JP4278365B2

JP4278365B2 - Transduced cell production device

Info

Publication number: JP4278365B2
Application number: JP2002339256A
Authority: JP
Inventors: 順佐々木; 幸宏陽奥; 一雄玉虫; 昭夫伊藤
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2002-11-22
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2022-11-22
Also published as: JP2004166653A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ライフサイエンス分野、再生医療およびゲノム創薬に関連する分野において利用される遺伝子導入細胞生産装置に関し、特に、細胞内に外来の遺伝子溶液および薬剤溶液を、微小針を用いて注入し、注入済み細胞を大量に生産することができる遺伝子導入細胞生産装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、再生医療およびゲノム創薬等の分野において、遺伝子および薬剤を導入した細胞を利用する機会が増加している。従来も、研究用途において多くの遺伝子導入技術が用いられているが、研究用途とは異なる、医療用途特有の背景を以下に記す。
（１）細胞の種類および導入物質の種類を問わないこと。
従来の手法では、細胞と導入物質の組合せに制限を受けるものが多かった。研究用途ではこの制約を満たす組合せを探して解決を図っていたが、医療用途では細胞と導入物質の組合せが決まっているため、種類を問わない手法の確立が必要である。
（２）細胞の個別操作が可能であること。
研究用途では、多数の細胞が懸濁した状態でウィルスベクターもしくは薬液を注入することにより遺伝子導入を行う方法が広く取られているが、医療用途では導入後の各細胞を番号付けの上で管理し、注入効果の発現状況を観察する必要がある。これには遺伝子導入段階からの個別細胞操作が必要であり、細胞を群として扱う研究用途の手法をそのまま適用することが困難である。
（３）細胞が大量に供給できること。
再生医療用途では、一度に１０⁵〜１０⁶個の導入細胞が必要と言われている。このため、上記（１）および（２）の要求を満たすためにスループットが低下することはあってはならない。
【０００３】
遺伝子導入の方法としては、従来から以下の技術が知られている。
（１）ベクター法などの生物的手法。
（２）トランスフェクションなどの化学的手法。
（３）電気穿孔法、パーティクルガン、インジェクションなどの物理的手法。
このうち上記（１）、（２）については、分子生物学研究において広く用いられているものの、細胞と導入物質の組合せに制限を受けるため、研究用には使えても再生医療用途には向かない。
上記（３）のうち、電気パルスで細胞膜を破開し、その穴から遺伝子を注入する電気穿孔法（特許文献１，２等参照）や、遺伝子を付着させた微細粒子を加速し、細胞に打ちつけて細胞膜を破開するパーティクルガン（特許文献３，特許文献４等参照）といった方法は、細胞と導入物質の組合せを選ばない方法として知られている。
しかし装置制御が難しく、細胞膜が破開したまま死滅してしまう、もしくは出力を細胞膜に当てることができずに導入ができない細胞が多く出るという欠点があり、導入成功率は数％のオーダにとどまっているという問題がある。
【０００４】
これらに対して、インジェクション法（特許文献５，６，７等参照）は、人工授精に広く使われていることからも分かるように、１００％に近い成功率の高さが特色である。導入は顕微鏡下で行われ、熟練した作業者または分解能の高い制御装置を用いることにより、細胞へのダメージを最低限に抑えるための針先制御が行われていることがその理由である。
細胞と導入物質の組合せを選ばず、かつ成功率が高いインジェクション法は、遺伝子導入方法として最も確実であると考えられる。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１１−１８７７０号公報
【特許文献２】
特表平１１−５０６６３０号公報
【特許文献３】
特開平６−６２８７１号公報
【特許文献４】
特開平９−２４８１８３号公報
【特許文献５】
特開平５−１９２１７１号公報
【特許文献６】
特開平６−３４３４７８号公報
【特許文献７】
特開２０００−２３６５７号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子導入の方法としては、従来から上記技術が知られているが、前記した医療用途特有の要求をすべて満足するものが存在しないことが問題になっている。
上記方法の中で、インジェクション法は医療用途の遺伝子導入方法として最も確実であると考えられると考えられるが、この方法の欠点は、スループットが著しく低いことである。
多くのインジェクション法は、顕微鏡視野下でのシャーレ上の手作業となるために熟練を要することが最大の原因であり、熟練した作業者でも１時間あたり数百個であると言われている。また、遺伝子導入後のシャーレを培養工程に回すために作業者自身が培養装置に運ぶ必要がある。
前記特許文献７に記載される、細胞を１次元ないし２次元のアレイ型に整列してからインジェクションを行う方式についても、インジェクション後に作業者自身が細胞を取出して培養装置に運ばなければならない点では同等である。
【０００７】
このような環境は、基礎研究や人工授精など、必要とする細胞数が少ない環境では有効であるが、再生医療やゲノム創薬などの産業応用には、スループットの点で及ばない。
本発明の装置の適用分野で対象とする細胞は、卵細胞に限定しない細胞すべてである。人工授精においては、卵細胞を１個ずつの単位で扱うが、従来の一般的な細胞に対する遺伝子導入では、ほとんどの手法で細胞を群として扱っている。
一般細胞を対象とした既存のインジェクション方式においても、細胞はシャーレ上に不規則に並んでいるため、導入後の細胞の取扱いは群としての扱いにならざるを得ない。細胞を群として扱うことは、扱う細胞の数が多い場合には手軽であるが、医療用途で想定される、単一細胞について効果発現の有無を観察するなどの用途には向かないという問題があった。
【０００８】
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、本発明の目的は、細胞に遺伝子を導入する装置において、細胞の種類および導入物質の種類を問わないインジェクション方式を採用しながら、インジェクション方式の欠点であるスループットが低いことと、個別操作が不可能であることを克服し、再生医療・ゲノム創薬等の事業に供しうる遺伝子導入細胞生産装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、上記課題を次のようにして解決する。
（１）遺伝子導入細胞生産装置を、図１に示すように、細胞内に遺伝子溶液および薬剤溶液を注入する遺伝子導入装置１と、配管部２ａを介して遺伝子導入装置１の前段に置かれ、細胞懸濁液の搬送が可能な第１の送液装置３ａと、配管部２ｂを介して遺伝子導入装置１の後段に置かれ、導入物質注入後の細胞の搬送が可能な第２の送液装置３ｂと、第２の送液装置３ｂの後段に置かれた分注装置４とから構成する。
上記遺伝子導入装置１に細胞捕捉装置６と、遺伝子導入微小針８を設け、画像処理装置からなる細胞観察装置に装着し、該画像処理装置の出力を制御装置に接続する。
そして、画像処理装置１１からなる細胞観察装置１２で観察し、細胞が接近したことを認識するとともに、細胞の捕捉完了を検出する。
画像処理装置１１から、上位計算機等から構成される制御装置に、細胞を認識したことを送信するとともに、捕捉完了時に捕捉完了信号を送信する。制御装置は細胞を認識したことを受信したとき、細胞捕捉装置に捕捉指令を送信して細胞を捕捉させ、また、細胞の捕捉完了信号を受信したとき、遺伝子導入用微小針による遺伝子導入操作を開始させ、導入完了時に上記細胞捕捉装置に開放指令を送信して細胞への遺伝子導入操作を完了させる。
上記のように、装置を構成する各部分を配管部２ａ，２ｂで接続し、細胞懸濁液を送液装置３ａ，３ｂにて搬送することで、スループットの問題を解決し、注入済細胞を大量に生産することを可能とする。
また、上記構成とすることにより、細胞の個別の取り扱いを可能としながら、人手を要することなく注入済細胞を大量に生産することが可能となる。
さらに、上記第１の送液装置３ａを、送液制御装置１６ａと、第１の送出装置１７ａに充填された細胞懸濁液と第２の送出装置１７ｂに充填された培地を混合する混合部１８ａとから構成し、細胞懸濁液の濃度、および、培地の送液量および液圧を送液制御装置の指令によって変化させることにより、上記混合部から出力される細胞懸濁液の濃度の制御を可能する。
上記のように細胞懸濁液の濃度の制御を可能することにより、微細流路５に細胞を一つずつ順次流すことができ、細胞を一つずつ捕捉して、遺伝子導入用微小針８による細胞の個別操作が可能となる。
また、第２の送液装置３ｂに、送出装置１７ｃと混合器１９ｂを設け、遺伝子導入後の細胞懸濁液を希釈して、細胞１個を含む液滴を生成できる濃度を実現することにより、遺伝子導入後の収納、培養、観察の局面の利便性を図ることができる。
（２）遺伝子導入装置１に、細胞が列をなして流れる微細流路５の側面に設けられた細胞捕捉装置６を設け、細胞捕捉装置６によって捕捉された細胞に対して、微細流路５の側面に有する開口部から、遺伝子導入用微小針８を挿入することにより、細胞内に遺伝子溶液および薬剤溶液を注入する。
上記のように、インジェクション方式の遺伝子導入装置１を微細流路５上に実現し、微細流路５の側面に設けたた細胞捕捉装置６にて細胞を捕捉し、同じく流路側面にある遺伝子導入微小針８を用いて遺伝子導入を実現することで、従来のように顕微鏡視野下でのシャーレ上の手作業を行うことなく、注入済細胞を大量に生産することが可能となる。
（３）上記細胞捕捉装置６による細胞の捕捉は、微細流路の側面に有する開口部を介して微細流路５と接続された吸引装置により流路内部の細胞を吸引したり、微細流路の側面に有する開口部２５を介して微細流路に挿入される捕捉器によって細胞を物理的に押さえたり、あるいは、微細流路の側面に存在する細胞親和性物質によって流路内部の細胞を付着させることにより行うことができる。
これにより、微細流路５を流れてくる細胞を容易に捕捉することができ、細胞の個別操作が可能となる。
（４）上記遺伝子導入装置１の微細流路５を、透明材質によって構成し、画像処理装置１１からなる細胞観察装置１２で微細流路５を観察し、画像処理装置１１で、細胞が接近したことを認識するとともに、細胞の捕捉完了を検出する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施形態である遺伝子導入細胞生産装置の構成例について説明する。
図１は本発明の実施例の遺伝子導入細胞生産装置の構成を示す図である。
図１において、３ａは第１の送液装置であり、送液装置３ａは、細胞懸濁液１４を送出する第１の送出装置１７ａと、培地１５を送出する第２の送出装置１７ｂと、送液制御装置１６ａと、混合部１８ａから構成される。
第１の送液装置に充填された細胞懸濁液１４は、送出装置１７ｂに充填された培地１５と混合部１８ａによって混合され、細胞を個別にインジェクションするために適当な倍率に希釈され、配管部２ａを介して遺伝子導入装置１に送られる。
上記細胞懸濁液および培地の送液量および液圧は送液制御装置１６ａの指令によって変化させることができ、これにより混合部１８ａから出力される細胞懸濁液の濃度が制御される。
【００１１】
上記送出装置１７ａに充填される細胞懸濁液１４の濃度は１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度である。これは継代後、数日間培養した細胞懸濁液の一般的な密度である。
この細胞懸濁液を、送液装置３ａ内の混合部１８ａにて１００倍程度に希釈することによって、１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の懸濁液を得ることができる。
送出装置１７ａ，１７ｂおよびその制御部である送液制御装置１６ａには、公知の液体クロマトグラフィー用微量送液装置を用いることができるが、送液手段はこれに限定しない。
好ましい実施例として、送液装置３ａからの送液量を１μＬ／ｍｉｎ程度とすると、懸濁液濃度から換算すれば、遺伝子導入装置１個当たりの処理能力は１０ｃｅｌｌｓ／ｍｉｎとなる。
【００１２】
１は遺伝子導入装置であり、遺伝子導入装置１は上記配管部２ａと、導入物質注入後の細胞を送出する配管部２ｂに接続された微細流路５と、光源１０ａと対物レンズ１０ｂを備えた画像処理装置１１からなる細胞観察装置１２と、微細流路５を列をなして流れてくる細胞を一つずつ捕捉する細胞捕捉装置６と、捕捉された細胞の細胞膜に穿孔して導入物質の注入を行うための遺伝子導入微小針８とから構成される。上記細胞観察装置１２は、微細流路５を常時観察し、細胞の検出信号を送出するとともに、上記細胞捕捉装置６による細胞の捕捉完了を検出する。
また、上記細胞捕捉装置６を制御する細胞捕捉機構制御装置７と、上記遺伝子導入微小針８を制御する制御装置９と、制御装置７，９および上記細胞観察装置１２に接続された上位計算機１３を備える。
上位計算機１３は、上記細胞観察装置１２から細胞の検出信号が送出されてくると、上記細胞捕捉装置６を制御する制御装置７に細胞捕捉開始の指令を送信し、また、細胞観察装置１２から細胞捕捉完了信号が送信されてくると、上記遺伝子導入微小針８を制御する制御装置９に対して遺伝子導入の開始を指令する。
導入物質が注入された細胞は、微細流路５から配管部２ｂを介して第２の送液装置３ｂに送られる。
【００１３】
遺伝子導入装置１における微細流路５の内径は、該流路５を細胞が列をなして流れる程度の幅であることが望ましく、細胞の外径が１５−２０μｍ程度であることを考慮すると、５０−１００μｍ程度の幅であることが好ましい。
微細流路５は前記した画像処理装置に設けられた光源１０ａと対物レンズ１０ｂからなる顕微鏡視野下に置くことができ、流路中の細胞の動きを観察することができるように透明な部材で形成される。
上記微細流路５への細胞の流入、捕捉の状態、遺伝子導入の状態など、視野内の細胞、細胞捕捉装置６ならびに遺伝子導入微小針８の状態は、画像処理装置１１により検出することができる。
細胞捕捉装置６は例えば図２に示すような構成を有する。図２は図１のＡ部の拡大図であり、細胞捕捉機構制御装置７によって、同図に示すように微細流路内部の液体および細胞２１を吸引し、微細流路５の側面に開口されたφ数μｍ程度の微細穴２４に、同図に示すように細胞２２を捕捉することにより実現される。
上記細胞捕捉装置６による細胞捕捉手段に関しては、後述するように、圧電素子等によって駆動できる捕捉器を接続して機械的に細胞を捕捉したり、細胞親和性物質を用いて捕捉するなど、他の手段であっても良い。
上記遺伝子導入微小針８の先端部の直径は、細胞を穿孔するのに十分な鋭利さを持つことが必要であり、１μｍ程度であることが好ましく、また微小針８が通過する微細穴２３の直径は１０−２０μｍ程度であることが好ましい。
【００１４】
図１の３ｂは第２の送液装置であり、送液装置３ｂは、配管部２ｂを介して送られてくる導入物質注入後の細胞を含む細胞懸濁液を培地１５と混合するための混合部１８ｂと、送出制御装置１６ｃにより制御される培地１５を送出するための送出装置１７ｃとから構成される。
混合部１８ｂにおいて、細胞を個別に取り扱うことができるように適当な倍率に希釈された導入物質注入後の細胞を含む細胞懸濁液は、配管部２ｃを介して分注装置４に送られる。
分注装置４は、上記希釈された導入物質注入後の細胞を含む細胞懸濁液を、個別の細胞毎に、汎用の多穴プレートに分注する。上記分注装置４としては、公知の液体分注装置を用いることができる。
【００１５】
図３は、前記上位計算機、画像処理装置、細胞捕捉装置、遺伝子導入用針制御装置の動作を説明するフローチャートであり、同図を参照しながら、本実施例の遺伝子導入細胞生産装置による遺伝子導入細胞の生成処理について説明する。
細胞懸濁液１４を送出装置１７ａに充填する。粘着細胞の場合は、トリプシン処理によって担体から剥離されているものとする。
充填された細胞懸濁液１４は、該細胞懸濁液とは別に用意され、送出装置１７ｂに充填された培地１５と、混合部１８ａによって混合され、細胞を個別にインジェクションするために適当な倍率に希釈される。
混合部１８ａを通過した細胞懸濁液は、配管部２ａを介して遺伝子導入装置１に送られる。
遺伝子導入装置１に送られた細胞懸濁液は、装置内の微細流路５に入る。微細流路５は、前記したように、細胞観察装置１２による観察が可能なように透明材質で構成される。
【００１６】
細胞観察装置１２は、流路内を常時観察する。視界内に細胞２１が搬送されてくる状態を検出した場合、図３に示すように細胞観察装置１２の上位に位置づけられる上記計算機１３に、細胞の検出情報を送信する。
これを受け取った上位計算機１３は、細胞捕捉機構制御装置７に対して、捕捉開始の指令を送信する。
細胞捕捉機構制御装置７は、上位計算機１３の指令に応じて、細胞捕捉装置６を操作し、図２に示すように、微細穴２４を介して細胞を流路内に捕捉する。
細胞観察装置１２は、流路内を常時観察する。視界内の細胞捕捉装置６付近にて細胞が停止した状態を検出した場合、図３に示すように上位計算機１３に、細胞の捕捉完了情報を送信する。これを受け取った上位計算機１３は、遺伝子導入用微小針制御装置９に対して、遺伝子導入開始の指令を送信する。
遺伝子導入用微小針制御装置９は、上位計算機１３の指令に応じて、遺伝子導入用微小針８を移動し、微細流路壁面にある微小な穴２３（図２参照）を介して、細胞捕捉装置６に捕捉されている細胞２１の細胞膜を穿孔し、導入物質の注入を行う。
なお、導入物質は微小針の内部に充填されていてもよく、また微小針の先端に付着していてもよい。内部に充填されている場合は、遺伝子導入用微小針制御装置９内に有する送液装置によって、遺伝子を導入するのに適当な量だけ注入される。
【００１７】
遺伝子導入用針制御装置９は、遺伝子の導入動作を完了すると、導入終了信号を上位計算機１３に送出する。これに応じて、上記計算機１３は、開放信号を画像処理装置１１、細胞捕捉機構制御装置７に送出し、画像処理装置１１は信号検出動作を終了し、また細胞捕捉機構制御装置７は細胞捕捉装置６を操作し、捕捉されていた細胞を開放する。
以上のようにして細胞に導入物質が注入されると、導入物質注入後の細胞は、微細流路５を通過後、配管部２ｂを介して第２の送液装置３ｂに搬送される。送液装置３ｂの内部では、混合部１８ｂを通過する際に、細胞懸濁液とは別に用意された培地９によって、細胞を個別に取り扱うために適当な倍率に希釈される。
送液装置３より送られた希釈済みの細胞懸濁液は、分注装置４により、汎用の多穴プレートに分注される。これによって、個別細胞の取扱いが可能な形で細胞を収納することができる。
細胞の個別収納後は、必要に応じて、細胞のクローニングおよび導入遺伝子および薬剤の効果発現の確認を行うことができる。
【００１８】
上記では、図２に示す細胞捕捉装置６を用いて、細胞を捕捉する場合について説明したが、細胞の捕捉は、捕捉器等を使用した機械的操作による捕捉や任意の細胞親和性物質による捕捉であってもよい。
図４は、捕捉器により細胞の捕捉する場合の細胞捕捉器装置６の構成例を示す図である。
同図に示すように、開口部２５より挿入される捕捉器２６を設け、微細流路５を流れてくる細胞２１を、上記捕捉器２６を同図の矢印のように移動させて捕捉する。捕捉された細胞２２には、微細流路壁面にある微小な穴２３から挿入される遺伝子導入用微小針８により、導入物質が注入される。
図５は、細胞親和性物質により細胞を捕捉する場合の細胞捕捉器装置６の構成例を示す図である。
同図に示すように、微細流路５に細胞親和性物質２７を設け、微細流露を流れてくる細胞２１の細胞膜を、上記細胞親和性物質２７に付着させて捕捉する。捕捉された細胞２２には、微細流路壁面にある微小な穴２３から挿入される遺伝子導入用微小針８により、導入物質が注入される。
【００１９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、細胞と導入物質の組合せを選ばず、導入の確実性が高いインジェクション方式でありながら、従来のインジェクション方式が不得意とする細胞の大量処理を実現し、かつ細胞の個別の取扱いを可能とする効果が得られる。このため、再生医療およびゲノム創薬等の医療用途の遺伝子導入装置としての適用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例の遺伝子導入細胞生産装置の構成を示す図である。
【図２】陰圧により細胞を捕捉する細胞捕捉装置の構成例を示す図である。
【図３】上位計算機、画像処理装置、細胞捕捉機構制御装置、遺伝子導入微小針制御装置間における情報の送受信の概要を示すフローチャートである。
【図４】捕捉器により細胞を捕捉する細胞捕捉装置の構成例を示す図である。
【図５】細胞親和性物質により細胞を捕捉する細胞捕捉装置の構成例を示す図である。
【符号の説明】
１遺伝子導入装置
２ａ〜２ｃ配管部
３ａ第１の送液装置
３ｂ第２の送液装置
４分注装置
５微細流路
６細胞捕捉装置
７細胞捕捉機構制御装置
８遺伝子導入用微小針
９遺伝子導入用微小針制御装置
１０ａ光源
１０ｂ対物レンズ
１１画像処理装置
１２細胞観察装置
１３上位計算機
１４細胞懸濁液
１５培地
１６ａ，１６ｂ送液制御装置
１７ａ〜１７ｃ送出装置
１８ａ，１８ｂ混合部
２１細胞
２２捕捉された細胞
２３遺伝子導入用微小針用開口部
２４細胞捕捉装置（陰圧式）用開口部
２５細胞捕捉装置（機械式）用開口部
２６捕捉器
２７細胞親和性物質[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene-transferred cell production apparatus used in the fields of life science, regenerative medicine and genomic drug discovery, and in particular, a foreign gene solution and drug solution are injected into cells using a microneedle. The present invention relates to a gene transfer cell production apparatus capable of producing a large amount of injected cells.
[0002]
[Prior art]
In recent years, opportunities for using cells into which genes and drugs have been introduced are increasing in fields such as regenerative medicine and genome drug discovery. Conventionally, many gene transfer techniques have been used in research applications, but the background specific to medical applications, which is different from research applications, is described below.
(1) Regardless of the type of cell and the type of introduced substance.
Many conventional techniques are limited by the combination of cells and introduced substances. In research applications, a search was made for a combination that satisfies this restriction, but in medical applications, the combination of cells and introduced substances has been determined. Therefore, it is necessary to establish a method regardless of the type.
(2) The individual operation of the cell is possible.
In research applications, gene transfer is widely used by injecting a virus vector or drug solution in a state where a large number of cells are suspended. In medical applications, each cell after introduction is managed by numbering. Therefore, it is necessary to observe the appearance of the injection effect. This requires individual cell manipulation from the gene transfer stage, and it is difficult to apply a method for research use that treats cells as a group as it is.
(3) A large amount of cells can be supplied.
In regenerative medicine applications, it is said that 10 ⁵ to 10 ⁶ introduced cells are required at a time. For this reason, the throughput should not decrease in order to satisfy the requirements (1) and (2).
[0003]
Conventionally, the following techniques are known as gene transfer methods.
(1) Biological methods such as vector method.
(2) Chemical methods such as transfection.
(3) Physical methods such as electroporation, particle gun, and injection.
Of these, although (1) and (2) above are widely used in molecular biology research, they are limited by the combination of cells and introduced substances, so they can be used for research but not for regenerative medicine. No.
Among the above (3), the electroporation method (see Patent Documents 1 and 2, etc.) that breaks the cell membrane with an electric pulse and injects the gene from the hole, or accelerates the fine particles to which the gene is attached, A method such as a particle gun (see Patent Document 3, Patent Document 4, etc.) that breaks the cell membrane by striking is known as a method that does not select a combination of cells and introduced substances.
However, it is difficult to control the device, and the cell membrane is killed while being ruptured, or the output cannot be applied to the cell membrane and there are many cells that cannot be introduced, so the success rate of introduction is only on the order of several percent. There is a problem that.
[0004]
On the other hand, the injection method (see Patent Documents 5, 6, 7, etc.) is characterized by a high success rate close to 100%, as can be seen from the fact that it is widely used for artificial insemination. The introduction is performed under a microscope, and the reason is that needle tip control is performed to minimize damage to cells by using a skilled worker or a control device with high resolution.
An injection method with a high success rate regardless of the combination of the cell and the introduced substance is considered to be the most reliable gene transfer method.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 11-18770 [Patent Document 2]
Japanese National Patent Publication No. 11-506630 [Patent Document 3]
JP-A-6-62871 [Patent Document 4]
JP-A-9-248183 [Patent Document 5]
JP-A-5-192171 [Patent Document 6]
JP-A-6-343478 [Patent Document 7]
Japanese Patent Laid-Open No. 2000-23657
[Problems to be solved by the invention]
As a method for gene transfer, the above-mentioned technique has been conventionally known. However, there is a problem that none of the methods satisfying all the requirements specific to medical use described above exists.
Among the above methods, the injection method is considered to be the most reliable gene transfer method for medical use, but the disadvantage of this method is that the throughput is extremely low.
In many injection methods, it is said that skill is necessary for manual operation on a petri dish under a microscope field of view, and even a skilled worker is said to have several hundred pieces per hour. Moreover, in order to send the petri dish after gene introduction to the culture process, it is necessary for the operator himself to carry it to the culture apparatus.
Regarding the method described in Patent Document 7 in which the cells are injected into a one-dimensional or two-dimensional array type and then injected, the operator must take out the cells after injection and transport them to the culture apparatus. It is equivalent.
[0007]
Such an environment is effective in an environment where a small number of cells are required, such as basic research and artificial insemination, but it is not sufficient in terms of throughput for industrial applications such as regenerative medicine and genomic drug discovery.
The target cells in the field of application of the device of the present invention are all cells that are not limited to egg cells. In artificial insemination, egg cells are handled in units of one by one. However, in conventional gene transfer for general cells, cells are handled as a group by almost all methods.
Even in the existing injection method for general cells, since cells are irregularly arranged on a petri dish, handling of cells after introduction must be handled as a group. Handling cells as a group is easy when the number of cells to be handled is large, but it is not suitable for applications such as observing the presence or absence of effect on single cells, which is assumed in medical applications. there were.
[0008]
The present invention has been made in view of the above background, and an object of the present invention is to adopt an injection method while adopting an injection method regardless of the type of cell and the type of substance to be introduced in an apparatus for introducing a gene into a cell. It is to provide a gene-introduced cell production apparatus that can be used for businesses such as regenerative medicine and genome drug discovery, overcoming the low throughput and the inability of individual operations.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In the present invention, the above problems are solved as follows.
(1) As shown in FIG. 1, the gene-introduced cell production device is placed at the front stage of the gene-introducing device 1 via the gene-introducing device 1 for injecting the gene solution and the drug solution into the cells and the piping part 2a, A first liquid delivery device 3a capable of transporting the cell suspension and a second liquid delivery device placed downstream of the gene transfer device 1 via the piping 2b and capable of transporting the cells after the introduction of the introduced substance. It comprises a device 3b and a dispensing device 4 placed at the subsequent stage of the second liquid delivery device 3b.
The gene introduction apparatus 1 is provided with a cell capture device 6 and a gene introduction microneedle 8, and is attached to a cell observation device comprising an image processing device, and the output of the image processing device is connected to a control device.
And it observes with the cell observation apparatus 12 which consists of the image processing apparatus 11, recognizes that the cell approached, and detects the completion of capture of the cell.
The image processing device 11 transmits a recognition of the cell to a control device constituted by a host computer or the like, and transmits a capture completion signal when the capture is completed. When the control device receives the recognition of the cell, it sends a capture command to the cell capture device to capture the cell, and when it receives the cell capture completion signal, it performs the gene introduction operation with the gene introduction microneedle. When the introduction is completed, an opening command is transmitted to the cell capture device to complete the gene introduction operation into the cell.
As described above, each part constituting the apparatus is connected by the piping parts 2a and 2b, and the cell suspension is conveyed by the liquid feeding apparatuses 3a and 3b, thereby solving the problem of throughput and introducing the injected cells. Enables mass production.
In addition, with the above-described configuration, it is possible to produce a large amount of injected cells without requiring manual work while allowing individual handling of cells.
Further, the first liquid delivery device 3a is mixed with the liquid delivery control device 16a, the cell suspension filled in the first delivery device 17a, and the medium filled in the second delivery device 17b. 18a, and by changing the concentration of the cell suspension, and the amount and pressure of the medium fed according to the command of the liquid feeding control device, the concentration of the cell suspension output from the mixing unit Allows control.
By controlling the concentration of the cell suspension as described above, cells can be sequentially flowed into the microchannel 5 one by one, and the cells can be captured one by one by the microneedle 8 for gene introduction. Individual manipulation of cells is possible.
In addition, the second liquid delivery device 3b is provided with a delivery device 17c and a mixer 19b to dilute the cell suspension after gene introduction to achieve a concentration capable of generating a droplet containing one cell. The convenience of storage, culture, and observation after gene introduction can be achieved.
(2) the gene transfer device 1, the cells of the cell capturing apparatus 6 provided provided on the side of the micro channel 5 flows in rows, against cells captured by the cell capturing unit 6, the micro channel 5 The gene solution and the drug solution are injected into the cell by inserting the gene introduction microneedle 8 through the opening on the side surface.
As described above, the injection-type gene introduction device 1 is realized on the microchannel 5, and the cells are captured by the cell trapping device 6 provided on the side surface of the microchannel 5, and the gene on the side surface of the channel is also used. By introducing the gene using the introduction microneedle 8, it becomes possible to produce a large amount of injected cells without manually performing the operation on the petri dish under the microscope field as in the prior art.
(3) Cell capture by the cell trapping device 6 can be performed by sucking cells inside the flow path with a suction device connected to the fine flow path 5 through an opening provided on the side surface of the fine flow path, The cells are physically pressed by a trap inserted into the fine channel through the opening 25 on the side surface of the tube, or the cells inside the channel are attached by a cytophilic substance present on the side surface of the fine channel. Can be performed.
Thereby, the cell which flows through the fine flow path 5 can be captured easily, and the individual operation of the cell becomes possible.
(4) The fine flow path 5 of the gene introduction apparatus 1 is made of a transparent material, and the fine flow path 5 is observed with the cell observation apparatus 12 including the image processing apparatus 11, and the cell approaches with the image processing apparatus 11. And the completion of cell capture is detected.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, a configuration example of a gene transfer cell production apparatus which is a preferred embodiment of the present invention will be described.
FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a gene-introduced cell production apparatus according to an embodiment of the present invention.
In FIG. 1, 3 a is a first liquid delivery device, and the liquid delivery device 3 a includes a first delivery device 17 a for delivering the cell suspension 14, a second delivery device 17 b for delivering the culture medium 15, It is comprised from the liquid feeding control apparatus 16a and the mixing part 18a.
The cell suspension 14 filled in the first liquid feeding device is mixed with the culture medium 15 filled in the feeding device 17b by the mixing unit 18a, diluted to an appropriate magnification for injecting the cells individually, and piping. It is sent to the gene introduction apparatus 1 via the part 2a.
The amount and the fluid pressure of the cell suspension and the medium can be changed according to a command from the fluid feeding control device 16a, thereby controlling the concentration of the cell suspension output from the mixing unit 18a.
[0011]
The concentration of the cell suspension 14 filled in the delivery device 17a is about 10 ⁶ cells / mL. This is the general density of cell suspensions cultured for several days after passage.
By diluting this cell suspension about 100 times with the mixing unit 18a in the liquid delivery device 3a, a suspension of about 10 ⁴ cells / mL can be obtained.
As the delivery devices 17a and 17b and the delivery control device 16a which is a control unit thereof, a known minute delivery device for liquid chromatography can be used, but the delivery means is not limited to this.
As a preferred embodiment, when the amount of liquid fed from the liquid feeding device 3a is about 1 μL / min, the processing capacity per gene introduction device is 10 cells / min when converted from the suspension concentration.
[0012]
Reference numeral 1 denotes a gene introduction device, and the gene introduction device 1 includes the above-described piping portion 2a, a fine channel 5 connected to a piping portion 2b for delivering cells after the introduction of the introduced substance, a light source 10a, and an objective lens 10b. A cell observation device 12 including an image processing device 11, a cell capturing device 6 that captures cells flowing in a row in the fine flow path 5, and a permeation of the introduced substance by perforating the cell membrane of the captured cells. It is composed of a gene introduction microneedle 8 for performing injection. The cell observation device 12 always observes the fine flow path 5 and sends a cell detection signal, and detects completion of cell capture by the cell capture device 6.
Also, a cell capture mechanism control device 7 for controlling the cell capture device 6, a control device 9 for controlling the gene introduction microneedle 8, and a host computer 13 connected to the control devices 7 and 9 and the cell observation device 12. Is provided.
When the cell detection signal is sent from the cell observation device 12, the host computer 13 transmits a cell capture start command to the control device 7 that controls the cell capture device 6, and from the cell observation device 12. When a cell capture completion signal is transmitted, the controller 9 that controls the gene introduction microneedle 8 is instructed to start gene introduction.
The cells into which the introduced substance has been injected are sent from the fine channel 5 to the second liquid delivery device 3b via the pipe portion 2b.
[0013]
The inner diameter of the fine channel 5 in the gene introduction apparatus 1 is desirably a width that allows cells to flow in a row in the channel 5, and considering that the outer diameter of the cell is about 15-20 μm, The width is preferably about 50-100 μm.
The fine channel 5 is a transparent member that can be placed under the microscope visual field composed of the light source 10a and the objective lens 10b provided in the above-described image processing apparatus, so that the movement of cells in the channel can be observed. It is formed.
The image processing device 11 can detect the cells in the field of view, the state of the cell capture device 6 and the gene introduction microneedle 8, such as the flow of cells into the microchannel 5, the state of capture, and the state of gene introduction. .
The cell trapping device 6 has a configuration as shown in FIG. FIG. 2 is an enlarged view of part A of FIG. 1, and the cell trapping mechanism control device 7 sucks the liquid and the cells 21 inside the fine channel as shown in FIG. This is realized by capturing the cells 22 in the fine holes 24 having a diameter of about several μm as shown in FIG.
Regarding the cell trapping means by the cell trapping device 6, as will be described later, a trapping device that can be driven by a piezoelectric element or the like is connected to mechanically trap cells, or using a cell affinity substance, etc. It may be the means.
The diameter of the tip of the gene-introduced microneedle 8 needs to be sharp enough to perforate cells, and is preferably about 1 μm, and the diameter of the microhole 23 through which the microneedle 8 passes. The diameter is preferably about 10-20 μm.
[0014]
1b of FIG. 1 is a 2nd liquid feeding apparatus, and the liquid feeding apparatus 3b is for mixing with the culture medium 15 the cell suspension containing the cell after the injection | pouring substance injection | pouring sent via the piping part 2b. It comprises a mixing unit 18b and a delivery device 17c for delivering the culture medium 15 controlled by the delivery control device 16c.
In the mixing part 18b, the cell suspension containing the cells after the introduction of the introduced substance diluted to an appropriate magnification so that the cells can be handled individually is sent to the dispensing device 4 via the pipe part 2c.
The dispensing device 4 dispenses the cell suspension containing the diluted cells after the introduction of the introduced substance into a general-purpose multi-well plate for each individual cell. As the dispensing device 4, a known liquid dispensing device can be used.
[0015]
FIG. 3 is a flowchart for explaining the operations of the host computer, the image processing device, the cell trapping device, and the gene introduction needle control device. With reference to FIG. 3, the gene introduction by the gene introduction cell production device of the present example. The cell generation process will be described.
The cell suspension 14 is filled into the delivery device 17a. In the case of adherent cells, it is assumed that they are detached from the carrier by trypsin treatment.
The filled cell suspension 14 is prepared separately from the cell suspension, mixed with the medium 15 filled in the delivery device 17b by the mixing unit 18a, and an appropriate magnification for individually injecting the cells. Diluted to
The cell suspension that has passed through the mixing unit 18a is sent to the gene introduction device 1 through the piping unit 2a.
The cell suspension sent to the gene introduction apparatus 1 enters the microchannel 5 in the apparatus. As described above, the microchannel 5 is made of a transparent material so that the cell observation device 12 can observe the microchannel 5.
[0016]
The cell observation device 12 always observes the inside of the flow path. When the state where the cells 21 are conveyed within the field of view is detected, the cell detection information is transmitted to the calculator 13 positioned above the cell observation device 12 as shown in FIG.
Receiving this, the host computer 13 transmits a capture start command to the cell capture mechanism control device 7.
The cell trapping mechanism control device 7 operates the cell trapping device 6 in accordance with a command from the host computer 13 and traps cells in the flow path through the micro holes 24 as shown in FIG.
The cell observation device 12 always observes the inside of the flow path. When a state in which cells are stopped is detected in the vicinity of the cell capturing device 6 in the field of view, cell capture completion information is transmitted to the host computer 13 as shown in FIG. Receiving this, the host computer 13 sends a gene introduction start command to the gene introduction microneedle control device 9.
The gene introduction microneedle control device 9 moves the gene introduction microneedle 8 in response to a command from the host computer 13 and captures the cell via the minute hole 23 (see FIG. 2) in the wall surface of the minute channel. The cell membrane of the cell 21 captured by the device 6 is perforated, and the introduced substance is injected.
The introduction substance may be filled in the microneedles or may be attached to the tip of the microneedles. When the inside is filled, an appropriate amount for injecting the gene is injected by the liquid feeding device provided in the gene introduction microneedle control device 9.
[0017]
When the gene introduction operation is completed, the gene introduction needle control device 9 sends an introduction end signal to the host computer 13. In response to this, the computer 13 sends an open signal to the image processing device 11 and the cell capturing mechanism control device 7, the image processing device 11 ends the signal detection operation, and the cell capturing mechanism control device 7 captures the cell. The device 6 is operated to release the trapped cells.
When the introduction substance is injected into the cells as described above, the cells after the introduction of the introduction substance pass through the fine flow path 5 and are then conveyed to the second liquid delivery device 3b via the pipe portion 2b. Inside the liquid feeding device 3b, when passing through the mixing section 18b, the medium 9 prepared separately from the cell suspension is diluted to an appropriate magnification in order to handle the cells individually.
The diluted cell suspension sent from the liquid delivery device 3 is dispensed by the dispensing device 4 into a general-purpose multi-hole plate. As a result, the cells can be stored in such a form that individual cells can be handled.
After individual storage of the cells, cell cloning and expression of the effect of the transgene and drug can be confirmed as necessary.
[0018]
In the above description, the case where cells are captured using the cell capture device 6 shown in FIG. 2 has been described. Cell capture can be performed by mechanical operation using a capture device or the like, or by any cytophilic substance. It may be.
FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration example of the cell trap device 6 when cells are trapped by the trap.
As shown in the figure, a trap 26 inserted from the opening 25 is provided, and the cells 21 flowing through the microchannel 5 are captured by moving the trap 26 as shown by the arrows in the figure. The introduced substance is injected into the trapped cells 22 by the gene introduction microneedle 8 inserted from the minute hole 23 in the wall surface of the fine channel.
FIG. 5 is a diagram illustrating a configuration example of the cell trap device 6 in the case of capturing cells with a cytophilic substance.
As shown in the figure, a cytophilic substance 27 is provided in the fine flow path 5, and the cell membrane of the cells 21 flowing through the fine dew adheres to the cytophilic substance 27 and is captured. The introduced substance is injected into the trapped cells 22 by the gene introduction microneedle 8 inserted from the minute hole 23 in the wall surface of the fine channel.
[0019]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a combination of cells and introduced substances can be selected, and a high-reliability injection method can be achieved, but a large amount of cells can be processed which is difficult for the conventional injection method. And the effect of enabling individual handling of cells. Therefore, it can be applied as a gene introduction apparatus for medical use such as regenerative medicine and genome drug discovery.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a gene-transferred cell production apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration example of a cell capturing device that captures cells by negative pressure.
FIG. 3 is a flowchart showing an outline of information transmission / reception among a host computer, an image processing device, a cell trapping mechanism control device, and a gene introduction microneedle control device.
FIG. 4 is a diagram showing a configuration example of a cell trapping device that traps cells by a trapping device.
FIG. 5 is a diagram illustrating a configuration example of a cell capturing device that captures cells with a cytophilic substance.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Gene transfer apparatus 2a-2c Piping part 3a 1st liquid supply apparatus 3b 2nd liquid supply apparatus 4 Dispensing apparatus 5 Microchannel 6 Cell capture apparatus 7 Cell capture mechanism control apparatus 8 Microneedle 9 for gene introduction Gene introduction Microneedle control device 10a Light source 10b Objective lens 11 Image processing device 12 Cell observation device 13 Host computer 14 Cell suspension 15 Medium 16a, 16b Liquid feed control device 17a-17c Delivery device 18a, 18b Mixing unit 21 Cell 22 Captured Cell 23 microneedle opening 24 for gene introduction opening 25 for cell trapping device (negative pressure type) opening 26 for cell trapping device (mechanical type) trap 27 cell affinity substance

Claims

A gene transfer cell production device for injecting a gene solution and a drug solution into a cell using a microneedle,
A gene introduction device for injecting a gene solution and a drug solution into cells;
A first liquid delivery device that is placed upstream of the gene transfer device via a piping unit and capable of transporting a cell suspension, and is placed downstream of the gene transfer device via a piping portion to inject an introduced substance. A second liquid delivery device capable of transporting cells later, and a dispensing device placed at the rear stage of the second liquid delivery device,
The gene introduction device comprises a cell capture device and a gene introduction microneedle, and is attached to a cell observation device comprising an image processing device, and the output of the image processing device is connected to a control device,
The image processing device transmits a recognition of the cell to the control device when the cell approaches, and transmits a cell capture completion signal to the control device when the capture is completed.
When the control device receives that the cell has been recognized, it sends a capture command to the cell capture device to capture the cell,
When a cell capture completion signal is received, the gene transfer operation with the gene transfer microneedle is started,
When the introduction is completed, an open command is sent to the cell capture device to complete the gene introduction operation into the cell,
The first liquid feeding device includes a liquid feeding control device, a mixing unit that mixes the cell suspension filled in the first delivery device and the medium filled in the second delivery device,
The concentration of the cell suspension and the concentration and concentration of the cell suspension output from the mixing unit can be controlled by changing the amount and pressure of the medium sent by the command of the liquid feeding controller. A transduced cell production apparatus characterized by the above.

Said gene introduction device comprises a cell capture device provided on a side surface of the microchannel flow cells in a row,
A gene solution and a drug solution are injected into cells by inserting the microneedle for gene introduction into the cells captured by the cell capture device from the opening provided on the side surface of the fine channel. The gene-introduced cell production apparatus according to claim 1.

The cell capture device of the gene introduction device is provided on the side surface of the fine channel,
Aspiration device connected to the microchannel through the opening on the side of the microchannel sucks cells inside the channel, or inserts into the microchannel through the opening on the side of the microchannel The cells are captured by physically pressing the cells with a trapping device, or by attaching the cells inside the channel with a cytophilic substance present on the side surface of the fine channel. The gene-introduced cell production apparatus according to claim 2.

It said gene introduction device comprises a cell capture device provided on a side surface of the micro channel, the microchannels, of claim 1 or claim 3, characterized in that it is constituted by a transparent material Gene Introduced cell production device.