JP2010004803A - Ｃ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法、およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＨＣＶの感染増殖性を簡便に評価することが可能なＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法、およびその利用を提供する。
【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培養上清中に漏出した前記細胞由来の成分を検出する検出工程を有する。
【選択図】なし
【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培養上清中に漏出した前記細胞由来の成分を検出する検出工程を有する。
【選択図】なし
Description
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法、およびその利用に関するものであり、特に、Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞に由来する成分を指標としたＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法、およびその利用に関するものである。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：Hepatitis C Virus）の感染者は、世界中で約３億人に達するとの報告があり、日本国内においてもＣ型肝炎ウイルスの持続感染者は、２００万人に達すると推定されている。
ＨＣＶの感染者は非常に高い確率で慢性肝炎を発症し、一部の患者においては、慢性肝炎が更に肝硬変、肝癌へと進行する。つまり、ＨＣＶは、重篤な疾患を引き起こす原因ウイルスである。
ＷＨＯによれば毎年３００万人〜４００万人の新規感染者が報告されており、現在その治療方法としては、インターフェロン、および抗ウイルス薬であるリバビリンを併用した治療方法が多用されている。しかしながら、日本ではインターフェロンが効きにくい１ｂタイプのＨＣＶ（ＨＣＶ−１ｂ）の感染者が多いことから、上記治療方法では治療効果が低いという問題点を有している。また、インターフェロンは、患者に対して強い副作用を示すことも明らかになっている。そのため、ＨＣＶの感染拡大の防止およびＨＣＶの撲滅に向けた新規治療薬および新規ワクチンの開発が、急務となっている。
新規治療薬および新規ワクチンの開発には、これら治療薬の候補物質およびワクチンの候補物質の効果を確認するために、ＨＣＶの生活環（例えば、増殖性や感染性など）の全体を再現することが可能な小規模かつ簡便な検査システムを構築することが必要となる。例えば、このようなシステムに上記候補物質を投入してＨＣＶの生活環を阻害することができれば、当該候補物質をＨＣＶ感染症に対する治療薬として用いることができる可能性がある。それ故に、現在まで、ＨＣＶの生活環を再現した検査システムの開発に力が注がれてきた。
例えば、ＨＣＶはヒトまたはチンパンジーの生体にしか感染しないことが知られているが、１９９９年にはＨＣＶのサブゲノムを培養細胞中にて複製増殖させることが可能なＨＣＶサブゲノムレプリコンシステムが報告された（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、当該技術は、ウイルスＲＮＡの複製が出来るのみであり、それが可能な株もごく少数に限られたものであった。
また、２００５年には、脇田らがクローニングしたＪＦＨ−１株を用いることによって、培養細胞を用いたＨＣＶの複製が世界で初めて可能となった（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、上記ＪＦＨ−１株は、ＨＣＶ感染患者の中では極めて稀な劇症肝炎患者から分離された細胞であり、劇症肝炎を発症させるタイプのＨＣＶを複製することはできるが、我が国のＨＣＶ感染患者の多くを占める慢性肝炎患者の血清由来の天然型ＨＣＶを複製することはできなかった。
そこで、本願発明者らは独自にヒト不死化肝細胞を樹立し、中空糸を用いて上記ヒト不死化肝細胞を立体培養することによって、患者血清由来の天然型ＨＣＶの感染増殖を再現することができる技術を開発した（例えば、特許文献１参照）。なお、当該技術を用いれば、ＨＣＶが感染増殖する様子を一ヶ月間以上にわたって継続して観察することができるようになり、それ故に、当該技術を新しい抗ウイルス薬のスクリーニングなどに用いようとする試みがなされている。
上述したような抗ウイルス薬のスクリーニングを行う場合には、ＨＣＶの感染増殖性を評価するための評価方法が必要となる。現在のところ、ＨＣＶの感染増殖性を評価する場合には、培養中の細胞を溶解してＲＮＡを回収した後、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行って細胞内のＨＣＶゲノムのコピー数を定量するか、あるいは、培養上清中からＲＮＡを回収した後、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行って培養上清中に存在するＨＣＶゲノムコピー数を定量する方法が用いられている。
ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６８６１１（公開日：２００８年４月３日）
Science. 285：110-113,1999
脇田隆字ら, ウイルス, 55（2）: pp287-296（2005）
しかしながら、上記従来のＨＣＶの感染増殖性の評価方法は、ＨＣＶの感染増殖性を簡便に評価できないという問題点を有している。
具体的には、上記従来の評価方法では、核酸抽出操作が必要であるため多くの労力と時間がかかる上、核酸（ＲＮＡ）を回収する時点で細胞が失われてしまうため継続して同一の細胞を観察することができないという問題点を有している。
また、多くの薬剤をスクリーニングする場合には、培養する細胞の数（マルチプレートのウェル数）が多くなり、評価すべきサンプルの数が多くなる。また、培養する細胞を経時的に観察する場合には、評価すべきサンプルの数が、更に莫大なものとなる。この場合、上記従来の評価方法では、多大な時間と労力がかかるという問題点を有している。
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染増殖性を簡便に評価することが可能なＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法、およびその利用を提供することにある。
一般的にＨＣＶは、細胞に対する傷害性が低いと考えられてきた。しかしながら、本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、本発明の構成であればＨＣＶはその感染時に細胞傷害性を示し、この細胞傷害によって細胞内の成分（例えば、乳酸脱水素酵素など）が培養液中に漏出し、当該成分を検出することによって簡便かつ高感度にＨＣＶの感染増殖性を評価することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法は、上記課題を解決するために、Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培養上清中に漏出した上記細胞由来の成分を検出する検出工程を有することを特徴としている。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、上記検出工程では、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、アラニントランスアミラーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびγ−グルタミルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも１つが検出されることが好ましい。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、上記検出工程の前段に、上記細胞を中空糸の内腔中に充填する充填工程と、上記内腔中に充填された上記細胞に対してＣ型肝炎ウイルスを感染させる感染工程と、を有することが好ましい。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、上記検出工程の前段に、上記細胞にＣ型肝炎ウイルスを感染させる感染工程と、上記Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞を中空糸の内腔中に充填する充填工程と、を有することが好ましい。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、上記細胞は、肝細胞または肝臓由来細胞であることが好ましい。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、上記細胞は、Ｈｕ−Ｅ／２細胞であることが好ましい。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、上記Ｃ型肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血清に由来するものであることが好ましい。
本発明の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法は、上記課題を解決するために、上記評価方法の何れかを用いることを特徴としている。
本発明の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法では、上記Ｃ型肝炎ウイルスと上記細胞とは、同一の生体から分離されたものであることが好ましい。
本発明の感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法は、上記課題を解決するために、上記評価方法の何れかにてＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性を評価する評価工程を有することを特徴としている。
本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法は、Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培養上清中に漏出した上記細胞由来の成分を検出する検出工程を有する方法である。
また、本発明の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法は、本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法を用いる方法である。
また、本発明の感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法は、本発明の評価方法にてＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性を評価する評価工程を有する方法である。
それ故に、本発明は、ＨＣＶの感染増殖性を簡便に評価することができるという効果を奏する。
また、本発明は、短時間で多量のサンプルを評価することができるという効果を奏する。
また、本発明は、短時間で多量のサンプルを評価することができるので、ＨＣＶの感染増殖性を正確に評価することができるという効果を奏する。
また、本発明は、ＨＣＶが感染した細胞を殺す必要がないので、同一の細胞を継続して観察することができるという効果を奏する。
また、本発明は、ウイルスの生活環のすべてのステップを標的とした抗ＨＣＶ薬剤のスクリーニングを可能にするという効果を奏する。
以下に本発明の具体的な実施の形態を説明するが、本発明はこれに限定されない。
〔１．Ｃ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法〕
本実施の形態のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法は、ＨＣＶが感染した細胞（感染状態を維持した細胞）の培養上清中に漏出した細胞由来の成分を検出する検出工程を有するものである。つまり、本実施の形態の評価方法では、ＨＣＶは感染した細胞に対して傷害性を示す。そして、傷害を受けた細胞からは様々な成分が培地内へと漏出し、当該成分を検出することによって、ＨＣＶの感染増殖性を評価することが可能になる。例えば、培地内に上記成分が検出されれば、ＨＣＶが感染増殖性を有することを示しており。培地内に上記成分が検出されなければ、ＨＣＶが感染増殖能を有さないことを示している。以下に、検出工程について説明する。
本実施の形態のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法は、ＨＣＶが感染した細胞（感染状態を維持した細胞）の培養上清中に漏出した細胞由来の成分を検出する検出工程を有するものである。つまり、本実施の形態の評価方法では、ＨＣＶは感染した細胞に対して傷害性を示す。そして、傷害を受けた細胞からは様々な成分が培地内へと漏出し、当該成分を検出することによって、ＨＣＶの感染増殖性を評価することが可能になる。例えば、培地内に上記成分が検出されれば、ＨＣＶが感染増殖性を有することを示しており。培地内に上記成分が検出されなければ、ＨＣＶが感染増殖能を有さないことを示している。以下に、検出工程について説明する。
検出工程では、ＨＣＶが感染した細胞の培養上清中に漏出した細胞由来の成分が検出される。
上記ＨＣＶとしては特に限定されず、少なくとも感染能および複製能を有するＨＣＶであればよい。具体的には、例えば、天然型ＨＣＶを用いることが好ましい。なお、天然型ＨＣＶとは、天然に存在するＨＣＶを意図する。当該天然型ＨＣＶの中には、天然に存在するＨＣＶに突然変異が生じたものも含まれる。
天然型ＨＣＶは、ＨＣＶ感染患者の血液または血清から公知の方法（例えば、スクロース勾配遠心分離など）によって得ることが可能である。そして、当該天然型ＨＣＶを細胞に接触させることによって、ＨＣＶを細胞に感染させることができる。また、ＨＣＶの感染患者の血液または血清をそのまま感染源として用いることも可能である。
上記細胞はＨＣＶが感染し得る細胞であればよく、特に限定されない。例えば、上記細胞は、肝細胞または肝臓由来細胞であることが好ましく、ヒト肝細胞またはヒト肝臓由来細胞であることが更に好ましい。また、上記細胞は、不死化されたヒト肝細胞であるＨｕｓ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９０８）であることが最も好ましい。上記構成であれば、特に効率よくＨＣＶを感染させることができる。なお、本明細書においては、上記ＨＣＶを感染させる細胞を、培養細胞または宿主細胞と称することもある。
本実施の形態のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法では、培養上清中に漏出した細胞由来の成分が検出される。つまり、ＨＣＶが感染した細胞を所望の時間、培地中で培養した後、当該培地（例えば、液体培地）中に漏出した細胞由来の成分が検出される。
上記培地の組成としては特に限定されず、細胞に合わせて適宜公知の培地を用いることができる。
また、培養方法としても特に限定されず、用いる細胞に合わせて適宜公知の方法を用いることが可能である。例えば、ＨＣＶが感染した細胞が充填された中空糸を培養容器に移し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養することが好ましい。このとき、振とう機などによって培養容器を振とうさせながら培養することが更に好ましい。上記構成によれば、中空糸の内腔中の細胞に対して効率よく栄養や酸素を供給することができる。そして、その結果、より感度よくＨＣＶの感染増殖性を評価することができる。
培養時間としては特に限定されないが、ＨＣＶが細胞に対して十分な傷害を与えることができる程度の時間であることが好ましい。具体的には、上記時間は、培地上清中にＨＣＶのＲＮＡが検出可能な時間であることが好ましい。なお、具体的な時間は培養条件などによって異なるので特に限定されないが、例えば、培養時間の一例として、好ましくは感染後１日〜２０日、更に好ましくは感染後５日〜１５日、最も好ましくは７日〜１５日を挙げることが可能であるが、これに限定されない。上記構成によれば、より感度良くＨＣＶの感染増殖性を評価することができる。なお、当該培養時間は、例えば、培地中に漏出するＨＣＶのＲＮＡを指標として予め決定しておけばよい。このとき、ＨＣＶのＲＮＡの検出には適宜公知の方法を用いることが可能である。例えば、ＰＣＲ法、またはＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。
上述したように、検出工程では、培養上清中に漏出した細胞由来の成分が検出される。上記細胞由来の成分は特に限定されないが、例えば、ポリペプチド（例えば、タンパク質など）であることが好ましい。上記構成であれば、簡便かつ高感度にて生体由来の成分を検出することができる。また、上記ポリペプチドは特に限定しないが、例えば、酵素であることが好ましい。上記構成であれば、例えば酵素活性などを検出することによって、より簡便かつ高感度にて生体由来の成分を検出することができる。
更に具体的には、上記細胞由来の成分は、例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニントランスアミラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。上記構成であれば、公知の方法によって感度良く細胞由来の成分の存在を検出することができるので、細胞傷害活性の有無、換言すればＨＣＶの感染増殖性を正確に評価することができる。また、上記細胞由来の成分の中では、ＬＤＨが最も好ましい。その理由は、ＬＤＨであれば最も簡便に測定することが可能であるからである。
上記検出工程において細胞由来の成分を検出するための具体的な方法は特に限定されず、適宜公知の方法を用いることが可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）を用いることが好ましい。当該方法であれば、細胞由来の成分を感度良く検出することができる。また、上記酵素としてＬＤＨを用いる場合には、市販のＬＤＨ測定キット（例えば、LDH cytotoxicity detection kit（TaKaRa））を用いることが更に好ましい。なお、ＬＤＨ以外の他の酵素に関しても、適宜市販のキットを用いて検出することが更に好ましい。
細胞にＨＣＶを感染させる方法としては特に限定されないが、細胞を中空糸の内腔中に充填する充填工程と、細胞に対してＨＣＶを感染させる感染工程とを含む方法であることが好ましい。なお、充填工程および感染工程を行う順番は特に限定されない。つまり、充填工程を行った後に感染工程を行うことも可能であり、感染工程を行った後に充填工程を行うことも可能である。以下に、感染工程および充填工程について説明する。
＜１−１．充填工程＞
充填工程では、ＨＣＶが感染する前の細胞またはＨＣＶに感染した後の細胞が、中空糸の内腔中に充填される。
充填工程では、ＨＣＶが感染する前の細胞またはＨＣＶに感染した後の細胞が、中空糸の内腔中に充填される。
上記中空糸は、ＨＣＶが感染した細胞を保持するための内腔を備えるものであればよく、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、上記中空糸は、一端が封止されているとともに他端が開口されているものであって、細胞は通過させないが水、塩類、タンパク質等の培養液成分、Ｃ型肝炎ウイルス粒子を通過させ得る細孔を有する、換言すれば、透過性を有するものであることが好ましい。更に具体的には、上記中空糸は透過性を有する膜状のものであることが好ましい。上記構成であれば、内腔中に充填された細胞に対して、容易にＨＣＶを感染させることができる。また、上記構成であれば、２次感染能を有するＨＣＶを効率よく複製することができるので、より感度良くＨＣＶの感染増殖性を評価することができる。
中空糸の材料は特に限定されないが、細胞を中空糸の内腔中に保持できるとともに、溶液および低分子などの物質、ＨＣＶを透過させ得るものであることが好ましい。例えば、上記材料は、セルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリスルホンなどであることが好ましい。
中空糸の内腔の大きさは特に限定されないが、その内径が２０μｍ〜１０００μｍであることが好ましく、５０μｍ〜５００μｍであることが更に好ましい。
中空糸の膜厚も特に限定されず、適度の強度を保つとともに、物質の透過性が良好な範囲で設定すればよい。例えば、中空糸の膜厚は、例えば１０〜２００μｍ程度であることが好ましい。
中空糸からなる多孔性膜を使用する場合、その孔径の大きさも特に限定されない。例えば、上記孔径としては、０．１μｍ〜５μｍであることが好ましい。上記構成であれば、内腔中に充填された細胞に対して、容易にＨＣＶを感染させることができる。また、上記構成であれば、２次感染能を有するＨＣＶを効率よく複製することができるので、より感度良くＨＣＶの感染増殖性を評価することができる。
また上述したように、上記中空糸は、（１）着脱可能に連結された流入側流通管と流出側流通管とからなる、一端が開口した細胞懸濁液流通管と、（２）細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部と、を備えた器具に取り付けられた状態で用いられることが好ましい。このとき中空糸は、一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が（１）の細胞懸濁液流通管と連通し、（２）の中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通するように、上記器具に１本または複数本取り付けられていることが好ましい。
なお、上記中空糸および中空糸付きの器具は、特開２００５−１１０６９５号公報に記載されたものを好適に使用することが可能であり、本願発明においては、当該特許文献の記載を適宜援用することができる。
上記中空糸の内腔中に充填される細胞は、ＨＣＶが感染し得る細胞であればよく、特に限定されない。例えば、上記細胞は、肝細胞または肝臓由来細胞であることが好ましく、ヒト肝細胞またはヒト肝臓由来細胞であることが更に好ましい。また、上記細胞は、不死化されたヒト肝細胞であるＨｕｓ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９０８）であることが最も好ましい。上記構成であれば、特に効率よくＨＣＶを感染させることができる。なお、本明細書においては、上記ＨＣＶを感染させる細胞を、培養細胞または宿主細胞と称することもある。
充填工程では、上記中空糸の内腔中にＨＣＶを感染させるべき細胞、またはＨＣＶに既に感染した細胞が充填される。具体的な充填方法は特に限定されないが、細胞に対して圧力を加えることによって、当該細胞を内腔中に充填することが好ましい。また、上記圧力は、遠心力であること、換言すれば、遠心力によって上記細胞が内腔中に充填されることが更に好ましい。なお、中空糸の内腔中に充填された細胞は更に培養されることが好ましいので、上記中空糸は、細胞を充填する前に親水化処理および滅菌処理されていることが好ましい。中空糸の親水化処理および滅菌処理の具体的な方法は特に限定されず、適宜従来公知の方法によって行われ得る。また、細胞を充填する前に、中空糸の内腔中に細胞培養用の液体培地、細胞保存用液、または適当なバッファーなどを満たしておくことが好ましい。充填工程の更に具体的な構成を以下に説明するが、充填工程はこれらに限定されない。
充填工程では、中空糸の内腔中に充填される細胞を、細胞培養用の液体培地、細胞保存用液または適当なバッファー等に懸濁し、当該細胞懸濁液を中空糸の開口部から内腔中に充填することが好ましい。また、中空糸の内腔中に予め細胞培養用の液体培地、細胞保存用液、または適当なバッファーを満たしておき、当該内腔中に同じ液体培地、細胞保存用液またはバッファーに懸濁した細胞を充填することが更に好ましい。なお、上記構成の中では、細胞培養用の液体培地を用いることが、より好ましい。
中空糸の他端が封止されていれば、中空糸の開口部から内腔に注入された細胞懸濁液中の液体培地等の液体成分が中空糸の細孔から中空糸の外側に流出するとともに、細胞が中空糸の内腔中に堆積する。上記構成であれば、より効率良くＨＣＶを細胞に感染させることができる。
上記充填工程では、細胞に対して圧力を加えることによって当該細胞を内腔中に充填することが好ましい。細胞に対して圧力を加えるための具体的な方法としては特に限定されないが、例えば、公知の遠心機によって細胞に対して遠心力を負荷することが好ましい。また、中空糸の内腔内部の圧力を陽圧にする、および／または中空糸の内腔外部の圧力を陰圧にすることによって、細胞に対して圧力を加えることが好ましい。上記構成によれば、細胞に対して圧力を加えることによって、内腔中の細胞を凝集体化することができる。そして、細胞を凝集体化することができれば、当該細胞に対して高効率かつ安定にＨＣＶを感染させることができる。なお、細胞に対して圧力を加えるための具体的な方法としては、特開２００４−１６６７１７号公報および特開２００４−２８３０１０号公報に記載された方法も好適に使用することが可能であり、本願発明においては、当該特許文献の記載を適宜援用することができる。
＜１−２．感染工程＞
感染工程では、中空糸の内腔中に充填される前の細胞、または中空糸の内腔中に充填された後の細胞の少なくとも一方に対してＨＣＶを感染させる。つまり、感染工程は、上述した充填工程の前段および後段の少なくとも一方で行われ得る。
感染工程では、中空糸の内腔中に充填される前の細胞、または中空糸の内腔中に充填された後の細胞の少なくとも一方に対してＨＣＶを感染させる。つまり、感染工程は、上述した充填工程の前段および後段の少なくとも一方で行われ得る。
上述したように、ＨＣＶとしては特に限定されず、少なくとも感染能および複製能を有するＨＣＶであればよい。更に具体的には、例えば、天然型ＨＣＶを用いることが好ましい。上記天然型ＨＣＶとは、天然に存在するＨＣＶを意図する。なお、当該天然型ＨＣＶの中には、天然に存在するＨＣＶに突然変異が生じたものも含まれる。
天然型ＨＣＶは、ＨＣＶ感染患者の血液または血清から公知の方法（例えば、スクロース勾配遠心分離など）によって得ることが可能である。そして、感染工程では、当該天然型ＨＣＶを細胞に接触させることによって、ＨＣＶを細胞に感染させることが好ましい。また、ＨＣＶの感染患者の血液または血清をそのまま感染源として用いれば、容易にＨＣＶ感染細胞を得ることができるので、更に好ましい。また、エレクトロポーレーションを用いてＨＣＶを感染させることも可能である。
感染工程が充填工程の前段に設けられている場合には、細胞に対して予めＨＣＶを感染させた後、当該細胞を中空糸の内腔中に充填させることになる。
この場合、ＨＣＶを感染させる時の細胞の状態としては特に限定されないが、例えば、培養プレート上に接着した細胞に対してＨＣＶを感染させることも可能であり、液体培地中に懸濁された状態の細胞に対してＨＣＶを感染させることも可能である。なお、培養プレート上に接着した細胞に対してＨＣＶを感染させる場合には、ＨＣＶが感染した後の細胞をトリプシンなどによってプレートから剥がした後、当該細胞を中空糸の内腔中に充填すればよい。ウイルスと細胞との接触機会が増加してウイルスの感染効率が上昇するので、上記方法の中では、液体培地中に懸濁された状態の細胞に対してＨＣＶを感染させる方が好ましい。
また、細胞に対してＨＣＶを感染させる方法としても特に限定されず、例えば、ＨＣＶを細胞に対して一定時間接触させることによって感染させることが好ましい。更に具体的には、ＨＣＶ含有液（例えば、Ｃ型肝炎感染患者の血液または血清、ＨＣＶ粒子を含む培養上清など）を細胞に対して一定時間接触させることによって感染させることが好ましい。上記構成によれば、簡便にＨＣＶ感染細胞を得ることができる。また、エレクトロポーレーションを用いて感染させることも可能である。
感染工程が充填工程の後段に設けられている場合には、予め細胞を中空糸の内腔中に充填した後、当該細胞に対してＨＣＶを感染させることになる。上記構成によれば、内腔中で細胞が凝集体化しているので、感染工程が充填工程の前段に設けられている場合と比較して、ＨＣＶが、細胞に対して高効率かつ安定に感染することができる。つまり、当該構成であれば、より多くのＨＣＶ感染細胞を得ることが可能になる。そして、より多くのＨＣＶ感染細胞を得ることができれば、それだけ多くの細胞が傷害を受けることになり、培地中に漏出している細胞由来の成分の量が多くなる。その結果、より感度良く、ＨＣＶの感染増殖性を評価することができる。
細胞に対してＨＣＶを感染させる方法としても特に限定されず、例えば、ＨＣＶを中空糸の内腔中に充填された細胞に対して一定時間接触させることによって感染させればよい。また、ＨＣＶ含有液（例えば、Ｃ型肝炎感染患者の血液または血清、ＨＣＶを含む培養上清など）を中空糸の内腔中に充填された細胞に対して一定時間接触させることによって感染させることが好ましい。なお、この場合には、中空糸は、ＨＣＶを容易に通過させ得るとともに細胞を通過させることができない程度の大きさの細孔を有することが好ましい。
なお、本明細書において「ＨＣＶが細胞に対して感染した」とは、細胞内にＨＣＶが進入するとともに、当該ＨＣＶが安定的に増殖している状態を意図している。
〔２．抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法〕
本実施の形態の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法は、本願発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法を用いるスクリーニング方法である。
本実施の形態の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法は、本願発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法を用いるスクリーニング方法である。
具体的には、本実施の形態の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法では、抗Ｃ型肝炎ウイルス剤候補物質の存在下で、ＨＣＶの感染増殖性が評価される。したがって、本実施の形態のスクリーニング方法に用いられるＨＣＶは、細胞に対する感染能の有無が予め評価されているＨＣＶであることが好ましい。
例えば、抗Ｃ型肝炎ウイルス剤候補物質の存在下にて、感染能を有することが予め明らかになっているＨＣＶを細胞に対して感染させる。更に具体的には、例えば、ＨＣＶが感染した細胞を所望の時間培養するときに、培地中に抗Ｃ型肝炎ウイルス剤候補物質を添加する。このときに、ＨＣＶの感染増殖性が認められなかった場合には、当該候補物質を抗Ｃ型肝炎ウイルス剤として用い得ることを示している。
上記構成によれば、ＨＣＶの感染評価自体が簡便にできるので、より多くの候補物質を短時間で評価することが可能になる。
上記抗Ｃ型肝炎ウイルス剤候補物質としては特に限定されず、適宜スクリーニングしたい物質（例えば、化合物など）を用いればよい。当該抗Ｃ型肝炎ウイルス剤候補物質としては、単一の物質でもよく、複数の物質を含む混合物であってもよい。また、天然から分離された物質であってもよく、人工的に合成された物質であってもよい。
また、本実施の形態の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法は、ＨＣＶと当該ＨＣＶを感染させる細胞とは、同一の生体から分離されたものであることが好ましい。なお、上記生体としては特に限定しないが、例えば、ヒトであることが好ましい。
ＨＣＶは、その遺伝子に変異が生じ易く、患者によってＨＣＶの遺伝子が異なっている場合が多い。そして、遺伝子が異なるＨＣＶは、例えば、薬剤に対する抵抗性、細胞に対する感染性など多くの性質が異なる場合が多い。しかしながら、当該スクリーニング方法では、生体（例えば、患者）から採取したＨＣＶを、同一の生体から採取した細胞に感染させる過程における抗Ｃ型肝炎ウイルス剤候補物質の効果を確認できるので、生体ごとに最適な抗Ｃ型肝炎ウイルス剤をスクリーニングすることができる。つまり、本実施の形態の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法は、Ｃ型肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または検査に好適に利用することができる。
〔３．感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法〕
本実施の形態の感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法は、本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法にてＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性を評価する評価工程を有する製造方法である。
本実施の形態の感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法は、本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法にてＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性を評価する評価工程を有する製造方法である。
本明細書において「感染性Ｃ型肝炎ウイルス」とは、細胞を含む各種生体に対する感染性を備えたＣ型肝炎ウイルスが意図される。
本願発明に用いているウイルス感染・増殖システムでは、２次感染能を有するＣ型肝炎ウイルスを複製することができる。したがって、上記評価工程にてウイルスの感染増殖性が認められれば、当該ウイルスが感染した細胞からは２次感染能を有するＣ型肝炎ウイルスが複製されることになる。
したがって、本実施の形態の感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法によれば、確実に感染性を有するＣ型肝炎ウイルスを製造することが可能になる。
以下に、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
〔実施例１〕
ヒト肝臓に由来する不死化ヒト肝細胞であるＨｕＳ−Ｅ／２細胞を、以下の実験に使用した。なお、ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は、２００７年９月７日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている（受託番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９０８）。
ヒト肝臓に由来する不死化ヒト肝細胞であるＨｕＳ−Ｅ／２細胞を、以下の実験に使用した。なお、ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は、２００７年９月７日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託されている（受託番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９０８）。
まず、３×１０５個のＨｕＳ−Ｅ／２細胞を、セルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）の中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間の遠心力を負荷して充填し、当該セルローストリアセテート製中空糸モジュールを１２ｗｅｌｌプレート中で振盪培養した。
２４時間の振盪培養後、培養液を、患者血清由来ＨＣＶを３×１０５ゲノムコピー／ｍｌの濃度にて含有する０．８ｍｌの培養液に交換した。更に２４時間の振盪培養を行った後に当該培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。
その後、２〜３日ごとに培養液を新しいものに交換しながら、感染後３０日まで培養を続けた。この間、感染後３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０日目に、培養上清中のＨＣＶ−ＲＮＡ量と培養上清中の乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase）の活性とを測定した。なお、ＨＣＶ−ＲＮＡの定量は、培養上清中から常法に従ってＲＮＡ抽出を行い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によって定量した。また、培養上清中の乳酸脱水素酵素の活性の測定には、LDH cytotoxicity detection kit（TaKaRa）を用い、当該キットに添付されたプロトコールに従って測定を行った。
〔実施例２〕
ヒト肝臓に由来する不死化ヒト肝細胞であるＨｕＳ−Ｅ／２細胞を、以下の実験に使用した。
ヒト肝臓に由来する不死化ヒト肝細胞であるＨｕＳ−Ｅ／２細胞を、以下の実験に使用した。
まず、３×１０５個のＨｕＳ−Ｅ／２細胞を、セルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）の中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間の遠心力を負荷して充填し、当該セルローストリアセテート製中空糸モジュールを１２ｗｅｌｌプレート中で振盪培養した。
２４時間の振盪培養後、培養液を、ＨＣＶ ＪＦＨ−１を３×１０５ゲノムコピー／ｍｌの濃度にて含有する０．８ｍｌの培養液に交換した。更に２４時間の振盪培養を行った後に当該培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。
その後、２〜３日ごとに培養液を新しいものに交換しながら、感染後３０日まで培養を続けた。この間、感染後３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０日目に、培養上清中のＨＣＶ−ＲＮＡ量と培養上清中の乳酸脱水素酵素（Lactate Dehydrogenase）の活性とを測定した。なお、ＨＣＶ−ＲＮＡの定量は、培養上清中から常法に従ってＲＮＡ抽出を行い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によって定量した。また、培養上清中の乳酸脱水素酵素の活性の測定には、LDH cytotoxicity detection kit（TaKaRa）を用い、当該キットに添付されたプロトコールに従って測定を行った。
〔結果〕
実施例１においては、感染から１０日後に、培養上清中のＨＣＶ−ＲＮＡ量が著しく増加した。また、非感染細胞の培養上清と比較して、患者血清由来ＨＣＶ（天然ＨＣＶ）の感染細胞の培養上清の方が、感染３日後から乳酸脱水素酵素活性が高かった。また、この活性は培養上清中に最も高いＨＣＶ−ＲＮＡ量が存在した感染１０日後に、最も高い値を示した。
実施例１においては、感染から１０日後に、培養上清中のＨＣＶ−ＲＮＡ量が著しく増加した。また、非感染細胞の培養上清と比較して、患者血清由来ＨＣＶ（天然ＨＣＶ）の感染細胞の培養上清の方が、感染３日後から乳酸脱水素酵素活性が高かった。また、この活性は培養上清中に最も高いＨＣＶ−ＲＮＡ量が存在した感染１０日後に、最も高い値を示した。
また、実施例２においても実施例１と同様に、培養上清中に最も高いＨＣＶ−ＲＮＡ量が存在した感染１０日後に、最も高いＬＤＨ活性が検出された。
この結果は、ＪＦＨ−１株および天然型ＨＣＶは感染時に細胞傷害性を示し、当該細胞傷害によって細胞内成分（例えば、乳酸脱水素酵素）が培養上清中に漏出していることを示している。そして、この結果は、培養液中に漏出した上記細胞内成分を検出することによって、簡便かつ高感度にＨＣＶの感染増殖を評価することが可能となることを示している。
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明によれば、培養細胞を使ったＨＣＶの感染増殖システムを用いて、培養上清中に漏出する細胞内成分（例えば、ＬＤＨなどの細胞内酵素、または細胞因子など）を検出することによって、ＨＣＶの感染増殖性を簡便に評価することが可能となった。したがって、本発明は、抗ＨＣＶ薬剤のスクリーニングやオーダーメイド治療に用いることが可能である。
Claims (10)
- Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培養上清中に漏出した前記細胞由来の成分を検出する検出工程を有することを特徴とするＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 前記検出工程では、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、アラニントランスアミラーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびγ−グルタミルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも１つが検出されることを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 前記検出工程の前段に、細胞を中空糸の内腔中に充填する充填工程と、前記内腔中に充填された前記細胞に対してＣ型肝炎ウイルスを感染させる感染工程と、を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 前記検出工程の前段に、細胞にＣ型肝炎ウイルスを感染させる感染工程と、前記Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞を中空糸の内腔中に充填する充填工程と、を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 前記細胞は、肝細胞または肝臓由来細胞であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 前記細胞は、Ｈｕ−Ｅ／２細胞であることを特徴とする請求項５に記載のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 前記Ｃ型肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血清に由来するものであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載のＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性の評価方法。
- 請求項１〜７の何れか１項に記載の評価方法を用いることを特徴とする抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法。
- 前記Ｃ型肝炎ウイルスと前記細胞とは、同一の生体から分離されたものであることを特徴とする請求項８に記載の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤のスクリーニング方法。
- 請求項１〜７の何れか１項に記載の評価方法にてＣ型肝炎ウイルスの感染増殖性を評価する評価工程を有することを特徴とする感染性Ｃ型肝炎ウイルスの製造方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8717335B2 (en) | 2010-06-15 | 2014-05-06 | Industrial Technology Research Institute | Active photosensing pixel |
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