じて有効量のアジュバント及び調剤上許容し得る担体と共に含有してワクチン製剤とすることができる。
この製剤は、注射により皮下、皮内又は筋肉に注入する等適当な経路で患者に投与することができる。ワクチンの投与量は共に投与するアジュバントの有無等によって異なるが、一般的に１成人１投与あたり１μｇ〜１００mgの量で投与する。本ワクチンと共にアジュバントを投与する場合、一般的には、１成人１投与あたり１ng〜１mgの量を投与する。アジュバントとしてはdimethyl dioctadecylammonium bromide (DDA, Eastman Kodak)、monophosphoryl lipid A(MPL, RIBI ImmunoChem Research Inc.)等を使用できる。
このペプチドを、必要に応じて有効量のアジュバント及び調剤上許容し得る担体と共に含有してワクチン製剤とすることができる。
この製剤は、注射により皮下、皮内又は筋肉に注入する等適当な経路で患者に投与することができる。ワクチンの投与量は共に投与するアジュバントの有無等によって異なるが、一般的に１成人１投与あたり１μｇ〜１００mgの量で投与する。本ワクチンと共にアジュバントを投与する場合、一般的には、１成人１投与あたり１ng〜１mgの量を投与する。アジュバントとしてはdimethyl dioctadecylammonium bromide (DDA, Eastman Kodak)、monophosphoryl lipid A(MPL, RIBI ImmunoChem Research Inc.)等を使用できる。
また、このペプチドにより定法に従ってマウス等の哺乳動物を免疫し、この哺乳動物のリンパ球や脾臓細胞を単離し、これとミエローマ細胞株と定法に従って融合させて複数のハイブリドーマを得ることができる。更に限界希釈によるクローニングを行い、ハイブリドーマの上清が本ペプチドと特異的に反応するようなハイブリドーマを選択し、選択したハイブリドーマの産生する抗体（モノクローナル抗体）を得ることができる。このような抗体は、このペプチドに特異的に反応するため、結核菌を検査したり、抗結核菌ワクチンを製造する場合にワクチンをクリーニングする際に有用である。この抗原抗体反応を検知する方法に特に制限はないが、イムノブロット法、ドットブロット法、ELISA法等を用いて行うことができる。
また、このペプチドをコードする塩基配列から成るオリゴヌクレオチドは、これを含むベクターを利用して、これを発現させることにより抗結核菌ＤＮＡワクチンとして使用できる。
ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込み可能であって、目的ＤＮＡの転写が可能な位置にプロモーターを含有しているものを選択できる。ベクターはプラスミド、ファージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクターにはさらに、選択マーカー、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、エンハンサー、ポリリンカーなどを適宜含むことができる。細菌等の原核生物用や、菌類、酵母類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等の真核生物用の種々の発現ベクターを用いることができる。
プロモーターとしては、市販の発現ベクターに予め組込まれているもの等を適宜選択して用いることができる。例えば、原核生物用としてtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなど、酵母用としてGAPプロモーター、ADHプロモーター、GPDプロモーターなど、動物細胞用としてサイトメガロウイルスプロモーター、SV40初期プロモーター、レトロウイルスプロモーター、乳腺細胞特異的プロモーターなど、植物細胞用としてカリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターなどが挙げられる。
形質転換法として、塩化カルシウム法、燐酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法などを用いることができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込み可能であって、目的ＤＮＡの転写が可能な位置にプロモーターを含有しているものを選択できる。ベクターはプラスミド、ファージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクターにはさらに、選択マーカー、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、エンハンサー、ポリリンカーなどを適宜含むことができる。細菌等の原核生物用や、菌類、酵母類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等の真核生物用の種々の発現ベクターを用いることができる。
プロモーターとしては、市販の発現ベクターに予め組込まれているもの等を適宜選択して用いることができる。例えば、原核生物用としてtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなど、酵母用としてGAPプロモーター、ADHプロモーター、GPDプロモーターなど、動物細胞用としてサイトメガロウイルスプロモーター、SV40初期プロモーター、レトロウイルスプロモーター、乳腺細胞特異的プロモーターなど、植物細胞用としてカリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターなどが挙げられる。
形質転換法として、塩化カルシウム法、燐酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法などを用いることができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
プラスミドＤＮＡワクチン（pCI-MPT51）の構成
ＭＰＴ５１をコードするＤＮＡをプラスミドｐＭＢ４９（長崎大学医学部大原直也氏より入手）からプライマー（配列番号２及び３）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ｐＭＢ４９はM.bovis BCG Tokyo strainのＭＰＢ５１遺伝子(Gene Bank/EMBL/CCBJ accession number: D26486)を含む。Xba Iで消化されたPCR断片を発現プラスミドｐCI（Promega, Madison, WI）のサイトメガルウイルスのエンハンサー／プロモーター領域の下流に位置するXba I位置に挿入した。
ＭＰＴ５１をコードするＤＮＡをプラスミドｐＭＢ４９（長崎大学医学部大原直也氏より入手）からプライマー（配列番号２及び３）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ｐＭＢ４９はM.bovis BCG Tokyo strainのＭＰＢ５１遺伝子(Gene Bank/EMBL/CCBJ accession number: D26486)を含む。Xba Iで消化されたPCR断片を発現プラスミドｐCI（Promega, Madison, WI）のサイトメガルウイルスのエンハンサー／プロモーター領域の下流に位置するXba I位置に挿入した。
マウスの免疫
HLA-A*0201トランスジェニック／マウスHMCクラスI欠損(HHD)マウス（パスツール研究所、フランス、F.A. Lemonnier氏より入手）を遺伝子銃（Bio-Rad Laboratories）を用いて上記プラスミドＤＮＡワクチン（pCI-MPT51）で免疫処置した。0.5mgの金粒子を１μｇのプラスミドＤＮＡワクチンでコートした。マウスを免疫するために、腹部の皮膚の毛を剃り70％エタノールで拭いた。このマウスに、1度に0.5mgの金粒子を２回打ち込んだ。マウスは一週間の間隔を空けて４回に分けて２μｇのプラスミドDNAを４度打ち込んだ。
HLA-A*0201トランスジェニック／マウスHMCクラスI欠損(HHD)マウス（パスツール研究所、フランス、F.A. Lemonnier氏より入手）を遺伝子銃（Bio-Rad Laboratories）を用いて上記プラスミドＤＮＡワクチン（pCI-MPT51）で免疫処置した。0.5mgの金粒子を１μｇのプラスミドＤＮＡワクチンでコートした。マウスを免疫するために、腹部の皮膚の毛を剃り70％エタノールで拭いた。このマウスに、1度に0.5mgの金粒子を２回打ち込んだ。マウスは一週間の間隔を空けて４回に分けて２μｇのプラスミドDNAを４度打ち込んだ。
ペプチドの合成
ＭＰＢ５１(配列番号４)について、図１に示すように、２０アミノ酸から成るペプチドを１０アミノ酸が重複するように選び、２６種のペプチドを合成した。但し、最後のペプチド（255〜266）は１２アミノ酸から成る。
ＭＰＢ５１(配列番号４)について、図１に示すように、２０アミノ酸から成るペプチドを１０アミノ酸が重複するように選び、２６種のペプチドを合成した。但し、最後のペプチド（255〜266）は１２アミノ酸から成る。
ELISAによるIFN-γ濃度測定
免疫したマウスから採取した脾臓細胞の懸濁液を、９６穴プレートのRPMI/10FCS中で５μMの上記各ペプチドの存在下、３７℃、５％CO2条件で培養した。２４時間後に上清液を回収してIFN-γ濃度評価まで−２０℃で保存した。
IFN-γ濃度はELIZA法で測定した。９６穴ELISAプレート（E.I.A./R.I.A.プレートA/2）をキャプチャ抗体（抗murine IFN-γモノクローナル抗体(mAb) R4-6A2; BD PharMingen）で４℃で一晩コートし、0.05% Tween-20を含むPBSで洗浄し、Block Ace(大日本製作所)により37℃で２時間ブロックした。洗浄後、培養上清液をプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlビオチンでラベルされた抗murine IFN-γモノクローナル抗体(mAb)(XMG1.2; BD PharMingen)をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、0.1μg/mlのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプタビジン(streptavidine)(Vector Laboratories, Inc.)を添加した。次にこのプレートを室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンゼンジヒドロクロライド(TMB, Sigma-Aldrich Japan)を用いて、結合したHRP結合ストレプタビジンを測定した。5分後、色反応を２M H2SO4で終了させ、EZS-ABSマイクロプレートリーダー（IWAKI）を用いて450nmの吸収を測定した。
結果を図２に示す。ＭＰＢ５１(図１、配列番号４)の５１〜７０番目（P51）が最も高いIFN-γ量を与えることが分かった。
免疫したマウスから採取した脾臓細胞の懸濁液を、９６穴プレートのRPMI/10FCS中で５μMの上記各ペプチドの存在下、３７℃、５％CO2条件で培養した。２４時間後に上清液を回収してIFN-γ濃度評価まで−２０℃で保存した。
IFN-γ濃度はELIZA法で測定した。９６穴ELISAプレート（E.I.A./R.I.A.プレートA/2）をキャプチャ抗体（抗murine IFN-γモノクローナル抗体(mAb) R4-6A2; BD PharMingen）で４℃で一晩コートし、0.05% Tween-20を含むPBSで洗浄し、Block Ace(大日本製作所)により37℃で２時間ブロックした。洗浄後、培養上清液をプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlビオチンでラベルされた抗murine IFN-γモノクローナル抗体(mAb)(XMG1.2; BD PharMingen)をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、0.1μg/mlのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプタビジン(streptavidine)(Vector Laboratories, Inc.)を添加した。次にこのプレートを室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンゼンジヒドロクロライド(TMB, Sigma-Aldrich Japan)を用いて、結合したHRP結合ストレプタビジンを測定した。5分後、色反応を２M H2SO4で終了させ、EZS-ABSマイクロプレートリーダー（IWAKI）を用いて450nmの吸収を測定した。
結果を図２に示す。ＭＰＢ５１(図１、配列番号４)の５１〜７０番目（P51）が最も高いIFN-γ量を与えることが分かった。
ペプチドの合成
次に、ＭＰＢ５１(図１、配列番号４)の（１）５１〜７０番目、（２）２１〜２９番目、（３）５３〜６１番目（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶ）、及び（４）５３〜６２番目（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）から成るペプチドを合成した。
次に、ＭＰＢ５１(図１、配列番号４)の（１）５１〜７０番目、（２）２１〜２９番目、（３）５３〜６１番目（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶ）、及び（４）５３〜６２番目（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）から成るペプチドを合成した。
フローサイトメトリーによる評価
抗原特異的T細胞サブセットについて、T細胞表現型及び細胞内IFN-γ合成を、同時フローサイトメトリー評価法により測定した。RBC（赤血球）を除去するために、実施例１で得た免疫脾臓細胞をACK溶解緩衝液で室温で５分間処理し、PRMI−1640培養液で２度洗浄し、PRMI/10FCS中に1×107細胞/mlの濃度で再懸濁した。この細胞(200μl)を、1000倍希釈のGolgiplugストック溶液（brefeldin A solution; BD PharMingen）中の5μMの上記合成ペプチドの存在又は不存在下で、37℃で4時間インキュベートした。次に細胞をFACS緩衝液(1%FCS及び0.1%NaN3を含むリン酸緩衝食塩水）で２度洗浄し、イソチオシアン酸フルオレッセイン(FITC)結合抗CD8抗体（53-6.7, BD PharMingen）及びCyChrome結合抗CD4抗体(RM4-5, BD PharMingen）で氷上で３０分間染色し、２回洗浄し、続いてCytofix/Cytoperm キット(BD PharMingen)を用いて細胞内サイトカイン染色(ICS)を行った。IFN-γに対する細胞内サイトカイン染色はフィコエリトリン(PE)結合抗IFN-γ抗体(clone XMG1.2; BD PharMingen)を用いて行った。細胞を２回洗浄し、続いてFACS緩衝液に再懸濁した。これらをEPICSデジタルフローサイトメーター(EPICS XL; Beckman Coulter)で分析した。
抗原特異的T細胞サブセットについて、T細胞表現型及び細胞内IFN-γ合成を、同時フローサイトメトリー評価法により測定した。RBC（赤血球）を除去するために、実施例１で得た免疫脾臓細胞をACK溶解緩衝液で室温で５分間処理し、PRMI−1640培養液で２度洗浄し、PRMI/10FCS中に1×107細胞/mlの濃度で再懸濁した。この細胞(200μl)を、1000倍希釈のGolgiplugストック溶液（brefeldin A solution; BD PharMingen）中の5μMの上記合成ペプチドの存在又は不存在下で、37℃で4時間インキュベートした。次に細胞をFACS緩衝液(1%FCS及び0.1%NaN3を含むリン酸緩衝食塩水）で２度洗浄し、イソチオシアン酸フルオレッセイン(FITC)結合抗CD8抗体（53-6.7, BD PharMingen）及びCyChrome結合抗CD4抗体(RM4-5, BD PharMingen）で氷上で３０分間染色し、２回洗浄し、続いてCytofix/Cytoperm キット(BD PharMingen)を用いて細胞内サイトカイン染色(ICS)を行った。IFN-γに対する細胞内サイトカイン染色はフィコエリトリン(PE)結合抗IFN-γ抗体(clone XMG1.2; BD PharMingen)を用いて行った。細胞を２回洗浄し、続いてFACS緩衝液に再懸濁した。これらをEPICSデジタルフローサイトメーター(EPICS XL; Beckman Coulter)で分析した。
結果を図３に示す。（４）ＭＰＢ５１(配列番号４)の５３〜６２番目から成るペプチドを用いた場合のT細胞（CD8）によるIFN-γの産生量が顕著に高いことがわかる。これは（３）ＭＰＢ５１の５３〜６１番目から成るペプチドを用いた場合と比較すると特に顕著である。
即ち、T細胞（CD8）がＭＰＢ５１(配列番号４)の５３〜６２番目から成るペプチドに反応して、IFN-γを生産したことを示している。
これは、この（４）の配列がＭＰＴ５１、即ち結核菌のＴ細胞エピトープであることを示すものであり、（３）と比較するとそのC末端に特徴があるといえる。更に、通常有効なエピトープは８〜１０アミノ酸であると考えられているため、ＭＰＴ５１のエピトープは（４）の配列のC末端を含む８〜１０アミノ酸から成る部分であるということができる。
即ち、T細胞（CD8）がＭＰＢ５１(配列番号４)の５３〜６２番目から成るペプチドに反応して、IFN-γを生産したことを示している。
これは、この（４）の配列がＭＰＴ５１、即ち結核菌のＴ細胞エピトープであることを示すものであり、（３）と比較するとそのC末端に特徴があるといえる。更に、通常有効なエピトープは８〜１０アミノ酸であると考えられているため、ＭＰＴ５１のエピトープは（４）の配列のC末端を含む８〜１０アミノ酸から成る部分であるということができる。
Claims (3)
- 細胞を配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチドと接触させ、これをフローサイトメトリーを用いて、このペプチドに反応する細胞を検出することから成る、該細胞中のＭＰＢ／ＭＰＴ５１分子に特異的なＴ細胞(ＣＤ８＋)を検出するための方法。
- 細胞を配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＴＬＡＧＫＧＩＳＶＶ）のＣ末端から少なくとも８の連続するアミノ酸からなるペプチドの存在下で培養し、Ｔ細胞を分離し、このＴ細胞を抗ＩＦＮ−γ抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリーを用いて、これら両抗体に反応するＴ細胞を検出することから成る、該細胞中のＭＰＢ／ＭＰＴ５１分子に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するための方法。
- 前記細胞がヒトから取り出した細胞である請求項１又は２に記載の方法。
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| JP2005130807A (ja) * | 2003-10-31 | 2005-05-26 | Japan Science & Technology Agency | 新規ペプチド及びこのペプチドから成る抗結核菌ワクチン |
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