JP2021148492A - Horny cell layer separation improving agent and method for screening the same - Google Patents
Horny cell layer separation improving agent and method for screening the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021148492A JP2021148492A JP2020046374A JP2020046374A JP2021148492A JP 2021148492 A JP2021148492 A JP 2021148492A JP 2020046374 A JP2020046374 A JP 2020046374A JP 2020046374 A JP2020046374 A JP 2020046374A JP 2021148492 A JP2021148492 A JP 2021148492A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stratum corneum
- cell adhesion
- adhesion factor
- desmoglein
- corneum cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 claims description 199
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 110
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 52
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 52
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 39
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 claims description 37
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 claims description 28
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 claims description 27
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 27
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 23
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 21
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000036252 glycation Effects 0.000 claims description 11
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 102000011799 Desmoglein Human genes 0.000 claims description 2
- 108050002238 Desmoglein Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 14
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 abstract 4
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 abstract 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract 1
- 102000005708 Desmoglein 1 Human genes 0.000 description 79
- 108010045579 Desmoglein 1 Proteins 0.000 description 79
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 50
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 45
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 42
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000218033 Hibiscus Species 0.000 description 14
- 235000005206 Hibiscus Nutrition 0.000 description 14
- 235000007185 Hibiscus lunariifolius Nutrition 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 13
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 13
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100034868 Kallikrein-5 Human genes 0.000 description 9
- 101710176223 Kallikrein-5 Proteins 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100021202 Desmocollin-1 Human genes 0.000 description 6
- 101710157876 Desmocollin-1 Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 6
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 6
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 5
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 5
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-N peroxynitrous acid Chemical compound OON=O CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 4
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 4
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 4
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 4
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 3
- 210000001047 desmosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynonenal Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004784 Cymbopogon citratus Species 0.000 description 2
- 235000017897 Cymbopogon citratus Nutrition 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000924316 Homo sapiens Desmoglein-1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038297 Kallikrein-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710176219 Kallikrein-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023970 Keratin, type I cytoskeletal 10 Human genes 0.000 description 2
- 108010065038 Keratin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 102000005806 Serine Peptidase Inhibitor Kazal-Type 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010005020 Serine Peptidase Inhibitor Kazal-Type 5 Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N Tetranitromethane Chemical compound [O-][N+](=O)C([N+]([O-])=O)([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000056110 human DSG1 Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOMZHDJXSYHPKS-DROYEMJCSA-L Amido Black 10B Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC2=CC(S([O-])(=O)=O)=C(\N=N\C=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1\N=N\C1=CC=C(N(=O)=O)C=C1 AOMZHDJXSYHPKS-DROYEMJCSA-L 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 239000004342 Benzoyl peroxide Substances 0.000 description 1
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000004201 Ceramidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000751 Ceramidases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BHYOQNUELFTYRT-UHFFFAOYSA-N Cholesterol sulfate Natural products C1C=C2CC(OS(O)(=O)=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 BHYOQNUELFTYRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001340526 Chrysoclista linneella Species 0.000 description 1
- 241000209205 Coix Species 0.000 description 1
- 241001327300 Cymbopogon schoenanthus Species 0.000 description 1
- 102000029792 Desmoplakin Human genes 0.000 description 1
- 108091000074 Desmoplakin Proteins 0.000 description 1
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- 101000856199 Homo sapiens Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001047819 Homo sapiens Heparanase Proteins 0.000 description 1
- 102100038298 Kallikrein-14 Human genes 0.000 description 1
- 101710115806 Kallikrein-14 Proteins 0.000 description 1
- 102100038301 Kallikrein-15 Human genes 0.000 description 1
- 101710115873 Kallikrein-15 Proteins 0.000 description 1
- 102100034867 Kallikrein-7 Human genes 0.000 description 1
- 101710176222 Kallikrein-7 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108010087999 Steryl-Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 102100038021 Steryl-sulfatase Human genes 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- BHYOQNUELFTYRT-DPAQBDIFSA-N cholesterol sulfate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 BHYOQNUELFTYRT-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000037336 dry skin Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000000802 nitrating effect Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 nitronium ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- ZEODWVHHPARISX-UHFFFAOYSA-N oxocarbamoperoxoic acid Chemical compound OOC(=O)N=O ZEODWVHHPARISX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000007845 reactive nitrogen species Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000037075 skin appearance Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 230000036548 skin texture Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003696 structure analysis method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 108010036927 trypsin-like serine protease Proteins 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
- 239000009538 yokuinin Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
本発明は、角層剥離改善剤及びそのスクリーニング方法に関する。より詳細には、タンパク質の修飾による角層細胞接着因子の状態変化の制御作用等を有する角層剥離改善剤、及び当該制御作用等指標として角層剥離改善剤をスクリーニングする方法、に関する。 The present invention relates to a stratum corneum exfoliation improving agent and a screening method thereof. More specifically, the present invention relates to a horny layer exfoliation improving agent having an action of controlling a state change of a horny layer cell adhesion factor due to protein modification, and a method of screening a horny layer peeling improving agent as an index of the controlling action or the like.
角層は皮膚の最表層に位置し、生体と外部環境の間の物理的・化学的バリアとして機能するほか、皮膚の質感や外観を調整し、健康的な生体や皮膚の維持にとって、健常な角層の維持は不可欠である。この健常な角層の維持においては、表皮ターンオーバー、すなわち、表皮基底層における表皮細胞の増殖と角化、角層剥離の過程（角層剥離の過程は落屑とも呼ばれる）が適切に進行することが重要である。中でも角層剥離は、種々の酵素によって細胞接着因子の分解が複雑に制御された過程であり、それら分子の量や機能が精密に制御されている必要がある。 The stratum corneum is located on the outermost layer of the skin and functions as a physical and chemical barrier between the living body and the external environment. It also regulates the texture and appearance of the skin and is healthy for maintaining a healthy living body and skin. Maintenance of the stratum corneum is essential. In the maintenance of this healthy stratum corneum, epidermal turnover, that is, the process of proliferation and keratinization of epidermal cells in the basal layer of the epidermis and the process of exfoliation of the epidermis (the process of exfoliation of the epidermis is also called desquamation) proceeds appropriately. is important. Among them, stratum corneum exfoliation is a process in which the decomposition of cell adhesion factors is complicatedly controlled by various enzymes, and the amount and function of these molecules need to be precisely controlled.
正常な皮膚では、角層の細胞同士を接着している細胞接着因子の分解がスムーズに行われるため、角層の最外層では角層の細胞同士の接着が弱くなり、自然な剥離が行なわれる。一方、表皮細胞の異常な増殖亢進や酵素活性の低下、角層剥離酵素抑制因子の異常などは、細胞接着因子分解過程の精密な制御を乱し、皮膚の粗い質感や外観、皮膚疾患の原因となる。また、上記異常などが局所的に生じることによって、異常を来していない、周囲の皮膚との違いが外観上明確に認識されるため、角層剥離の異常は美容上、特に好ましくない。従って、健康的な生体や皮膚の維持にとって、正常な角層剥離過程の維持は極めて重要である。 In normal skin, the cell adhesion factor that adheres the cells of the stratum corneum is smoothly decomposed, so that the adhesion between the cells of the stratum corneum is weakened in the outermost layer of the stratum corneum, and natural exfoliation occurs. .. On the other hand, abnormal hyperproliferation of epidermal cells, decreased enzyme activity, and abnormalities of stratum corneum exfoliating enzyme inhibitor disturb the precise control of the cell adhesion factor decomposition process, causing rough skin texture and appearance, and skin diseases. It becomes. Further, since the above-mentioned abnormality or the like occurs locally, the difference from the surrounding skin, which does not cause the abnormality, is clearly recognized from the appearance, so that the abnormality of the exfoliation of the stratum corneum is not particularly preferable from the viewpoint of cosmetics. Therefore, maintaining a normal process of exfoliation of the stratum corneum is extremely important for maintaining a healthy living body and skin.
特許文献１において、保湿剤は、角層の落屑にも関与し、健全な皮膚を維持する上で、一定の効果を果たすことが知られているが、皮膚上のキモトリプシン様酵素やトリプシン様酵素の酵素活性が低下しているような場合には、保湿剤の使用のみによっては、十分に角層が剥離させることが困難な場合が多く認められることが開示されている。また、特許文献２において、皮膚表面形状のケアとして、一般的には保湿剤や角質ケア剤が使われるが、それぞれ、保湿剤は効果発現が比較的遅く効果実感が得られにくい、角質ケア剤は刺激性がある等が課題となっており、皮膚表面形状を早期に改善し、その改善効果を実感でき、安全に使用できる改善技術が必要であることが述べられている。しかしながら、どちらの特許文献においても、角層剥離酵素の活性化を作用対象とし、生体由来の角層剥離酵素を含むと目される日焼けしたヒト皮膚から得た角層あるいは健常なヒト皮膚そのものに被験試料を1週間という長期間適用し、細胞接着因子であるデスモグレインの残存度を測定することによって被験試料の有用性を評価しており、そもそも生体に備わった角層剥離酵素の人為的な活性化によらない作用の影響が除去できないため、被験者毎に試験前のデスモグレイン量が異なること、角層剥離改善剤適用の必要性の高い皮膚トラブルを有するヒトと異なり、試験に参加していただきやすい健常なヒトではデスモグレイン残存度は比較的少ないこと、日焼けしたヒト皮膚等からの角層の取得が容易ではないこと、また、測定可能な程度の酵素活性の発現に長期間を要することなど、有用な角層剥離改善剤を多数の試料から精度よく見出すには困難があった。このような背景を踏まえ、有用な角層剥離促進剤、およびその探索手段が求められていた。
In
角層細胞には、細胞接着因子の一種、コルネオデスモソームが存在する。コルネオデスモソームとは、角化細胞が顆粒細胞から角層細胞になるときにデスモゾームが構造変化したものである。コルネオデスモソームは、顆粒細胞のデスモゾーム構成の主要素であるデスモグレイン１（ＤＳＧ１）とデスモコリン１（ＤＳＣ１）に加えて、細胞内の層板顆粒から供給されるコルネオデスモシン（ＣＤＳＮ）が細胞外部分に加わり構成される。 Corneodesmosome, a type of cell adhesion factor, is present in stratum corneum cells. Corneodesmosomes are structural changes in desmosomes when keratinocytes change from granule cells to stratum corneum cells. In the corneodesmosome, in addition to desmoglein 1 (DSG1) and desmocollin 1 (DSC1), which are the main elements of the desmosome composition of granule cells, corneodesmocin (CDSN) supplied from the intracellular lamellar granules is an extracellular part. Is composed of.
コルネオデスモソームの分解には ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ-ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ （ＫＬＫ）、カテプシンＶ(別名カテプシンＬ２、もしくはｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｔｈｉｏｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ)、カテプシンＬ様酵素、カテプシンＤ様酵素、カテプシンＥ様酵素などのタンパク分解酵素が関与しており、タンパク質分解酵素以外では、細胞間脂質の分解に関わるセラミダーゼ、その他にステロイドスルファターゼ、ヘパラナーゼ１も角層剥離の過程で関わっていることが知られている。
カリクレインはカリクレイン１からカリクレイン１５までの１５種類からなるセリンプロテアーゼに属する酵素ファミリーである。皮膚ではコルネオデスモソーム成分を分解する作用が証明されているカリクレイン５、カリクレイン７、カリクレイン１４を含む少なくとも８つのカリクレインが発現しており、角層においてはトリプシン様セリンプロテアーゼであるカリクレイン５がデスモグレイン１とデスモコリン１を、キモトリプシン様セリンプロテアーゼであるカリクレイン７はデスモコリン１を分解し、さらに両者はコルネオデスモシンを分解することがｉｎ ｖｉｔｒｏの研究から明らかにされている。
この働きを調節する因子としては、ＬＥＫＴＩをはじめとする剥離酵素のインヒビター、相対湿度、硫酸コレステロール、遊離脂肪酸、ｐＨ、Ｃａ２＋、酸化などがある（非特許文献２）。
角層剥離には、コルネオデスモソームに対するカリクレインの作用の寄与が大きく、ＬＥＫＴＩがカリクレインの作用を抑制すると角層剥離も抑制される。
Proteases such as kalikrein-related peptidases (KLK), catepsin V (also known as catepsin L2, or stratum corneum thiol protein), catepsin L-like enzyme, catepsin D-like enzyme, and catepsin E-like enzyme are involved in the degradation of corneodesmosomes. In addition to proteolytic enzymes, it is known that ceramidase, which is involved in the degradation of intercellular lipids, and steroid sulfatase and
Kallikrein is an enzyme family belonging to 15 types of serine proteases from
Factors that regulate this function include inhibitors of exfoliating enzymes such as LEKTI, relative humidity, cholesterol sulfate, free fatty acids, pH, Ca 2+ , and oxidation (Non-Patent Document 2).
The action of kallikrein on corneodesmosomes contributes significantly to the exfoliation of the stratum corneum, and when LEKTI suppresses the action of kallikrein, the exfoliation of the stratum corneum is also suppressed.
一方で、角層では糖化やカルボニル化、ニトロ化などのタンパク質修飾が起こっていることが知られている。
糖化については、角層中の終末糖化産物（ＡＧＥｓ）と表皮粘弾性や皮膚表面形態の平均粗さとの関連性（非特許文献３）、表皮中ケラチン１０の糖化による角層細胞の形成異常（特許文献３）、カルボニル化については、角層中ケラチンのカルボニル化による皮膚の乾燥（特許文献４）、露光部角層のカルボニル化タンパク質による光学的透過性低下（非特許文献４）、角層タンパク質の酸化（カルボニル化）による肌の柔軟性・弾力性の低下（特許文献５）が報告されている。また、角層のニトロ化と肌状態については、黄ぐすみの原因となっていることが報告されている（特許文献６）。
以上のように、角層においてタンパク質修飾が生じ、皮膚状態に関与することは知られていたものの、角層細胞接着因子においてタンパク質修飾が生じることやタンパク質修飾が角層剥離の過程に及ぼす影響は全く知られていなかった。
さらに、特許文献３には、表皮中ケラチン１０の糖化はケラチン繊維の凝集を阻害することで角層細胞の形成異常を引き起こすことが報告されているが、角層におけるタンパク質修飾が凝集を引き起こす可能性、延いては角層細胞接着因子におけるタンパク質修飾が、角層細胞接着因子の凝集を引き起こす可能性や接着が弱くなるのではなく逆に強くなる可能性については全く想定されていなかった。したがって、角層剥離促進剤のスクリーニングに際して、ヒト皮膚やヒト皮膚から得た角層を必ずしも必要とせず、角層細胞接着因子に着目し、タンパク質修飾によって変化する角層細胞接着因子の状態のみでも指標にできうることは、全く知られていなかった。
On the other hand, it is known that protein modifications such as saccharification, carbonylation, and nitration occur in the stratum corneum.
Regarding glycation, the relationship between terminal glycation products (AGEs) in the stratum corneum and epidermal viscoelasticity and average roughness of skin surface morphology (Non-Patent Document 3), and dysplasia of stratum corneum cells due to glycation of keratin 10 in the epidermis (Non-Patent Document 3). Regarding patent documents 3) and carbonylation, dry skin due to carbonylation of keratin in the stratum corneum (Patent Document 4), decrease in optical permeability due to carbonylation protein in the exposed area stratum corneum (Non-Patent Document 4), stratum corneum It has been reported that skin softness and elasticity are reduced due to protein oxidation (carbonylation) (Patent Document 5). In addition, it has been reported that nitration of the stratum corneum and skin condition cause yellowing (Patent Document 6).
As described above, although it was known that protein modification occurs in the stratum corneum and is involved in the skin condition, the occurrence of protein modification in the stratum corneum cell adhesion factor and the effect of protein modification on the process of stratum corneum detachment are It was completely unknown.
Further,
本発明は、角層細胞接着因子の状態を指標とした角層剥離改善剤の探索を可能にする方法及びその効果に優れた角層剥離改善剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method that enables a search for a horny layer peeling improving agent using the state of a horny layer cell adhesion factor as an index, and a horny layer peeling improving agent having an excellent effect thereof.
より具体的には下記の発明に関する：
〔１〕角層細胞接着因子の状態を指標とする、角層剥離改善剤のスクリーニング方法。
〔２〕（１）角層細胞接着因子と、候補素材を含む被験溶液または候補素材を含まないブランク溶液を混合する工程
（２）タンパク質を修飾する反応を施す工程
（３）角層細胞接着因子の状態を測定する工程
を含む〔１〕に記載の方法。
〔３〕（１）角層細胞接着因子と、候補素材を含む被験溶液または候補素材を含まないブランク溶液を混合する工程
（２）タンパク質を修飾する工程
（３）角層細胞接着因子の分解酵素を添加する工程
（４）角層細胞接着因子の状態を測定する工程
を含む〔１〕に記載の方法。
〔４〕角層細胞接着因子がデスモグレインである〔１〕〜〔３〕いずれかに記載のスクリーニング方法。
〔５〕タンパク質を修飾する反応が、糖化、カルボニル化、またはニトロ化の中から選ばれる１種以上である〔１〕〜〔４〕いずれかに記載のスクリーニング方法。
〔６〕角層細胞接着因子の状態が、以下から選択される少なくとも１種以上である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１）角層細胞接着因子の凝集・高分子化
（２）凝集・高分子化していない角層細胞接着因子に対する角層細胞接着因子分解酵素処理により生じた角層細胞接着因子の分解
〔７〕〔１〕〜〔６〕いずれかに記載のスクリーニング方法により選択された角層剥離改善剤。
〔８〕〔７〕の角層剥離改善剤を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
〔９〕〔１〕〜〔６〕いずれかに記載の方法を用いて角層剥離改善効果を評価する方法。
More specifically, the following inventions:
[1] A method for screening a stratum corneum exfoliation improving agent using the state of a stratum corneum cell adhesion factor as an index.
[2] (1) A step of mixing the stratum corneum cell adhesion factor with a test solution containing a candidate material or a blank solution containing no candidate material (2) A step of subjecting a reaction to modify a protein (3) A stratum corneum cell adhesion factor The method according to [1], which comprises a step of measuring the state of.
[3] (1) A step of mixing the stratum corneum cell adhesion factor with a test solution containing a candidate material or a blank solution containing no candidate material (2) A step of modifying a protein (3) A degrading enzyme of the stratum corneum cell adhesion factor (4) The method according to [1], which comprises a step of measuring the state of the stratum corneum cell adhesion factor.
[4] The screening method according to any one of [1] to [3], wherein the stratum corneum cell adhesion factor is desmoglein.
[5] The screening method according to any one of [1] to [4], wherein the reaction for modifying a protein is one or more selected from glycation, carbonylation, and nitration.
[6] The screening method according to any one of [1] to [5], wherein the state of the stratum corneum cell adhesion factor is at least one selected from the following.
(1) Aggregation and polymerization of stratum corneum cell adhesion factor (2) Degradation of stratum corneum cell adhesion factor caused by treatment with stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme for non-aggregated and non-polymerized stratum corneum cell adhesion factor [7] ] The stratum corneum peeling improver selected by the screening method according to any one of [1] to [6].
[8] An external preparation for skin, which comprises the stratum corneum exfoliation improving agent of [7].
[9] A method for evaluating the effect of improving the exfoliation of the stratum corneum by using the method according to any one of [1] to [6].
本発明によれば、作用が発揮されやすい角層剥離促進剤を多数の試料から精度よく短時間でスクリーニングすることが可能になる。このことにより、角層剥離の改善による皮膚状態の健全性の維持や健全化が可能となる。 According to the present invention, it is possible to accurately screen a large number of samples for a stratum corneum exfoliation accelerator, which is likely to exert its action, in a short time. This makes it possible to maintain and improve the soundness of the skin condition by improving the exfoliation of the stratum corneum.
本発明者は、鋭意研究した結果、角層剥離改善剤及びそのスクリーニング方法を研究する過程で、糖化、カルボニル化、またはニトロ化により角層細胞接着因子の凝集・高分子化物の生成やタンパク質構造の変化等が生じ、このことにより分解酵素による分解が阻害される、という驚くべき知見を得た。 As a result of diligent research, the present inventor, in the process of studying a stratum corneum exfoliation improving agent and its screening method, aggregates and polymerizes stratum corneum cell adhesion factor by saccharification, carbonylation, or nitration, and protein structure. We have obtained the surprising finding that the degradation by degrading enzymes is inhibited by the change of the protein.
上記知見に基づけば、角層剥離の正常性が低下した皮膚では、何らかの理由により角層細胞接着因子が糖化、カルボニル化、またはニトロ化等のタンパク質修飾を受け、驚くべきことにこのようなタンパク質修飾が角層細胞接着因子の接着作用を妨害するのではなく、これによりタンパク質の凝集や高分子化を生じ、結果として角層接着因子の分解酵素が十分に機能しにくいことで、円滑な角層剥離が阻害された状態になっていることが考えられた。即ち、これらの状態が解消できれば、角層剥離の遅延を改善できるとの結論に達し、本発明の角層剥離改善剤をスクリーニングする方法を開発するに至った。以下に詳細を述べる。 Based on the above findings, in skin with reduced normality of stratum corneum detachment, for some reason, stratum corneum cell adhesion molecules undergo protein modifications such as glycation, carbonylation, or nitration, and surprisingly such proteins. The modification does not interfere with the adhesion action of the stratum corneum cell adhesion factor, but it causes protein aggregation and polymerization, and as a result, the degrading enzyme of the stratum corneum adhesion factor does not function sufficiently, resulting in smooth horns. It was considered that the layer peeling was inhibited. That is, it was concluded that if these conditions could be resolved, the delay in the exfoliation of the stratum corneum could be improved, and a method for screening the exfoliation improving agent for the stratum corneum of the present invention was developed. Details will be described below.
本発明でいう角層剥離を改善するとは、角層剥離を促進することにより角層剥離の遅延の予防や遅延した角層剥離の円滑化によって皮膚の質感や外観を調整し皮膚の状態を健全に保つ、あるいは健全化すること、角層細胞接着因子のタンパク質修飾を防ぐことにより皮膚状態を健全に保つ、あるいは健全化することを意味する。 Improving the exfoliation of the stratum corneum in the present invention means to prevent the delay of exfoliation of the stratum corneum by promoting the exfoliation of the stratum corneum and to adjust the texture and appearance of the skin by facilitating the delayed exfoliation of the stratum corneum to improve the condition of the skin. It means to keep the skin condition healthy or to be healthy by preventing the protein modification of the stratum corneum cell adhesion factor.
本発明で用いられる角層細胞接着因子は、特に限定されない。角層細胞接着因子としては、デスモソームの構成成分であるデスモグレイン１、２、３、４、デスモコリン１、２、３、コルネオデスモシン、プラコグロビン、プラコフィリン、デスモプラキン１、２等を挙げることができる。
The stratum corneum cell adhesion factor used in the present invention is not particularly limited. Examples of the stratum corneum cell adhesion molecule include
角層細胞接着因子は市販の試料などであってよく、遺伝子組み換え体などが使用できる。例えば、デスモグレイン１であれば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ−１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ （Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＤＳＧ１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ）等が、デスモコリン１であればＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ−１（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）， Ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ−１ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｙｓａｔｅ （ＮＯＶＵＳ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ）等が使用できる。
The stratum corneum cell adhesion factor may be a commercially available sample or the like, and a genetically modified product or the like can be used. For example, in the case of
角層細胞接着因子は細胞や皮膚等から抽出されたものであってもよい。採取した角層に溶解バッファー(例えば、８Ｍ Ｕｒｅａ， １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２％ ＳＤＳ， ５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ)を加えて得られる角層細胞接着因子を豊富に含む溶液等が使用できる。皮膚等からの抽出に際しては、複数名・複数個所から収集した採取物を混合したり、濃縮や精製を行ったりすることによって、試験結果の安定化や感度の調整を行ってよい。 The stratum corneum cell adhesion factor may be extracted from cells, skin, or the like. A solution rich in stratum corneum cell adhesion factor obtained by adding a lysis buffer (for example, 8M urea, 100 mM Tris-HCl, 2% SDS, 5 mM EDTA, 1% Mercaptoethanol) to the collected stratum corneum can be used. When extracting from the skin or the like, the test results may be stabilized and the sensitivity may be adjusted by mixing, concentrating or purifying the samples collected from a plurality of persons or from a plurality of places.
細胞や皮膚、採取した角層等から角層細胞接着因子を抽出して試料とする場合は、タンパク質を修飾する反応を施す工程は角層細胞接着因子を抽出する前に施してもよく、該工程後に角層細胞接着因子を抽出して試料とすることもできる。 When the stratum corneum cell adhesion factor is extracted from cells, skin, collected stratum corneum, etc. and used as a sample, the step of subjecting the protein modification reaction may be performed before the stratum corneum cell adhesion factor is extracted. After the step, the stratum corneum cell adhesion factor can be extracted and used as a sample.
角層細胞接着因子の状態とは、構造的、または化学的な状態もしくは形態であって、例えばタンパク質の分子量、分子サイズや立体構造で現される形状もしくは形態が挙げられる。より具体的には、角層細胞接着因子が化合物もしくは他のタンパク質と共有結合した凝集・高分子化した後の形状、角層細胞接着因子が分解酵素等により分解された後の形状、ジスルフィド結合等の結合により変化した立体構造が例に挙げられる。 The state of the stratum corneum cell adhesion factor is a structural or chemical state or morphology, and examples thereof include a shape or morphology expressed by the molecular weight, molecular size or three-dimensional structure of a protein. More specifically, the shape after aggregation / polymerization of the stratum corneum cell adhesion factor covalently bound to a compound or other protein, the shape after the stratum corneum cell adhesion factor is decomposed by a degrading enzyme or the like, and the disulfide bond. An example is a three-dimensional structure changed by a bond such as.
「角層細胞接着因子の状態を指標とする」とは、 任意の方法を用いて角層細胞接着因子の状態が変化した量を効果判定の基準にするという趣旨である。
具体的には、角層細胞接着因子の凝集・高分子化物が生成した量を判定基準にする、またはタンパク質修飾反応を施す前の分子量や分子サイズの角層細胞接着因子が分解酵素等により分解された量を判定基準にするということである。
"Using the state of the stratum corneum cell adhesion factor as an index" means that the amount of change in the state of the stratum corneum cell adhesion factor is used as a criterion for determining the effect by using an arbitrary method.
Specifically, the amount of aggregation and polymerized products of the stratum corneum cell adhesion factor is used as a criterion, or the molecular weight and molecular size of the stratum corneum cell adhesion factor before the protein modification reaction is decomposed by degrading enzymes or the like. It means that the determined amount is used as a criterion.
例えば、角層細胞接着因子の凝集・高分子化物が生成した量を判定基準にする場合は、任意の方法を用いて角層細胞接着因子の分子量や分子サイズを測定し、角層細胞接着因子の本来の分子量や分子サイズよりも大きい分子量や分子サイズの物質が存在した場合には異常と判定でき、存在しない場合には良好な状態と判定できる。
候補素材のスクリーニングにおいては、糖化、カルボニル化、またはニトロ化のタンパク質を修飾する反応を施す工程を経た角層細胞接着因子において、タンパク質修飾反応を施す前の角層細胞接着因子の分子量や分子サイズより分子量や分子サイズが大きくなった物質の量が増加した場合、凝集・高分子化したと判断することができる。さらには、角層細胞接着因子を糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理をする場合において、候補素材の存在により、角層細胞接着因子の凝集・高分子化した物質の量を無添加群より減少させることができる場合、効果ありと判定することができる。なお、この時の凝集・高分子化した物質の量の減少は、凝集・高分子化した物質の新規生成の抑制による場合、または既存の凝集・高分子化した物質の分解による場合のどちらでもあり得る。
角層細胞接着因子の凝集・高分子化物の生成した量を判定基準にする場合は、例えば、凝集・高分子化物の量を用いて生成率や抑制率として数値化することで客観的に評価することができる。
For example, when the amount of aggregation / polymerized product of the stratum corneum cell adhesion factor is used as a criterion, the molecular weight and molecular size of the stratum corneum cell adhesion factor are measured using an arbitrary method, and the stratum corneum cell adhesion factor is used. If a substance having a molecular weight or molecular size larger than the original molecular weight or molecular size of is present, it can be determined to be abnormal, and if it does not exist, it can be determined to be in a good state.
In the screening of candidate materials, the molecular weight and molecular size of the stratum corneum cell adhesion factor before the protein modification reaction is performed in the stratum corneum cell adhesion factor that has undergone the step of subjecting the reaction to modify the glycated, carbonylated, or nitrated protein. When the amount of the substance having a larger molecular weight or molecular size increases, it can be determined that the substance has aggregated and polymerized. Furthermore, when the stratum corneum cell adhesion factor is saccharified, carbonylated, or nitrated, the amount of aggregated / polymerized substance of the stratum corneum cell adhesion factor is increased from the non-addition group due to the presence of the candidate material. If it can be reduced, it can be determined to be effective. The decrease in the amount of the agglomerated / polymerized substance at this time is either due to suppression of new production of the agglomerated / polymerized substance or by decomposition of the existing agglomerated / polymerized substance. could be.
When the amount of aggregation / polymerized product of the stratum corneum cell adhesion factor is used as a criterion, for example, the amount of aggregated / polymerized product is used and quantified as the production rate or suppression rate for objective evaluation. can do.
また、例えば、角層細胞接着因子が分解酵素等により分解された量を判定基準にする場合は、任意の方法を用いて、凝集・高分子化していない、もしくは分子量や分子サイズがほとんど変化していないような見かけ上凝集・高分子化していない角層細胞接着因子に対する角層細胞接着因子分解酵素の処理によって生じた分解産物の量を測定し、角層細胞接着因子の本来の分子量や分子サイズよりも小さい分子量や分子サイズの物質が存在した場合に良好な状態と判定できる。
候補素材のスクリーニングにおいては、角層細胞接着因子の糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理により凝集・高分子化していない物質の量に対して角層細胞接着因子分解酵素の処理によって生じた分解産物の量が増加した場合、効果ありと判定できる。さらには、無添加群における角層細胞接着因子の糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理により凝集・高分子化していない物質に対する角層接着因子分解酵素の処理によって生じた分解産物の量よりも、候補素材の存在により凝集・高分子化していない物質に対する角層細胞接着因子分解酵素の処理によって生じた分解産物の量が多ければ、効果ありと判定することができる。
角層細胞接着因子の分解物の量を判定基準にする場合は、例えば、分解物の量を用いて分解率として数値化することにより、客観的に評価することができる。
Further, for example, when the amount of the stratum corneum cell adhesion factor decomposed by a degrading enzyme or the like is used as a criterion, it is not aggregated or polymerized by any method, or the molecular weight and molecular size are almost changed. Measure the amount of degradation products produced by the treatment of stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme with respect to the apparently non-aggregated and non-polymerized stratum corneum cell adhesion molecule, and measure the original molecular weight and molecule of the stratum corneum cell adhesion molecule. When a substance having a molecular weight or molecular size smaller than the size is present, it can be judged to be in a good state.
In the screening of candidate materials, the amount of substances that have not been aggregated or polymerized by the treatment of glycation, carbonylation, or nitration of the stratum corneum cell adhesion factor is degraded by the treatment of the stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme. When the amount of product increases, it can be judged to be effective. Furthermore, it is more than the amount of degradation products produced by the treatment of the stratum corneum adhesion factor degrading enzyme for substances that have not been aggregated or polymerized by the treatment of glycation, carbonylation, or nitration of the stratum corneum cell adhesion factor in the additive-free group. If the amount of degradation products produced by the treatment of the adhesion molecule-degrading enzyme for stratum corneum on a substance that has not been aggregated or polymerized due to the presence of the candidate material is large, it can be judged to be effective.
When the amount of decomposition products of the stratum corneum cell adhesion factor is used as a criterion, it can be objectively evaluated by, for example, quantifying the amount of decomposition products as the decomposition rate.
角層細胞接着因子の凝集・高分子化とは、タンパク質の分子又は複合体を含む重合集合体を形成することであり、可視的な沈殿物が形成される程度にまで進行することも含む。タンパク質の重合集合体は、単一または複数種のタンパク質からなるものを含み、重合形態は分子間架橋等の共有結合、イオン結合、疎水相互作用、ファンデルワールス力等の非共有結合によるものを含む。凝集・高分子化物、または凝集・高分子化した物質とは、上記の状態を示すタンパク質のことであり、例えば糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理により角層細胞接着因子の分子量や分子サイズが増大したタンパク質が増加した場合、分子量や分子サイズが増大したタンパク質を凝集・高分子化物と判断することができる。 Aggregation / polymerization of stratum corneum cell adhesion factor is to form a polymerization aggregate containing protein molecules or complexes, and also includes progressing to the extent that a visible precipitate is formed. Protein aggregation aggregates include those consisting of single or multiple types of proteins, and the polymerization forms are those by covalent bonds such as intermolecular cross-linking, ionic bonds, hydrophobic interactions, and non-covalent bonds such as van der Waals forces. include. Aggregated / polymerized substances or aggregated / polymerized substances are proteins exhibiting the above-mentioned states. For example, the molecular weight and molecular size of the stratum corneum cell adhesion factor by treatment of saccharification, carbonylation, or nitration. When the number of proteins with increased molecular weight increases, it can be determined that the protein with increased molecular weight or molecular size is an aggregated / polymerized product.
角層細胞接着因子の状態を把握する方法は、任意の手法を用いて把握することができる。ＳＤＳ-ＰＡＧＥが例に挙げられるが、電気泳動による測定方法の他に特異的な抗体を利用する周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法やウェスタンブロット法などの免疫測定方法、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、タンパク質の立体構造決定に用いられるＸ線結晶構造解析法、核磁気共鳴法や電子顕微鏡法など、様々な方法が使用できる。免疫学的測定法においては、角層細胞接着因子に特異的な抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。またそれぞれの手法を用いて検出したシグナルやバンドは、目視により判断することも可能であるが、任意の方法により数値化することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定した場合は、検出したバンドを画像解析装置やソフトを用いてバンド強度を数値化することにより、凝集・高分子化した角層細胞接着因子、凝集・高分子化していない角層細胞接着因子、分解酵素により分解された産物を数値化することができ、生成率や分解率を角層細胞接着因子の状態を把握する指標として算出することもできる。 The method for grasping the state of the stratum corneum cell adhesion factor can be grasped by using an arbitrary method. SDS-PAGE is an example, but in addition to the measurement method by electrophoresis, well-known methods using specific antibodies, such as immunostaining using fluorescent substances, dyes, enzymes, and immunity such as Western blotting. Various methods such as measurement method, liquid chromatography, gas chromatography, mass analysis, X-ray crystal structure analysis method used for determining the three-dimensional structure of a protein, nuclear magnetic resonance method and electron microscopy can be used. In immunoassay, the antibody specific for the stratum corneum cell adhesion factor may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Further, the signals and bands detected by each method can be visually judged, but can be quantified by any method. For example, when measured using SDS-PAGE, by quantifying the band strength of the detected band using an image analyzer or software, the aggregated / polymerized stratum corneum cell adhesion factor and aggregated / polymer The unmodified stratum corneum cell adhesion factor and the product decomposed by the degrading enzyme can be quantified, and the production rate and degradation rate can be calculated as an index for grasping the state of the stratum corneum cell adhesion factor.
凝集・高分子化物の生成率は、例えば角層細胞接着因子に糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理を施した場合、凝集・高分子化しない物質、つまり修飾された角層細胞因子の通常想定される分子量や分子サイズを示す物質と凝集・高分子化した物質が存在することから、凝集・高分子化しない物質（例えば〔図１〕（１）に示される１１０ｋＤａの角層細胞接着因）の量に対する凝集・高分子化した物質（例えば〔図１〕（１）に生じた黒矢印で示される角層細胞接着因子）の量から算出することができる。または、角層細胞接着因子が糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理をしない場合の角層細胞接着因子の量、つまり本来の分子量や分子サイズを示す角層細胞接着因子（例えば〔図１〕（７）に示される角層細胞接着因子）の量に対する、角層細胞接着因子を糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理することで凝集・高分子化した角層細胞接着因子（例えば〔図１〕（１）に生じた黒矢印で示される角層細胞接着因子）の量から算出することができる。上記に挙げた算出方法に限定されるものではない。 The rate of aggregation / polymerization is usually determined by substances that do not aggregate / polymerize, that is, modified stratum corneum cell factors, for example, when the stratum corneum cell adhesion factor is saccharified, carbonylated, or nitrated. Since there are substances that show the expected molecular weight and size and substances that have aggregated and polymerized, substances that do not aggregate and polymerize (for example, 110 kDa stratum corneum cell adhesion cause shown in [Fig. 1] (1)) ) Can be calculated from the amount of aggregated / polymerized substance (for example, the stratum corneum cell adhesion factor indicated by the black arrow in FIG. 1 (1)). Alternatively, the amount of the stratum corneum cell adhesion factor when the stratum corneum cell adhesion factor is not subjected to glycation, carbonylation, or nitration treatment, that is, the stratum corneum cell adhesion factor indicating the original molecular weight and molecular size (for example, [Fig. 1]]. The stratum corneum cell adhesion factor (for example, [Fig.] 1] It can be calculated from the amount of stratum corneum cell adhesion factor) generated in (1) indicated by the black arrow. The calculation method is not limited to the above.
凝集・高分子化物の生成抑制率は、例えば無添加群における角層細胞接着因子の糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理により凝集・高分子化した物質の量に対して、候補素材の存在下により減少した凝集・高分子化した物質の量から算出することができる。無添加群における凝集・高分子化した物質の量よりも、候補素材の存在により凝集・高分子化した物質の量が少なければ抑制したと言える。凝集・高分子化の生成抑制率は、無添加群の凝集・高分子化物の生成率と候補素材添加群の凝集・高分子化物の生成率から算出することも可能であり、上記に挙げた算出方法に限定されるものではない。 Regarding the rate of inhibition of aggregation / polymerization, for example, the presence of candidate materials relative to the amount of substances aggregated / polymerized by the treatment of saccharification, carbonylation, or nitration of stratum corneum cell adhesion factor in the additive-free group. It can be calculated from the amount of agglomerated / polymerized substances reduced by the bottom. It can be said that if the amount of the aggregated / polymerized substance due to the presence of the candidate material is smaller than the amount of the aggregated / polymerized substance in the additive-free group, it is suppressed. The rate of inhibition of agglutination / polymerization can also be calculated from the rate of agglutination / polymerization in the additive-free group and the rate of agglutination / polymerization in the candidate material addition group, and are listed above. It is not limited to the calculation method.
角層細胞接着因子の分解率は、角層細胞接着因子の糖化、カルボニル化、またはニトロ化の処理により凝集・高分子化していない物質に対して角層細胞接着因子分解酵素の処理によって生じた分解産物の量から算出することができる。例えば、角層細胞接着因子を糖化、カルボニル化、またはニトロ化処理した場合、凝集・高分子化物（例えば〔図２〕（１）もしくは（３）に生じた黒矢印で示される角層細胞接着因子）と凝集・高分子化しない本来の分子量や分子サイズを示す物質（例えば〔図２〕（１）もしくは（３）に示される１１０ｋＤａの角層細胞接着因）が生じるが、さらに角層細胞接着因子分解酵素で処理した場合では角層細胞接着因子の分解物はほとんど生じない（例えば〔図２〕（２））。一方で、候補素材存在下で角層細胞接着因子をカルボニル化処理した場合、さらに角層細胞接着因子分解酵素で処理すると角層細胞接着因子の分解物が生じる（例えば〔図２〕（４））。角層細胞接着因子の分解率は、凝集・高分子化しない本来の分子量や分子サイズを示す物質の量に対する分解物の量から算出され、無添加群に対して候補素材の存在により分解率が高くなれば効果ありと判定することができる。また、同一試料内におけるタンパク質全体量に対して、角層細胞接着因子分解酵素の処理によって生じた分解産物の量から算出することも可能である。上記に挙げた算出方法に限定されるものではない。
さらには、分解が抑制されている点を捉えて、分解率を１００から引いた差として算出される値や無添加群の分解率と候補素材添加群の分解率から算出される値、上記に挙げた算出方法に限定されず分解率を基にして算出される値を分解抑制率として判定に用いることができるのは言うまでもない。
The degradation rate of the stratum corneum cell adhesion factor was generated by the treatment of the stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme for the substance that was not aggregated or polymerized by the treatment of glycation, carbonylation, or nitration of the stratum corneum cell adhesion factor. It can be calculated from the amount of decomposition products. For example, when the stratum corneum cell adhesion factor is saccharified, carbonylated, or nitrated, the stratum corneum cell adhesion indicated by the black arrow generated in the aggregated / polymerized product (for example, [Fig. 2] (1) or (3)). Factors) and substances showing the original molecular weight and molecular size that do not aggregate or polymerize (for example, 110 kDa stratum corneum cell adhesion cause shown in [Fig. 2] (1) or (3)) are generated, but further stratum corneum cells When treated with adhesion factor degrading enzymes, almost no degradation products of stratum corneum cell adhesion factor are produced (for example, [Fig. 2] (2)). On the other hand, when the stratum corneum cell adhesion factor is carbonylated in the presence of a candidate material, further treatment with a stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme produces a degradation product of the stratum corneum cell adhesion factor (for example, [Fig. 2] (4)). ). The decomposition rate of the stratum corneum cell adhesion factor is calculated from the amount of decomposition products relative to the amount of substances that indicate the original molecular weight and molecular size that do not aggregate or polymerize, and the decomposition rate is higher than the additive-free group due to the presence of candidate materials. The higher the value, the more effective it can be determined. It is also possible to calculate from the amount of degradation products produced by the treatment of the stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme with respect to the total amount of protein in the same sample. The calculation method is not limited to the above.
Furthermore, the value calculated as the difference obtained by subtracting the decomposition rate from 100 and the value calculated from the decomposition rate of the additive-free group and the decomposition rate of the candidate material addition group, taking into account the point that decomposition is suppressed, are described above. Needless to say, the value calculated based on the decomposition rate can be used for the determination as the decomposition suppression rate without being limited to the above calculation methods.
タンパク質を修飾する反応を施す工程は、タンパク質に対する様々な化学的修飾を施す工程であって、例えば角層細胞接着因子を糖化、カルボニル化またはニトロ化する工程等が挙げられる。 The step of subjecting the reaction to modify the protein is a step of subjecting various chemical modifications to the protein, and examples thereof include a step of saccharifying, carbonylating, or nitrating a stratum corneum cell adhesion molecule.
本発明で用いられる糖化の方法は、公知の手法を用いることができる。糖類の種類には特に制限は無く、単糖類、単糖類の縮合体であるオリゴ糖類および多糖類等を用いることができるが、好ましくは還元糖(例えば、グルコース、リボース、またはフルクトース)であり、上記の糖類の少なくとも１種類以上を用いることができる。反応に用いる上記糖類の濃度は、タンパク質が糖化できる濃度であれば特に限定されないが、好ましくは１００ｍＭ〜５０００ｍＭである。また、糖化反応においては、タンパク質が糖化できるｐＨであれば特に限定されないが、好ましくは５．０〜９．０である。糖化の反応温度および反応時間は特に限定されないが、好ましくは、反応時間は１０〜１５０時間、反応温度は４０〜８０℃である。 As the saccharification method used in the present invention, a known method can be used. The type of saccharide is not particularly limited, and monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides which are condensates of monosaccharides can be used, but reducing sugars (for example, glucose, ribose, or fructose) are preferable. At least one or more of the above sugars can be used. The concentration of the saccharide used in the reaction is not particularly limited as long as the protein can be saccharified, but is preferably 100 mM to 5000 mM. Further, in the saccharification reaction, the pH is not particularly limited as long as the protein can be saccharified, but it is preferably 5.0 to 9.0. The reaction temperature and reaction time for saccharification are not particularly limited, but preferably the reaction time is 10 to 150 hours and the reaction temperature is 40 to 80 ° C.
本発明で用いられるカルボニル化の方法は、公知の手法を用いることができる。周知の酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、ベンゾイルペルオキシドなど）やアルデヒド類（例えば、アクロレイン、４−ヒドロキシ−２−ノネナールなど）、不飽和脂肪酸（例えば、リノール酸やオレイン酸など）を用いて処理するによりカルボニル化することができる。カルボニル化反応においては、反応を早めるためにタンパク質に影響を与えない範囲で加温することができ、好ましくは３０〜４０℃である。また、角層試料であれば、紫外線等の光を照射することでもカルボニル化することができ、例えば、不飽和脂肪酸を塗布後に紫外線を照射することによりカルボニル化させてもよい。また、タンパク質にカルボニル化以外の影響を与えない範囲であれば、生体分泌物中に含まれる酵素なども用いることができる。 As the carbonylation method used in the present invention, a known method can be used. Use well-known oxidants (eg, sodium hypochlorite, benzoyl peroxide, etc.), aldehydes (eg, acrolein, 4-hydroxy-2-nonenal, etc.), and unsaturated fatty acids (eg, linoleic acid, oleic acid, etc.) It can be carbonylated by treatment with. In the carbonylation reaction, in order to accelerate the reaction, the protein can be heated within a range that does not affect the protein, preferably 30 to 40 ° C. Further, if it is a stratum corneum sample, it can be carbonylated by irradiating it with light such as ultraviolet rays. For example, it may be carbonylated by irradiating it with ultraviolet rays after applying an unsaturated fatty acid. In addition, enzymes contained in biological secretions can also be used as long as they do not affect the protein other than carbonylation.
本発明で用いられるニトロ化の方法は、公知の手法を用いることができる。
ペルオキシナイトライト等の活性窒素種によってニトロ化させてもよいし、一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンを混合する、またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）とＮａＮＯ２、過酸化水素等と混合し、試験系中に活性窒素種を発生させてニトロ化させてもよい。また、ニトロニウムイオンを発生させるテトラニトロメタンや硝酸などの試薬等を用いてニトロ化してもよいし、塩化ニトロイルやニトロソペルオキシカルボキシレート、またアジ化ナトリウムおよびカタラーゼ等の処理によりニトロ化しても良い。
As the nitration method used in the present invention, a known method can be used.
It may be nitrated with reactive nitrogen species such as peroxynitrite, mixed with nitric oxide and superoxide anion, or mixed with myeloperoxidase (MPO) with NaNO2, hydrogen peroxide, etc. and activated in the test system. Nitrogen species may be generated and nitrated. Further, it may be nitrated using a reagent such as tetranitromethane or nitric acid that generates nitronium ions, or it may be nitrated by treatment with nitroyl chloride, nitrosoperoxycarboxylate, sodium azide, catalase or the like.
本発明の候補素材は、特に制限されない。動植物由来の抽出物、細胞由来の抽出物、菌類の培養物またはこれらの酵素処理物、化合物またはその誘導体等を用いることができ、これらの混合物も用いることができる。また性状は、液状の他、粉末状、ジェル状、シート状等であってもろ過や限外ろ過、遠心分離等で除去できるのであれば差し支えない。さらに、候補素材の各原体からの抽出方法や添加濃度も特に限定されない。 The candidate material of the present invention is not particularly limited. Extracts derived from animals and plants, extracts derived from cells, cultures of fungi or enzyme-treated products thereof, compounds or derivatives thereof and the like can be used, and mixtures thereof can also be used. In addition to liquid, powder, gel, sheet, etc. may be used as long as they can be removed by filtration, ultrafiltration, centrifugation, or the like. Furthermore, the extraction method and the concentration of the candidate material from each drug substance are not particularly limited.
以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Unless otherwise specified, the blending amount is shown in% by mass.
＜実験方法＞
１．角層細胞接着因子の糖化、カルボニル化およびニトロ化
糖化したデスモグレイン１は以下のように調製した。組み換え体デスモグレイン１（９４４-ＤＭ-１００，Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）に糖化溶液（１Ｍ グルコース,１００ｍＭ リボース）を加えて、６０℃で３日間処理した。処理後、精製水を適量加えて遠心濃縮チューブｖｉｖａｓｐｉｎ５００（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に投入し、遠心分離して糖化デスモグレイン１を得た。
カルボニル化したデスモグレイン１は以下のように調製した。組み換え体デスモグレイン１に０．５％ アクロレイン溶液を加えて、３７℃で２４時間処理した。処理後、精製水を適量加えてｖｉｖａｓｐｉｎ５００に投入し、遠心分離してカルボニル化デスモグレイン１を得た。
また、ニトロ化したデスモグレイン１は以下のように調製した。組み換え体デスモグレイン１に２０ｍＭテトラニトロメタン水溶液を加えて、室温で１６時間処理した。処理後、精製水を適量加えてｖｉｖａｓｐｉｎ５００に投入し、遠心分離してニトロ化デスモグレイン１を得た。
ブランクとして、組み換え体デスモグレイン１に精製水を加えた後、ｖｉｖａｓｐｉｎ５００に投入し、遠心分離して無処理デスモグレイン１を得た。
<Experimental method>
1. 1. The glycated, carbonylated and nitrated saccharified desmoglein 1 of the stratum corneum cell adhesion factor was prepared as follows. A saccharified solution (1M glucose, 100 mM ribose) was added to recombinant desmoglein 1 (944-DM-100, R & D SYSTEMS), and the mixture was treated at 60 ° C. for 3 days. After the treatment, an appropriate amount of purified water was added, and the mixture was placed in a centrifugal concentration tube vivaspin500 (sartorius) and centrifuged to obtain
The
The
As a blank, purified water was added to the
２．分解酵素処理
糖化デスモグレイン１、カルボニル化デスモグレイン１、ニトロ化デスモグレイン１、および無処理デスモグレイン１にカリクレイン５（１１０８−ＳＥ−０１０， Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）を加えて、３７℃で３時間処理した。
2. Degrading enzyme-treated
３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
アクリルアミド７．５％濃度のＬｏｗｅｒ ｇｅｌおよび、４．５％濃度のＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌを作製した。糖化デスモグレイン１またはニトロ化デスモグレイン１に、それと３倍量のサンプリングバッファー(０．５Ｍ-Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ＰＨ６．８）２ｍＬ， １０％ ＳＤＳ ４ｍＬ， β-メルカプトエタノール １．２ｍＬ， グリセロール ２ｍＬ， 蒸留水 ０．８ｍＬ， １％ ＢＰＢ 適量)を添加し、１００℃で５分間加熱し、ゲルに添加する試料を調製した。ランニングバッファー（Ｔｒｉｓ塩 ３０．３ｇ， グリシン １４４．０ｇ， ＳＤＳ １０．０ｇ， 蒸留水で１０Ｌ）中で、３０ｍＡで電気泳動を行った。電気泳動後にゲルを取り出し、ＣＢＢ染色液でゲルを染色後、脱色液を用いて適度にゲルを脱色した。
3. 3. SDS-PAGE
A Lower gel having a concentration of 7.5% acrylamide and a Stacking gel having a concentration of 4.5% were prepared.
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプル
（１） 糖化処理デスモグレイン１のサンプル
（２） 糖化処理デスモグレイン１にカリクレイン５で処理したサンプル
（３） カルボニル化処理デスモグレイン１のサンプル
（４） カルボニル化処理デスモグレイン１にカリクレイン５で処理したサンプル
（５） ニトロ化処理デスモグレイン１のサンプル
（６） ニトロ化処理デスモグレイン１にカリクレイン５で処理したサンプル
（７） 無処理のデスモグレイン１のサンプル
（８） 無処理デスモグレイン１にカリクレイン５で処理したサンプル
SDS-PAGE sample (1) Sample of saccharified desmoglein 1 (2) Sample of
図１より、糖化処理を施したデスモグレイン１は、何も処理をしていないデスモグレイン１よりも分子サイズが増大した物質の量が増加することが示され、デスモグレイン１は糖化により分子サイズが増大し、その物質量が増加することが初めてわかった。さらに、分解酵素カリクレイン５で処理した糖化デスモグレイン１では分解産物が生成しなかったことから、糖化されたデスモグレイン１においては、分解酵素による分解が阻害されることが初めてわかった。これらのことから、デスモグレイン１は、糖化により分子サイズが増大することにより、分解酵素による分解が阻害されることが考えられた。
From FIG. 1, it is shown that the
また、カルボニル化処理を施したデスモグレイン１は、一部分では分子サイズが増大した物質の量が増加していることが初めて分かった。しかしながら、糖化処理や後述するニトロ化に比べると、分子サイズが増大した物質の量が増加する割合は低かった。また、分子サイズの増大が見られない物質も確認され、その物質の量は分子サイズが増大した物質の量よりも多かった。さらに、分解酵素カリクレイン５で処理したカルボニル化デスモグレイン１では分解産物が生成しなかったことから、カルボニル化されたデスモグレイン１においては、分子サイズが増大した物質および分子サイズが変化しなかった物質ともに分解酵素による分解が阻害されることが初めてわかった。これらのことから、デスモグレイン１は、カルボニル化により分子サイズが増大することに加えて、分子サイズが変化しない物質においても分解酵素による分解が阻害されることが考えられた。以上のことから、カルボニル化においては、分子サイズは増大していないが、立体構造が変化している物質も生じていると言える。
Moreover, it was found for the first time that the amount of the substance whose molecular size was increased was partially increased in the
同様に、ニトロ化処理を施したデスモグレイン１は、何も処理をしていないデスモグレイン１よりも分子サイズが増大した物質の量が増加することが示され、デスモグレイン１はニトロ化により分子サイズが増大し、その物質量が増加することが初めてわかった。さらに、分解酵素カリクレイン５で処理したニトロ化デスモグレイン１では分解産物が生成しなかったことから、ニトロ化されたデスモグレイン１においては、分解酵素による分解が阻害されることが初めてわかった。これらのことから、デスモグレイン１は、ニトロ化により分子サイズが増大することにより、分解酵素による分解が阻害されることが考えられた。
Similarly,
結果として、糖化、カルボニル化、またはニトロ化処理することにより、デスモグレイン１は凝集・高分子化することにより分子サイズが増大し、凝集・高分子化物の量が増加することがわかった。また、凝集・高分子化したデスモグレイン１においては分解酵素による分解が阻害されることがわかった。同時に、例えばカルボニル化処理の時のように、分子サイズに変化がなく凝集・高分子化していないように見える場合であっても、分解酵素による分解が阻害される場合があることもわかった。
As a result, it was found that by saccharification, carbonylation, or nitration treatment,
このことから、角層細胞接着因子に対する糖化、カルボニル化、またはニトロ化を抑制することができれば、角層剥離を改善できると言える。また、糖化、カルボニル化またはニトロ化し凝集・高分子化した角層細胞接着因子に対して、糖化、カルボニル化またはニトロ化を分解し、角層細胞接着因子分解酵素によって分解することができれば、角層剥離を改善できると言える。 From this, it can be said that if saccharification, carbonylation, or nitration of the stratum corneum cell adhesion factor can be suppressed, the stratum corneum detachment can be improved. In addition, if saccharification, carbonylation, or nitration can be decomposed with respect to glycated, carbonylated, or nitrated aggregated and polymerized stratum corneum cell adhesion factor, and can be decomposed by stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme, horns. It can be said that layer peeling can be improved.
本発明における角層細胞接着因子の凝集・高分子化を指標とする角層剥離剤のスクリーニング方法は、例えば、デスモグレイン１を用いる場合は、以下のように行うことができる。
（１）デスモグレイン１と、候補素材含む被験溶液または含まないブランク溶液を混合する。
（２）前記混合溶液を糖化、カルボニル化またはニトロ化処理する。
（３）糖化、カルボニル化、またはニトロ化処理物に角層細胞接着因子の分解酵素であるカリクレイン５で処理する。
（４）分解酵素処理物を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、バンドを検出する。
（５）それぞれ検出されたバンドを、画像解析ソフトを用いて数値化する。
（６）ブランク溶液における凝集・高分子化したデスモグレイン１の量と候補素材を含む溶液の凝集・高分子化したデスモグレイン１の量を比較し、凝集・高分子化したデスモグレイン１の量の変化から生成率や抑制率、分解率、分解抑制率等を算出する。
（７）目的に応じて、凝集・高分子化したデスモグレイン１の量を減少させる素材を有効素材として選別する。
更に詳しくは、段落００３６〜００３９に記載の方法に準じて行うことができる。
The screening method for a stratum corneum release agent using the aggregation and polymerization of stratum corneum cell adhesion factor as an index in the present invention can be performed as follows, for example, when desmoglein 1 is used.
(1)
(2) The mixed solution is saccharified, carbonylated or nitrated.
(3) The saccharified, carbonylated, or nitrated product is treated with
(4) SDS-PAGE is performed using the degrading enzyme-treated product to detect the band.
(5) Each detected band is quantified using image analysis software.
(6) Comparing the amount of aggregated /
(7) A material that reduces the amount of aggregated /
More specifically, it can be carried out according to the method described in paragraphs 0036 to 0039.
なお、糖化、カルボニル化またはニトロ化により凝集・高分子化したデスモグレイン１の分解作用を有する素材をスクリーニングする場合は、あらかじめ糖化、カルボニル化またはニトロ化したデスモグレイン１に候補素材を混合して処理した溶液を用いることもできる。
（１）デスモグレイン１を糖化、カルボニル化またはニトロ化処理する。
（２）糖化、カルボニル化またはニトロ化デスモグレイン１と、候補素材含むまたは含まないブランク溶液を混合する。
（３）前記混合物に角層細胞接着因子の分解酵素であるカリクレイン５で処理する。
（４）分解酵素処理物を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、バンドを検出する。
（５）それぞれ検出されたバンドを、画像解析ソフトを用いて数値化する。
（６）候補素材を含まないブランク溶液における凝集・高分子化したデスモグレイン１の量と、候補素材を含むブランク溶液の凝集・高分子化したデスモグレイン１の量を比較し、凝集・高分子化したデスモグレイン１の量の変化から生成率や抑制率、分解率、分解抑制率等を算出する。
（７）目的に応じて、凝集・高分子化したデスモグレイン１の量を減少させる素材を有効素材として選別する。
When screening a material that decomposes
(1)
(2) The saccharified, carbonylated or
(3) The mixture is treated with
(4) SDS-PAGE is performed using the degrading enzyme-treated product to detect the band.
(5) Each detected band is quantified using image analysis software.
(6) The amount of aggregated /
(7) A material that reduces the amount of aggregated /
＜候補素材の調製＞
ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ Ｌ．）の花 ５ｇに１５倍の重量の蒸留水 ７５ｇを加えて６０℃、３時間加熱抽出した。抽出後、ろ過をし、植物原体を取り除いた後、固形蒸発残分が５％になるように蒸留水に溶解した。最後に、最終全量の３０％量の１,３ブチレングリコールを加えたエキスを候補素材として得た。
レモングラス（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ Ｓｃｈｏｅｎａｎｔｈｕｓ）の葉 ５ｇに１０倍の重量の蒸留水 ５０ｇを加えて６０℃、３時間加熱抽出した。抽出後、ろ過をし、植物原体を取り除いた後、固形蒸発残分が５％になるように蒸留水に溶解した。最後に、最終全量の３０％量の１,３ブチレングリコールを加えたエキスを候補素材として得た。
ハトムギ（Ｃｏｉｘ Ｌａｃｒｙｍａ−Ｊｏｂｉ Ｍａ−ｙｕｅｎ）の種実（ヨクイニン） ５ｇに１０倍の重量の蒸留水 ５０ｇを加えて６０℃、３時間加熱抽出した。抽出後、ろ過をし、植物原体を取り除いた後、固形蒸発残分が５％になるように蒸留水に溶解した。最後に、最終全量の３０％量の１,３ブチレングリコールを加えたエキスを候補素材として得た。
<Preparation of candidate materials>
To 5 g of hibiscus sabdarifa L. flowers, 75 g of distilled water having a weight of 15 times was added, and the mixture was heated and extracted at 60 ° C. for 3 hours. After extraction, the plant was filtered to remove the bulk plant, and then dissolved in distilled water so that the solid evaporation residue was 5%. Finally, an extract containing 30% of the final total amount of 1,3 butylene glycol was obtained as a candidate material.
To 5 g of leaves of Lemongrass (Cymbopogon Schoenanthus), 50 g of distilled water having a weight of 10 times was added, and the mixture was heated and extracted at 60 ° C. for 3 hours. After extraction, the plant was filtered to remove the bulk plant, and then dissolved in distilled water so that the solid evaporation residue was 5%. Finally, an extract containing 30% of the final total amount of 1,3 butylene glycol was obtained as a candidate material.
To 5 g of seeds (Yokuinin) of Coix Lacrima-Jobi Ma-yuen, 50 g of distilled water having a weight of 10 times was added, and the mixture was heat-extracted at 60 ° C. for 3 hours. After extraction, the plant was filtered to remove the bulk plant, and then dissolved in distilled water so that the solid evaporation residue was 5%. Finally, an extract containing 30% of the final total amount of 1,3 butylene glycol was obtained as a candidate material.
＜角層細胞接着因子の凝集・高分子化抑制剤のスクリーニング＞
組み換え体デスモグレイン１（９４４-ＤＭ-１００，Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）に、エキス最終濃度が１％になるようにハイビスカス花エキスを加えた。ブランク溶液として、ハイビスカス花エキスの代わりに精製水を加えたサンプルも準備した。最終濃度が５００μＭになるようにペルオキシナイトライトを加えた。１分間室温で放置した後、ペルオキシナイトライト溶液と等量の０．３ Ｎ ＨＣｌ 溶液を混合した。処理後、精製水を適量加えてｖｉｖａｓｐｉｎ５００（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に投入し、遠心分離してニトロ化デスモグレイン１を得た。ニトロ化デスモグレイン１にカリクレイン５（１１０８−ＳＥ−０１０， Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）を加えて、３７℃で３時間処理した。ニトロ化デスモグレイン１に、１／３倍量のサンプリングバッファー(０．５Ｍ-Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ＰＨ６．８）２ｍＬ， １０％ ＳＤＳ ４ｍＬ， β-メルカプトエタノール １．２ｍＬ， グリセロール ２ｍＬ， 蒸留水 ０．８ｍＬ， １％ ＢＰＢ 適量)を添加し、１００℃で１０分間加熱し、ゲルに添加する試料を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、アクリルアミド７．５％濃度のＬｏｗｅｒ ｇｅｌおよび、４．５％濃度のＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌを作製し、ランニングバッファー（Ｔｒｉｓ塩 ３０．３ｇ， グリシン １４４．０ｇ， ＳＤＳ １０．０ｇ， 蒸留水で１０Ｌ）中で、３０ｍＡで電気泳動を行った。電気泳動後にゲルを取り出し、ＣＢＢ染色液でゲルを染色後、脱色液を用いて適度にゲルを脱色した。ゲルをカメラで撮影し、画像解析ソフト ＩｍａｇｅＪ（オープンソース）にてバンド強度を数値化した。
<Screening for agents that inhibit the aggregation and polymerization of stratum corneum cell adhesion factors>
Hibiscus flower extract was added to recombinant desmoglein 1 (944-DM-100, R & D SYSTEMS) so that the final extract concentration was 1%. As a blank solution, a sample in which purified water was added instead of the hibiscus flower extract was also prepared. Peroxynitrite was added to a final concentration of 500 μM. After allowing to stand at room temperature for 1 minute, a peroxynitrite solution and an equal volume of 0.3 N HCl solution were mixed. After the treatment, an appropriate amount of purified water was added, and the mixture was charged into vivaspin500 (sartorius) and centrifuged to obtain
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプル
（１） ニトロ化処理デスモグレイン１のサンプル
（２） ニトロ化処理デスモグレイン１にカリクレイン５で処理したサンプル
（３） デスモグレイン１とハイビスカス花エキス混合物をニトロ化処理したサンプル
（４） デスモグレイン１とハイビスカス花エキス混合物をニトロ化処理後にカリクレイン５で処理したサンプル
（５） 無処理のデスモグレイン１のサンプル
（６） 無処理デスモグレイン１にカリクレイン５で処理したサンプル
SDS-PAGE sample (1) Sample of nitrated desmoglein 1 (2) Sample of
図２より、デスモグレイン１をニトロ化しカリクレイン５で処理した場合のデスモグレイン１分解率は８．８％であった。一方で、デスモグレイン１とハイビスカス花エキスの混合物をニトロ化しカリクレイン５で処理した場合のデスモグレイン１分解率は３５．８％であった。したがって、ハイビスカス花エキスには、角層細胞接着因子の凝集・高分子化を抑制する効果があると言える。
以上のことから、角層細胞接着因子が分解酵素等により分解された量を判定基準とする、すなわち、分解酵素の処理によって生じた分解産物の量を用いて、たとえば、分解率として数値化することで同様の判定を行うことができることが示された。
なお、他の角層細胞接着因子であるデスモコリン１を用いた場合でも同様の結果が得られたことから、デスモグレイン１に限らず、他の角層細胞接着因子においても上述の判定を行うことができると言える。
From FIG. 2, when
From the above, the amount of stratum corneum cell adhesion factor degraded by a degrading enzyme or the like is used as a criterion, that is, the amount of degradation products produced by the treatment of the degrading enzyme is used to quantify, for example, the degradation rate. It was shown that the same judgment can be made.
Since the same result was obtained when
＜候補素材のスクリーニング＞
組み換え体デスモグレイン１（９４４-ＤＭ-１００，Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）に、エキス最終濃度が２％になるように候補素材またはブランク物質（精製水）を加えた。最終濃度が２ｍＭになるようにペルオキシナイトライトを加えた。２分間室温で放置した後、ペルオキシナイトライト溶液と等量の０．３ Ｎ ＨＣｌ 溶液を混合した。処理後、１／３倍量のサンプリングバッファー(０．５Ｍ-Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ＰＨ６．８）２ｍＬ， １０％ ＳＤＳ ４ｍＬ， β-メルカプトエタノール １．２ｍＬ， グリセロール ２ｍＬ， 蒸留水 ０．８ｍＬ， １％ ＢＰＢ 適量)を添加し、１００℃で１０分間加熱し、ゲルに添加する試料を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、アクリルアミド７．５％濃度のＬｏｗｅｒ ｇｅｌおよび、４．５％濃度のＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌを作製し、ランニングバッファー（Ｔｒｉｓ塩 ３０．３ｇ， グリシン １４４．０ｇ， ＳＤＳ １０．０ｇ， 蒸留水で１０Ｌ）中で、３０ｍＡで電気泳動を行った。電気泳動後にゲルを取り出し、ＣＢＢ染色液でゲルを染色後、脱色液を用いて適度にゲルを脱色した。ゲルをカメラで撮影し、画像解析ソフト ＩｍａｇｅＪ（オープンソース）にてバンド強度を数値化した。
<Screening of candidate materials>
Candidate material or blank substance (purified water) was added to recombinant desmoglein 1 (944-DM-100, R & D SYSTEMS) so that the final extract concentration was 2%. Peroxynitrite was added to a final concentration of 2 mM. After allowing to stand at room temperature for 2 minutes, a peroxynitrite solution and an equal volume of 0.3 N HCl solution were mixed. After treatment, 1/3 times the amount of sampling buffer (0.5M-Tris-HCl (PH 6.8) 2 mL, 10
数１を用いて凝集・高分子化物の生成率（％）を算出した結果を表１に示す。デスモグレイン１をニトロ化した場合の凝集・高分子化物の生成率は６８．９％、デスモグレイン１とハイビスカス花エキスの混合物をニトロ化した場合の凝集・高分子化物の生成率は５２．１％、デスモグレイン１とレモングラス葉エキスの混合物の凝集・高分子化物の生成率は８２．８％、デスモグレイン１とハトムギ種子エキスの混合物の凝集・高分子化物の生成率は７９．７％であった。
以上のことから、ハイビスカス花エキスには、角層細胞接着因子の凝集・高分子化物の生成を抑制する効果があることが示され、本発明のスクリーニング方法を利用することにより角層剥離を改善する素材を選択することが可能であることが分かった。
Table 1 shows the results of calculating the agglomeration / polymerized product formation rate (%) using
From the above, it was shown that the hibiscus flower extract has an effect of suppressing the aggregation of the stratum corneum cell adhesion factor and the formation of polymerized products, and the screening method of the present invention is used to improve the stratum corneum detachment. It turned out that it is possible to select the material to be used.
＜角層細胞接着因子の凝集・高分子化を抑制することが確認された候補素材を用いた、人での角質改善試験＞
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で用いたハイビスカス花エキスを１％配合した乳液を調製し、２０〜３０代の１０名の女性による２ヶ月間の実使用試験を行い、角層改善度を確認した。ハイビスカス花エキスを水に置き換えた乳液をプラセボ群として比較例とした。乳液の処方を表２に示す。製法は常法に従った。
<Human keratin improvement test using candidate materials confirmed to suppress aggregation and polymerization of stratum corneum cell adhesion factor>
A milky lotion containing 1% of the hibiscus flower extract used in the in vitro test was prepared, and a two-month actual use test was conducted by 10 women in their 20s and 30s to confirm the degree of improvement in the stratum corneum. A milky lotion in which the hibiscus flower extract was replaced with water was used as a comparative example as a placebo group. The emulsion formulation is shown in Table 2. The manufacturing method followed the conventional method.
角層改善度は、重層剥離率として算出した。使用開始前、使用開始後４週間後、８週間後にほほ中央部よりテープストリッピング法にて角層細胞を採取した。この角層細胞を角層染色液（ナフトールブルーブラック ０．１ｇ、酢酸ナトリウム０．８２ｇ、酢酸 ９ｇ、蒸留水 残部）に３０分間浸漬した。３０分間流水にて洗浄後一晩風乾し、光学顕微鏡にて観察した。角層の重層剥離率は全角層面積に占める重層している部分の面積の割合として算出し、プラセボ群に対するエキス配合群の比率として算出した。 The degree of improvement in the stratum corneum was calculated as the exfoliation rate of multiple layers. Before the start of use, 4 weeks and 8 weeks after the start of use, stratum corneum cells were collected from the central part of the cheek by the tape stripping method. The stratum corneum cells were immersed in a stratum corneum stain (0.1 g of naphthol blue black, 0.82 g of sodium acetate, 9 g of acetic acid, and the balance of distilled water) for 30 minutes. After washing with running water for 30 minutes, the mixture was air-dried overnight and observed with an optical microscope. The multi-layer peeling rate of the stratum corneum was calculated as the ratio of the area of the multi-layered portion to the total area of the stratum corneum, and was calculated as the ratio of the extract-blended group to the placebo group.
測定の結果を図３に示す。結果から、使用開始前と比較して４週間後および８週間後では角層重層率がそれぞれ０．７１、０．５３であり、角層の重層が減少していることから、ハイビスカス花エキスを塗布することにより角層が剥がれやすくなっていることが明らかとなった。このことは、角層中の角層細胞接着因子の経時的な糖化、カルボニル化、ニトロ化の修飾がハイビスカス花エキスにより抑えられることで角層が剥がれにくい状態になることなく正常に角層細胞接着因子分解酵素が作用できたこと、もしくは糖化、カルボニル化、ニトロ化の修飾を受けていた既存の角層細胞接着因子がハイビスカス花エキスの作用により修飾が解消して正常に角層細胞接着因子分解酵素が作用できたことが要因であると考えられた。 The measurement results are shown in FIG. From the results, the stratum corneum ratio was 0.71 and 0.53, respectively, after 4 weeks and 8 weeks as compared with before the start of use, and the stratum corneum was reduced. Therefore, the hibiscus flower extract was used. It was clarified that the stratum corneum was easily peeled off by the application. This means that the hibiscus flower extract suppresses the modification of glycation, carbonylation, and nitration of the stratum corneum cell adhesion factor in the stratum corneum over time, so that the stratum corneum does not become difficult to peel off and the stratum corneum cells normally. The existing adhesion factor that had been modified by saccharification, carbonylation, and nitration could be acted on by the adhesion factor degrading enzyme, but the modification was canceled by the action of the hibiscus flower extract, and the adhesion factor was normally formed. It was considered that the factor was that the degrading enzyme was able to act.
以上の結果から、本発明の角層細胞接着因子の変化を指標とした角層剥離改善剤の探索を可能にする方法を用いることにより、効果に優れた皮膚剥離改善剤を提供すること可能になることが明らかとなった。 From the above results, it is possible to provide a skin exfoliation improving agent having an excellent effect by using a method that enables the search for a stratum corneum exfoliation improving agent using the change of the stratum corneum cell adhesion factor of the present invention as an index. It became clear that it would be.
上記記載と同様の方法を用いることにより、糖化、カルボニル化およびニトロ化による角層細胞接着因子の凝集・高分子化を抑制し角層剥離を改善する素材を選択することが可能である。 By using the same method as described above, it is possible to select a material that suppresses aggregation and polymerization of stratum corneum cell adhesion factor due to saccharification, carbonylation and nitration and improves stratum corneum detachment.
上記の実施例は、本発明の元となる原理・現象を証拠付けるデータの取得のための実験の例を説明するものであり、当業者であれば、これらの実験例に記載された情報、及び、前述した実施形態に関する記載を基に、容易に本発明を実施可能であることは明らかである。 The above-mentioned examples explain examples of experiments for obtaining data proving the principle / phenomenon that is the basis of the present invention, and those skilled in the art can use the information described in these experimental examples. And, it is clear that the present invention can be easily carried out based on the description of the above-described embodiment.
以上の結果から、本願のスクリーニング方法を用いることで、角層剥離を改善する素材を見出すことができる。すでに述べたとおり、角層中の角層細胞接着因子の分解酵素による分解は、角層剥離に寄与していることから、このスクリーニング方法で見出すことができる素材には、角層剥離改善効果があることが期待される。
From the above results, it is possible to find a material that improves the exfoliation of the stratum corneum by using the screening method of the present application. As already mentioned, the decomposition of the stratum corneum cell adhesion factor in the stratum corneum by the degrading enzyme contributes to the stratum corneum exfoliation. Therefore, the material that can be found by this screening method has an effect of improving the stratum corneum exfoliation. Expected to be.
Claims (9)
（２）タンパク質を修飾する反応を施す工程
（３）角層細胞接着因子の状態を測定する工程
を含む請求項１に記載の方法。 (1) Step of mixing the test solution containing the candidate material or the blank solution not containing the candidate material with the stratum corneum cell adhesion factor (2) Step of performing a reaction to modify the protein (3) The state of the stratum corneum cell adhesion factor The method according to claim 1, which comprises a step of measuring.
（２）タンパク質を修飾する工程
（３）角層細胞接着因子の分解酵素を添加する工程
（４）角層細胞接着因子の状態を測定する工程
を含む請求項１に記載の方法。 (1) Mixing the test solution containing the candidate material or the blank solution not containing the candidate material with the stratum corneum cell adhesion factor (2) Step of modifying the protein (3) Add the degrading enzyme of the stratum corneum cell adhesion factor Step (4) The method according to claim 1, which comprises a step of measuring the state of the stratum corneum cell adhesion factor.
（１）角層細胞接着因子の凝集・高分子化
（２）凝集・高分子化していない角層細胞接着因子に対する角層細胞接着因子分解酵素処理により生じた角層細胞接着因子の分解 The screening method according to any one of claims 1 to 5, wherein the state of the stratum corneum cell adhesion factor is at least one selected from the following.
(1) Aggregation and polymerization of stratum corneum cell adhesion factor (2) Degradation of stratum corneum cell adhesion factor caused by treatment with stratum corneum cell adhesion factor degrading enzyme for non-aggregated and non-polymerized stratum corneum cell adhesion factor
A method for evaluating the effect of improving exfoliation of the stratum corneum using the method according to any one of claims 1 to 6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020046374A JP7419120B2 (en) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Corner layer peel improving agent and its screening method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020046374A JP7419120B2 (en) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Corner layer peel improving agent and its screening method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021148492A true JP2021148492A (en) | 2021-09-27 |
| JP7419120B2 JP7419120B2 (en) | 2024-01-22 |
Family
ID=77851204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020046374A Active JP7419120B2 (en) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Corner layer peel improving agent and its screening method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7419120B2 (en) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1617215A4 (en) | 2003-04-21 | 2007-09-26 | Shiseido Co Ltd | Method of evaluating oxidized protein in horny cell layer |
| JP6580895B2 (en) | 2014-08-08 | 2019-09-25 | 株式会社コーセー | Astaxanthin-containing desmoglein reducing agent |
| JP6863548B2 (en) | 2015-08-11 | 2021-04-21 | ポーラ化成工業株式会社 | Cosmetic base for improving skin condition and its screening method |
-
2020
- 2020-03-17 JP JP2020046374A patent/JP7419120B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7419120B2 (en) | 2024-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alper et al. | Human C′ 3: evidence for the liver as the primary site of synthesis | |
| Camisa et al. | The effects of retinoids on neutrophil functions in vitro | |
| Buxman et al. | Harlequin ichthyosis with epidermal lipid abnormality | |
| Hanifin et al. | In vitro studies of granulomatous hypersensitivity to beryllium. | |
| JP5081896B2 (en) | Cosmetic active ingredient comprising arginine ferulate and microalgae extract and use thereof | |
| RUDNER et al. | Scleromyxedema: a variant of lichen myxedematosus | |
| Cakmak et al. | Serum prolidase activity and oxidative status in patients with bronchial asthma | |
| Smith et al. | The skin as a route of allergen exposure: part I. Immune components and mechanisms | |
| JP5025015B2 (en) | Method for evaluating the degree of glycation of protein and method for evaluating an agent for inhibiting or improving glycation of protein | |
| Rossi et al. | Mechanism of production of toxic oxygen radicals by granulocytes and macrophages and their function in the inflammatory process | |
| EP2986983B1 (en) | Use of barrier biomarkers for evaluating the effectiveness of active ingredients | |
| Visscher et al. | Epidermal immunity and function: origin in neonatal skin | |
| Stenram | Interferometric determinations of the ribose nucleic acid concentration in liver nucleoli of protein-fed and protein-deprived rats | |
| Hendriks et al. | Cutaneous application of leukotriene B4 as an in vivo model of psoriasis-like skin inflammation: an immunohistological study | |
| JP2021148492A (en) | Horny cell layer separation improving agent and method for screening the same | |
| JP3457008B2 (en) | Process for the preparation of products intended especially for the prevention and healing of skin disorders and products of this kind | |
| Flesch et al. | The gram-staining material of human epidermis | |
| Harmon et al. | Identification and characterization of the insulin receptor in the R3230AC mammary adenocarcinoma of the rat | |
| WO2013084578A1 (en) | Evaluation method, screening method, antipruritic substance, and antipruritic agent | |
| Pincelli et al. | Pseudopelade of Brocq: an immunologically mediated disease? | |
| JPS634147B2 (en) | ||
| WO2004100915A1 (en) | Active ingredient for skin treatments, method for the production thereof and use of the same | |
| JP7263573B2 (en) | Screening method for keratotic plug formation preventive/improving agent | |
| JP7024004B2 (en) | Screening method for preventive / ameliorating agents for keratin plug formation | |
| Foltinová et al. | Placenta and umbilical cord blood deserve attention |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221019 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230810 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230815 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231012 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240109 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240110 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7419120 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |