JP2010085103A - 質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチド - Google Patents

質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチド Download PDF

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Abstract

【課題】生体試料中の代謝酵素のタンパク質絶対量を高感度に一斉定量することが可能なアミノ酸配列からなるペプチドやその使用方法を提供すること。
【解決手段】細胞内タンパク質である代謝酵素を高感度に一斉定量することを可能とする質量分析装置で高感度検出可能なペプチドを選択し、アミノ酸配列を同定する。この定量対象ペプチドと、同じアミノ酸配列を有する安定同位体標識ペプチドとを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する。試料の被定量代謝酵素タンパク質をトリプシンにより断片化して得られるペプチド断片に、安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量代謝酵素タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出し、該面積比から検量線を用いて定量値を算出する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト又は哺乳類における代謝酵素タンパク質を、質量分析装置を用いて一斉に定量するために用いるペプチドやその使用方法に関し、より詳細には、生体試料中の複数のヒト又は哺乳類における代謝酵素タンパク質の絶対量を、質量分析装置を用いて高感度に一斉定量するために用いる、ヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列等からなるペプチドやその使用方法に関する。
ヒトをも含む哺乳類における代謝酵素としては、薬物代謝酵素、ステロイド代謝酵素、アミノ酸代謝酵素、核酸代謝酵素等があるが、なかでも薬物代謝酵素は、薬物を代謝により修飾することによって薬の効き目や毒性発現に関わっている重要な酵素である。かかる代謝酵素にはＣＹＰ（Ｐ−４５０）や、グルクロン酸抱合、硫酸抱合、及び、グルクロナイド抱合酵素などがある。これらの酵素分子は、様々な要因で発現の誘導、抑制がかかり、そのような発現の変動によって薬の効き目や毒性発現が変化する。従って、薬物代謝酵素群の発現プロファイルはどのように薬が代謝されるかを規定するため、薬の開発において非常に重要な情報である。
薬物代謝酵素の発現プロファイルは、ＰＣＲやＤＮＡチップ等を用いてｍＲＮＡレベルで解析を行うことが可能である。しかし、ｍＲＮＡの発現は活性の実態であるタンパク質の発現と必ずしも一致しない。さらに、一つの薬物が複数の代謝酵素で代謝されることが多く、このような場合、ｍＲＮＡ発現では、各代謝酵素の寄与の大きさは解析できない。従って、代謝酵素をタンパク質発現量で解析し、さらにその絶対発現量を求めることによって異なる代謝酵素間の比較を可能にすることが望まれている。
代謝酵素タンパク質を検出する一つの方法に、抗体を用いた方法がある。当該方法では、Western blotによって検出及び定量が可能であるが、特異的抗体を調製することが大変困難であるだけではなく、複数分子のプロファイルを構築することは大変な時間と労力を有する。
一方、近年、質量分析法（mass spectrometry）の進展が目覚しく、種々の生物学材料の検出や測定にこの方法が検討され、利用されてきた。質量分析計には、エレクトロスプレー・イオン化法（ＥＳＩ：electrosprayionization)による質量分析計、液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）をもつ質量分析計、質量分析計を２台結合した、ＭＳ／ＭＳスペクトル（ＭＳ／ＭＳspectrum）又はタンデムマススペクトル（tandem mass spectrum: tandem MS）質量分析計等、種々の機能をもつ質量分析計が開発されており、これらの機能を組み合わせたものが、生物学材料の検出や測定や定量に利用されている（特許文献１〜３）。
本発明者らは質量分析装置を用いて２０種類以上の膜タンパク質の絶対発現量を一斉定量する方法を発明している（特許文献４）。この発明は、標的タンパク質のトリプシン消化ペプチドのうち、高感度ペプチドを選択し、そのペプチドと同一アミノ酸配列を持つ安定同位体標識ペプチドを用いて、トリプシン消化した生体試料中の定量対象ペプチドの絶対発現量を定量することによって標的タンパク質の絶対発現量を求める方法である。従って、標的タンパク質中の高感度のペプチドを選択することが、定量において高い感度、精度、信頼性を達成するために非常に重要である。
しかし、上記特許文献４記載の発明は、細胞膜タンパク質の絶対発現量の定量に関する方法とペプチドのアミノ酸配列に関する発明であり、細胞内のタンパク質である代謝酵素の定量に用いることができるペプチドに関する情報は不明であった。細胞膜と比較して細胞内には膨大なタンパク質が存在することから、細胞内タンパク質である代謝酵素の定量は、より複雑なタンパク質試料中の微量なタンパク質を定量する必要があり、細胞内タンパク質を試料とする代謝酵素の定量のための定量対象ペプチドの選択は、細胞膜タンパク質の定量対象ペプチド選択と比較してより困難が予想されていた。
特開２００４−２８９９３号公報 特開２００４−７７２７６号公報 特表２００４−５３３６１０号公報 国際公開公報ＷＯ０７／０５５１１６号
本発明の課題は、生体試料中の代謝酵素のタンパク質絶対量を高感度に一斉定量することが可能なアミノ酸配列からなるペプチドやその使用方法を提供することにある。
発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、特定のアミノ酸が存在するとペプチドがイオン化しにくく感度が低くなること、これとは異なる特定のアミノ酸が存在すると衝突誘起解離の効率が上がりペプチドがイオン化しやすく感度が高くなることを見出し、それぞれのクライテリアにスコアをつけて総合スコアで複数のペプチドから候補を絞り込むことにより、細胞内タンパク質である代謝酵素を高感度に一斉定量することを可能とする、質量分析装置で高感度検出可能なペプチドを選択し、アミノ酸配列を同定するに至り本発明を完成した。
すなわち本発明は、（１）質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号１〜４１２のいずれかに示されるヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドや、（２）質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号４１３〜６９５のいずれかに示されるマウス代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドや、（３）質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号１〜６９５のいずれかに示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドや、（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドにおいて、ペプチドを構成するアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上を含むことを特徴とする安定同位体標識ペプチドに関する。
また、本発明は、（５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド、及び、前記（４）に記載の安定同位体標識ペプチドを備えた、代謝酵素群の一斉タンパク質定量用キットや、（６）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド、及び、前記（４）に記載の安定同位体標識ペプチドを、代謝酵素群の一斉タンパク質定量用プローブとして使用する方法に関する。
さらに、本発明は、（７）（ａ）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドと前記（４）に記載の安定同位体標識ペプチドとを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する工程；（ｂ）試料の被定量代謝酵素タンパク質をトリプシンにより断片化して得られるペプチド断片に、前記（４）に記載の安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量代謝酵素タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出する工程；（ｃ）該面積比から検量線を用いて定量値を算出する工程；を備えた安定同位体標識ペプチドを用いた液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による代謝酵素群の一斉タンパク質の定量法に関する。
本発明のアミノ酸配列によって構成されるペプチドを用いた質量分析による代謝酵素タンパク質の定量法により、従来法では困難であった代謝酵素タンパク質の定量を、簡便、かつ迅速に、更に、精度よく行うことが可能となる。また、本発明の代謝酵素タンパク質の定量法は、抗体を使用せずに、代謝酵素タンパク質を定量することできるので、従来もっとも時間のかかっていた抗体作製の段階を省略することができ、更に、抗体が作製できない代謝酵素についても定量が可能となって、適用範囲の広い、精度の高い細胞内タンパク質である代謝酵素タンパク質の定量法を提供することができる。従って、本発明を利用した代謝酵素タンパク質の定量法は、薬物の相互作用、個人差、毒性の解明において大きく貢献が期待できるものである。特に、新薬の開発に際しては、新薬候補物質がどのような代謝酵素をどの程度発現を変動させるかは相互作用や毒性を予測する上で非常に重要な意義を有しており、新薬開発における開発促進に多大な貢献が期待できる。
（ヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチド）
本発明のペプチドは、質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、ヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるものである。当該ヒト代謝酵素タンパク質としては、具体的にはＣＹＰ１Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０４７９８）、ＣＹＰ１Ａ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０５１７７）、ＣＹＰ１Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ１６６７８）、ＣＹＰ２Ａ６（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１１５０９）、ＣＹＰ２Ａ７（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２０８５３）、ＣＹＰ２Ａ１３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ１６６９６）、ＣＹＰ２Ｂ６（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２０８１３）、ＣＹＰ２Ｃ８（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１０６３２）、ＣＹＰ２Ｃ９（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１１７１２）、ＣＹＰ２Ｃ１８（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３３２６０）、ＣＹＰ２Ｃ１９（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３３２６１）、ＣＹＰ２Ｄ６（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１０６３５）、ＣＹＰ２Ｅ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０５１８１）、ＣＹＰ２Ｆ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２４９０３）、ＣＹＰ２Ｊ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５１５８９）、ＣＹＰ２Ｒ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６ＶＶＸ０）、ＣＹＰ２Ｓ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９６ＳＱ９）、ＣＹＰ２Ｗ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８ＴＡＶ３）、ＣＹＰ３Ａ４（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０８６８４）、ＣＹＰ３Ａ５（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２０８１５）、ＣＹＰ３Ａ７（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２４４６２）、ＣＹＰ３Ａ４３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＨＢ５５）、ＣＹＰ４Ａ１１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０２９２８）、ＣＹＰ４Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１３５８４）、ＣＹＰ４Ｆ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ７８３２９）、ＣＹＰ４Ｆ３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０８４７７）、ＣＹＰ４Ｆ８（SwissProtアクセッション番号：Ｐ９８１８７）、ＣＹＰ４Ｆ１１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＨＢＩ６）、ＣＹＰ４Ｆ１２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＨＣＳ２）、ＣＹＰ４Ｆ２２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６ＮＴ５５）、ＣＹＰ４Ｖ２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６ＺＷＬ３）、ＣＹＰ４Ｘ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８Ｎ１１８）、ＣＹＰ４Ｚ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８６Ｗ１０）、ＣＹＰ７Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２２６８０）、ＣＹＰ７Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ７５８８１）、ＣＹＰ８Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＵＮＵ６）、ＣＹＰ１１Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１５５３８）、ＣＹＰ１１Ｂ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１９０９９）、ＣＹＰ１７Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０５０９３）、ＣＹＰ１９Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１１５１１）、ＣＹＰ２１Ａ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０８６８６）、ＣＹＰ２４Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０７９７３）、ＣＹＰ２６Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ４３１７４）、ＣＹＰ２６Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＮＲ６３）、ＣＹＰ２６Ｃ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６Ｖ０Ｌ０）、ＣＹＰ２７Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０２３１８）、ＣＹＰ２７Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ１５５２８）、ＣＹＰ２７Ｃ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ４Ｇ０Ｓ４）、ＣＹＰ３９Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＮＹＬ５）、ＣＹＰ４６Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｙ６Ａ２）、ＣＹＰ５１Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ１６８５０）、ＵＧＴ１Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２２３０９）、ＵＧＴ１Ａ３（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３５５０３）、ＵＧＴ１Ａ４（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２２３１０）、ＵＧＴ１Ａ５（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３５５０４）、ＵＧＴ１Ａ６（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１９２２４）、ＵＧＴ１Ａ７（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＨＡＷ７）、ＵＧＴ１Ａ１０（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＨＡＷ８）、ＵＧＴ２Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｙ４Ｘ１）、ＵＧＴ２Ｂ４（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０６１３３）、ＵＧＴ２Ｂ７（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１６６６２）、ＵＧＴ２Ｂ１０（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３６５３７）、ＵＧＴ２Ｂ１１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ７５３１０）、ＵＧＴ２Ｂ１７（SwissProtアクセッション番号：０７５７９５）、ＵＧＴ２Ｂ２８（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＢＹ６４）、ＧＳＴＡ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０８２６３）、ＧＳＴＡ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０９２１０）、ＧＳＴＡ３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ１６７７２）、ＧＳＴＡ４（SwissProtアクセッション番号：Ｏ１５２１７）、ＧＳＴＡ５（SwissProtアクセッション番号：Ｑ７ＲＴＶ２）、ＧＳＴＫ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｙ２Ｑ３）、ＧＳＴＭ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０９４８８）、ＧＳＴＭ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２８１６１）、ＧＳＴＭ３（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２１２６６）、ＧＳＴＭ４（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０３０１３）、ＧＳＴＭ５（SwissProtアクセッション番号：Ｐ４６４３９）、ＧＳＴＰ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０９２１１）、ＧＳＴＴ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３０７１１）、ＧＳＴＴ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３０７１２）、ＭＧＳＴ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１０６２０）、ＭＧＳＴ２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９９７３５）、ＭＧＳＴ３（SwissProtアクセッション番号：Ｏ１４８８０）、ＳＵＬＴ１Ａ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５０２２６）、ＳＵＬＴ１Ａ３（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５０２２４）、ＳＵＬＴ１Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ４３７０４）、ＳＵＬＴ１Ｃ２（SwissProtアクセッション番号：ＰＯ００３３８）、ＳＵＬＴ１Ｃ３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６ＩＭＩ６）、ＳＵＬＴ１Ｃ４（SwissProtアクセッション番号：Ｏ７５８９７）、ＳＵＬＴ１Ｅ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ４９８８８）、ＳＵＬＴ２Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０６５２０）、ＳＵＬＴ２Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ００２０４）、ＳＵＬＴ４Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＢＲ０１）、ＳＵＬＴ４Ｓ６（SwissProtアクセッション番号：Ｑ７ＬＦＸ５）、Ｐ４５０Ｒ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１６４３５）、ＭＧＭＴ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１６４５５）、ｄＣＫ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２７７０７）、ＣＤＡ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３２３２０）、ｃＮ−ＩＡ（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＢＸ１３）、ｃＮ−ＩＢ（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９６Ｐ２６）、ｃＮ−ＩＩ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ４９９０２）、ｃＮ−ＩＩＩ（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｈ０Ｐ０）、ｄＮＴ−１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８ＴＣＤ５）、ｄＮＴ−２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＮＰＢ１）、Ｅｃｔｏ−５’−ＮＴ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２１５８９）、ＲＲＭ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２３９２１）、ＲＲＭ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３１３５０）、ＵＭＰ／ＣＭＰＫ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３００８５）、ｄＣＭＰＤＡ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３２３２１）、ＣＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１７８１２）、ＣＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＮＲＦ８）等を例示することができる。
本発明のペプチドは前記ヒト代謝酵素タンパク質タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、具体的には例えば、ＣＹＰ１Ａ１の部分配列である配列番号１〜５に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ１Ａ２の部分配列である配列番号６〜８に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ１Ｂ１の部分配列である配列番号９〜１４に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１を定量することができる。
同様に、ＣＹＰ２Ａ６の部分配列である配列番号１５〜１７に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ａ７の部分配列である配列番号１８〜１９に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ａ１３の部分配列である配列番号２０〜２１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｂ６の部分配列である配列番号２２〜２５に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｃ８の部分配列である配列番号２６〜２９に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｃ９の部分配列である配列番号３０〜３１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｃ１８の部分配列である配列番号３２〜３４に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｃ１９の部分配列である配列番号３５〜３７に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｄ６の部分配列である配列番号３８〜３９に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｅ１の部分配列である配列番号４０〜４６に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｆ１の部分配列である配列番号４７に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｊ２の部分配列である配列番号４８〜５５に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｒ１の部分配列である配列番号５６〜６３に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｓ１の部分配列である配列番号６４〜７２に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２Ｗ１の部分配列である配列番号７３〜７９に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ２Ｗ１を定量することができる。
同様に、ＣＹＰ３Ａ４の部分配列である配列番号８０〜８１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ３Ａ５の部分配列である配列番号８２〜８４に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ３Ａ７の部分配列である配列番号８５〜８８に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ３Ａ４３の部分配列である配列番号８９〜９６に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３を定量することができる。
同様に、ＣＹＰ４Ａ１１の部分配列である配列番号９７〜１０１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｂ１の部分配列である配列番号１０２〜１１１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｆ２の部分配列である配列番号１１２〜１１４に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｆ３の部分配列である配列番号１１５に示されるアミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｆ８の部分配列である配列番号１１６〜１１９に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｆ１１の部分配列である配列番号１２０〜１２２に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｆ１２の部分配列である配列番号１２３〜１２７に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｆ２２の部分配列である配列番号１２８〜１３６に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｖ２の部分配列である配列番号１３７〜１４４に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｘ１の部分配列である配列番号１４５〜１５４に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ４Ｚ１の部分配列である配列番号１５５〜１６５に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１を定量することができる。
同様に、ＣＹＰ７Ａ１の部分配列である配列番号１６６〜１７１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ７Ｂ１の部分配列である配列番号１７２〜１７８に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ８Ｂ１の部分配列である配列番号１７９〜１８５に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ１１Ｂ１の部分配列である配列番号１８６〜１９１に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ１１Ｂ２の部分配列である配列番号１９２〜１９５に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ１７Ａ１の部分配列である配列番号１９６〜２００に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ１９Ａ１の部分配列である配列番号２０１〜２０７に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１を定量することができる。
同様に、ＣＹＰ２１Ａ２の部分配列である配列番号２０８〜２１０に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２４Ａ１の部分配列である配列番号２１１〜２１６に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２６Ａ１の部分配列である配列番号２１７〜２２６に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２６Ｂ１の部分配列である配列番号２２７〜２３８に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２６Ｃ１の部分配列である配列番号２３９〜２４９に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２７Ａ１の部分配列である配列番号２５０〜２５６に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２７Ｂ１の部分配列である配列番号２５７〜２６５に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ２７Ｃ１の部分配列である配列番号２６６〜２７５に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ｃ１を定量することができる。
同様に、ＣＹＰ３９Ａ１の部分配列である配列番号２７６に示されるアミノ酸配列；ＣＹＰ４６Ａ１の部分配列である配列番号２７７〜２８４に示される各アミノ酸配列；ＣＹＰ５１Ａ１の部分配列である配列番号２８５〜２９６に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＹＰ３９Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ５１Ａ１を定量することができる。
同様に、ＵＧＴ１Ａ１の部分配列である配列番号２９７に示されるアミノ酸配列；ＵＧＴ１Ａ３の部分配列である配列番号２９８〜２９９に示される各アミノ酸配列；ＵＧＴ１Ａ４の部分配列である配列番号３００〜３０１に示される各アミノ酸配列；ＵＧＴ１Ａ５の部分配列である配列番号３０２に示されるアミノ酸配列；ＵＧＴ１Ａ６の部分配列である配列番号３０３〜３０５に示される各アミノ酸配列；ＵＧＴ１Ａ７の部分配列である配列番号３０６〜３０７に示される各アミノ酸配列；ＵＧＴ１Ａ１０の部分配列である配列番号３０８に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ１０を定量することができる。
同様に、ＵＧＴ２Ａ１の部分配列である配列番号３０９〜３１０に示される各アミノ酸配列；ＵＧＴ２Ｂ４の部分配列である配列番号３１１に示されるアミノ酸配列；ＵＧＴ２Ｂ７の部分配列である配列番号３１２〜３１３に示される各アミノ酸配列；ＵＧＴ２Ｂ１０の部分配列である配列番号３１４に示されるアミノ酸配列；ＵＧＴ２Ｂ１１の部分配列である配列番号３１５に示されるアミノ酸配列；ＵＧＴ２Ｂ１７の部分配列である配列番号３１６に示されるアミノ酸配列；ＵＧＴ２Ｂ２８の部分配列である配列番号３１７に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＵＧＴ２Ａ１、ＵＧＴ２Ｂ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１０、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＵＧＴ２Ｂ２８を定量することができる。
同様に、ＧＳＴＡ１の部分配列である配列番号３１８に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＡ２の部分配列である配列番号３１９に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＡ３の部分配列である配列番号３２０に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＡ４の部分配列である配列番号３２１〜３２３に示される各アミノ酸配列；ＧＳＴＡ５の部分配列である配列番号３２４に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＧＳＴＡ１、ＧＳＴＡ２、ＧＳＴＡ３、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＡ５を定量することができる。
同様に、ＧＳＴＫ１の部分配列である配列番号３２５に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＭ１の部分配列である配列番号３２６に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＭ２の部分配列である配列番号３２７〜３２８に示される各アミノ酸配列；ＧＳＴＭ３の部分配列である配列番号３２９に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＭ４の部分配列である配列番号３３０に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＭ５の部分配列である配列番号３３１に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＰ１の部分配列である配列番号３３２に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＴ１の部分配列である配列番号３３３〜３３４に示される各アミノ酸配列；ＧＳＴＴ２の部分配列である配列番号３３５に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ２、ＧＳＴＭ３、ＧＳＴＭ４、ＧＳＴＭ５、ＧＳＴＴ１、ＧＳＴＴ２を定量することができる。
同様に、ＭＧＳＴ１の部分配列である配列番号３３６に示されるアミノ酸配列；ＭＧＳＴ２の部分配列である配列番号３３７に示されるアミノ酸配列；ＭＧＳＴ３の部分配列である配列番号３３８に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＭＧＳＴ１、ＭＧＳＴ２、ＭＧＳＴ３を定量することができる。
同様に、ＳＵＬＴ１Ａ２の部分配列である配列番号３３９に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ１Ａ３の部分配列である配列番号３４０に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ１Ｂ１の部分配列である配列番号３４１に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ１Ｃ２の部分配列である配列番号３４２に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ１Ｃ３の部分配列である配列番号３４３に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ１Ｃ４の部分配列である配列番号３４４に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ１Ｅ１の部分配列である配列番号３４５に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ２Ａ１の部分配列である配列番号３４６に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ２Ｂ１の部分配列である配列番号３４７に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ４Ａ１の部分配列である配列番号３４８に示されるアミノ酸配列；ＳＵＬＴ４Ｓ６の部分配列である配列番号３４９に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＳＵＬＴ１Ａ２、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＵＬＴ１Ｂ１、ＳＵＬＴ１Ｃ２、ＳＵＬＴ１Ｃ３、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＳＵＬＴ４Ｓ６を定量することができる。
同様に、Ｐ４５０Ｒの部分配列である配列番号３５０〜３５９に示される各アミノ酸配列；ＭＧＭＴの部分配列である配列番号３６０〜３６１に示される各アミノ酸配列；ｄＣＫの部分配列である配列番号３６２〜３６３に示される各アミノ酸配列；ＣＤＡの部分配列である配列番号３６４に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＰ４５０Ｒ、ＭＧＭＴ、ｄＣＫ、ＣＤＡを定量することができる。
同様に、ｃＮ−ＩＡの部分配列である配列番号３６５〜３６６に示される各アミノ酸配列；ｃＮ−ＩＢの部分配列である配列番号３６７〜３７４に示される各アミノ酸配列；ｃＮ−ＩＩの部分配列である配列番号３７５に示されるアミノ酸配列；ｃＮ−ＩＩＩの部分配列である配列番号３７６〜３８２に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれ、ｃＮ−ＩＡ、ｃＮ−ＩＢ、ｃＮ−ＩＩ、ｃＮ−ＩＩＩを定量することができる。
同様に、ｄＮＴ−１の部分配列である配列番号３８３に示されるアミノ酸配列；ｄＮＴ−２の部分配列である配列番号３８４〜３８５に示される各アミノ酸配列；Ｅｃｔｏ−５’−ＮＴの部分配列である配列番号３８６〜３８８に示される各アミノ酸配列；ＲＲＭ１の部分配列である配列番号３８９〜３９２に示される各アミノ酸配列；ＲＲＭ２の部分配列である配列番号３９３〜３９４に示される各アミノ酸配列；ＵＭＰ／ＣＭＰＫの部分配列である配列番号３９５に示されるアミノ酸配列；ｄＣＭＰＤＡの部分配列である配列番号３９６に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれ、ｄＮＴ−１、ｄＮＴ−２、Ｅｃｔｏ−５’−ＮＴ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＵＭＰ／ＣＭＰＫ、ｄＣＭＰＤＡを定量することができる。
同様に、ＣＴＰ Ｓｙｎｔｈａｓｅ１の部分配列である配列番号３９７〜４０５に示される各アミノ酸配列；ＣＴＰ Ｓｙｎｔｈａｓｅ２の部分配列である配列番号４０６〜４１２に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれ、ＣＴＰ Ｓｙｎｔｈａｓｅ１、ＣＴＰ Ｓｙｎｔｈａｓｅ２を定量することができる。
（マウス代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチド）
また、本発明のペプチドは配列番号４１３〜６９５記載のマウス代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドである。当該マウス代謝酵素タンパク質としては、具体的にはＣｙｐ１１ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＱＺ８２）、Ｃｙｐ１７ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２７７８６）、Ｃｙｐ１９ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２８６４９）、Ｃｙｐ１ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ００１８４）、Ｃｙｐ１ａ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ００１８６）、Ｃｙｐ２１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ０３９４０）、Ｃｙｐ２４ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４４４１）、Ｃｙｐ２６ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ５５１２７）、Ｃｙｐ２７ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＤＢＧ１）、Ｃｙｐ２７ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ３５０８４）、Ｃｙｐ２ａ４（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１５３９２）、Ｃｙｐ２ａ５（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２０８５２）、Ｃｙｐ２ｂ１９（SwissProtアクセッション番号：Ｏ５５０７１）、Ｃｙｐ２ｃ２９（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４４５８）、Ｃｙｐ２ｃ３９（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５６６５６）、Ｃｙｐ２ｃ７０（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９１Ｗ６４）、Ｃｙｐ２ｄ１０（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２４４５６）、Ｃｙｐ２ｄ２６（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８ＣＩＭ７）、Ｃｙｐ２ｄ９（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１１７１４）、Ｃｙｐ２ｅ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ０５４２１）、Ｃｙｐ２ｆ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３３２６７）、Ｃｙｐ２ｊ５（SwissProtアクセッション番号：Ｏ５４７４９）、Ｃｙｐ２ｒ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６ＶＶＷ９）、Ｃｙｐ２ｓ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＤＢＸ６）、Ｃｙｐ３９ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＪＫＪ９）、Ｃｙｐ３ａ１１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４４５９）、Ｃｙｐ３ａ１３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４４６４）、Ｃｙｐ３ａ１６（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４４８１）、Ｃｙｐ３ａ２５（SwissProtアクセッション番号：Ｏ０９１５８）、Ｃｙｐ４６ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＷＶＫ８）、Ｃｙｐ４ａ１４（SwissProtアクセッション番号：Ｏ３５７２８）、Ｃｙｐ４ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４４６２）、Ｃｙｐ４ｆ１４（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＥＰ７５）、Ｃｙｐ４ｖ３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＤＢＷ０）、Ｃｙｐ５ａ（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３６４２３）、Ｃｙｐ８ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ８８９６２）、ＧＳＴＯ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ０９１３１）、ＳＴ２Ｂ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ３５４００）、ＳＴ３Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｏ３５４０３）、ＣＨＳＴ３（SwissProtアクセッション番号：Ｏ８８１９９）、ＳＮＡＴ（SwissProtアクセッション番号：Ｏ８８８１６）、ＵＤ２Ｂ５（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１７７１７）、ＧＳＴＰ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１９１５７）、ＧＳＴＭ４（SwissProtアクセッション番号：Ｐ１９６３９）、ＧＳＴＡ４（SwissProtアクセッション番号：Ｐ２４４７２）、ＧＳＴＡ３（SwissProtアクセッション番号：Ｐ３０１１５）、ＧＳＴＭ５（SwissProtアクセッション番号：Ｐ４８７７４）、ＳＴ１Ｅ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ４９８９１）、ＡＲＹ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５０２９４）、ＡＲＹ２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５０２９５）、ＡＲＹ３（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５０２９６）、ＳＴ１Ａ１（SwissProtアクセッション番号：Ｐ５２８４０）、ＵＤ１２（SwissProtアクセッション番号：Ｐ７０６９１）、ＣＧＴ（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６４６７６）、ＵＤ１７Ｃ（SwissProtアクセッション番号：Ｑ６ＺＱＭ８）、ＳＴ１Ｃ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８０ＶＲ３）、ＣＨＳＴ２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ８０ＷＶ３）、ＭＧＳＴ３（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＣＰＵ４）、ＳＴ１Ｃ２（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｄ９３９）、ＧＳＴＫ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＤＣＭ２）、ＣＨＳＴ７（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＥＰ７８）、ＣＨＳＴ１（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＥＱＣ０）、ＣＨＳＴ５（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＱＵＰ４）、ＮＡＴ６（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｒ１２３）、ＣＨＳＴ４（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９Ｒ１Ｉ１）、ＭＡＡＩ（SwissProtアクセッション番号：Ｑ９ＷＶＬ０）等を例示することができる。
本発明のペプチドは上に列挙したタンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、具体的には例えば、Ｃｙｐ１１ａ１の部分配列である配列番号４１３〜４２２に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ１７ａ１の部分配列である配列番号４２３〜４２９に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ１９ａ１の部分配列である配列番号４３０〜４３６に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ１ａ１の部分配列である配列番号４３７〜４３８に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ１ａ２の部分配列である配列番号４３９〜４４３に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣｙｐ１１ａ１、Ｃｙｐ１７ａ１、Ｃｙｐ１９ａ１、Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ１ａ２を定量することができる。
同様に、Ｃｙｐ２１の部分配列である配列番号４４４〜４４８に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２４ａ１の部分配列である配列番号４４９〜４５５に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２６ａ１の部分配列である配列番号４５６〜４６４に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２７ａ１の部分配列である配列番号４６５〜４７０に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２７ｂ１の部分配列である配列番号４７１〜４７８に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣｙｐ２１、Ｃｙｐ２４ａ１、Ｃｙｐ２６ａ１、Ｃｙｐ２７ａ１、Ｃｙｐ２７ｂ１を定量することができる。
同様に、Ｃｙｐ２ａ４の部分配列である配列番号４７９に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ２ａ５の部分配列である配列番号４８０に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｂ１９の部分配列である配列番号４８１〜４８３に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｃ２９の部分配列である配列番号４８４に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｃ３９の部分配列である配列番号４８５〜４８８に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｃ７０の部分配列である配列番号４８９〜４９２に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｄ１０の部分配列である配列番号４９３に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｄ２６の部分配列である配列番号４９４〜４９７に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｄ９の部分配列である配列番号４９８〜４９９に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｅ１の部分配列である配列番号５００に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｆ２の部分配列である配列番号５０１〜５０５に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｊ５の部分配列である配列番号５０６〜５１１に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｒ１の部分配列である配列番号５１２〜５１３に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ２ｓ１の部分配列である配列番号５１４〜５２６に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣｙｐ２ａ４、Ｃｙｐ２ａ５、Ｃｙｐ２ｂ１９、Ｃｙｐ２ｃ２９、Ｃｙｐ２ｃ３９、Ｃｙｐ２ｃ７０、Ｃｙｐ２ｄ１０、Ｃｙｐ２ｄ２６、Ｃｙｐ２ｄ９、Ｃｙｐ２ｅ１、Ｃｙｐ２ｆ２、Ｃｙｐ２ｊ５、Ｃｙｐ２ｒ１、Ｃｙｐ２ｓ１を定量することができる。
同様に、Ｃｙｐ３９ａ１の部分配列である配列番号５２７に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ３ａ１１の部分配列である配列番号５２８に示されるアミノ酸配列；Ｃｙｐ３ａ１３の部分配列である配列番号５２９〜５３４に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ３ａ１６の部分配列である配列番号５３５〜５３６に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ３ａ２５の部分配列である配列番号５３７〜５３８に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてＣｙｐ３９ａ１、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ１３、Ｃｙｐ３ａ１６、Ｃｙｐ３ａ２５を定量することができる。
同様に、Ｃｙｐ４６ａ１の部分配列である配列番号５３９〜５４５に示される各アミノ酸配列からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてＣｙｐ４６ａ１を定量することができる。
同様に、Ｃｙｐ４ａ１４の部分配列である配列番号５４６〜５５０に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ４ｂ１の部分配列である配列番号５５１〜５５４に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ４ｆ１４の部分配列である配列番号５５５〜５５８に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ４ｖ３の部分配列である配列番号５５９〜５６６に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ５ａの部分配列である配列番号５６７〜５７０に示される各アミノ酸配列；Ｃｙｐ８ｂ１の部分配列である配列番号５７１〜５７６に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣｙｐ４ａ１４、Ｃｙｐ４ｂ１、Ｃｙｐ４ｆ１４、Ｃｙｐ４ｖ３、Ｃｙｐ５ａ、Ｃｙｐ８ｂ１を定量することができる。
同様に、ＧＳＴＯ１の部分配列である配列番号５７７〜５７８に示される各アミノ酸配列；ＳＴ２Ｂ１の部分配列である配列番号５７９に示されるアミノ酸配列；ＳＴ３Ａ１の部分配列である配列番号５８０〜５８５に示される各アミノ酸配列；ＣＨＳＴ３の部分配列である配列番号５８６〜５９５に示される各アミノ酸配列；ＳＮＡＴの部分配列である配列番号５９６に示されるアミノ酸配列；ＵＤ２Ｂ５の部分配列である配列番号５９７に示されるアミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＧＳＴＯ１、ＳＴ２Ｂ１、ＳＴ３Ａ１、ＣＨＳＴ３、ＳＮＡＴ、ＵＤ２Ｂ５を定量することができる。
同様に、ＧＳＴＰ１の部分配列である配列番号５９８に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＭ４の部分配列である配列番号５９９に示されるアミノ酸配列；ＧＳＴＡ４の部分配列である配列番号６００〜６０３に示される各アミノ酸配列；ＧＳＴＡ３の部分配列である配列番号６０４〜６０５に示される各アミノ酸配列；ＧＳＴＭ５の部分配列である配列番号６０６〜６０９に示される各アミノ酸配列；ＳＴ１Ｅ１の部分配列である配列番号６１０〜６１３に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ４、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＡ３、ＧＳＴＭ５、ＳＴ１Ｅ１を定量することができる。
同様に、ＡＲＹ１の部分配列である配列番号６１４〜６１５に示される各アミノ酸配列；ＡＲＹ２の部分配列である配列番号６１６〜６２０に示される各アミノ酸配列；ＡＲＹ３の部分配列である配列番号６２１〜６２４に示される各アミノ酸配列；ＳＴ１Ａ１の部分配列である配列番号６２５〜６２６に示される各アミノ酸配列；ＵＤ１２の部分配列である配列番号６２７〜６２９に示される各アミノ酸配列；ＣＧＴの部分配列である配列番号６３０〜６３８に示される各アミノ酸配列；ＵＤ１７Ｃの部分配列である配列番号６３９〜６４１に示される各アミノ酸配列；ＳＴ１Ｃ１の部分配列である配列番号６４２〜６４３に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＡＲＹ１、ＡＲＹ２、ＡＲＹ３、ＳＴ１Ａ１、ＵＤ１２、ＣＧＴ、ＵＤ１７Ｃ、ＳＴ１Ｃ１を定量することができる。
同様に、ＣＨＳＴ２の部分配列である配列番号６４４〜６５０に示される各アミノ酸配列；ＭＧＳＴ３の部分配列である配列番号６５１に示されるアミノ酸配列；ＳＴ１Ｃ２の部分配列である配列番号６５２〜６５５に示される各アミノ酸配列；ＧＳＴＫ１の部分配列である配列番号６５６〜６５９に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＨＳＴ２、ＭＧＳＴ３、ＳＴ１Ｃ２、ＧＳＴＫ１を定量することができる。
同様に、ＣＨＳＴ７の部分配列である配列番号６６０〜６７１に示される各アミノ酸配列；ＣＨＳＴ１の部分配列である配列番号６７２〜６７６に示される各アミノ酸配列；ＣＨＳＴ５の部分配列である配列番号６７７〜６８３に示される各アミノ酸配列；ＮＡＴ６の部分配列である配列番号６８４〜６８６に示される各アミノ酸配列；ＣＨＳＴ４の部分配列である配列番号６８７〜６９１に示される各アミノ酸配列；ＭＡＡＩの部分配列である配列番号６９２〜６９５に示される各アミノ酸配列；からなる各ペプチドも本発明のペプチドであり、当該各ペプチドを用いてそれぞれＣＨＳＴ７、ＣＨＳＴ１、ＣＨＳＴ５、ＮＡＴ６、ＣＨＳＴ４、ＭＡＡＩを定量することができる。
（ホモログ由来ペプチド又はヒトＳＮＰｓ対応ペプチド）
また、本発明のペプチドとして、質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号１〜６９５のいずれかに示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。これらペプチドとして、具体的には、配列番号１〜６９５のいずれかに示されるアミノ酸配列中の１又は２個（好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒト又はマウス以外の哺乳類のホモログ（相同タンパク質）に由来するペプチドや、配列番号１〜４１３のいずれかに示されるヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列中の１又は２個（好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒト代謝酵素タンパク質のＳＮＰｓに対応するペプチドを好適に例示することができる。上記ヒト又はマウス以外の哺乳類としては、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、ヒヒ又はチンパンジー等）、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット等を挙げることができる。
本発明の前記ヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドや、前記ネズミ代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチドや、上記ホモログ由来ペプチド又はヒトＳＮＰｓ対応ペプチド（以下、これら本発明のペプチドを「本件非標識ペプチド」と総称する場合がある。）は、一般的な化学合成法により製造することができる。かかるペプチド合成法として、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法や、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法のいずれも採用することができる。
（安定同位体標識ペプチド）
また、本発明の標識ペプチドとしては、上記の本件非標識ペプチドを構成するアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、及び数は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／Ｍ）で分離可能な質量差を有する限りにおいて特に制限されないが、中でも１３Ｃで６箇所標識されたロイシン（Leucine）を含むことがより好ましい。かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてＦ−ｍｏｃ法（Amblard M, Fehrentz JA, Martinez J, Subra G. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で目的ペプチドを化学合成することができる。また、安定同位体標識ペプチドは、定量対象ペプチドと標識アミノ酸の質量が異なる点以外では化学的に同一でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定において同一の挙動を示すことから、質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量における内部標準ペプチドとして有利に用いることができる。
（定量用キットとプローブとしての使用）
本発明の代謝酵素群の一斉タンパク質定量用キットとしては、本件非標識ペプチドと本発明の安定同位体標識ペプチドとを備えたものであれば特に制限されず、また、本発明の使用方法としては、本件非標識ペプチドと本発明の安定同位体標識ペプチドとを代謝酵素群の一斉タンパク質定量用プローブとして使用する方法であれば特に制限されず、定量対象ペプチドでもある本件非標識ペプチドは、定量用の検量線作成に用いられ、安定同位体標識ペプチドは、定量用の検量線作成及び内部標準ペプチドとして用いられる。
（代謝酵素群の一斉タンパク質の定量）
本発明の安定同位体標識ペプチドを用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる代謝酵素群の一斉タンパク質の定量法としては、（ａ）本件非標識ペプチドと本発明の安定同位体標識ペプチドとを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する工程、（ｂ）試料の被定量代謝酵素タンパク質をトリプシンにより断片化して得られるペプチド断片に、本発明の安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量代謝酵素タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出する工程、（ｃ）該面積比から検量線を用いて定量値を算出する工程の各工程を備えた方法であれば特に制限されず、定量の対象となるタンパク質の供給源としての上記試料として、肝臓等の各種組織、各種組織由来の培養細胞等を例示することができる。また、試料中に含まれる被定量タンパク質が質量分析計の測定限界値以下である場合、高圧窒素ガス充填法等により分画した試料を測定に用いることが好ましい。また、一つの標的代謝酵素タンパク質に対して複数の定量対象ペプチドが同定されている場合、複数の定量対象ペプチドを用い、定量することによってより精度と信頼性の高い代謝酵素群の一斉タンパク質の定量を行うことができる。
さらに、被定量タンパク質とそのサブタイプが極めて似たアミノ酸配列を有する場合には、それらに共通のペプチドの定量値と、一方に特異的なペプチドの定量値の差を求めることにより、被定量タンパク質を定量することもできる。例えば、代謝タンパク質ＣＹＰ３Ａ４の定量値は、（ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５に共通のペプチドの定量値）−（ＣＹＰ３Ａ５特異的なペプチドの定量値）により求めることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたペプチド（ＣＹＰ及びＰ４５０Ｒ）の検出）
ヒト代謝酵素ＣＹＰ及びＰ４５０Ｒの部分配列ペプチドである、定量対象ペプチド（非標識ペプチド：ＣＹＰ１Ａ２；ＹＬＰＮＰＡＬＱＲ（配列番号７）、ＣＹＰ２Ａ６；ＧＴＧＧＡＮＩＤＰＴＦＦＬＳＲ（配列番号１５）、ＣＹＰ２Ｂ６；ＧＹＧＶＩＦＡＮＧＮＲ（配列番号２５）、ＣＹＰ２Ｃ８；ＧＮＳＰＩＳＱＲ（配列番号２８）、ＣＹＰ２Ｃ９；ＧＩＦＰＬＡＥＲ（配列番号３０）、ＣＹＰ２Ｃ１８；ＩＡＥＮＦＡＹＩＫ（配列番号３２）、ＣＹＰ２Ｃ１９；ＧＨＦＰＬＡＥＲ（配列番号３５）、ＣＹＰ２Ｄ６；ＤＩＥＶＱＧＦＲ（配列番号３９）、ＣＹＰ２Ｅ１；ＧＩＩＦＮＮＧＰＴＷＫ（配列番号４４）、ＣＹＰ２Ｊ２；ＥＥＮＧＱＰＦＤＰＨＦＫ（配列番号５２）、ＣＹＰ３Ａ４；ＬＱＥＥＩＤＡＶＬＰＮＫ（配列番号８１）、ＣＹＰ３Ａ５；ＤＴＩＮＦＬＳＫ（配列番号８３）、ＣＹＰ３Ａ７；ＦＮＰＬＤＰＦＶＬＳＩＫ（配列番号８５）、ＣＹＰ３Ａ４３；ＹＩＰＦＧＡＧＰＲ（配列番号９１）、ＣＹＰ４Ａ１１；ＩＰＩＰＩＡＲ（配列番号１００）、ＣＹＰ５１Ａ１；ＦＡＹＶＰＦＧＡＧＲ（配列番号２９０）、Ｐ４５０Ｒ；ＦＡＶＦＧＬＧＮＫ（配列番号３５５）、及び合成した安定同位体標識ペプチド［同位体標識ペプチド：ＣＹＰ１Ａ２；ＹＬＰＮＰＡＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＱＲ（配列番号７）、ＣＹＰ２Ａ６；ＧＴＧＧＡＮＩＤＰＴＦＦＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＳＲ（配列番号１５）、ＣＹＰ２Ｂ６；ＧＹＧＶＩＦＡ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＮＧＮＲ（配列番号２５）、ＣＹＰ２Ｃ８；ＧＮＳＰＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＳＱＲ（配列番号２８）、ＣＹＰ２Ｃ９；ＧＩＦＰＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＡＥＲ（配列番号３０）、ＣＹＰ２Ｃ１８；ＩＡＥＮＦＡＹＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｋ（配列番号３２）、ＣＹＰ２Ｃ１９；ＧＨＦＰＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＡＥＲ（配列番号３５）、ＣＹＰ２Ｄ６；ＤＩＥＶＱＧＦ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｒ（配列番号３９）、ＣＹＰ２Ｅ１；ＧＩＩＦＮＮＧＰ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＴＷＫ（配列番号４４）、ＣＹＰ２Ｊ２；ＥＥＮＧＱＰＦＤＰＨＦ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｋ（配列番号５２）、ＣＹＰ３Ａ４；ＬＱＥＥＩＤＡＶＬＰ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＮＫ（配列番号８１）、ＣＹＰ３Ａ５；ＤＴＩＮＦＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＳＫ（配列番号８３）、ＣＹＰ３Ａ７；ＦＮＰＬＤＰＦＶＬＳＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｋ（配列番号８５）、ＣＹＰ３Ａ４３；ＹＩＰＦＧＡＧＰ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｒ（配列番号９１）、ＣＹＰ４Ａ１１；ＩＰＩＰＩＡ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｒ（配列番号１００）、ＣＹＰ５１Ａ１；ＦＡＹＶＰＦＧＡ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＧＲ（配列番号２９０）、Ｐ４５０Ｒ；ＦＡＶＦＧＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＧＮＫ（配列番号３５５）］を用いて、次の条件でｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
１ｆｍｏｌの非標識ペプチドにそれぞれ５０ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。カラムは逆相Ｃ１８ １５０μｍ Ｉ．Ｄ．×４０ｍｍを用い、移動相は０．１％ギ酸と０．１％ギ酸、アセトニトリルとし、３５分間で０．１％ギ酸、アセトニトリル濃度が４５％となるリニアグラジエントで分析を行った。質量分析計はアプライドバイオシステムの４０００Ｑｔｒａｐを用いた。ペプチドは、定量対象ペプチドと標識ペプチドが、同一時間に溶出されることで同定した。結果を図１に示す。
（ヒト肝組織試料におけるＣＹＰ及びＰ４５０Ｒの一斉定量）
ヒト肝臓組織をハサミで細断した後に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２に懸濁した。ガラスホモジナイザーにてホモジナイズし、溶液を８，０００×ｇ，１０分間遠心した。さらに、上清を１００，０００×ｇ，６０分間遠心して粗膜画分を得た。得られた粗膜画分を７Ｍ 塩酸グアニジン、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．５緩衝液中で変性させ、システイン残基のＳＨ基を保護するために、ＤＴＴによる還元処理とIodoacetamideによるカルバミドメチル化処理を行なった。メタノールクロロホルム沈殿法により、脱塩濃縮した。１．２Ｍ Ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに顕濁した後に、タンパク質重量の１／１００量のＴｒｙｐｓｉｎを加え３７℃で１６時間酵素消化してペプチド試料を得た。
得られた粗膜画分ペプチド試料５μｇに、５０ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを加えてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した（図２）。測定後、ＭＳスペクトル面積比（非標識ペプチド／１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチド）を算出し、検量線を用いて定量値を算出した。
（検量線の作成）
選定した定量対象ペプチドを用いて、検量線を作成し直線性を検討した。１ｆｍｏｌ，５ｆｍｏｌ，１０ｆｍｏｌ，５０ｆｍｏｌ，１００ｆｍｏｌの非標識ペプチドに、それぞれ５０ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、同様にｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した、ＭＳスペクトル面積比（非標識ペプチド／１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチド）を算出し、検量線を作成した。
ＣＹＰ及びＰ４５０Ｒ定量結果を表１に示す。
Figure 2010085103
（ＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたペプチド（Ａｒａ−Ｃ代謝酵素）の検出）
ヒトＡｒａ−Ｃ代謝酵素の部分配列ペプチドである、定量対象ペプチド（非標識ペプチド：ｄＣＫ；ＡＱＬＡＳＬＮＧＫ（配列番号３６２）、ＣＤＡ；ＡＶＳＥＧＹＫ（配列番号３６４）、ｃＮ−ＩＡ；ＧＦＬＥＡＬＧＲ（配列番号３６６）、ｃＮ−ＩＢ； ＧＦＬＥＤＬＧＲ（配列番号３６９）、 ｃＮ−ＩＩ；ＶＦＬＡＴＮＳＤＹＫ（配列番号３７５）、ｃＮ−ＩＩＩ；ＧＥＬＩＨＶＦＮＫ（配列番号３７９）、ｄＮＴ−１；ＴＶＶＬＧＤＬＬＩＤＤＫ（配列番号３８３）、Ｅｃｔｏ−５’−ＮＴ；ＶＰＳＹＤＰＬＫ（配列番号３８８）、ＲＲＭ１；ＬＮＳＡＩＩＹＤＲ（配列番号３９０）、ＲＲＭ２；ＥＮＴＰＰＡＬＳＧＴＲ（配列番号３９３）、ＵＭＰ／ＣＭＰＫ；ＦＬＩＤＧＦＰＲ（配列番号３９５）、ｄＣＭＰＤＡ；ＬＩＩＱＡＧＩＫ（配列番号３９６）、ＣＴＰＳ１； ＦＶＧＱＤＶＥＧＥＲ（配列番号４０２）、ＣＴＰＳ２；ＡＤＧＩＬＶＰＧＧＦＧＩＲ（配列番号４０９）)及び合成した安定同位体標識ペプチド［同位体標識ペプチド：ｄＣＫ； ＡＱＬＡＳＬ（１３Ｃ６ ,１５Ｎ）ＮＧＫ（配列番号３６２）、ＣＤＡ； ＡＶ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＳＥＧＹＫ（配列番号３６４）、ｃＮ−ＩＡ；ＧＦＬＥＡＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＧＲ（配列番号３６６）、ｃＮ−ＩＢ；ＧＦＬＥＤＬ（１３Ｃ６,１５Ｎ）ＧＲ（配列番号３６９）、ｃＮ−ＩＩ；ＶＦＬＡ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＴＮＳＤＹＫ（配列番号３７５）、ｃＮ−ＩＩＩ；ＧＥＬＩＨＶＦ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＮＫ（配列番号３７９）、ｄＮＴ−１；ＴＶＶＬＧＤＬＬＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＤＤＫ（配列番号３８３）、Ｅｃｔｏ−５’−ＮＴ；ＶＰＳＹＤＰＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｋ（配列番号３８８）、ＲＲＭ１；ＬＮＳＡＩＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＹＤＲ（配列番号３９０）、ＲＲＭ２；ＥＮＴＰＰＡＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＳＧＴＲ（配列番号３９３）、ＵＭＰ／ＣＭＰＫ；ＦＬＩＤＧＦＰ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｒ（配列番号３９５）、ｄＣＭＰＤＡ；ＬＩＩＱＡＧＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｋ（配列番号３９６）、ＣＴＰＳ１；ＦＶＧＱＤＶ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＥＧＥＲ（配列番号４０２）、ＣＴＰＳ２；ＡＤＧＩＬＶＰＧＧＦＧＩ（１３Ｃ６，１５Ｎ）Ｒ（配列番号４０９）］を用いて、次の条件でｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
１０ｆｍｏｌの非標識ペプチドにそれぞれ５００ｆｍｏlの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。カラムは逆相Ｃ１８ ０．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍを用い、移動相は０．１％ギ酸と０．１％ギ酸、アセトニトリルとし、６０分間で０．１％ギ酸、アセトニトリル濃度が４５％となるリニアグラジエントで分析を行った。質量分析計はアプライドバイオシステムのＡＰＩ５０００を用いた。ペプチドは、定量対象ペプチドと標識ペプチドが同一時間に溶出されることで同定した。結果を図７に示す。
（ヒト培養細胞におけるＡｒａ−Ｃ代謝タンパク質の一斉定量）
１０％ ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地において培養したヒト白血病細胞株Ｋ５６２細胞５．０×１０８個を、ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ法によって細胞破砕した。この溶液を１０，０００×ｇ，１０分間遠心した。さらに、上清を１００，０００×ｇ，６０分間遠心して可溶性画分を得た。得られた可溶性画分を７Ｍ 塩酸グアニジン、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．５緩衝液中で変性させ、システイン残基のＳＨ基を保護するために、ＤＴＴによる還元処理とIodoacetamideによるカルバミドメチル化処理を行なった。 メタノールクロロホルム沈殿法により、脱塩濃縮した。１．２Ｍ Ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに顕濁した後に、タンパク質重量の１／１００量のＴｒｙｐｓｉｎを加え３７度で１６時間酵素消化してペプチド試料を得た。
得られた粗膜画分ペプチド試料 ５０μｇに、５００ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを加えてＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。測定後、ＭＳスペクトル面積比（１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチド）を算出し、検量線を用いて定量値を算出した。
（検量線の作成）
選定した定量対象ペプチドを用いて、検量線を作成した。１ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌ、１０００ｆｍｏｌの非標識ペプチドにそれぞれ５００ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、実施例１と同様にｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した、ＭＳスペクトル面積比（非標識ペプチド／１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチド）を算出し、検量線を作成した。
Ａｒａ−Ｃ代謝酵素定量結果を表２に示す。
Figure 2010085103
［比較例１］
ヒトトランスポーターＥＮＴ２（ＳＬＣ２９Ａ２）の部分配列ペプチドである、定量対象ペプチド（非標識ペプチド：ＥＮＴ２；ＶＡＬＴＬＤＬＤＬＥＫ（配列番号６９６））及び合成した安定同位体標識ペプチド［同位体標識ペプチド：ＥＮＴ２；ＶＡＬＴＬＤＬＤＬ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＥＫ（配列番号６９６）］を用いて次の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行ったが、検出感度が低く、定量することができなかった。
５００ｆｍｏｌの非標識ペプチドにそれぞれ５００ｆｍｏlの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。カラムは逆相Ｃ１８ ０．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍを用い、移動相は０．１％ギ酸と０．１％ギ酸、アセトニトリルとし、６０分間で０．１％ギ酸、アセトニトリル濃度が４５％となるリニアグラジエントで分析を行った。質量分析計はアプライドバイオシステムのＡＰＩ５０００を用いた。ペプチドは、定量対象ペプチドと標識ペプチドが同一時間に溶出されることを同定条件としたが、両者とも感度が低くピークとして確認することができなかった。
［比較例２］
ヒトトランスポーターＢＧＴ１（ＳＬＣ６Ａ１２）の部分配列ペプチドである、定量対象ペプチド（非標識ペプチド：ＢＧＴ１；ＱＥＬＩＡＷＥＫ（配列番号６９７））及び合成した安定同位体標識ペプチド［同位体標識ペプチド：ＢＧＴ１；ＱＥＬＩＡ（１３Ｃ６，１５Ｎ）ＷＥＫ（配列番号６９７）］を用いて、次の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行ったが、逆相カラムに保持されないため検出感度が低く、定量することができなかった。
５００ｆｍｏｌの非標識ペプチドにそれぞれ５００ｆｍｏlの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。カラムは逆相Ｃ１８ ０．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍを用い、移動相は０．１％ギ酸と０．１％ギ酸、アセトニトリルとし、６０分間で０．１％ギ酸、アセトニトリル濃度が４５％となるリニアグラジエントで分析を行った。質量分析計はアプライドバイオシステムのＡＰＩ５０００を用いた。ペプチドは、定量対象ペプチドと標識ペプチドが同一時間に溶出されることを同定条件としたが、定量対象ペプチド、標識ペプチドともにピークは検出されなかった。
１ｆｍｏｌの非標識定量対象ペプチドにそれぞれ５０ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した図である。ＮａｎｏＬＣによって１ｆｍｏｌの選択したペプチド（ＣＹＰ）が検出可能である。 ヒト肝臓のＣＹＰ絶対発現量解析例：ヒト肝臓を解析した際の定量対象ペプチドのピーク（左図、赤）と内部標準としての標識ペプチドのピーク（右図、赤）。両ピークは同じ溶出時間に検出されている。グラフの横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸はIntensity (cps)を示す。 ヒト肝臓のＣＹＰ絶対発現量解析例：ヒト肝臓を解析した際の定量対象ペプチドのピーク（左図、赤）と内部標準としての標識ペプチドのピーク（右図、赤）。両ピークは同じ溶出時間に検出されている。グラフの横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸はIntensity (cps)を示す。 ヒト肝臓のＣＹＰ絶対発現量解析例：ヒト肝臓を解析した際の定量対象ペプチドのピーク（左図、赤）と内部標準としての標識ペプチドのピーク（右図、赤）。両ピークは同じ溶出時間に検出されている。グラフの横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸はIntensity (cps)を示す。 ヒト肝臓のＣＹＰ絶対発現量解析例：各ＣＹＰ分子の検量線である。横軸は定量対象ペプチドの量(ｆｍｏｌ)を示し、縦軸は定量対象ペプチド対標識ペプチドのピークエリア比を示す。チャート中、青丸は合成ペプチドの標準品、緑三角は試料中の定量対象ペプチドをそれぞれ示す。 ヒト肝臓のＣＹＰ絶対発現量解析例：各ＣＹＰ分子の検量線である。横軸は定量対象ペプチドの量(ｆｍｏｌ)を示し、縦軸は定量対象ペプチド対標識ペプチドのピークエリア比を示す。チャート中、青丸は合成ペプチドの標準品、緑三角は試料中の定量対象ペプチドをそれぞれ示す。 １０ｆｍｏｌの非標識定量対象ペプチドにそれぞれ５００ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加し、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した図である。ＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＨＰＬＣによって１０ｆｍｏｌのペプチド（Ａｒａ−Ｃ代謝酵素）が検出可能である。 ヒト白血病細胞のＡｒａ−Ｃ関連代謝酵素絶対発現量解析例：ヒト白血病細胞を解析した際の定量対象ペプチドのピーク（左図、赤）と内部標準としての標識ペプチドのピーク（右図、赤）。両ピークは同じ溶出時間に検出されている。グラフの横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸はIntensity(cps)を示す。 ヒト白血病細胞のＡｒａ−Ｃ関連代謝酵素絶対発現量解析例：ヒト白血病細胞を解析した際の定量対象ペプチドのピーク（左図、赤）と内部標準としての標識ペプチドのピーク（右図、赤）。両ピークは同じ溶出時間に検出されている。グラフの横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸はIntensity(cps)を示す。 ヒト白血病細胞のＡｒａ−Ｃ関連代謝酵素発現量解析例：各Ａｒａ−Ｃ代謝酵素分子の検量線である。横軸は定量対象ペプチドの量(ｆｍｏｌ)を示し、縦軸は定量対象ペプチド対標識ペプチドのピークエリア比を示す。チャート中、青丸は合成ペプチドの標準品、緑三角は試料中の定量対象ペプチドを示す。 ヒト白血病細胞のＡｒａ−Ｃ関連代謝酵素発現量解析例：各Ａｒａ−Ｃ代謝酵素分子の検量線である。横軸は定量対象ペプチドの量(ｆｍｏｌ)を示し、縦軸は定量対象ペプチド対標識ペプチドのピークエリア比を示す。チャート中、青丸は合成ペプチドの標準品、緑三角は試料中の定量対象ペプチドを示す。

Claims (7)

  1. 質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号１〜４１２のいずれかに示されるヒト代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチド。
  2. 質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号４１３〜６９５のいずれかに示されるマウス代謝酵素タンパク質の部分アミノ酸配列からなるペプチド。
  3. 質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチドであって、配列番号１〜６９５のいずれかに示されるアミノ酸配列中の１又は２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
  4. 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドにおいて、ペプチドを構成するアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上を含むことを特徴とする安定同位体標識ペプチド。
  5. 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、及び、請求項４に記載の安定同位体標識ペプチドを備えた、代謝酵素群の一斉タンパク質定量用キット。
  6. 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、及び、請求項４に記載の安定同位体標識ペプチドを、代謝酵素群の一斉タンパク質定量用プローブとして使用する方法。
  7. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えた安定同位体標識ペプチドを用いた液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による代謝酵素群の一斉タンパク質の定量法。
    （ａ）請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドと請求項４に記載の安定同位体標識ペプチドとを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する工程；
    （ｂ）試料の被定量代謝酵素タンパク質をトリプシンにより断片化して得られるペプチド断片に、請求項４に記載の安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量代謝酵素タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出する工程；
    （ｃ）該面積比から検量線を用いて定量値を算出する工程；
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