JP2010077045A - スフィンゴシン１−リン酸の新規トランスポーター分子 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、Ｓ１Ｐを細胞内から細胞外へ移動させる新規トランスポーター分子を提供することを課題とする。また、該Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞を提供することを課題とし、さらには、Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】脊椎動物のＳｐｉｎ２が、Ｓ１Ｐの新規トランスポーター分子として機能する。被検物質と本発明のＳ１Ｐトランスポーター分子と相互作用させ、該トランスポーターの機能を増強または低減させうる物質を検出する、Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法による。前記スクリーニング方法により、Ｓ１Ｐの機能亢進または減弱に起因する疾患、あるいは症状としてＳ１Ｐの機能が亢進または減弱する疾患の改善剤をスクリーニングすることができる。
【選択図】図４

Description

本発明は、スフィンゴシン１−リン酸を細胞内から細胞外へ移動させる新規トランスポーター分子に関する。具体的には、脊椎動物のＳｐｉｎ２からなるスフィンゴシン１−リン酸の新規トランスポーター分子に関する。また、本発明は該スフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子を発現しうる細胞に関し、さらには、スフィンゴシン１−リン酸トランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法に関する。

スフィンゴシン１−リン酸（以下、「Ｓ１Ｐ」という。）は、細胞膜スフィンゴミエリンから生成され、スフィンゴシンの１位の水酸基が、スフィンゴキナーゼによってリン酸化されて細胞外で作用する。セラミド、スフィンゴシンはアポトーシスを引き起こすが、Ｓ１Ｐは逆にアポトーシスを抑制して細胞増殖に働くといわれている。このように、スフィンゴシンとＳ１Ｐは全く別の生理活性を有することから、これらの生体内での量のバランスが、生体内機能のバランスを維持するのに重要であることが考えられる。

Ｓ１Ｐは、細胞膜に存在するＧタンパク質共役受容体であるＳ１Ｐ受容体１（Ｓ１Ｐ_１）−５（Ｓ１Ｐ_５）と相互作用し、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等に作用して、血管内皮細胞の増殖、平滑筋の収縮、細胞の遊走を調節している。特に血栓形成時のＳ１Ｐの機能が注目され、また免疫調節因子としての新たな機能が明らかにされている（非特許文献１）。Ｓ１Ｐとその受容体の血管系、免疫系における生理的重要性は明らかにされつつある。血液中にＳ１Ｐが高濃度に存在することから、血管系におけるＳ１Ｐの重要性が予測される。また、免疫系におけるＳ１Ｐとその受容体の重要性は、臨床評価中の新たな免疫抑制剤（ＦＴＹ７２０、ノバルティスファーマ株式会社）により明らかにされつつある。ＦＴＹ７２０は、生体内において直接作用するのではなく、リン酸化されてＦＴＹ７２０−Ｐとなり、Ｓ１Ｐ_２以外の受容体のアゴニストとして作用するといわれている。このように、Ｓ１Ｐとその受容体の作用については明らかにされつつある。

受容体アゴニストとしての役割が明らかとなりつつあるものの、Ｓ１Ｐの細胞内の作用については、未解明な部分が多い。細胞内で生成されたＳ１Ｐの一部が放出されて受容体に作用すると考えられる。一方、細胞内のＳ１Ｐの作用としては、細胞増殖、アポトーシス抑制、カルシウム動員などが考えられるが、これらの作用はＳ１Ｐ受容体を介する作用と類似しているため、そのシグナル伝達経路の関与など不明な点が多い。

細胞内で生成されたＳ１Ｐがいかなる機構で細胞外に輸送されるのかは明らかになっていない（非特許文献１）。細胞外ＡＢＣトランスポーターに属するＡＢＣＡ１とＡＢＣＣ１が、Ｓ１Ｐトランスポーター活性があると報告されているが（非特許文献２、３）、アッセイ方法の違いにより、Ｓ１Ｐのトランスポーターとして機能するか否かは、まだ十分に解明されているわけではない。このように、Ｓ１Ｐやそのトランスポーターについては、不明な点が多く残されている。
Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 139-150 (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 16394-16399 (2006) Prostaglandins Other Lipid Mediat., 84, 154-162 (2007)

本発明は、Ｓ１Ｐを細胞内から細胞外へ移動させる新規トランスポーター分子を提供することを課題とする。また、本発明は該Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞を提供することを課題とし、さらには、Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ね、ゼブラフィッシュの変異体解析により責任遺伝子の同定および機能解析を行った結果、脊椎動物のＳｐｉｎ２がＳ１Ｐのトランスポーターとして機能しうることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の１）〜４）から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるスＳ１Ｐトランスポーター分子：
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、Ｓ１Ｐのトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から選択される部分アミノ酸配列であって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、Ｓ１Ｐのトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
４）上記３）に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含むアミノ酸配列。
２．前項１に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子をコードするｃＤＮＡを含む、Ｓ１Ｐトランスポーター分子の発現用細胞。
３．さらにスフィンゴシンキナーゼをコードするｃＤＮＡを含む、前項２に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子発現用細胞。
４．被検物質と前項１に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子とを相互作用させ、該トランスポーターの機能を増強または低減させうる物質を検出する、Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法。
５．被検物質と前項１に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子とを相互作用させる方法が、被検物質と前項２または３に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子発現用細胞と接触させることによる、前項４に記載のスクリーニング方法。
６．以下の工程を含む、Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法：
１）前項３に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子発現用細胞に、Ｓ１Ｐトランスポーター分子とスフィンゴシンキナーゼを発現させる工程；
２）上記１）の細胞培養液に標識したスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内に該標識スフィンゴシンを導入し、前記１）の細胞内で発現したスフィンゴシンキナーゼを反応させて、標識Ｓ１Ｐを生成させる工程；
３）さらに、上記２）の細胞培養液に被検物質を加えて培養し、被検物質と細胞内で発現したＳ１Ｐトランスポーター分子とを相互作用させる工程；
４）一定時間培養後に、細胞内外のＳ１Ｐ量を測定する工程。
７．Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストまたはアゴニストが、免疫性疾患あるいは血管系疾患の改善剤である前項４〜６のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
８．Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストまたはアゴニストが、Ｓ１Ｐの機能亢進または減弱に起因する疾患、あるいは症状としてＳ１Ｐの機能が亢進または減弱する疾患の改善剤である前項４〜６のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
９．前項１に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子、または前項２若しくは３に記載のＳ１Ｐトランスポーター分子発現用細胞を含む、Ｓ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング用試薬。

本発明のＳ１Ｐのトランスポーター分子とＳ１Ｐとの相互作用を解析することで、Ｓ１Ｐの機能をより詳しく解明することができ、Ｓ１Ｐの機能亢進、減弱を伴う疾患等の解明に貢献するものと思われる。さらに、本発明のスクリーニング方法により、Ｓ１Ｐの機能亢進または減弱に起因する疾患、あるいは症状としてＳ１Ｐの機能が亢進または減弱する疾患の改善剤を開発することができる。

Ｓ１Ｐは、上記背景技術の欄で説明したように、細胞膜スフィンゴミエリンから生成され、スフィンゴシンの１位の水酸基が、スフィンゴキナーゼによってリン酸化されたものであり、細胞外で作用する。本発明におけるＳ１Ｐのトランスポーター分子とは、スフィンゴ脂質と細胞情報伝達機構の過程において、細胞内で生成したＳ１Ｐを細胞内から細胞外へ輸送する機能を有する分子をいう。

本発明で特定されるＳ１Ｐのトランスポーター分子は、脊椎動物由来Ｓｐｉｎ２、またはその部分、あるいは脊椎動物由来Ｓｐｉｎ２の一部のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは導入されたものであって、Ｓ１Ｐトランスポート機能を有するものであればよい。脊椎動物由来Ｓｐｉｎ２の例として、具体的には、配列表の配列番号１に示されるヒトのＳｐｉｎ２や配列番号２に示されるゼブラフィッシュのＳｐｉｎ２が挙げられる。配列番号１および２に記載のアミノ酸配列は、各々DDJB Accession No.AB441165およびAB441164に登録されている。

本発明で特定されるＳ１Ｐのトランスポーター分子は、具体的には以下の１）〜４）から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成される。
１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列；
２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、Ｓ１Ｐのトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から選択される部分アミノ酸配列であって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、Ｓ１Ｐトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
４）上記３）に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含むアミノ酸配列。

本発明で特定されるＳ１Ｐの他のトランスポーター分子は、以下の５）〜８）から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成されるものであってもよい。
５）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列；
６）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、配列番号２に示すアミノ酸配列の１５３番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、Ｓ１Ｐのトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
７）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列から選択される部分アミノ酸配列であって、配列番号２に示すアミノ酸配列の１５３番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、Ｓ１Ｐのトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
８）上記７）に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列の１５３番目に位置するアルギニンを少なくとも含むアミノ酸配列。

Ｓ１Ｐとその受容体１（Ｓ１Ｐ_１）−５（Ｓ１Ｐ_５）が相互作用することで、血管系および／または免疫系に作用する。Ｓ１Ｐの機能が亢進または減弱することで、生体内でのＳ１Ｐ機能のバランスが崩れ、疾患に結びつく。本発明のＳ１Ｐトランスポーター分子は、Ｓ１Ｐの機能亢進または減弱に影響を及ぼしていることが考えられる。そこで、本発明のＳ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストまたはアゴニストが、Ｓ１Ｐの機能異常、すなわちＳ１Ｐの機能亢進または減弱を制御することで、Ｓ１Ｐの機能亢進若しくは減弱に起因する疾患、または疾患の結果、Ｓ１Ｐの機能亢進若しくは減弱するような疾患を改善することが考えられる。

Ｓ１Ｐの機能亢進若しくは減弱に起因する疾患、または疾患の結果、Ｓ１Ｐの機能亢進若しくは減弱するような疾患として、免疫性疾患や血管系疾患が挙げられる。

免疫性疾患として、いわゆる免疫性疾患の他、免疫機能が作用する疾患全般が挙げられる。具体的には、炎症性疾患、自己免疫疾患や癌関連疾患などが挙げられる。より具体的には、慢性関節リウマチ、乾癬、肺炎症、ネフローゼ症候群、クローン病、大腸炎、慢性下痢、腎線維症、肺線維症、肝線維症、慢性気管支喘息、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺炎、特発性間質性肺炎、過敏性肺臓炎、胸膜炎や固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫などが挙げられる。上記した固形腫の中には、例えば、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、卵胞膜細胞腫、頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、骨肉腫、膵臓癌、尿路癌、甲状腺癌、脳腫瘍などが挙げられる。また、免疫性疾患として、例えば心移植、腎移植、皮膚移植、肝移植、骨髄移植など、各種臓器移植等に伴う拒絶反応も含めることができる。

血管系疾患として、動脈硬化症、閉塞性血栓血管炎、バージャー病、糖尿病性ニュロパチーの末梢動脈疾患、敗血症、血管炎、脳梗塞、心筋梗塞症、静脈瘤、解離性大動脈瘤、狭心症、ＤＩＣ、うっ血性心不全、多臓器不全などが挙げられ、その他異常な血管新生を伴なう疾患（例えば再狭窄、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、後水晶体繊維増殖症、アテローム性動脈硬化症プラークの毛細血管増殖、甲状腺過形成、肺炎症、ネフローゼ症候群）なども血管系疾患に含めることができる。

本発明は、本発明のＳ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞にも及ぶ。前記細胞は、該Ｓ１Ｐトランスポーター分子をコードするｃＤＮＡを含む。具体的には、発現ベクターのプロモーターの下流に前記ｃＤＮＡを有するプラスミドを構築し、発現用ベクターを作製して、宿主細胞に導入することで、Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞を構築することができる。ここで、発現ベクターは特に限定されず、Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現可能なベクターであればよい。具体的には、ＣＭＶプロモーターなどを含むベクターが挙げられ、例えば市販のｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen社）などを利用することができる。Ｓ１Ｐトランスポーター分子発現確認のために、レポータータンパク質との融合タンパク質を発現する発現用ベクターを用いてもよい。
遺伝子の導入方法は特に限定されず、自体公知の方法、または今後開発される方法を適用することができるが、例えば遺伝子導入試薬（Lipofectamine^TM-200試薬, Invitogen社）を用いることができる。
また、宿主細胞についても、特に限定されないが、例えば細菌、酵母、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。後述のＳ１Ｐトランスポーターのアゴニストおよび／またはアンタゴニストのスクリーニングを行うために、細胞を利用する場合には、本発明のＳ１Ｐトランスポーターを発現させることにより細胞外にＳ１Ｐをトランスポート可能にできる細胞であることが必要であり、好適には動物細胞を用いることができ、より具体的には、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞等を用いることができる。

本発明の、Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞は、後述のＳ１Ｐトランスポーターのアゴニストおよび／またはアンタゴニストのスクリーニングを行うために、使用することができる。前記Ｓ１Ｐトランスポーターのアゴニストおよび／またはアンタゴニストのスクリーニング方法に使用するためには、Ｓ１Ｐトランスポーターの機能を確認できる細胞であることが好ましい。Ｓ１Ｐトランスポーターの機能は、例えば細胞内外のＳ１Ｐ量を測定することにより、確認することができる。例えば、細胞外にＳ１Ｐが認められない場合は、Ｓ１Ｐトランスポーターの機能が低いと考えられ、細胞内よりも細胞外にＳ１Ｐが多く認められる場合は、Ｓ１Ｐトランスポーターが機能していると考えられる。

そこで、本発明において、Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞は、さらにスフィンゴシンキナーゼをコードするｃＤＮＡを含んでいてもよい。各々の発現用ベクターは、各タンパク質が別々に発現しうるものであればよく、異なるベクターであってもよいし、１種のベクターに、各々を発現しうる発現カセットを含んでいてもよい。スフィンゴシンキナーゼをコードするｃＤＮＡの配列は、Accession No.NP_079643に開示する配列を参照することができる。

本発明はＳ１Ｐトランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法にも及ぶ。スクリーニング方法としては、候補物質である被検物質と、本発明のトランスポーター分子とを相互作用させ、該トランスポート機能を増強または低減させうる物質を検出することによる。

本発明のスクリーニング方法は、例えば以下の１）〜４）の工程によることができる。
１）Ｓ１Ｐトランスポーター分子発現用細胞に、Ｓ１Ｐトランスポーター分子とスフィンゴシンキナーゼを発現させる工程；
２）上記１）の細胞培養液にスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内に該スフィンゴシンを導入し、前記１）の細胞内で発現したスフィンゴシンキナーゼを反応させて、Ｓ１Ｐを生成させる工程；
３）さらに、上記２）の細胞培養液に被検物質を加えて培養し、被検物質と細胞内で発現したＳ１Ｐトランスポーター分子とを相互作用させる工程；
４）一定時間培養後に、細胞内外のＳ１Ｐ量を測定する工程。

本発明のスクリーニング方法は、より具体的には、以下の１）〜５）の工程によることができる。
１）スフィンゴシンキナーゼおよび本発明のＳ１Ｐトランスポーター分子を発現する細胞を構築する工程。
２）構築した細胞の培養液にスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内にスフィンゴシンを導入する工程。導入したスフィンゴシンは、細胞内のスフィンゴシンキナーゼによりＳ１Ｐとなる。ここで、導入するスフィンゴシンは、後の検出のために標識ラベルしたものであってもよい。
３）上記細胞と被検物質を相互作用させ、一定時間培養後、遠心分離などにより細胞と培養液を分離し、細胞内外のＳ１Ｐを検出する工程。検出方法は、Ｓ１Ｐが検出可能な方法であればよく、特に限定されない。例えば、クロマトグラフィーや質量分析、またはこれらの組み合わせによって検出することができ、あるいは標識スフィンゴシンから生成した標識Ｓ１Ｐであれば、標識を検出することができる。
４）被検物質と細胞を相互作用させない場合の細胞内外のＳ１Ｐ量を対照とし、被検物質と細胞を相互作用させた場合の細胞内外のＳ１Ｐを比較する工程。
５）対照の細胞外Ｓ１Ｐ量に対して、被検物質と細胞を相互作用させた場合の細胞外Ｓ１Ｐが増加した場合に、被検物質はＳ１Ｐトランスポーターアゴニストとし、細胞外Ｓ１Ｐが減少した場合に、被検物質はＳ１Ｐトランスポーターアンタゴニストと判定する工程。

上記のスクリーニング方法において、スフィンゴシンキナーゼおよび本発明のＳ１Ｐトランスポーター分子を発現する細胞は、あらかじめ構築したものを用いてもよい。また、標識ラベルしたスフィンゴシンは、予め標識されたものを用いてもよい。スフィンゴシンの標識方法も特に限定されず、自体公知の標識方法を適用することができる。判定の容易さを考慮すると、放射性物質や蛍光物質で標識することができ、例えば³Hで標識することができる。

より具体的には、以下の方法によりＳ１Ｐトランスポーターのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
１）発現ベクターのプロモーターの下流にスフィンゴシンキナーゼコードするｃＤＮＡを有するプラスミドを構築し、発現用ベクターを作製してＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞に導入し、スフィンゴシンキナーゼ１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ-ＳｐｈＫ）を構築する。さらに本発明のＳ１Ｐトランスポーター分子を発現する発現用ベクターを作製し、ＣＨＯ-ＳｐｈＫに導入する。Ｓ１Ｐトランスポーター分子発現確認のために、レポータータンパク質との融合タンパク質を発現する発現用ベクターを用いてもよい。遺伝子の導入は、例えば遺伝子導入試薬（Lipofectamine^TM-200試薬, Invitogen社）を用いることができる。
２）ＣＨＯ-ＳｐｈＫを６−１６時間程度培養後、培養液を交換し、標識したスフィンゴシンを加える。脂溶性のスフィンゴシンは、細胞内に発現するマウス・スフィンゴシンキナーゼ１によりリン酸化され、標識Ｓ１Ｐに変換される。
３）培養液に被検物質を添加し、ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃、約３０分経過後、各遺伝子を導入したＣＨＯ-ＳｐｈＫについて、培地（上清：Ｓ）および細胞（沈殿：Ｐ）に分離し、抽出された標識Ｓ１Ｐを薄層クロマトグラフィーで展開し、バイオイメージングアナライザーを用いて検出する。
４）被検物質と細胞を相互作用させない場合の細胞内外のＳ１Ｐ量を対照とし、被検物質と細胞を相互作用させた場合の細胞内外のＳ１Ｐを比較する。
５）対照の細胞外Ｓ１Ｐ量に対して、被検物質と細胞を相互作用させた場合の細胞外Ｓ１Ｐが増加した場合に、被検物質はＳ１Ｐトランスポーターアゴニストとし、細胞外Ｓ１Ｐが減少した場合に、被検物質はＳ１Ｐトランスポーターアンタゴニストと判定する。

本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされたＳ１Ｐトランスポーターのアゴニストまたはアンタゴニストは、免疫性疾患または血管系疾患改善剤の有効成分となり得、あるいはＳ１Ｐの機能亢進若しくは減弱に起因する疾患、または症状としてＳ１Ｐの機能が亢進若しくは減弱する疾患改善剤の有効成分として用いることができる。

本発明のスクリーニング方法により得られたＳ１Ｐトランスポーターのアゴニストまたはアンタゴニストを有効成分とする改善剤は、有効成分としてのアゴニストまたはアンタゴニストを、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等とともに製剤化し、製造することができる。製剤用の助剤は、当業者に周知のものを利用することができる。本発明の改善剤は、靜脈内投与、経口投与等、好ましい投与経路を設定して、望ましい治療効果を達成することが期待できる。

本発明は、上記スクリーニングのために使用する試薬にも及ぶ。ここで、スクリーニングのために使用する試薬には、Ｓ１Ｐトランスポーター分子を含む試薬の他、Ｓ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞も試薬とすることができる。さらには、本発明のスクリーニングの別の試薬として、スフィンゴシンを含むスクリーニング用試薬も挙げられ、上述のＳ１Ｐトランスポーター分子を発現しうる細胞とスフィンゴシンを含むスクリーニング用キットも提供することができる。ここで、標識Ｓ１Ｐを検出する場合は、標識ラベルしたスフィンゴシンを試薬とすることができる。

以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。

（実施例１）Ｓｐｉｎ２による形態学的機能
セブラフィッシュについて、野生型ゼブラフィッシュ、Ｓ１Ｐ_２欠損型ゼブラフィッシュおよび変異型Ｓｐｉｎ２保有ゼブラフィッシュ由来の各胚についての形態学的変異を比較した。変異型Ｓｐｉｎ２を保有する突然変異型ゼブラフィッシュは、Development, 123, 1-36 (1996)に記載の方法に従い、化学変異原（ＥＮＵ, N-ethyl N-nitrosourea）の投与によって作製した。第２世代(F2 fish)が成魚となった時に、ペア交配を行い、心臓の形成に異常を示す変異体をスクリーニングし、ｋｏ１５７というアリルを有する変異体、すなわちＳｐｉｎ２変異体胚を得た。Ｓ１Ｐ_２機能阻害胚は、Ｓ１Ｐ_２に対するアンチセンス・モルフォリノ（S1P₂ MO; 15ng）の投与によって作製した。

その結果、野生型ゼブラフィッシュ由来の胚では心臓が１つであるのに対し、Ｓ１Ｐ_２機能阻害胚およびＳｐｉｎ２変異体胚では、２つの心臓が認められた（図１）。このことから、Ｓｐｉｎ２変異体胚では、Ｓ１Ｐ_２機能阻害胚と同様にＳ１Ｐの機能が十分ではなく、その結果、形態学的に異常を認めたものと考えられた。心臓の発生過程の確認は、各胚について、心臓特異的遺伝子cmlc2 (cardiac myosin light chain 2)のプロモーター領域に、単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）を接続したレポーター遺伝子をもつトランスジェニック系統から得られた胚にＳｐｉｎ２およびＳ１Ｐ_２に対するアンチセンス・モルフォリノを投与し、心臓を赤で可視化して観察した。

Ｓｐｉｎ２変異体胚における変異型Ｓｐｉｎ２のｃＤＮＡを、ABI Genetic Analyzer 3130により解析した結果、ゼブラフィッシュＳｐｉｎ２（ｚＳｐｉｎ２）を構成するアミノ酸配列（配列番号２）のうち、第１５３番目のアルギニンがセリンに変異したことが確認された。セブラフィッシュのＳｐｉｎ２の第１５３番目のアミノ酸は、ヒトのＳｐｉｎ２（配列番号１）の第１９９番目のアミノ酸（アルギニン）に対応する（図２参照）。

（実施例２）Ｓｐｉｎ２によるＳ１Ｐトランスポーターとしての機能の確認
以下の工程に従い、ゼブラフィッシュ野生型Ｓｐｉｎ２、ゼブラフィッシュ変異型Ｓｐｉｎ２、ヒト野生型Ｓｐｉｎ１、ヒト野生型Ｓｐｉｎ２、ヒト変異型Ｓｐｉｎ２の各遺伝子を導入したときのＳ１Ｐの細胞外への分泌量を測定した。

ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子を有する発現用ベクター(pcDNA3)のＣＭＶプロモーターの下流にマウス・スフィンゴシンキナーゼ１をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製し、遺伝子導入試薬（Lipofectamine^TM-2000試薬, Invitogen社）によりＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞に導入した。Ｇ４１８に耐性を示す細胞のうち、Ｓ１Ｐ合成活性の高いものを選択し、ＣＨＯ-ＳｐｈＫとして実験に用いた。

ＣＨＯ-ＳｐｈＫに、ゼブラフィッシュ野生型Ｓｐｉｎ２（zSpins2）、ゼブラフィッシュ変異型Ｓｐｉｎ２（zSpins2-R153S）、ヒト野生型Ｓｐｉｎ１（hSpin1）、ヒト野生型Ｓｐｉｎ２（hSpin2）、ヒト変異型Ｓｐｉｎ２（hSpin2-R199S）の各遺伝子を導入した。
上記各Ｓｐｉｎタンパク質と緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を融合タンパク質として発現する哺乳類細胞の発現用ベクターを作製し、遺伝子導入試薬（Lipofectamine^TM-2000試薬, Invitogen社）を用いてＣＨＯ-ＳｐｈＫに導入した。Ｓｐｉｎ関連遺伝子は含まず、ＥＧＦＰを発現する遺伝子のみを導入したＣＨＯ-ＳｐｈＫを対照とした。

前記各遺伝子を導入したＣＨＯ-ＳｐｈＫを６−１６時間培養後、培養液を交換し、[³H]スフィンゴシンを加えた。脂溶性の[³H]スフィンゴシンは、細胞内に発現するマウス・スフィンゴシンキナーゼ１によりリン酸化され、[³H]Ｓ１Ｐに変換される。

ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃３０分経過後、各遺伝子を導入した細胞について、遠心分離により、培地（上清：Ｓ）および細胞（沈殿：Ｐ）に分離し、各々の画分に抽出された[³H]Ｓ１Ｐを薄層クロマトグラフィーで展開した後にバイオイメージングアナライザー (FLA-3000 Bioimaging Analyzer (富士フィルム製))を用いて検出した（図３、４）。

その結果、対照細胞では、細胞外で抽出されたＳ１Ｐはわずかであり、ＣＨＯ細胞内にはＳ１Ｐを細胞内から細胞外へトランスポートする機能を有する物質はほとんど存在しないと考えられた。zSpins2またはhSpin2を導入した系では、細胞外にＳ１Ｐを認めたが、zSpins2-R153S、hSpin1またはhSpin2-R199Sを導入した系では、細胞外に対照と同程度のＳ１Ｐを認めたのみであった。以上の結果、ＣＨＯ細胞にゼブラフィッシュ野生型Ｓｐｉｎ２またはヒト野生型Ｓｐｉｎ２の遺伝子を導入した場合に、細胞外のＳ１Ｐの量が多く認められ、野生型Ｓｐｉｎ２は、Ｓ１Ｐトランスポート機能を有することが確認された。

以上詳述したように、本発明のトランスポーター分子とＳ１Ｐとの相互作用を解析することで、Ｓ１Ｐの機能をより詳しく解明することができ、Ｓ１Ｐの亢進、減弱を伴う疾患等の解明にも貢献するものと思われる。さらに、本発明のスクリーニング方法により、Ｓ１Ｐの機能亢進または減弱に起因する疾患、あるいは症状としてＳ１Ｐの機能亢進または減弱する疾患の改善剤を開発することができる。

Ｓｐｉｎ２のゼブラフィッシュに及ぼす形態学的影響を示す図である。ゼブラフィッシュ変異型Ｓｐｉｎ２を有するゼブラフィッシュまたはＳｐｉｎ２変異体胚では、Ｓ１Ｐ_２欠損型ゼブラフィッシュと同様に２個の心臓を認めた。S1P₂ MO (15ng)またはspin₂ MO (10 ng)を心臓の発生過程を単量体赤色蛍光タンパク質の発現でモニターできるゼブラフィッシュ胚に投与した。（実施例１） ゼブラフィッシュ変異型Ｓｐｉｎ２タンパク質の変異部位を示す図である。Ｓｐｉｎ２は、染色体５番（ＬＧ５）に存在するz9419およびz63525マーカー遺伝子の近傍にマップされた。ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。Ｓｐｉｎ２の１５３番目のアルギニン（Ｒ）がセリン（Ｓ）に変異していた。（実施例１） 各種Ｓｐｉｎ遺伝子導入細胞（ＣＨＯ-ＳｐｈＫ）における細胞内外の[³H]Ｓ１Ｐを、バイオイメージングアナライザーを用いて検出した結果を示す図である。Ｐは、細胞画分を、Ｓは培養液を示す。Ｓｐｈは、スフィンゴシンを、Ｃｅｒは、セラミドを示す。セラミドは、スフィンゴシンの前駆体である。（実施例２） 各種Ｓｐｉｎ遺伝子を導入した細胞（ＣＨＯ-ＳｐｈＫ）における細胞外Ｓ１Ｐ分泌量を示す図である。（実施例２）

Claims (9)

1. 以下の１）〜４）から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子：
   １）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列；
   ２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、スフィンゴシン１−リン酸のトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
   ３）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から選択される部分アミノ酸配列であって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含み、かつ、スフィンゴシン１−リン酸のトランスポート機能を有するアミノ酸配列；
   ４）上記３）に示すアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸が、置換、欠失、付加または導入されており、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９９番目に位置するアルギニンを少なくとも含むアミノ酸配列。
2. 請求項１に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子をコードするｃＤＮＡを含む、スフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子の発現用細胞。
3. さらにスフィンゴシンキナーゼをコードするｃＤＮＡを含む、請求項２に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子発現用細胞。
4. 被検物質と請求項１に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子とを相互作用させ、該トランスポーターの機能を増強または低減させうる物質を検出する、スフィンゴシン１−リン酸トランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法。
5. 被検物質と請求項１に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子とを相互作用させる方法が、被検物質と請求項２または３に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子発現用細胞と接触させることによる、請求項４に記載のスクリーニング方法。
6. 以下の工程を含む、スフィンゴシン１−リン酸トランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング方法：
   １）請求項３に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子発現用細胞に、スフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子とスフィンゴシンキナーゼを発現させる工程；
   ２）上記１）の細胞培養液に標識したスフィンゴシンを加えて培養し、細胞内に該標識スフィンゴシンを導入し、前記１）の細胞内で発現したスフィンゴシンキナーゼを反応させて、標識スフィンゴシン１−リン酸を生成させる工程；
   ３）さらに、上記２）の細胞培養液に被検物質を加えて培養し、被検物質と細胞内で発現したスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子とを相互作用させる工程；
   ４）一定時間培養後に、細胞内外のスフィンゴシン１−リン酸量を測定する工程。
7. スフィンゴシン１−リン酸トランスポーターのアンタゴニストまたはアゴニストが、免疫性疾患あるいは血管系疾患の改善剤である請求項４〜６のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
8. スフィンゴシン１−リン酸トランスポーターのアンタゴニストまたはアゴニストが、スフィンゴシン１−リン酸の機能亢進または減弱に起因する疾患、あるいは症状としてスフィンゴシン１−リン酸の機能が亢進または減弱する疾患の改善剤である請求項４〜６のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
9. 請求項１に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子、または請求項２若しくは３に記載のスフィンゴシン１−リン酸トランスポーター分子発現用細胞を含む、スフィンゴシン１−リン酸トランスポーターのアンタゴニストおよび／またはアゴニストのスクリーニング用試薬。