JP2010090093A

JP2010090093A - Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤

Info

Publication number: JP2010090093A
Application number: JP2008264589A
Authority: JP
Inventors: Jun Nojima; 潤野嶋; Enyo Shu; 艶陽周; Hiroyasu Iwahashi; 弘恭岩橋
Original assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2010-04-22
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: JP5860579B2

Abstract

【課題】優れた作用を有し、かつ安全性の高い、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の提供。
【解決手段】ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするＩ型コラーゲン産生促進剤、ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤、ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするインボルクリン産生促進剤、及びノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤である。
【選択図】なし

Description

本発明は、ノニの抽出物を含有するＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤に関する。

皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、皮膚線維芽細胞、及び、これらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、これら皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより、水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
ところが、紫外線（ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ）の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄、過酸化水素との接触等の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、コラーゲン等の細胞外マトリックスの産生量が減少すると共に、架橋による弾力低下を起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。
このように皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少乃至変性が関与していることが知られている。
コラーゲンの中でもＩ型コラーゲンは、最も多く体内に含まれるコラーゲンであり、皮膚の真皮にも多く含まれ、皮膚の強さを生み出す役割を果たしていることが知られている。

また、天然保湿因子（ＮａｔｕｒａｌＭｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇＦａｃｔｏｒｓ；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸，加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが報告されている（非特許文献１参照）。
近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが報告されている（非特許文献２参照）。
従って、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進を通じて、フィラグリンの合成を促進することによって角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
このため、フィラグリン合成促進剤としては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献１参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献２参照）、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進剤の少なくともいずれかとして、Ｃｉｔｒｕｓ属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献３参照）、などが提案されている。

また、表皮は、角化細胞の分裂とその後の分化により、常に新しい角質細胞を作り出すことで、外界からの種々の刺激から皮膚を守る防御機能を有する。特に、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけてインボルクリン等のタンパク質が発現し、酵素トランスグルタミナーゼ−１の作用によって架橋され、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）を形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する。
しかし、様々な要因で表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１或いはインボルクリンの産生量が減少すると、コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられる。
このようなことから、角化細胞の表皮におけるインボルクリンやトランスグルタミナーゼ−１の産生を高め、コーニファイドエンベロープの形成を促進して角化を正常化することによれば、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。

また、ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物は、コラゲナーゼ活性阻害作用（特許文献４参照）、及びグリケーション阻害作用（特許文献５参照）を有することが知られているが、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することは知られていない。

このように、Ｉ型コラーゲン、フィラグリン、インボルクリン、及びトランスグルタミナーゼ−１の産生を促進することのできる物質は、非常に有用であることが考えられる。しかしながら、現在までのところ、前記したような産生促進作用を有し、かつ安全性が高く、そのため、皮膚外用剤、美容用飲食品、研究用試薬などの成分として広く利用が可能な優れた物質は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。

特開２００２−３６３０５４号公報特開２００３−１４６８８６号公報特開２００１−２６１５６８号公報特開２００５−１４５９４５号公報特開２００４−２５０４４５号公報フレグランスジャーナル臨時増刊Ｖｏｌ．１７、ｐ１４−１９、２０００年発行「Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ. Ｒｅｓ．」Ｖｏｌ．２８８、ｐ．４４２−４４６、１９９６年発行

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、第１に、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いＩ型コラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第２に、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第３に、優れたインボルクリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いインボルクリン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第４に、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、かつ安全性の高いトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物が、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするＩ型コラーゲン産生促進剤である。
＜２＞ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤である。
＜３＞ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするインボルクリン産生促進剤である。
＜４＞ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤である。

本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、前記目的を達成することができる。
即ち、本発明によると、第１に、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いＩ型コラーゲン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第２に、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第３に、優れたインボルクリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いインボルクリン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第４に、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、かつ安全性の高いトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することができる。

（Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤）
本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
前記ノニの抽出物が含有する、前記各作用（Ｉ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用）を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記ノニの抽出物がこのような優れた作用を有することは、従来には知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。

前記ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）は、日本名をヤエヤマアオキといい、アカネ科の植物であり、沖縄〜小笠原諸島、台湾〜中国、インドの沿岸部等に分布しており、これらの地域から容易に入手可能である。
抽出原料として使用する前記ノニの部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、花、蕾、果実、果汁、果皮、種子、種皮、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根、根茎、根皮、これらの混合物などが挙げられ、これらの中でも、果実又は果汁が好ましい。
なお、前記果汁は、抽出原料として使用してもよいし、そのまま抽出物として使用してもよい。

抽出原料である前記ノニは、例えば、採取した後に、そのままの状態で又は乾燥後に粗砕機等を用いて粉砕した状態で、圧搾抽出又は溶媒抽出に供することができる。前記乾燥は、例えば、天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記ノニは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、前記ノニの極性溶媒による抽出処理を、効率よく行うことができる。

前記ノニの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。また、前記ノニの抽出物としては、市販品を使用してもよい。なお、前記ノニの抽出物には、前記ノニの抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又は、これらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。

前記抽出に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又は、これらの混合溶媒を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記ノニに含まれるＩ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって、容易に抽出することができる。

前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。

抽出原料である前記ノニから、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する抽出物を抽出するにあたって、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、前記抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜４時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０℃〜９５℃にて１時間〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０℃〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として用いることができる。

抽出により得られる前記ノニの抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られる前記ノニの抽出液は、そのままでもＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、常法を利用することができ、また、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料である前記ノニは特有の匂いと味を有している場合があり、そのため、前記ノニの抽出物に対しては、生理活性の低下を招かない範囲で、脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、例えば皮膚化粧料に添加する場合などには大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。

以上のようにして得られる前記ノニの抽出物は、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、これらの作用に基づき、本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤の有効成分として好適に利用可能なものである。

前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤中の前記ノニの抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、前記ノニの抽出物そのものであってもよい。

また、前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤中に含まれ得る、前記ノニの抽出物以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ノニの抽出物を所望の濃度に希釈等するための、生理食塩液などが挙げられる。
また、前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、前記その他の成分として、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有する、前記ノニの抽出物以外の天然抽出物等を含んでいてもよい。前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

また、前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。

前記Ｉ型コラーゲン産生促進剤は、有効成分として含有されるノニの抽出物の作用により、Ｉ型コラーゲン産生促進作用を発揮する。
前記フィラグリン産生促進剤は、有効成分として含有されるノニの抽出物の作用により、フィラグリン産生促進作用を発揮する。
前記インボルクリン産生促進剤は、有効成分として含有されるノニの抽出物の作用により、インボルクリン産生促進作用を発揮する。
前記トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、有効成分として含有されるノニの抽出物の作用により、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮する。

本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤によると、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用を通じて、例えば、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等を改善し、皮膚の老化を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤は、これらの用途以外にもＩ型コラーゲン産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。

本発明のフィラグリン産生促進剤によると、優れたフィラグリン産生促進作用を通じて、例えば、角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を改善し、皮膚の老化を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。

本発明のインボルクリン産生促進剤によると、優れたインボルクリン産生促進作用を通じて、例えば、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）の形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れ等、様々な皮膚症状を予防・改善することができ、皮膚の老化を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のインボルクリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。

本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤によると、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、例えば、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）の形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れ等、様々な皮膚症状を予防・改善することができ、皮膚の老化を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、これらの用途以外にもトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。

なお、本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サル等）に対して適用することもできる。

本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、優れた作用を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、例えば、皮膚外用剤に配合するのに好適である。ここで、前記皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。

また、本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、優れた作用を有するとともに、経口的に摂取した場合の安全性にも優れているため、例えば、美容用飲食品に配合するのに好適である。ここで、前記美容用飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。

また、本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、優れた作用を有するので、Ｉ型コラーゲン、フィラグリン、インボルクリン、及びトランスグルタミナーゼ−１に関連する疾患の研究のための試薬としても好適に利用可能である。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

（製造例１：ノニ果実抽出物（凍結乾燥品）の製造）
抽出原料としてノニの果実２００ｇより、果汁を圧搾抽出し、ろ過した。ろ液を凍結乾燥機で乾燥して抽出物１２ｇを得た。

（製造例２：ノニ果実５０％エタノール抽出物の製造）
抽出原料としてノニの果実２００ｇを、５０質量％エタノール２，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して抽出物２０ｇを得た。

（実施例１：Ｉ型コラーゲン産生促進作用試験）
前記製造例１のノニの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、Ｉ型コラーゲン産生促進作用を試験した。

ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６穴マイクロプレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各穴に２００μＬ添加し（試料濃度：１００ｐｐｍ又は２５ｐｐｍ）（ｐｐｍ＝μｇ/ｍＬ）で３７℃、５％ＣＯ_２下で３日間培養した後、上清９０μＬをＥＬＩＳＡプレートに移し換え、４℃、一晩でプレートに吸着させた後、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行った。その後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、抗ヒトコラーゲンタイプＩ抗体（ウサギＩｇＧ；ケミコン社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた後、同様の洗浄操作を行い、発色反応を行った。
Ｉ型コラーゲン産生促進率は、標準品を用いて上記ＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成し、試料無添加時のＩ型コラーゲン産生量を１００％として算出した。各試料のＩ型コラーゲン産生促進率（％）を表１に示す。なお、Ｉ型コラーゲン産生促進率の計算方法は以下のとおりである。
Ｉ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時のＩ型コラーゲン量、Ｂは被験試料無添加時のＩ型コラーゲン量を表す。

表１の結果から、ノニの抽出物が、試料濃度１００μｇ／ｍＬの時に有意なＩ型コラーゲン産生促進作用を有することが認められた。

（実施例２：プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用試験）
前記製造例１のノニの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、フィラグリン産生促進作用を試験した。

正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ^２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ_２下で培養し、常法によりにより細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して５％ＣＯ_２下、３７℃で３日間培養した。培養後、培地を０．５質量％ＤＭＳＯに溶解した被験試料（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ）を含む、又は含まない（コントロール）ＫＧＭ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ_２下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。
＜ウエスタンブロッティング＞
１０μｇ／列に調製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（ＨａｒｂｏｒＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（ＷｈｏｌｅＡｂ，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）で１，０００倍に希釈して順次反応させ、ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の発光により、プロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをＫＯＤＡＫ１ＤＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＥＤＡＳ２９０Ｖｅｒｓｉｏｎ３．５にて定量的に測定した。
結果は、被験試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのＮｅｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バンド強度）を合算した値を用いて、被験試料のフィラグリン産生促進作用を評価し、プロフィラグリン・フィラグリン産生促進率（％）を下記式に基づいて算出した。結果を表２に示す。
プロフィラグリン・フィラグリン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは「被験試料添加時のＮｅｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（プロフィラグリン及びフィラグリンの合計値）」を、Ｂは「被験試料無添加時（コントロール）のＮｅｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」を表す。

表２の結果から、ノニの抽出物が、フィラグリン産生促進作用を有することが認められた。

（実施例３：インボルクリン産生促進作用試験）
前記製造例１のノニの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、インボルクリン産生促進作用を試験した。

ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるようにＫＧＭで希釈した後、４８穴プレートに１穴あたり２００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ）を各穴に２００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で４８時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ細胞表面に発現したインボルクリンの量をモノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体（ＳＩＧＭＡ製）を用いたＥＬＩＳＡ法により測定（Ｂｉｏ−ＴｅｃｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製プレートリーダー）した。得られた測定結果から、下記式によりインボルクリン産生促進率（％）を算出した。結果を表３に示す。
インボルクリン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度、Ｂは被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。

表３の結果から、ノニの抽出物が、インボルクリン産生促進作用を有し、また、濃度依存的に有意なインボルクリン産生促進作用を有することが認められた。

（実施例４：トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用試験）
前記製造例１のノニの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を試験した。

ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６穴プレートに１穴当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２日間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ）を各穴に１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したトランスグルタミナーゼ−１の量をモノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ−１抗体（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いたＥＬＩＳＡ法により測定（Ｂｉｏ−ＴｅｃｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製プレートリーダー）した。結果を表４に示す。
トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
トランスグルタミナーゼ−１産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度、Ｂは被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。

表４の結果から、ノニの抽出物が、試料濃度５０μｇ／ｍＬの時に有意なトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することが認められた。

本発明のＩ型コラーゲン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、及びトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、かつ安全性にも優れるので、例えば、皮膚外用剤、美容用飲食品中の成分や、研究用の試薬として好適に利用可能である。

Claims

ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするＩ型コラーゲン産生促進剤。
ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするインボルクリン産生促進剤。
ノニ（Ｍｏｒｉｎｄａｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）の抽出物を含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤。