JP2010130946A - Cell coupling module, cell coupling device and cell coupling method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関し、更に詳細には、クローン胚の作出、細胞融合などに際して、簡便にしかも確実に細胞同士をカップリングさせることができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関する。 The present invention relates to a cell coupling module, a cell coupling apparatus, and a cell coupling method, and more specifically, a cell capable of easily and reliably coupling cells together in producing a cloned embryo, cell fusion, and the like. The present invention relates to a coupling module, a cell coupling device, and a cell coupling method.
生化学の分野を中心に微小流路をガラス基板やプラスチック基板に形成し、その微小閉空間内で化学反応を起こすマイクロ（化学）チップが開発されている。特にＤＮＡのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法の応用として、従来技術と比較し数倍〜十数倍の高速分離検出を可能とした多くの製品開発がされている（例えば、非特許文献１参照。）。現在その応用先は生化学反応を中心とした分野であり、細胞の分離や加工などの操作における細胞単体の個別搬送、個別加工などの技術は確立されていない。 In the field of biochemistry, a micro (chemical) chip has been developed in which a micro flow channel is formed on a glass substrate or a plastic substrate, and a chemical reaction occurs in the micro closed space. In particular, as an application of DNA PCR (Polymerase Chain Reaction) method, many products have been developed that enable high-speed separation detection several to tens times as compared with the prior art (for example, see Non-Patent Document 1). ). Currently, its application is in fields centered on biochemical reactions, and technologies such as individual transfer and processing of individual cells in operations such as cell separation and processing have not been established.
ところで、クローン技術の確立は今後の医療・化学産業を革新的に変化させると期待される技術である。ファンクショナルジェノミクスの分野では、遺伝子の影響を調べるために特定の遺伝子を持ったマウス（ＫＯマウス）を作成し、様々な創薬や治療の研究に使われている。ＫＯマウスの作成方法では、主として、ＥＳ細胞からキメラマウスを作り、その子孫からＫＯマウスを作成する方法が採られているが、安定したクローン技術により、ＥＳ細胞から直接クローン技術でＫＯマウスを作る方法や、体細胞で遺伝子をノックアウトしてクローンマウスを作る方法が有用となってくる。特に、ＥＳ細胞が樹立されていない動物種やマウスの系統では、体細胞からのクローン体の作成は非常に有効である。一方、現状のクローニングにおける核移植作業は、移植工程中に多くの手作業が含まれており（例えば、非特許文献２参照。）、研究の効率化、妥当な評価の障害になっている。例えば、移植後の卵細胞に対し、添加薬品の効果を比較する場合、手作業による卵子の損傷のばらつきが大きいと、薬品の効果を正確に評価することができない。 By the way, the establishment of clone technology is a technology that is expected to revolutionize the future medical and chemical industries. In the field of functional genomics, mice with specific genes (KO mice) have been created to investigate the effects of genes and are used in various drug discovery and treatment studies. In the method for producing KO mice, chimera mice are mainly produced from ES cells and KO mice are produced from their progeny. However, KO mice are produced directly from ES cells by a clone technique by a stable cloning technique. The method and the method of making a cloned mouse by knocking out a gene in somatic cells are useful. In particular, in animal species or mouse strains in which ES cells have not been established, the creation of clones from somatic cells is very effective. On the other hand, the current nuclear transfer operation in cloning involves many manual operations during the transplantation process (see, for example, Non-Patent Document 2), which is an obstacle to efficient research and appropriate evaluation. For example, when comparing the effects of added chemicals on transplanted egg cells, the effects of the chemicals cannot be accurately evaluated if there is a large variation in ovum damage due to manual labor.
このように自動化による研究の省力化と実験条件の安定化はファンクショナルジェノミクスの技術発展に必要不可欠であり、また、今後の産業化を考慮する上でも作業の自動化は重要であることに鑑み、種々の検討が行われている（例えば、特許文献１参照。）。
本発明の目的は、マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ正確に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a cell coupling module, a cell coupling device, and a cell coupling method capable of simply and accurately performing cell coupling in a microchannel.
本発明の細胞カップリングモジュールは、マイクロ流路内の搬送媒体中において複数の細胞のカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、前記搬送媒体とともに前記細胞を搬送する前段流路と、該前段流路に連続する後段流路と、該後段流路に交流電界を生じさせるための電極対と、該後段流路に設けられた誘電体の間隙からなり、前記交流電界の作用により生成する電界により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、前記後段流路の上流側に接続され、搬送媒体の注入により前記後段流路内に二層流を生じさせて前記細胞を前記捕捉ギャップに近接して流動させる媒体注入路とを備えたことを特徴とする。 The cell coupling module of the present invention is a cell coupling module that couples a plurality of cells in a transport medium in a microchannel, the front-stage channel that transports the cells together with the transport medium, and the front-stage An electric field generated by the action of the AC electric field, comprising a subsequent flow path continuous with the flow path, an electrode pair for generating an AC electric field in the subsequent flow path, and a dielectric gap provided in the subsequent flow path. The trapping gap for trapping the cells is connected to the upstream side of the rear-stage flow path, and a two-layer flow is generated in the rear-stage flow path by injecting a carrier medium to bring the cells close to the capture gap. And a medium injection path for fluidization.
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、後段流路内の細胞の搬送媒体中に電極対を用いて交流電界を生じさせ、その交流電界中には誘電体の間隙からなる捕捉ギャップが設けられている。捕捉ギャップには電場集中による電場勾配が生じ、その近傍を通過する細胞は、その電場勾配の方向に誘電泳動力を受けて捕捉ギャップに捕捉されることになる。ここで、誘電泳動力は（電場）2の勾配に比例するため、捕捉ギャップからの距離の増大に伴って著しく小さくなる。そのため、後段流路の幅が広く細胞が捕捉ギャップから遠い場所を通過する場合には、十分な大きさの誘電泳動力が細胞に作用せず、細胞を捕捉できない可能性がある。このような場合、捕捉ギャップからの距離に応じて電極対間の印加電圧を高くする必要があるが、強い電場による細胞損傷の虞があり、また、誘電泳動力以外の力又は流れが発生したり、機器の高出力化によるの影響が懸念される。本発明では、この点に鑑み、細胞が捕捉ギャップ近傍を通過するように、前段流路内に二層流を生じさせて細胞を捕捉ギャップに近づけるための媒体注入路が前段流路に接続されている。 In the cell coupling module of the present invention, an alternating electric field is generated using a pair of electrodes in the cell transport medium in the downstream flow path, and a trapping gap made of a dielectric gap is provided in the alternating electric field. Yes. An electric field gradient is generated in the trapping gap due to electric field concentration, and cells passing through the trapping gap are captured by the trapping gap by receiving a dielectrophoretic force in the direction of the electric field gradient. Here, since the dielectrophoretic force is proportional to the gradient of (electric field) 2 , it decreases significantly as the distance from the capture gap increases. Therefore, when the downstream channel is wide and the cell passes through a place far from the capture gap, a sufficiently large dielectrophoretic force does not act on the cell, and the cell may not be captured. In such a case, it is necessary to increase the applied voltage between the electrode pair according to the distance from the capture gap, but there is a risk of cell damage due to a strong electric field, and a force or flow other than the dielectrophoretic force is generated. There are concerns about the impact of higher output of equipment. In the present invention, in view of this point, a medium injection path for generating a two-layer flow in the upstream channel and bringing the cell closer to the capture gap is connected to the upstream channel so that the cells pass in the vicinity of the trapping gap. ing.
更に、本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、捕捉ギャップに細胞が捕捉されると、捕捉ギャップにおける電場分布は変化し、捕捉された細胞の表面を頂点とする電場勾配が新たに生じることとなる。そして、捕捉された細胞の近傍を更に他の細胞が通過すれば、その細胞にも上記新たな電場勾配により誘電泳動力が作用し、先に捕捉されている細胞に付着することとなる。このようにして、細胞のカップリングが成立する。 Furthermore, in the cell coupling module of the present invention, when a cell is captured in the capture gap, the electric field distribution in the capture gap changes, and a new electric field gradient with the captured cell surface at the apex is newly generated. . If another cell passes through the vicinity of the captured cell, the dielectrophoretic force acts on the cell due to the new electric field gradient and adheres to the previously captured cell. In this way, cell coupling is established.
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、前記後段流路における前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を吸引して前記細胞を捕捉ギャップに捕捉するための吸引路を更に備えていてもよい。この吸引路を設けたことにより、確実に細胞を捕捉ギャップに捕らえることができる。 The cell coupling module of the present invention may further include a suction path for sucking the carrier medium from the capture gap in the downstream flow channel and capturing the cells in the capture gap. By providing this suction path, the cells can be reliably captured in the capture gap.
ここで、前記後段流路における前記捕捉ギャップは、前記後段流路の流れを妨げないように、前記後段流路の延設方向に平行に開口するように設けられていることが好ましい。 Here, it is preferable that the capture gap in the rear-stage flow path is provided so as to open in parallel with the extending direction of the rear-stage flow path so as not to disturb the flow of the rear-stage flow path.
本発明の細胞カップリングモジュールは、前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である場合に好適に使用することができる。 The cell coupling module of the present invention can be suitably used when one of the plurality of cells is an ovum and the other one of the plurality of cells is a donor cell.
本発明の細胞カップリング装置は、上記の細胞カップリングモジュールと、前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプとを備えたことを特徴とする。 The cell coupling device of the present invention includes the above-described cell coupling module, a first liquid-feeding pump that sends out the transport medium for transporting the cells to the upstream flow path, and the transport to the medium injection path. And a second liquid feeding pump for feeding a medium to generate a two-layer flow.
更に、本発明の細胞カップリング装置は、前記吸引路から前記搬送媒体を吸引する吸引ポンプを備えていてもよい。 Furthermore, the cell coupling device of the present invention may include a suction pump that sucks the transport medium from the suction path.
加えて、前記後段流路における画像を撮像する画像センサと、該画像センサで撮像された画像に基づいて、前記第１の送液ポンプ及び前記第２の送液ポンプによる送液をコントロールするコントローラとを設けてもよく、このコントローラにより、前記吸引ポンプによる搬送媒体の吸引をコントロールしてもよい。 In addition, an image sensor that captures an image in the subsequent flow path, and a controller that controls liquid feeding by the first liquid feeding pump and the second liquid feeding pump based on the image captured by the image sensor The controller may control the suction of the transport medium by the suction pump.
本発明の細胞カップリング方法は、上記の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界により前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、前記電極対による交流電界の発生を止めることにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送することを特徴とする。 The cell coupling method of the present invention is a cell coupling method using the above-described cell coupling module, wherein the carrier medium is sent to the preceding flow path, and the first cell of the plurality of cells is removed. The first cell passes through the vicinity of the capture gap by transporting the transport medium from the medium injection path and generating a two-layer flow in the rear flow path while transporting to the rear flow path. In addition, the first cell is captured in the capture gap by the electric field generated in the capture gap, and the carrier medium is sent to the upstream flow path to transmit the second cell of the plurality of cells. The second cell in the vicinity of the first cell by sending the carrier medium from the medium injection path and generating a two-layer flow in the rear stage flow path. The second cell is coupled to the first cell by the electric field generated by the action on the dielectric and the first cell that forms the AC electric field capture gap, and the electrode pair By stopping the generation of the alternating electric field due to, the first and second cells after the coupling are separated from the capture gap and transported.
また、前記細胞を捕捉するための吸引路を備えた細胞カップリングモジュールの場合には、前記交流電界の作用により生成する電界と、前記媒体注入路からの搬送媒体の送出により生ずる二層流と、前記吸引路からの前記前記搬送媒体の吸引とにより前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記電極対による交流電界の発生を止めるとともに、前記吸引路からの前記前記搬送媒体を送出することにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送するように構成することもできる。 In the case of a cell coupling module provided with a suction path for capturing the cells, an electric field generated by the action of the alternating electric field, and a two-layer flow generated by sending the carrier medium from the medium injection path, The first cell is captured in the capture gap by suction of the transport medium from the suction path, and the generation of the alternating electric field by the electrode pair is stopped, and the transport medium from the suction path is sent out. Thus, the first and second cells after the coupling can be separated from the capture gap and transported.
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を使用すれば、交流電界に置かれた誘電体からなる捕捉ギャップに形成された電界と二層流との作用により、細胞を確実に捕捉ギャップに捕捉することができる。また、捕捉ギャップから搬送媒体を吸引する吸引路を備えた構成では、更に確実に細胞を捕捉ギャップに捕捉することが可能となる。 If the cell coupling module, the cell coupling device, and the cell coupling method of the present invention are used, a cell is produced by the action of an electric field formed in a capture gap made of a dielectric placed in an alternating electric field and a two-layer flow. It is possible to reliably capture in the capture gap. In addition, in the configuration including the suction path for sucking the transport medium from the capture gap, it becomes possible to capture the cells in the capture gap more reliably.
これにより、細胞を機械的に把持するような機構は不要となる。また、細胞の捕捉により後段流路で搬送媒体の流れが変化しても後段流路は十分な幅を有しているので、捕捉された細胞が搬送媒体の圧力によって離脱することもなく、搬送媒体の流速を細かく制御する必要もない。そのため、マイクロ流路の製造が容易となり、付随する装置も簡略化することができる。 This eliminates the need for a mechanism that mechanically grips the cells. In addition, even if the flow of the transport medium changes in the downstream flow path due to cell capture, the downstream flow path has a sufficient width, so that the captured cells are not separated by the pressure of the transport medium and can be transported. There is no need to finely control the flow rate of the medium. Therefore, the manufacture of the microchannel is facilitated, and the accompanying device can be simplified.
また、細胞のサイズや硬さのばらつきがあっても、種々の細胞を捕捉ギャップに捕捉することが可能となり、細胞の捕捉による搬送媒体の流量の乱れに対しても安定して細胞を保持することができる。 In addition, even if there are variations in cell size and hardness, various cells can be captured in the capture gap, and the cells can be stably held against disturbance in the flow rate of the transport medium due to cell capture. be able to.
本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本実施形態では、卵子からクローン胚を作出する際の操作を例として説明する。クローン胚の作出に際しては、卵子の透明帯が除去された後、卵子が二分割され、分割されたうちの無核卵子（核の無い方）にドナー細胞がカップリングされる。ここで、本明細書におけるカップリングとは、例えば電気融合において電圧を印加する前において、融合すべき細胞同士を接着した状態にすることを言う。 Embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings, but the present invention is not limited to the following embodiments. In the present embodiment, an operation when creating a cloned embryo from an egg will be described as an example. When producing a cloned embryo, after removing the zona pellucida of the ovum, the ovum is divided into two, and the donor cells are coupled to the anucleated ovum (one without nuclei). Here, the coupling in the present specification refers to, for example, bringing cells to be fused together into an adhesive state before applying a voltage in electrofusion.
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。本実施形態の細胞カップリング装置は、マイクロ流路１１を形成したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）からなる細胞カップリングモジュール１０と、ＺＦＭ（Zimmerman's fusion medium）などの搬送媒体をマイクロ流路１１内に送出する卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３と、マイクロ流路１１から搬送媒体を吸引する吸引ポンプ２５と、卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３の送液量（速度）並びに吸引ポンプ２５の吸引量を制御するコントローラ２４と、マイクロ流路１１の画像を撮像する画像センサ２８と、マイクロ流路１１の画像の監視と装置全体の運転状況を表示及び監視するためのモニタ２６とを備えている。 FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a cell coupling device according to an embodiment of the present invention. The cell coupling device of the present embodiment sends a cell coupling module 10 made of PDMS (polydimethylsiloxane) in which a microchannel 11 is formed and a transport medium such as ZFM (Zimmerman's fusion medium) into the microchannel 11. Liquid feeding pump 20, donor liquid feeding pump 22 and liquid feeding pump 23 for injection, suction pump 25 for sucking the carrier medium from the microchannel 11, liquid feeding pump 20 for egg, and liquid feeding pump for donor 22 and the controller 24 for controlling the amount (speed) of the liquid feeding pump 23 and the amount of suction by the suction pump 25, the image sensor 28 for capturing an image of the microchannel 11, and the image of the microchannel 11 And a monitor 26 for displaying and monitoring the operation status of the entire apparatus.
本実施形態における細胞カップリングモジュール１０の詳細を図２に示す。また、図２におけるＡ部の拡大平面図を図３に示す。図２及び図３に示すように、マイクロ流路１１は、無核卵子１３を搬送媒体とともに搬送する前段流路１２と、前段流路１２に続く幅の広くなった後段流路１６とを有しており、この後段流路１６は、図２に示すように、相対する電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９と、この電極対１９の延長上に設けられたＰＤＭＳとによって形成されている。電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９は、後段流路１６に交流電界を生じさせるために設けられている。また、マイクロ流路１１は、前段流路１２と後段流路１６との接続部分近傍に接続された媒体注入路１８と、卵子にカップリングするためのドナー細胞を搬送媒体とともに搬送するドナー搬送流路１４と、後述する捕捉ギャップ３３に連なる吸引路１７とを有している。本実施形態では、図３に示すように、前段流路１２の幅Ｗ1＝１２０μｍ、媒体注入路１８の幅Ｗ2＝５０μｍ、後段流路１６の幅Ｗ3＝４００μｍ、吸引路１７の幅Ｗ5＝１００μｍである。図２に示すように、前段流路１２、ドナー搬送流路１４及び媒体注入路１８の端部には、搬送媒体の流量を急激な変動を抑制するための緩衝部１２ａ,１４ａ,１８ａがそれぞれ設けられている。また、吸引路１７及び後段流路１６の端部にも、搬送媒体を吸引するための緩衝部１７ａ,１６ａがそれぞれ設けられている。 Details of the cell coupling module 10 in this embodiment are shown in FIG. FIG. 3 shows an enlarged plan view of a portion A in FIG. As shown in FIGS. 2 and 3, the micro flow path 11 has a front flow path 12 that transports the non-nucleated egg 13 together with the transport medium, and a wide rear flow path 16 that follows the front flow path 12. As shown in FIG. 2, the latter-stage flow path 16 is formed by an electrode pair 19 composed of opposing electrodes 19 a and 19 b and PDMS provided on the extension of the electrode pair 19. . The electrode pair 19 composed of the electrode 19 a and the electrode 19 b is provided to generate an alternating electric field in the rear flow path 16. In addition, the micro flow path 11 is a donor transport flow for transporting a donor cell for coupling to an egg together with a transport medium, and a medium injection path 18 connected in the vicinity of a connection portion between the front flow path 12 and the rear flow path 16. It has the channel | path 14 and the attraction | suction path 17 connected to the capture gap 33 mentioned later. In the present embodiment, as shown in FIG. 3, the width W 1 of the front flow path 12 is 120 μm, the width W 2 of the medium injection path 18 is 50 μm, the width W 3 of the rear flow path 16 is 400 μm, and the width of the suction path 17. W 5 = 100 μm. As shown in FIG. 2, buffer portions 12a, 14a, and 18a for suppressing rapid fluctuations in the flow rate of the transport medium are provided at the end portions of the front-stage flow channel 12, the donor transport flow channel 14, and the medium injection channel 18, respectively. Is provided. Further, buffer portions 17a and 16a for sucking the transport medium are also provided at the ends of the suction passage 17 and the rear passage 16 respectively.
更に、本実施形態の細胞カップリングモジュールでは、後段流路１６の前段流路１２との接続部側にＰＤＭＳからなる突起部３１と、島状部３２とが設けられており、この突起部３１と島状部３２との間に、卵子等の細胞を捕捉するための捕捉ギャップ３３が形成されている。捕捉ギャップ３３は後段流路１６の延設方向、即ち搬送媒体の流れの方向に沿って開口するように設けられており、捕捉ギャップ３３の裏面側には、前述の吸引路１７が接続されている。 Furthermore, in the cell coupling module of the present embodiment, the protrusion 31 made of PDMS and the island-shaped portion 32 are provided on the connection portion side of the rear flow channel 16 with the front flow channel 12. A trapping gap 33 for trapping a cell such as an egg is formed between the base and the island portion 32. The capture gap 33 is provided so as to open along the extending direction of the downstream flow path 16, that is, the direction of flow of the transport medium, and the suction path 17 is connected to the back side of the capture gap 33. Yes.
本実施形態では、捕捉ギャップ３３の開口部の幅ｄ＝４０μｍであり、突起部３１の幅Ｄ1＝１００μｍ、長さＬ1＝５００μｍ、島状部３２の長さＬ2＝４００μｍ、幅Ｄ2＝２００μｍである。ここで、捕捉ギャップ３３の開口部の幅ｄは、捕捉すべき卵子１３の直径より小さく、卵子１３の直径の２分の１程度が好ましい。また、後段流路１６の突起部３１及び島状部３２が形成されている部分での流路の幅Ｗ4＝２００μｍである。この幅Ｗ4は、卵子１３の直径の２〜３倍程度が好ましい。更に、本実施形態では、媒体注入路１８の前段流路１２への接続部から捕捉ギャップ３３までの距離Ｌ3＝７００μｍである。この距離Ｌ3は、後述する二層流により卵子１３が捕捉ギャップ３３に最も近接するように決められるが、卵子１３が捕捉ギャップ３３に捕捉されるために十分な距離であればよい。 In the present embodiment, the width d of the opening of the capture gap 33 is 40 μm, the width D 1 of the protrusion 31 is 100 μm, the length L 1 is 500 μm, the length L 2 of the island-shaped portion 32 is 400 μm, and the width D. 2 = 200 μm. Here, the width d of the opening of the catching gap 33 is smaller than the diameter of the egg 13 to be caught, and is preferably about one-half of the diameter of the egg 13. Further, the width W 4 of the flow path at the portion where the protruding portion 31 and the island-shaped portion 32 of the rear flow channel 16 are formed is 200 μm. The width W 4 is preferably about 2 to 3 times the diameter of the egg 13. Further, in the present embodiment, the distance L 3 from the connecting portion of the medium injection path 18 to the upstream flow path 12 to the capture gap 33 is 700 μm. The distance L 3 is determined so that the ovum 13 is closest to the capture gap 33 by a two-layer flow described later, but may be a distance sufficient for the ovum 13 to be captured by the capture gap 33.
本実施形態におけるマイクロ流路１１は、以下のようにして作成される。まず、基板上にリソグラフィー用の光硬化剤（レジスト）の塗膜を形成し、次に、フォトマスクを用いてマイクロ流路１１の形状の部分に光照射して硬化させる。更に、未照射の部分を除去することにより、マイクロ流路１１の形状の凸状パターンを基板上に形成する。次に、このパターンを覆って基板上にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を塗布し、これを硬化させた後に基板から取り外することにより、凹状のマイクロ流路１１が形成された細胞カップリングモジュール１０が得られる。このようにして作成したマイクロ流路１１の断面形状はほぼ矩形であり、その深さは、本実施形態では１２０μｍとなっている。 The microchannel 11 in the present embodiment is created as follows. First, a coating film of a photo-curing agent (resist) for lithography is formed on the substrate, and then the portion of the shape of the microchannel 11 is irradiated with light and cured using a photomask. Furthermore, a convex pattern having the shape of the microchannel 11 is formed on the substrate by removing the unirradiated portion. Next, PDMS (polydimethylsiloxane) is applied on the substrate so as to cover this pattern, and after curing this, the cell coupling module 10 in which the concave microchannel 11 is formed is removed from the substrate. can get. The cross-sectional shape of the microchannel 11 created in this way is substantially rectangular, and its depth is 120 μm in this embodiment.
以上の構成を有する装置における細胞カップリング方法について説明する。まず、卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２と、注入用送液ポンプ２３から搬送媒体を送出し、マイクロ流路１１のすべてを搬送媒体で満たす。 A cell coupling method in the apparatus having the above configuration will be described. First, the carrier medium is sent out from the egg liquid pump 20 and / or the donor liquid pump 22 and the injection liquid pump 23 to fill the entire microchannel 11 with the carrier medium.
次に、電極１９ａ及び電極１９ｂの間に交流電圧を印加し、後段流路１６内に交流電界を生じさせる。後段流路１６に何も存在しなければ、交流電圧の印加により後段流路１６には一様な交流電界が形成されるが、後段流路１６内には誘電体（ＰＤＭＳ）からなる突起部３１及び島状部３２が形成されているため、突起部３１及び島状部３２の間の捕捉ギャップ３３近傍では電界は一様とはならない。図５は、後段流路１６内における捕捉ギャップ３３近傍に形成される電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、１ＭＨｚ，１Ｖｒｍｓとした。同図に示すように、生成する電界は捕捉ギャップ３３近傍では一様とならず、電場勾配を生じている。このような電場勾配が生じている捕捉ギャップ３３の近傍を卵子１３が通過すると、卵子１３は誘電泳動力により捕捉ギャップ３３に捕捉されることとなる。なお、卵子などの誘電体が電場勾配から何れの方向に誘電泳動力を受けるかは、誘電体の誘電率、交流の周波数などの条件によって決まることが知られている。本実施形態では、卵子１３が捕捉ギャップ３３に引かれるような条件に設定されている。 Next, an AC voltage is applied between the electrode 19 a and the electrode 19 b to generate an AC electric field in the subsequent flow path 16. If nothing is present in the rear-stage channel 16, a uniform AC electric field is formed in the rear-stage channel 16 by application of an AC voltage, but a protrusion made of a dielectric (PDMS) is formed in the rear-stage channel 16. Since the 31 and the island-shaped portion 32 are formed, the electric field is not uniform in the vicinity of the capture gap 33 between the protrusion 31 and the island-shaped portion 32. FIG. 5 shows the electric field formed in the vicinity of the capture gap 33 in the latter-stage flow channel 16 by analysis. The alternating current at the time of analysis was 1 MHz and 1 Vrms. As shown in the figure, the generated electric field is not uniform in the vicinity of the capture gap 33, and an electric field gradient is generated. When the ovum 13 passes in the vicinity of the capture gap 33 where such an electric field gradient is generated, the ovum 13 is captured by the capture gap 33 by the dielectrophoretic force. It is known that in which direction a dielectric such as an egg receives a dielectrophoretic force from the electric field gradient depends on conditions such as the dielectric constant of the dielectric and the frequency of the alternating current. In the present embodiment, the condition is set such that the egg 13 is pulled by the capture gap 33.
このような電界が形成された後、マイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて卵子１３が緩衝部１２ａから前段流路１２に導入される。なお、卵子１３及び後述するドナー細胞１５は、接着性を高めるために予めＰＨＡ（Phytohemagglutinin）で処理してある。次に、前段流路１２に卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２から搬送媒体が送出されるとともに、媒体注入路１８にも搬送媒体が送出される。前段流路１２における搬送媒体の流量は、０．０５〜０．２μｌ／分である。また、媒体注入路１８には、前段流路１２における搬送媒体の２〜３倍の量の搬送媒体が送出される。卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３からの搬送媒体の送出量は、画像センサ２８からの後段流路１６の画像に基づいてコントローラ２４により制御されている。 After such an electric field is formed, the ovum 13 is introduced from the buffer portion 12a into the upstream channel 12 using a micropipette, a glass capillary tube, or the like. In addition, the egg 13 and the donor cell 15 which will be described later are previously treated with PHA (Phytohemagglutinin) in order to enhance adhesion. Next, the carrier medium is sent from the egg feeding pump 20 and / or the donor feeding pump 22 to the upstream channel 12, and the carrier medium is also sent to the medium injection path 18. The flow rate of the transport medium in the upstream channel 12 is 0.05 to 0.2 μl / min. In addition, the medium injection path 18 is fed with an amount of the conveyance medium that is two to three times as large as the conveyance medium in the upstream flow path 12. The delivery amount of the carrier medium from the egg feeding pump 20, the donor feeding pump 22, and the injection feeding pump 23 is controlled by the controller 24 based on the image of the rear flow path 16 from the image sensor 28. .
上述のように、後段流路１６では、前段流路１２からの搬送媒体と、媒体注入路１８からの搬送媒体とが合流することになる。このように２つの流れが合流すると、その合流地点から下流には二層流が形成されることが知られている。即ち、図３の破線３４に示すように、前段流路１２からの搬送媒体の流れは媒体注入路１８が接続されている側とは反対側に押しやられ、前段流路１２からの搬送媒体と媒体注入路１８からの搬送媒体との間に境界面が生じることとなる。この境界面は消滅せずに後段流路１６の下流まで移動し、少なくとも捕捉ギャップ３３の位置まで維持される。その結果、前段流路１２内を搬送媒体とともに搬送されてきた卵子１３は、後段流路１６内で媒体注入路１８からの搬送媒体によって突起部３１及び島状部３２の側に押しやられることとなる。そして、上述のように捕捉ギャップ３３には電場勾配が形成されているため、卵子１３は捕捉ギャップ３３に容易に捕捉されることとなる。また、本実施形態では、捕捉ギャップ３３の裏面側には吸引路１７が形成されているので、この吸引路１７からの搬送媒体の吸引により、卵子１３を捕捉ギャップ３３に更に容易に捕捉することが可能となっている。 As described above, in the rear flow path 16, the transport medium from the front flow path 12 and the transport medium from the medium injection path 18 merge. It is known that when two flows merge in this way, a two-layer flow is formed downstream from the merge point. That is, as shown by the broken line 34 in FIG. 3, the flow of the transport medium from the upstream flow path 12 is pushed to the side opposite to the side to which the medium injection path 18 is connected, and the transport medium from the upstream flow path 12 A boundary surface is generated between the medium injection path 18 and the transport medium. This boundary surface does not disappear but moves to the downstream of the downstream flow path 16 and is maintained at least up to the position of the capture gap 33. As a result, the ovum 13 that has been transported together with the transport medium in the front-stage flow path 12 is pushed toward the protrusion 31 and the island-shaped section 32 by the transport medium from the medium injection path 18 in the rear-stage flow path 16. Become. Since the electric field gradient is formed in the capture gap 33 as described above, the egg 13 is easily captured in the capture gap 33. Further, in the present embodiment, since the suction path 17 is formed on the back surface side of the capture gap 33, the egg 13 can be captured in the capture gap 33 more easily by suction of the transport medium from the suction path 17. Is possible.
次に、ドナー細胞１５がマイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて緩衝部１４ａからドナー搬送流路１４に導入される。ドナー細胞１５も前段流路１２に誘導され、更に後段流路１６に到達する。後段流路１６では、ドナー細胞１５も卵子１３と同様に二層流の影響を受けて、突起部３１及び島状部３２の側に押しやられて下流へと移動する。 Next, donor cells 15 are introduced into the donor transport channel 14 from the buffer portion 14a using a micropipette, a glass capillary tube, or the like. Donor cells 15 are also guided to the upstream channel 12 and reach the downstream channel 16. In the latter-stage flow channel 16, the donor cell 15 is also affected by the two-layer flow similarly to the ovum 13, and is pushed toward the protruding portion 31 and the island-shaped portion 32 and moves downstream.
後段流路１６には前述と同様に交流電界が生じているが、捕捉ギャップ３３には前述のように既に卵子１３が捕捉されているので、図５とは異なる電界が生じている。図６は捕捉ギャップ３３に卵子１３が捕捉されている場合の電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、前述と同様に１ＭＨｚ，１Ｖｒｍｓである。卵子１３が捕捉されている場合、同図に示すように、捕捉された卵子１３を頂点とする電場勾配が新たに生じていることがわかる。このような電場勾配が生じている卵子１３の近傍をドナー細胞１５が通過すると、図４に示すように、その電場勾配によりドナー細胞１５は卵子１３にカップリングされることとなる。 An AC electric field is generated in the rear-stage flow path 16 as described above, but since the egg 13 is already captured in the capture gap 33 as described above, an electric field different from that in FIG. 5 is generated. FIG. 6 shows the electric field obtained by analysis when the egg 13 is captured in the capture gap 33. The alternating current at the time of analysis is 1 MHz and 1 Vrms as described above. When the ovum 13 is captured, it can be seen that a new electric field gradient with the captured ovum 13 at the apex is newly generated, as shown in FIG. When the donor cell 15 passes through the vicinity of the ovum 13 where such an electric field gradient is generated, the donor cell 15 is coupled to the ovum 13 by the electric field gradient as shown in FIG.
次に、電極１９ａ及び電極１９ｂへの交流電圧の印加を止め、更に必要に応じて吸引路１７から搬送媒体を送出することにより、カップリングした卵子１３及びドナー細胞１５は捕捉ギャップ３３から離れて後段流路１６を流動して緩衝部１６ａ（図２）で回収されることとなる。 Next, the application of the AC voltage to the electrode 19a and the electrode 19b is stopped, and further, the transported medium is sent out from the suction path 17 as necessary, so that the coupled egg 13 and donor cell 15 are separated from the capture gap 33. It flows through the rear-stage flow path 16 and is collected by the buffer section 16a (FIG. 2).
本実施形態の細胞カップリングモジュールを使用すれば、交流電界に置かれた誘電体の間の捕捉ギャップ３３に形成された電界と二層流との作用により、卵子１３を確実に捕捉ギャップ３３に捕捉するとともに、ドナー細胞１５を卵子１３にカップリングさせることができる。また、捕捉ギャップ３３から搬送媒体を吸引する吸引路１７を備えているので、更に確実に卵子１３を捕捉ギャップ３３に捕捉することが可能となる。 If the cell coupling module of this embodiment is used, the egg 13 is surely made into the capture gap 33 by the action of the electric field formed in the capture gap 33 between the dielectrics placed in the alternating electric field and the two-layer flow. The donor cell 15 can be coupled to the ovum 13 while being captured. In addition, since the suction path 17 for sucking the conveyance medium from the capture gap 33 is provided, the ovum 13 can be captured in the capture gap 33 more reliably.
また、卵子１３の捕捉により後段流路１６において搬送媒体の流れが変化しても、後段流路１６は十分な幅を有しているので卵子１３が離脱することはなく、搬送媒体の流速を細かく制御する必要もない。 Even if the flow of the transport medium changes in the rear flow path 16 due to the capture of the ovum 13, the rear flow path 16 has a sufficient width so that the ovum 13 does not leave and the flow speed of the transport medium is reduced. There is no need for fine control.
また、卵子１３のサイズや硬さのばらつきがあっても、種々の卵子１３を捕捉ギャップに保持することが可能となり、卵子１３の捕捉による搬送媒体の流量の乱れに対しても安定して卵子１３を保持することができ、ドナー細胞１５の卵子１３への接触も確実に行うことが可能となる。 In addition, even if the size or hardness of the ovum 13 varies, it is possible to hold various ovums 13 in the capture gap, and the ovum is stable against disturbance in the flow rate of the transport medium due to the capture of the ovum 13. 13 can be held, and the donor cell 15 can be reliably brought into contact with the ovum 13.
なお、上記ではドナー搬送流路１４からドナー細胞１５を供給したが、ドナー搬送流路１４を設けることなく、前段流路１２からドナー細胞１５を供給するように構成してもよい。 In the above description, the donor cells 15 are supplied from the donor transport channel 14. However, the donor cells 15 may be supplied from the upstream channel 12 without providing the donor transport channel 14.
また、上記で説明した実施形態では、第１の細胞が分割した卵子であり、第２の細胞がドナー細胞である場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、２つの細胞をカップリングする操作について適用することができる。その場合、第１の細胞及び第２の細胞の大きさに応じて、前段流路１２、ドナー搬送流路１４、媒体注入路１８、後段流路１６、捕捉ギャップ３３等の大きさや幅を変更する必要があることは言うまでもない。 In the embodiment described above, the case where the first cell is an divided egg and the second cell is a donor cell has been described, but the present invention is not limited to this, and two This can be applied to the operation of coupling cells. In that case, the sizes and widths of the front channel 12, the donor transport channel 14, the medium injection channel 18, the rear channel 16, the capture gap 33, and the like are changed according to the size of the first cell and the second cell. It goes without saying that you need to do it.
更に、本実施形態では、マイクロ流路１１の断面形状が矩形の場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、断面が矩形以外の例えば円形であっても差し支えない。 Furthermore, although the case where the cross-sectional shape of the microchannel 11 is rectangular has been described in the present embodiment, the present invention is not limited to this, and the cross-section may be a circle other than a rectangle, for example.
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法は、細胞融合、クローン家畜生産などに有用なので、バイオ産業、畜産業などにおいて利用可能である。 The cell coupling module, cell coupling device and cell coupling method of the present invention are useful for cell fusion, clonal livestock production, and the like, and thus can be used in the bio industry, livestock industry and the like.
１０ 細胞カップリングモジュール
１１ マイクロ流路
１２ 前段流路
１２ａ 緩衝部
１３ 卵子
１４ ドナー搬送流路
１４ａ 緩衝部
１５ ドナー細胞
１６ 後段流路
１６ａ 緩衝部
１７ 吸引路
１７ａ 緩衝部
１８ 媒体注入路
１８ａ 緩衝部
１９ 電極対
１９ａ 電極
１９ｂ 電極
２０ 卵子用送液ポンプ
２２ ドナー用送液ポンプ
２３ 注入用送液ポンプ
２４ コントローラ
２５ 吸引ポンプ
２６ モニタ
２８ 画像センサ
３１ 突起部
３２ 島状部
３３ 捕捉ギャップ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Cell coupling module 11 Micro flow path 12 Pre-stage flow path 12a Buffer part 13 Egg 14 Donor conveyance flow path 14a Buffer part 15 Donor cell 16 Subsequent flow path 16a Buffer part 17 Suction path 17a Buffer part 18 Medium injection path 18a Buffer part 19 Electrode pair 19a Electrode 19b Electrode 20 Oocyte feeding pump 22 Donor feeding pump 23 Infusion feeding pump 24 Controller 25 Suction pump 26 Monitor 28 Image sensor 31 Projection 32 Island-like part 33 Capture gap
Claims (8)
前記搬送媒体とともに前記細胞を搬送する前段流路と、
該前段流路に連続する後段流路と、
該後段流路に交流電界を生じさせるための電極対と、
該後段流路に設けられた誘電体の間隙からなり、前記交流電界の作用により生成する電界により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、
前記後段流路の上流側に接続され、搬送媒体の注入により前記後段流路内に二層流を生じさせて前記細胞を前記捕捉ギャップに近接して流動させる媒体注入路と
を備えたことを特徴とする細胞カップリングモジュール。 A cell coupling module for coupling a plurality of cells in a transport medium in a microchannel,
A pre-stage flow path for transporting the cells together with the transport medium;
A rear-stage channel continuous to the front-stage channel;
An electrode pair for generating an alternating electric field in the downstream channel;
A trapping gap for trapping the cells by an electric field generated by the action of the alternating electric field, comprising a gap between dielectrics provided in the downstream flow path;
A medium injection path that is connected to the upstream side of the rear-stage flow path, and that causes a two-layer flow to be generated in the rear-stage flow path by injecting the transport medium and allows the cells to flow close to the capture gap. Features cell coupling module.
前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。 The cell coupling module according to any one of claims 1 to 4,
A first liquid feed pump for delivering the carrier medium for conveying the cells to the upstream channel;
A cell coupling device, comprising: a second liquid feeding pump that sends the carrier medium to the medium injection path to generate a two-layer flow.
前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプと、
前記吸引路から前記搬送媒体を吸引して細胞を捕捉する吸引ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。 A cell coupling module according to claim 2;
A first liquid feed pump for delivering the carrier medium for conveying the cells to the upstream channel;
A second liquid feed pump for sending the carrier medium to the medium injection path to generate a two-layer flow;
A cell coupling device comprising: a suction pump that sucks the carrier medium from the suction path to capture cells.
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界により前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記電極対による交流電界の発生を止めることにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。 A cell coupling method using the cell coupling module according to any one of claims 1 to 4,
The carrier medium is sent out to the front-stage flow path to carry the first cell of the plurality of cells to the rear-stage flow path, and the carrier medium is sent out from the medium injection path to the inside of the rear-stage flow path. By causing a two-layer flow to occur, the first cell passes through the vicinity of the capture gap, and the first cell is captured in the capture gap by the electric field generated in the capture gap. ,
The carrier medium is sent out to the upstream flow path to transport the second cell of the plurality of cells to the downstream flow path, and the transport medium is sent out from the medium injection path to the inside of the downstream flow path. By causing a two-layer flow in the first cell, the second cell passes through the vicinity of the first cell, and acts on the dielectric that forms the AC electric field capture gap and the first cell. Coupling the second cell to the first cell by an electric field generated by
The cell coupling method, wherein the first and second cells after the coupling are separated from the capture gap and transported by stopping generation of an alternating electric field by the electrode pair.
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界と前記吸引路からの前記前記搬送媒体の吸引とにより、前記捕捉ギャップ近傍を通過する前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記電極対による交流電界の発生を止めるとともに、前記吸引路からの前記前記搬送媒体を送出することにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。 A cell coupling method using the cell coupling module according to claim 2,
The carrier medium is sent out to the upstream flow path to transport the first cell of the plurality of cells to the downstream flow path, and the transport medium is sent out from the medium injection path to the downstream flow path. By causing a two-layer flow, the first cell passes through the vicinity of the capture gap, and the electric field generated in the capture gap and the suction of the transport medium from the suction path Capturing the first cell passing in the vicinity of the capture gap in the capture gap;
The carrier medium is sent out to the upstream flow path to transport the second cell of the plurality of cells to the downstream flow path, and the transport medium is sent out from the medium injection path to the inside of the downstream flow path. By causing a two-layer flow in the first cell, the second cell passes through the vicinity of the first cell, and acts on the dielectric that forms the AC electric field capture gap and the first cell. Coupling the second cell to the first cell by an electric field generated by
The generation of the alternating electric field by the electrode pair is stopped, and the first and second cells after the coupling are separated from the capture gap and transported by sending the transport medium from the suction path. A cell coupling method characterized by comprising:
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| JP2018148809A (en) * | 2017-03-10 | 2018-09-27 | 株式会社日立製作所 | Cytoplasm exchange apparatus |
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| JP5551355B2 (en) | 2014-07-16 |
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