JP2010002380A - Evaluation method of glycation degree of protein, and evaluation method of glycation suppressing/improving agent of protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はタンパク質の糖化度の評価方法及びタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法に関し、特にその簡便化及び迅速化に関する。 The present invention relates to a method for evaluating the degree of saccharification of a protein and a method for evaluating a glycation-inhibiting / improving agent for a protein.
食事によって過剰に摂取し、血液中の糖度が上昇すると、ブドウ糖のアルデヒド基とタンパク質のアミノ基が重合反応を起こし、各組織においてタンパク質が糖化される。このようなタンパク質の糖化は、糖尿病患者において特に顕著に認められ、例えば、動脈硬化（血管タンパク質の糖化）、白内障（水晶体タンパク質の糖化）、皮膚弾力の低下（皮膚コラーゲンの糖化）等の合併症の原因であることが知られてきた。
そのため、糖化タンパク質の測定は糖尿病の治療や診断の一つとして従来利用されてきた。糖尿病の治療ないし診断の手段として汎用されている糖化タンパク質の測定方法は、尿ないし血液を検体として用いた方法が主である。これらの測定方法は病気の診断を主眼としたものであるため、患者からの尿や血液の採取をはじめ、煩雑な処理や精密な測定を要する。
When excessively consumed by meals and the sugar content in blood rises, the aldehyde group of glucose and the amino group of protein cause a polymerization reaction, and the protein is glycated in each tissue. Such protein glycation is particularly prominent in diabetic patients. For example, complications such as arteriosclerosis (glycation of vascular protein), cataract (glycation of lens protein), and decreased skin elasticity (glycation of skin collagen). Has been known to be the cause of
Therefore, measurement of glycated protein has been conventionally used as one of the treatment and diagnosis of diabetes. As a method for measuring glycated protein, which is widely used as a means for treating or diagnosing diabetes, a method using urine or blood as a specimen is mainly used. Since these measurement methods are mainly used for diagnosing diseases, they require complicated processing and precise measurement, such as collection of urine and blood from patients.
ところで、糖尿病患者において、前記診断にかかる血液中のタンパク質と同様に、毛髪のタンパク質もまた糖化されていることが知られている（特許文献１）。さらに驚くべきことに、本発明者らは、非糖尿病患者においても加齢に伴って毛髪のケラチンタンパク質が糖化される傾向にあることを見出した。従来、加齢により血糖度が上昇することは知られていたが、毛髪ケラチンにおいても同様の傾向が認められることは知られていなかった。また、本発明者らは、このようなタンパク質の糖化が毛髪を切れ易くしたり、毛髪表面をくすませるといった変化を引き起こすことをも見出した。
これらの知見から、毛髪ケラチンの糖化度を評価することは、従来のように糖尿病の治療及び診断に寄与するだけでなく、基礎的な加齢研究、ないしは広く行なわれているアンチエイジングに関する評価に極めて貢献し得ると考えられる。
By the way, in diabetic patients, it is known that hair protein is also glycated as well as protein in blood for the diagnosis (Patent Document 1). Surprisingly, the inventors have found that hair keratin proteins tend to be glycated with age even in non-diabetic patients. Conventionally, it has been known that blood sugar level increases with aging, but it has not been known that the same tendency is observed in hair keratin. The present inventors have also found that such glycation of protein causes changes such as easy hair cutting and dull hair surface.
Based on these findings, evaluating the degree of keratinization of hair keratin not only contributes to the treatment and diagnosis of diabetes as in the past, but also to basic aging research or the evaluation of anti-aging that is widely performed. It is thought that it can contribute extremely.
なお、毛髪における糖化タンパク質の測定法については、例えば、先に挙げた特許文献１に記載がある。この測定方法は、毛髪をヒドラジンで処理し、その後発色試薬（フェニルヒドラジン）と反応させて比色定量するというものであり、これまでの糖化タンパク質の比色法に比べ、測定の簡便さ及び迅速さに優れていることが報告されている。
しかしながら、前記測定法においても、毛髪に数段階の前処理を施すことが必要とされ、毛髪におけるタンパク質の糖化度をより容易に評価する方法は、未だ開発されていない。
In addition, about the measuring method of glycated protein in hair, there exists description in the patent document 1 mentioned above, for example. In this measurement method, hair is treated with hydrazine and then reacted with a coloring reagent (phenylhydrazine) for colorimetric determination. Compared with conventional glycated protein colorimetric methods, the measurement is simpler and quicker. It is reported that it is excellent.
However, even in the measurement method, it is necessary to perform several stages of pretreatment on the hair, and a method for more easily evaluating the degree of protein glycation in the hair has not yet been developed.
また、タンパク質糖化度の評価や、タンパク質の糖化を抑制ないし改善し得る薬剤の評価において、タンパク質を人工的に糖化した検体を比較対象として用いることが考えられる。すなわち、タンパク質の糖化過程に前記薬剤を作用させ、これを糖化ないし薬剤未処理検体等と糖化度を比較することにより、検体の糖化度及び薬剤作用が評価される。
毛髪のタンパク質を人工的に糖化する手段として、例えば、非特許文献１に、毛髪をグルコース溶液で処理することが報告されている。また、一般的に五炭糖が高いタンパク質糖化作用を有することが知られている。
しかしながら、グルコース等を用いて毛髪を糖化するには１０日以上に及ぶ長期間の処理を要するため、検体の準備を含めて簡易的に糖化度及び薬剤作用の評価を実施することは困難であった。
また、毛髪の糖化程度には個体差があるため、特に薬剤の効果を精密に評価するには多数の検体について試験を行うことが必須とされていた。
As a means for artificially saccharifying hair proteins, Non-Patent Document 1, for example, reports treating hair with a glucose solution. Moreover, it is generally known that pentose sugar has a high protein saccharification action.
However, since saccharification of hair using glucose or the like requires a long-term treatment for 10 days or more, it is difficult to easily evaluate the degree of saccharification and drug action including preparation of specimens. It was.
In addition, since there are individual differences in the degree of glycation of hair, it has been essential to conduct tests on a large number of specimens, in particular, in order to accurately evaluate the effect of the drug.
本発明は上記知見及び従来技術に鑑みて行なわれたものであり、タンパク質の糖化度、及びタンパク質の糖化を抑制・改善する薬剤の評価を簡便且つ迅速に行う方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above knowledge and the prior art, and an object of the present invention is to provide a method for easily and quickly evaluating the degree of glycation of a protein and a drug that suppresses or improves glycation of the protein. .
本発明者らによる鋭意研究の結果、ケラチンフィルム化した毛髪を用いることにより、容易なタンパク質糖化度の評価が可能であり、しかも個体差によるデータのぶれを排除できることを見出した。また、本発明者らは、前記ケラチンフィルムをリボースで糖化することで、極めて短時間にタンパク質の糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価を行なうことができことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前記方法において、下記工程を備えることが好適である。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。
また、本発明にかかる毛髪損傷度の評価方法は、前記方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする。
As a result of intensive studies by the present inventors, it has been found that the use of keratin film-like hair makes it possible to easily evaluate the degree of protein saccharification and to eliminate data blur due to individual differences. In addition, the present inventors have found that by saccharifying the keratin film with ribose, it is possible to evaluate the degree of glycation of a protein or a saccharification inhibitor / improving agent in a very short time, and complete the present invention. It came.
That is, the method for evaluating the degree of saccharification of protein according to the present invention uses a keratin film obtained after contacting and drying a hair keratin protein solution in which hair is dissolved with a protein denaturant and a reducing agent, and a developing solution. It is characterized by that.
The method preferably includes the following steps.
(I) The keratin film is immersed in a ribose solution for 12 hours to 10 days.
(II) The absorbance of the keratin film in the visible light region is measured.
The hair damage degree evaluation method according to the present invention is characterized in that the evaluation of the degree of protein saccharification by the above method is used as an index.
また、本発明にかかるタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前期方法において、下記（１）〜（３）のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することが好適である。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
In addition, the method for evaluating a protein glycation inhibitor / improving agent according to the present invention is obtained after contacting and drying a hair keratin protein solution obtained by dissolving hair with a protein denaturant and a reducing agent, and a developing solution. A keratin film is used.
In the previous method, it is preferable to comparatively measure the absorbance in the visible region of the following keratin films (1) to (3).
(1) A keratin film immersed in a ribose solution for 12 hours to 10 days.
(2) A keratin film immersed in a ribose solution to which an evaluation agent has been added for 12 hours to 10 days.
(3) Untreated keratin film.
本発明によれば、毛髪由来タンパク質の糖化度を簡便且つ迅速に測定・評価することが可能となる。また、複数個体の混合毛髪より得たケラチンフィルムを用いることにより、個体による測定値のばらつきを低減し、高精度のデータを得ることができる。
本発明は従来操作が煩雑で長時間を要していたタンパク質糖化度の評価を容易にすることから、糖尿病の治療・診断をはじめ、加齢に伴うタンパク質の糖化の研究や、タンパク質の糖化予防・抑制剤の開発において高い貢献が期待できる。
According to the present invention, the glycation degree of hair-derived protein can be measured and evaluated easily and rapidly. In addition, by using a keratin film obtained from a plurality of mixed hairs, variation in measured values among individuals can be reduced and highly accurate data can be obtained.
Since the present invention facilitates the evaluation of the degree of protein saccharification, which has been complicated and requires a long time in the past, research and diagnosis of diabetes, research on protein saccharification associated with aging, and prevention of protein saccharification・ High contribution can be expected in the development of inhibitors.
本発明にかかる方法は、毛髪からケラチンフィルムを製造してこれを検体とし、該検体の吸光度を比較測定することにより、その毛髪タンパク質の糖化度を相対的に評価することに基づいている。前記測定は通常の単離毛髪においても可能であるが、測定時間の短縮及び個体差による測定値のばらつきを抑制する観点から、本発明では特に毛髪由来のケラチンフィルムを用いることが好ましい。
以下、本発明をその手順に沿って説明する。
The method according to the present invention is based on the relative evaluation of the degree of glycation of a hair protein by producing a keratin film from hair and using it as a specimen, and comparing and measuring the absorbance of the specimen. Although the measurement can be performed on normal isolated hair, it is particularly preferable to use a keratin film derived from hair in the present invention from the viewpoint of shortening the measurement time and suppressing variation in measurement values due to individual differences.
Hereinafter, the present invention will be described along the procedure.
ケラチンフィルムの調製
まず、毛髪からケラチンフィルムを調製する方法について説明する。
毛髪から、それを構成するケラチンタンパク質群を抽出するために、タンパク質変性剤を用いる。タンパク質変性剤としては、尿素系の化合物が好ましく、例えば、尿素、チオ尿素、およびこれらの誘導体等が挙げられる。これらの尿素系タンパク質変性剤の１種または２種以上を混合して用いることが好ましい。より好ましくは、尿素とチオ尿素を混合して用いることである。尿素とチオ尿素を混合して用いる場合には、混合質量比が５：１〜１：２であることが好ましい。チオ尿素の混合比が前記範囲より少ないとタンパク質の変成作用が劣る場合があり、また前記範囲を超えると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向がある。
Preparation of keratin film First, a method for preparing a keratin film from hair will be described.
In order to extract the keratin protein group which comprises it from hair, a protein denaturant is used. The protein denaturing agent is preferably a urea compound, and examples thereof include urea, thiourea, and derivatives thereof. It is preferable to use one or more of these urea-based protein denaturants in combination. More preferably, urea and thiourea are mixed and used. When using a mixture of urea and thiourea, the mixing mass ratio is preferably 5: 1 to 1: 2. If the mixing ratio of thiourea is less than the above range, the protein denaturation action may be inferior, and if it exceeds the above range, the extraction rate of the keratin protein group tends to decrease.
前記タンパク質変性剤は、毛髪サンプル処理液中の濃度が３０〜７０質量％であることが好ましい。３０質量％未満であると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向があり、また、７０質量％を超えて用いても増量による抽出率の向上の効果は認められず、さらに毛髪サンプル処理液の粘性が高くなり作業性が悪くなる場合がある。ここで、「毛髪サンプル処理液」とは、毛髪サンプルとタンパク質変性剤からなる毛髪ケラチンタンパク質溶解液、および後述する還元剤等を含み、ケラチンタンパク質群を抽出する製造過程の混合液を意味する。
前述のようにタンパク質変性剤を用いることにより、温和な条件で効率よくケラチンタンパク質群を毛髪から溶解させて抽出することが可能となる。
The concentration of the protein denaturant in the hair sample treatment solution is preferably 30 to 70% by mass. If the amount is less than 30% by mass, the extraction rate of the keratin protein group tends to decrease, and even if it is used in excess of 70% by mass, the effect of improving the extraction rate by increasing the amount is not recognized. In some cases, the viscosity of the resin becomes high and the workability deteriorates. Here, the “hair sample treatment liquid” means a hair keratin protein solution composed of a hair sample and a protein denaturant, and a mixed liquid in the production process for extracting a keratin protein group, including a reducing agent described later.
By using a protein denaturant as described above, it is possible to efficiently dissolve and extract the keratin protein group from the hair under mild conditions.
また、本発明に用いるケラチンフィルムを調製するにあたり、前記タンパク質変性剤と共に還元剤を併用する。還元剤としては、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリコール酸等のチオアルコール類が挙げられる。これらの１種または２種以上を組合せて用いることができる。
還元剤を前記タンパク質変性剤と併用することにより、ケラチンタンパク質群の抽出率をさらに向上させることができる。これは、強固なケラチン繊維構造をタンパク質変性剤が変性させ、続いて還元剤がケラチンタンパク質間の強固なＳ−Ｓ結合を効率よく解離させ、さらに毛髪サンプル処理液中での再結合が起こりにくくするためと考えられる。
Moreover, when preparing the keratin film used for this invention, a reducing agent is used together with the said protein denaturant. Examples of the reducing agent include thioalcohols such as 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, and thioglycolic acid. These 1 type (s) or 2 or more types can be used in combination.
By using a reducing agent in combination with the protein denaturant, the extraction rate of the keratin protein group can be further improved. This is because the protein modifier denatures the strong keratin fiber structure, and then the reducing agent efficiently dissociates the strong SS bond between the keratin proteins, and recombination hardly occurs in the hair sample treatment solution. It is thought to do.
前記還元剤をタンパク質変性剤と併用する場合、毛髪サンプル処理液中０．５〜４０質量％の濃度で含有させることが好ましく、より好ましくは１〜２０質量％である。ただし、用いる還元剤の毛髪サンプル処理液中における溶解性により適宜決定されることが好ましい。
還元剤の濃度が０．５質量％未満であると、ケラチンタンパク質感の強固なＳ−Ｓ結合の還元切断が十分に行なわれない傾向があり、また、４０質量％の濃度を超えて使用すると毛髪処理液中でのケラチンタンパク質群の溶解性が悪くなる場合がある。
When the reducing agent is used in combination with a protein denaturant, the hair sample treatment solution preferably contains 0.5 to 40% by mass, more preferably 1 to 20% by mass. However, it is preferably determined as appropriate depending on the solubility of the reducing agent used in the hair sample treatment solution.
When the concentration of the reducing agent is less than 0.5% by mass, there is a tendency that the reductive cleavage of the S—S bond having a strong keratin protein feeling is not performed sufficiently, and when the concentration exceeds 40% by mass. The solubility of the keratin protein group in the hair treatment solution may deteriorate.
毛髪ケラチンタンパク質溶液を得るための処理時間は、処理温度にも左右されるが、１〜４日間であることが好ましい。また、処理温度は、２０〜６０℃であることが好ましい。２０℃未満であると反応の進行が遅くなり効率が悪く、６０℃を超えると、毛髪サンプル処理液がアルカリ性を呈しているため、ペプチド結合の切断や置換基変換、架橋等の副反応を伴う場合がある。
また、毛髪サンプルと毛髪サンプル処理液の比は、１〜１００ｍｇ毛髪サンプル／ｍｌ毛髪サンプル処理液であることが好ましい。
毛髪サンプル処理液は、ケラチンタンパク質が十分に抽出された後、ろ過により未抽出毛髪を除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液を得ることができる。
The treatment time for obtaining the hair keratin protein solution depends on the treatment temperature, but is preferably 1 to 4 days. Moreover, it is preferable that processing temperature is 20-60 degreeC. If the temperature is lower than 20 ° C., the reaction progresses slowly and the efficiency is poor. If the temperature exceeds 60 ° C., the hair sample treatment solution exhibits alkalinity, which causes side reactions such as peptide bond cleavage, substituent conversion, and crosslinking. There is a case.
The ratio of the hair sample to the hair sample treatment solution is preferably 1 to 100 mg hair sample / ml hair sample treatment solution.
After the keratin protein is sufficiently extracted from the hair sample treatment liquid, unextracted hair is removed by filtration to obtain a hair keratin protein solution.
タンパク質変性剤と還元剤とを併用して毛髪サンプルを処理し、ろ過した後に得られる毛髪ケラチンタンパク質溶液の固体化またはゲル化のため、展開用溶液を接触させる。この固体化またはゲル化により、毛髪ケラチンタンパク質を本発明にかかるタンパク質の糖化度評価、ないしはタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価に適したフィルムとして成形することができる。
展開用溶液としては、例えば、トリクロロ酢酸、グアニジン塩酸、過塩素酸、およびそれらの誘導体等の変性剤と、水、生理食塩水、低級アルコール等の溶媒を混合して得られる変性剤溶液、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸およびそれらの塩等の酸性物質からなる賛成溶液が挙げられる。これらの１種または２種以上を用いることができる。本発明で用い得るケラチンフィルムの調製においては、展開溶液として過塩素酸溶液、グアニジン塩酸溶液、酢酸溶液、酢酸緩衝液から選択される１種または２種以上であることが好ましい。特に好ましくは、酢酸溶液または酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）である。
The hair sample is treated with a protein denaturant and a reducing agent in combination, and the developing solution is brought into contact with the hair keratin protein solution obtained after filtration and solidification or gelation. By this solidification or gelation, the hair keratin protein can be formed as a film suitable for the evaluation of the glycation degree of the protein according to the present invention or the evaluation of the protein glycation inhibitor / improving agent.
Examples of the developing solution include a modifying agent solution obtained by mixing a modifying agent such as trichloroacetic acid, guanidine hydrochloride, perchloric acid, and derivatives thereof, and a solvent such as water, physiological saline, and lower alcohol, hydrochloric acid For example, an acidic solution such as sulfuric acid, acetic acid, phosphoric acid and salts thereof. These 1 type (s) or 2 or more types can be used. In preparing the keratin film that can be used in the present invention, the developing solution is preferably one or more selected from a perchloric acid solution, a guanidine hydrochloric acid solution, an acetic acid solution, and an acetic acid buffer. Particularly preferred is an acetic acid solution or an acetic acid buffer (pH 4.0).
前記展開用溶液として用いる前記変性剤溶液の濃度は、１０〜６０質量％であることが好ましい。また、前記展開用溶液として用いる酸性溶液の濃度は、１０〜５００ｍＭであることが好ましい。
前記展開用溶液は、前記毛髪ケラチンタンパク質溶液のイオン強度を下げる作用を有し、これにより、毛髪サンプル処理液中のタンパク質変性剤、還元剤の溶解性の低下を招く。その結果、ケラチンタンパク質群の溶解性が低下、それに伴いケラチンタンパク質間のＳ−Ｓ結合が解離して−ＳＨ状態であったものが、再びＳ−Ｓ結合が再形成されて、短時間にケラチンタンパク質の固体化が進行することになる。
The concentration of the denaturant solution used as the developing solution is preferably 10 to 60% by mass. The concentration of the acidic solution used as the developing solution is preferably 10 to 500 mM.
The developing solution has an action of lowering the ionic strength of the hair keratin protein solution, thereby causing a decrease in the solubility of the protein denaturant and reducing agent in the hair sample treatment solution. As a result, the solubility of the keratin protein group is reduced, and the SS bond between the keratin proteins is dissociated and is in the -SH state, but the SS bond is re-formed again, and the keratin is regenerated in a short time. Protein solidification will proceed.
本発明で用いるケラチンフィルムを調製する場合、Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法またはＰｒｅ−ｃａｓｔ法を適用することができる。
Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法としては、シャーレ等の容器に予め前記展開用溶媒を満たしておき、これに毛髪ケラチンタンパク質溶液をキャストする方法（フォワード法）、または毛髪ケラチンタンパク質溶液を予め添加したシャーレ等の容器に、展開用溶液をキャストする方法（リバース法）が挙げられる。
Ｐｒｅ−ｃａｓｔ法とは、予め毛髪ケラチンタンパク質に展開用溶媒を混合し、水を張ったシャーレ等の容器へ前記混合用液をキャストする方法である。
本発明においては、前記Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法及びＰｒｅ−ｃａｓｔ法のいずれの適用によっても、本発明にかかるタンパク質糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価方法に適した均一性に優れたケラチンフィルムを調製することができる。
特に、Ｐｒｅ−ｃａｓｔ法に用いる展開用溶媒としては、酢酸溶液が好適に使用され得る。Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法においては、酢酸緩衝液が展開用溶媒として好適である。
また、還元剤としては、２−メルカプトエタノールがＰｏｓｔ−ｃａｓｔ法での使用に適し、ジチオスレイトールがＰｒｅ−ｃａｓｔ法での使用に適している。
展開用溶液は、毛髪ケラチンタンパク質溶液に対し１０〜１００００倍の質量比で用いることが好ましい。前記範囲内で展開用溶液を毛髪ケラチンタンパク質溶液に接触させることにより、適度な薄さを呈する薄膜を調製することができる。
When preparing the keratin film used in the present invention, the Post-cast method or the Pre-cast method can be applied.
As a post-cast method, a container such as a petri dish is filled with the developing solvent in advance and a hair keratin protein solution is cast thereon (forward method), or a container such as a petri dish to which a hair keratin protein solution is added in advance. In addition, a method of casting the developing solution (reverse method) may be mentioned.
The pre-cast method is a method in which a developing solvent is mixed with hair keratin protein in advance, and the mixing solution is cast into a container such as a petri dish filled with water.
In the present invention, a keratin film excellent in uniformity suitable for the method for evaluating the degree of glycation of protein or the glycation inhibitor / improving agent according to the present invention is prepared by applying the Post-cast method and the Pre-cast method. can do.
In particular, an acetic acid solution can be suitably used as a developing solvent used in the Pre-cast method. In the Post-cast method, an acetate buffer is suitable as a developing solvent.
As a reducing agent, 2-mercaptoethanol is suitable for use in the Post-cast method, and dithiothreitol is suitable for use in the Pre-cast method.
The developing solution is preferably used at a mass ratio of 10 to 10,000 times that of the hair keratin protein solution. By bringing the developing solution into contact with the hair keratin protein solution within the above range, a thin film having an appropriate thickness can be prepared.
シャーレ内に形成された薄膜状の毛髪ケラチンタンパク質成形品を前記展開用溶媒で洗浄する。洗浄の回数は特に限定されないが、１〜５回程度であることが好ましい。洗浄後、溶液を取り除き、シャーレ上の毛髪ケラチンタンパク質成形品を乾燥させ、ケラチンフィルムを得ることができる。乾燥の方法は特に限定されないが、埃がつかない室温下で静置することにより乾燥を行なうことなどが挙げられる。 The thin-film hair keratin protein molded product formed in the petri dish is washed with the developing solvent. The number of times of washing is not particularly limited, but is preferably about 1 to 5 times. After washing, the solution is removed, and the hair keratin protein molded product on the petri dish is dried to obtain a keratin film. The drying method is not particularly limited, and examples include drying by standing at room temperature free from dust.
ケラチンフィルムの調製に用いる毛髪サンプルは、油分が多く含まれているものもあり、処理前に予め脱脂しておいてもよい。脱脂の方法としては、例えばクロロホルムとメタノールの混合溶媒での処理等が挙げられるが、その他の慣用の方法を用いてもよく、特に制限されない。 Some hair samples used for the preparation of keratin film contain a large amount of oil, and may be degreased before treatment. Examples of the degreasing method include treatment with a mixed solvent of chloroform and methanol, but other conventional methods may be used and are not particularly limited.
上記ケラチンフィルムは、同一個体の毛髪から調製することもできるが、複数個体の混合毛髪から調製することもできる。
したがって、同一個体におけるタンパク質糖化度を評価することは勿論のこと、混合毛髪のフィルムを用いることで個体差によるデータのぶれを初めから排除し、薬剤の糖化抑制・改善作用を容易に評価することができる。
The keratin film can be prepared from hair of the same individual, but can also be prepared from mixed hair of a plurality of individuals.
Therefore, not only to evaluate the degree of protein glycation in the same individual, but also to eliminate the data blur due to individual differences by using a mixed hair film, and easily evaluate the glycation suppression / improvement effect of the drug. Can do.
前記方法により得たケラチンフィルムは、乾燥させたフィルムをシャーレ等に入れ、吸光光度計を用いて可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における吸光度を測定することで糖化度を測定することができる。前記ケラチンフィルムは、含有タンパク質の糖化度合が高くなる程白濁し、透明性が低下する。したがって、各ケラチンフィルムの吸光度を比較することにより、糖化度合を評価することができる。また、ケラチンフィルムの表面のくすみを目視で観察したり、反射強度を測定することによっても糖化度を評価することが可能である。 The keratin film obtained by the above method can be measured for the degree of saccharification by placing the dried film in a petri dish or the like and measuring the absorbance in the visible light region (400 to 800 nm) using an absorptiometer. The keratin film becomes cloudy as the glycation degree of the contained protein increases, and the transparency decreases. Therefore, the degree of saccharification can be evaluated by comparing the absorbance of each keratin film. The degree of saccharification can also be evaluated by visually observing dullness on the surface of the keratin film or measuring the reflection intensity.
また、前記糖化度の評価において、ケラチンフィルムに糖化処理を施した糖化ケラチンフィルムを比較測定に用いることができる。
ケラチンフィルムの糖化処理は、特定条件下においてケラチンフィルムを糖類溶液に浸漬することによって為し得る。糖類溶液には五炭糖を用いることが好ましく、特にリボース、さらにはＤ−リボースの使用が好ましい。糖類溶液にリボースを適用することにより、タンパク質の糖化に汎用されるグルコース等に比べ、糖化に要する処理時間を著しく短縮することができる。
In the evaluation of the saccharification degree, a saccharified keratin film obtained by subjecting a keratin film to saccharification can be used for comparative measurement.
The saccharification treatment of the keratin film can be performed by immersing the keratin film in a saccharide solution under specific conditions. It is preferable to use a pentose sugar for the saccharide solution, and it is particularly preferable to use ribose, more preferably D-ribose. By applying ribose to the saccharide solution, the processing time required for saccharification can be remarkably shortened compared to glucose or the like commonly used for protein saccharification.
リボース溶液は、生理食塩水、リン酸緩衝液等の溶媒中に、リボースを０．５ｍM〜５Ｍ、より好ましくは５〜５００ｍＭの濃度で溶解して得たものが好ましい。リボース濃度が０．５ｍＭ未満であると糖化に要する時間が長くなる、もしくは毛髪の糖化が不十分となることがあり、リボース濃度が５Ｍを超えても糖化に要する時間や糖化の程度に一定以上の向上は認められない。
前記リボース溶液に浸漬された毛髪サンプルは、ｐH ７．０〜８．０、温度３０〜５０℃の条件下において１２時間〜１０日間インキュベートする。
前記濃度範囲のリボース溶液を用い、且つ前記ｐH及び温度条件を適用することにより、従来数日から数週間を要していた毛髪タンパク質の十分な糖化をほぼ１日で達成することが可能となる。
インキュベート終了後は、ケラチンフィルムを滅菌水等で十分に洗浄して付着したリボース溶液を完全に除去し、必要に応じて乾燥させて前記吸光度の測定に供する。
The ribose solution is preferably obtained by dissolving ribose at a concentration of 0.5 mM to 5 M, more preferably 5 to 500 mM, in a solvent such as physiological saline or phosphate buffer. If the ribose concentration is less than 0.5 mM, the time required for saccharification may become long, or hair saccharification may be insufficient. Even if the ribose concentration exceeds 5 M, the time required for saccharification and the degree of saccharification are above a certain level. The improvement is not recognized.
The hair sample immersed in the ribose solution is incubated for 12 hours to 10 days under conditions of pH 7.0 to 8.0 and temperature 30 to 50 ° C.
By using the ribose solution in the above-mentioned concentration range and applying the pH and temperature conditions, it is possible to achieve sufficient saccharification of hair protein, which conventionally required several days to several weeks, in almost one day. .
After completion of the incubation, the keratin film is sufficiently washed with sterilized water or the like to completely remove the adhering ribose solution, dried as necessary, and used for the measurement of absorbance.
すなわち、上記糖化処理を施したケラチンフィルムを測定に用いる場合、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価は、下記工程を備えることが好ましい。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視領域における吸光度を測定する。
また、本発明者らの検討により、正常な毛髪は糖化度合が高くなる程損傷を受け、強度が低下する傾向にあることが明らかとなった。したがって、ケラチンフィルムの糖化度を指標として毛髪損傷度を評価することができると考えられる。
That is, when using the keratin film which performed the said saccharification process for a measurement, it is preferable to provide the following process for evaluation of the protein saccharification degree concerning this invention.
(I) The keratin film is immersed in a ribose solution for 12 hours to 10 days.
(II) The absorbance in the visible region of the keratin film is measured.
In addition, as a result of studies by the present inventors, it has been clarified that normal hair is damaged and its strength tends to decrease as the degree of saccharification increases. Therefore, it is considered that the hair damage degree can be evaluated using the degree of saccharification of the keratin film as an index.
さらに、本発明においては、上記したタンパク質糖化度の評価を利用して、各種薬剤等のタンパク質の糖化抑制及び／または改善効果を評価することができる。薬剤の具体的な評価方法には、検体としてケラチンフィルムを用いること以外特に制限はなく、例えば、以下のようにして行なうことができる。
まず、同じ毛髪構混合物から得たケラチンフィルムについて、次の（１）〜（３）のサンプルを用意する。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
上記各サンプルの可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における吸光度を測定し、（３）に対する（１）の糖化度合を指標に（２）の糖化度を評価することにより、評価薬剤のタンパク質糖化抑制・改善効果を計ることができる。
また、単に（１）及び（２）の糖化度を比較することで、薬剤の効果を評価してもよい。
評価薬剤は１つのサンプルに２種以上を添加してもよく、薬剤の種類や濃度を変えて（２）のサンプルを複数作成し、各々評価することも可能である。なお、（１）及び（２）におけるリボース溶液への浸漬は、前述の糖化処理条件に準じて行うことができる。
Furthermore, in the present invention, the above-described evaluation of the degree of protein saccharification can be used to evaluate glycation inhibition and / or improvement effects of proteins such as various drugs. A specific method for evaluating a drug is not particularly limited except that a keratin film is used as a specimen, and can be performed, for example, as follows.
First, the following samples (1) to (3) are prepared for keratin films obtained from the same hair composition.
(1) A keratin film immersed in a ribose solution for 12 hours to 10 days.
(2) A keratin film immersed in a ribose solution to which an evaluation agent has been added for 12 hours to 10 days.
(3) Untreated keratin film.
By measuring the absorbance in the visible light region (400 to 800 nm) of each sample, and evaluating the glycation degree of (2) using the degree of glycation of (1) relative to (3) as an index, The improvement effect can be measured.
Moreover, you may evaluate the effect of a chemical | medical agent only by comparing the saccharification degree of (1) and (2).
Two or more kinds of evaluation drugs may be added to one sample, and it is also possible to create a plurality of samples (2) by changing the kind and concentration of the drug and to evaluate each. In addition, the immersion to the ribose solution in (1) and (2) can be performed according to the above-mentioned saccharification treatment conditions.
以下、実施例により本発明にかかる評価方法を具体的に示すが、これらは一例であって本発明を何ら限定するものではない。
＜ケラチンフィルムによる糖化度の評価＞
下記方法により、毛髪由来のケラチンフィルムについて、吸光度とタンパク質の糖化における関係を試験した。
まず、本実施例において使用したケラチンフィルムの調製例を示す。
ケラチンフィルムの調製例１：Pre-cast
毛髪サンプル６００ｍｇを、尿素及びチオ尿素、還元剤、２５ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）８ｍｌを含む混合液に浸漬し、これを５０℃にて４日間保持して毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液３．５ｍｇへ、展開用溶媒６ｍｌを添加、混合し、この混合用液を蒸留水を満たしたシャーレ（直径３５ｍｍ）へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
Hereinafter, the evaluation method according to the present invention will be specifically described by way of examples, but these are merely examples and do not limit the present invention.
<Evaluation of saccharification degree by keratin film>
The relationship between absorbance and protein saccharification was tested for hair-derived keratin films by the following method.
First, the preparation example of the keratin film used in the present Example is shown.
Keratin film preparation example 1: Pre-cast
A hair sample (600 mg) is immersed in a mixed solution containing urea and thiourea, a reducing agent, 8 ml of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and kept at 50 ° C. for 4 days to obtain a hair keratin protein solution. Obtained. Unextracted hair was removed from the solution by filtration to obtain a hair keratin protein solution. 6 ml of the developing solvent was added to and mixed with 3.5 mg of the protein solution, and the mixed solution was gently cast into a petri dish (35 mm in diameter) filled with distilled water. After solidification, the developing solution containing distilled water was changed several times, and the solution in the gel was replaced with distilled water. Finally, distilled water was removed, and it was sufficiently dried in a box containing silica gel to obtain the desired keratin film.
ケラチンフィルムの調製例２：Post-cast
毛髪サンプル６００ｍｇを、尿素及びチオ尿素、還元剤、２５ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）８ｍｌを含む混合液に浸漬し、これを５０℃にて４日間保持して、毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液３．５ｍｇを、展開用溶媒６ｍｌを満たしたシャーレ（直径３５ｍｍ）へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
Keratin film preparation example 2: Post-cast
A hair sample (600 mg) was immersed in a mixed solution containing urea and thiourea, a reducing agent, 8 ml of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and held at 50 ° C. for 4 days to prepare a hair keratin protein solution. Got. Unextracted hair was removed from the solution by filtration to obtain a hair keratin protein solution. 3.5 mg of this protein solution was gently cast into a petri dish (35 mm in diameter) filled with 6 ml of the developing solvent. After solidification, the developing solution containing distilled water was changed several times, and the solution in the gel was replaced with distilled water. Finally, distilled water was removed, and it was sufficiently dried in a box containing silica gel to obtain the desired keratin film.
ケラチンフィルムの糖化
上記で得たケラチンフィルムの一部を３０ｍＭのＤ−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）へ浸漬し、これを３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら２４時間インキュベートした。
その後、ケラチンフィルムを滅菌水に２４時間浸けて洗浄し、インキュベーター内で乾燥させて糖化したケラチンフィルムを得た。なお、前記洗浄中、滅菌水の交換を３回行なった。
Saccharification of keratin film A part of the keratin film obtained above is immersed in phosphate buffered saline (pH 7.4) in which 30 mM D-ribose is dissolved, and this is shaken at 37 ° C (30 to 40 rpm). For 24 hours.
Thereafter, the keratin film was immersed in sterilized water for 24 hours, washed, and dried in an incubator to obtain a saccharified keratin film. During the washing, sterilized water was exchanged three times.
吸光度の測定
上記で得た糖化したケラチンフィルムと、未糖化処理のケラチンフィルムとを、それぞれシャーレに入れ、吸光光度計（POWERSCAN HT、大日本製薬社製）にて２００〜８００ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、コントロールとして、シャーレのみの吸光度についても測定を行なった。結果を図１に示す。また、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における糖化及び未糖化ケラチンフィルムの吸光度をそれぞれ積算した結果を図２に示す。
Measurement of absorbance The saccharified keratin film obtained above and the unsaccharified keratin film were placed in a petri dish, and the absorbance at 200 to 800 nm was measured with an absorptiometer (POWERSCAN HT, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). . As a control, the absorbance of only the petri dish was also measured. The results are shown in FIG. Moreover, the result of integrating | accumulating the light absorbency of the saccharified and non-glycated keratin film in visible region (400-800 nm), respectively is shown in FIG.
図１に示すとおり、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）において、糖化フィルムと未糖化フィルム共に、波長の上昇に伴い吸光度（ＯＤ）が低下する傾向を示したが、両者の値には明らかな差が認められた。この糖化フィルム及び未糖化フィルムにおける吸光度の差は、図２に示した両者の積算値を比較することにより、さらに明瞭となった。すなわち、毛髪由来のケラチンフィルムは、糖化により可視光領域における吸光度が上昇する。
以上のことから、毛髪由来のケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定することにより、毛髪タンパク質の糖化度を評価することができる。また、前記ケラチンフィルムをリボースで処理することによって、容易にタンパク質の糖化サンプルが得られることが明らかである。
As shown in FIG. 1, in the visible light region (400 to 800 nm), both the saccharified film and the unsaccharified film showed a tendency for the absorbance (OD) to decrease as the wavelength increased, but there was a clear difference between the two values. Was recognized. The difference in absorbance between the saccharified film and the unsaccharified film was further clarified by comparing the integrated values of the two shown in FIG. That is, the keratin film derived from hair has increased absorbance in the visible light region due to saccharification.
From the above, the glycation degree of hair protein can be evaluated by measuring the absorbance in the visible light region of the hair-derived keratin film. Moreover, it is clear that a glycated sample of protein can be easily obtained by treating the keratin film with ribose.
＜糖化度と毛髪損傷の関係＞
次の方法により加齢と毛髪の糖化における関係を試験した。
１０〜６０代の男性被験者８４名から毛髪を１０本ずつ採取し、各毛髪の根元から３ｍｍを混合したものをサンプルとした。各サンプルを特開平０６−３０７９１号公報に記載の方法に準じてヒドラジン処理後、発色試薬と反応させ、糖化タンパク質の比色定量を行った。年代ごとに糖化度の平均値（相対値）と標準偏差を算出した結果を図３に示す。
<Relationship between saccharification degree and hair damage>
The relationship between aging and hair saccharification was tested by the following method.
Ten pieces of hair were collected from 84 male subjects in their 10s and 60s, and 3 mm from the base of each hair was mixed as a sample. Each sample was treated with hydrazine according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 06-30791, reacted with a coloring reagent, and glycated protein was colorimetrically determined. The results of calculating the average value (relative value) and standard deviation of the degree of saccharification for each age are shown in FIG.
図３に示すとおり、５０代及び６０代の毛髪の糖化度は、２０代〜４０代の毛髪よりも高いことが明らかになった。この結果から、男性の毛髪は、加齢に伴って糖化が進む傾向にあることが認められる。 As shown in FIG. 3, it was revealed that the glycation degree of hair in the 50s and 60s was higher than that in hair in the 20s to 40s. From this result, it is recognized that saccharification of male hair tends to progress with aging.
続いて、次の方法により毛髪の強度と糖化における関係を試験した。
被験者３名から毛髪（先端２ｃｍ）をそれぞれ採取し、を３０ｍＭのＤ−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）へ浸漬し、これを３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら７２時間インキュベートした。その後、毛髪を滅菌水に２４時間浸けて洗浄を行ない、乾燥させて糖化毛髪を得た（洗浄中、滅菌水は３回交換した）。
前記糖化毛髪と、同一被験者から得た未糖化毛髪とを、それぞれ水中における引っ張り試験（KES-G1-SH, カトーテック社製）に供し、両者の破断までに要する積算荷重（ｇｆ／Ｐ・mm２）を比較した。結果を図４に示す（Ｐ＜０．００５）。
Subsequently, the relationship between hair strength and saccharification was tested by the following method.
Hair (tip 2 cm) was collected from 3 subjects each, immersed in phosphate buffered saline (pH 7.4) in which 30 mM D-ribose was dissolved, and shaken at 37 ° C. (30 to 40 rpm). For 72 hours. Thereafter, the hair was soaked in sterilized water for 24 hours, washed, and dried to obtain saccharified hair (the sterilized water was changed three times during the washing).
The saccharified hair and unsaccharified hair obtained from the same subject are each subjected to a tensile test in water (KES-G1-SH, manufactured by Kato Tech Co., Ltd.), and an integrated load (gf / P · mm) required until both break 2 ) were compared. The results are shown in FIG. 4 (P <0.005).
図４に示すとおり、糖化毛髪は未糖化毛髪に比べ、引っ張り強度に有意な低下が認められた。すなわち、毛髪は糖化により損傷を受け、破断し易くなったと考えられる。
以上の試験結果に鑑みると、加齢と毛髪損傷の関係、あるいは加齢または毛髪損傷それぞれの検討において、糖化度はその指標として広く用い得るものと認められる。
As shown in FIG. 4, the saccharified hair was significantly reduced in tensile strength as compared with the unsaccharified hair. That is, it is considered that the hair was damaged by saccharification and easily broken.
In view of the above test results, it is recognized that the degree of saccharification can be widely used as an index in the relationship between aging and hair damage, or in each study of aging or hair damage.
＜タンパク質の糖化抑制・改善剤の評価＞
下記各評価方法により、Ｌ−アルギニンのタンパク質糖化抑制効果を検討した。評価方法は次のとおりである。
実施例１
上記調製方法により得たケラチンフィルム１２枚を、下記表１に示す構成の溶液へそれぞれ浸漬した。各サンプルは３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら２４時間インキュベートした。
インキュベート後、ケラチンフィルムを滅菌水に２４時間浸け、洗浄を行なった（洗浄中、滅菌水を３回交換した）。
洗浄後、各ケラチンフィルムをデシケーター内で乾燥し、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）の吸光度を測定した。吸光度に基づく糖化度の評価結果を図５に示す。なお、図５における糖化量は、糖液及び薬剤処理を行ったサンプル４〜６（Ｌ−アルギニン未添加）、サンプル７〜９（Ｌ−アルギニン０．１％添加）、サンプル１０〜１２（Ｌ−アルギニン１％添加）それぞれの可視光領域の吸光度積算値から、未処理サンプル（サンプル１〜３）の可視光領域の吸光度積算値を引いた差を示す。
<Evaluation of protein glycation inhibitor / improving agent>
By the following evaluation methods, the protein saccharification inhibitory effect of L-arginine was examined. The evaluation method is as follows.
Example 1
Twelve keratin films obtained by the above preparation method were respectively immersed in solutions having configurations shown in Table 1 below. Each sample was incubated at 37 ° C. with shaking (30-40 rpm) for 24 hours.
After the incubation, the keratin film was soaked in sterilized water for 24 hours for washing (the sterilized water was changed three times during the washing).
After washing, each keratin film was dried in a desiccator, and the absorbance in the visible light region (400 to 800 nm) was measured. The evaluation result of the degree of saccharification based on the absorbance is shown in FIG. In addition, the amount of saccharification in FIG. 5 is the samples 4 to 6 (L-arginine not added), samples 7 to 9 (L-arginine 0.1% added), samples 10 to 12 (L -Addition of 1% arginine) The difference obtained by subtracting the integrated absorbance value in the visible light region of each untreated sample (samples 1 to 3) from the integrated absorbance value in each visible light region is shown.
（表１）
(Table 1)
また、同様に、Ｌ−リシンについてもタンパク質糖化抑制効果を評価した。
実施例２
上記実施例１と同様の方法を用い、表１のＬ−アルギニンをＬ−リシン塩酸塩に替えて評価を行なった。結果を図５に示す。
Similarly, L-lysine was also evaluated for protein saccharification inhibitory effect.
Example 2
Evaluation was performed using the same method as in Example 1 except that L-arginine in Table 1 was replaced with L-lysine hydrochloride. The results are shown in FIG.
図５に示すとおり、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシンを添加した糖類溶液で処理したケラチンフィルムは、前記薬剤を添加しない糖類溶液で処理したケラチンフィルムに比べ、糖化量が抑制されていた。したがって、ケラチンフィルムを検体として用いることによって、薬剤のタンパク質の糖化抑制効果を簡便な操作で迅速に評価することができると認められる。
また、この結果から、アルギニン及びリジンが毛髪タンパク質の糖化抑制効果を有することが分かった。さらに詳細な検討を行った結果、アルギニン及び／またはリジンを毛髪化粧料に配合する場合、その配合量は、化粧料に対しそれぞれ０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜１質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％であることが明らかになった。
As shown in FIG. 5, the amount of saccharification of the keratin film treated with the saccharide solution added with L-arginine or L-lysine was suppressed as compared with the keratin film treated with the saccharide solution not added with the drug. Therefore, it is recognized that by using a keratin film as a specimen, the effect of inhibiting glycation of a protein of a drug can be quickly evaluated with a simple operation.
Moreover, from this result, it was found that arginine and lysine have an effect of suppressing glycation of hair proteins. As a result of further detailed investigation, when arginine and / or lysine is blended in the hair cosmetic, the blending amount is 0.0001 to 10% by mass, preferably 0.001 to 1% by mass, based on the cosmetic, respectively. It was revealed that the content was more preferably 0.01 to 0.1% by mass.
以下、タンパク質の糖化抑制剤としてアルギニンまたはリジンを配合した毛髪化粧料の処方例を示すが、これらは本発明を何ら制限するものではない。
処方例１〜４の毛髪化粧料は全て、毛髪ケラチンフィルムによる本発明にかかる評価方法により、優れたタンパク質の糖化抑制作用を有することが示された。
Hereinafter, although the formulation example of hair cosmetics which mix | blended arginine or lysine as a protein glycation inhibitor is shown, these do not limit this invention at all.
It was shown that all the hair cosmetics of Formulation Examples 1 to 4 have an excellent protein glycation-inhibiting action by the evaluation method according to the present invention using a hair keratin film.
＜処方例１ 育毛料＞
（配合成分） （質量％）
Ｌ−アルギニン ０．１
エタノール ６０
ジプロピレングリコール ２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
乳酸 適 量
乳酸ナトリウム液 適 量
グリチルリチン酸モノアンモニウム ０．１
ニコチン酸アミド ０．１
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール ０．１
Ｌ−メントール ０．２
色素 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
<Prescription Example 1 Hair Growth>
(Compounding ingredients) (mass%)
L-Arginine 0.1
Ethanol 60
Dipropylene glycol 2
Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 0.5
Lactic acid Appropriate amount Sodium lactate solution Appropriate amount Monoammonium glycyrrhizinate 0.1
Nicotinamide 0.1
DL-α-tocopherol acetate 0.1
L-Menthol 0.2
Dye Appropriate amount Purified water Residual fragrance
＜処方例２ 頭髪用化粧料＞
（配合成分） （質量％）
塩酸Ｌ−リジン ０．１
揮発性イソパラフィン １４
ジメチルポリシロキサン ８
エタノール 適 量
精製水 ２
高重合ジメチルシロキサン・メチル（アミノプロピル）シロキサン共重合体
４
ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）・メチルポリシロキサン共重合体
４
香料 適 量
（製造方法）
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し（原液／噴射剤＝４０／６０（Ｌ．Ｐ．Ｇ． ０．１１５ＭＰａ））、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
<Prescription example 2 hair cosmetics>
(Compounding ingredients) (mass%)
L-lysine hydrochloride 0.1
Volatile isoparaffin 14
Dimethylpolysiloxane 8
Ethanol appropriate amount Purified water 2
Highly polymerized dimethylsiloxane / methyl (aminopropyl) siloxane copolymer
4
Poly (oxyethylene / oxypropylene) / methylpolysiloxane copolymer
4
Perfume appropriate amount (production method)
The above-mentioned stock solution was filled into a container together with a propellant (stock solution / propellant = 40/60 (LPG 0.115 MPa)) to obtain a cosmetic for hair in a spray form.
＜処方例３ 頭髪用化粧料＞
（配合成分） （質量％）
Ｌ−アルギニン ０．０１
流動パラフィン ６
ジメチルポリシロキサン ５
グリセリン ８
プロピレングリコール ８
ブチルエチルプロパンジオール ０．５
ホホバ油 １
カルナウバロウ ５
イソステアリン酸 ０．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル ５
２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
８
フェノキシエタノール ０．５
高重合ジメチルポリシロキサン ０．５
精製水 残 余
香料 適 量
（製造方法）
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し（原液／噴射剤＝９０／１０（Ｌ．Ｐ．Ｇ． ０．４３ＭＰａ））、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
<Prescription Example 3 Cosmetics for hair>
(Compounding ingredients) (mass%)
L-Arginine 0.01
Liquid paraffin 6
Dimethylpolysiloxane 5
Glycerin 8
Propylene glycol 8
Butylethylpropanediol 0.5
Jojoba oil 1
Carnauba wax 5
Isostearic acid 0.5
Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 0.5
Polyoxyethylene behenyl ether 5
2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine
8
Phenoxyethanol 0.5
Highly polymerized dimethylpolysiloxane 0.5
Purified water Residual fragrance Appropriate amount (production method)
The above stock solution was filled into a container together with a propellant (stock solution / propellant = 90/10 (LPG 0.43 MPa)) to obtain a cosmetic for hair in a spray form.
＜処方例４ シャンプー＞
（配合成分） （質量％）
塩酸Ｌ−リジン ０．０１
ジステアリン酸エチレングリコール １．５
ヤシ油脂肪酸エタノールアミド ５．５
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム ８
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン ５
ポリマーＪＲ−４００（ユニオンカーバイド社製） ０．５
クエン酸 ０．５
塩化ナトリウム １．２
ビワ葉エキス ０．１
フェノキシエタノール ０．１
安息香酸ナトリウム 適 量
エデト酸２ナトリウム 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
<Prescription Example 4 Shampoo>
(Compounding ingredients) (mass%)
L-lysine hydrochloride 0.01
Ethylene glycol distearate 1.5
Palm oil fatty acid ethanolamide 5.5
Coconut oil fatty acid methyl taurine sodium 8
Palm oil fatty acid amidopropyl betaine 5
Polymer JR-400 (Union Carbide) 0.5
Citric acid 0.5
Sodium chloride 1.2
Loquat leaf extract 0.1
Phenoxyethanol 0.1
Sodium benzoate Appropriate amount Disodium edetate Appropriate amount Purified water Residual fragrance Appropriate amount
Claims (5)
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。 The method according to claim 1, comprising the following steps.
(I) The keratin film is immersed in a ribose solution for 12 hours to 10 days.
(II) The absorbance of the keratin film in the visible light region is measured.
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。 The method for evaluating a protein saccharification inhibitor / ameliorating agent according to claim 4, wherein the absorbance in the visible region of the following keratin films (1) to (3) is compared and measured.
(1) A keratin film immersed in a ribose solution for 12 hours to 10 days.
(2) A keratin film immersed in a ribose solution to which an evaluation agent has been added for 12 hours to 10 days.
(3) Untreated keratin film.
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