JP2009520812A - ペプチド含有抗癌剤(anticanceragentcomprisingapeptide) - Google Patents
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Abstract
【選択図】図11
Description
Le, Y., Li, B., Gong, W., Shen, W., Hu, J., Dunlop, N. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2000) Immunol Rev. 177, 185-194. Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105. White, J. R., Lee, J. M., Young, P. R., Hertzberg, R. P., Jurewicz, A. J., Chaikin, M. A., Widdowson, K., Foley, J. J., Martin, L. D., Griswold, D. E., and Sarau, H. M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10095-10098. Zagorski, J., and Wahl, S. M. (1997) J. Immunol. 159, 1059-1062. Prossnitz, E. R., and Ye, R. D. (1997) Pharmacol. Ther. 74, 73-102. Su, S. B., Gong, W. H., Gao, J. L., Shen, W. P., Grimm, M. C., Deng, X., Murphy, P. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (1999) Blood 93, 3885-3892. Walther, A., Riehemann, K., and Gerke, V. (2000) Mol. Cell. 5, 831-840. Baek, S. H., Seo, J. K., Chae, C. B., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8170-8175. Seo, J. K., Choi, S. Y., Kim, Y., Baek, S. H., Kim, K. T., Chae, C. B., Lambeth, J. D., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1997) J. Immunol. 158, 1895-1901. Bae, Y. S., Ju, S. A., Kim, J. Y., Seo, J. K., Baek, S. H., Kwak, J. Y., Kim, B. S., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 241-248. Bae, Y. S., Kim, Y., Kim, Y., Kim, J. H., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 66, 915-922. Le, Y., Gong, W., Li, B., Dunlop, N. M., Shen, W., Su, S. B., Ye, R. D., and Wang, J. M. (1999) J. Immunol. 163, 6777-6784.
(a)人間のモノサイトまたは好中球でスーパーオキシド生成を誘導する;
(b)人間末梢血モノサイトまたは好中球による細胞内カルシウム増加を誘導する;
(c)FPR(ホルミルペプチド受容体)またはFPRL1(ホルミルペプチド受容体-like1)に結合する;
(d)試験管内で人間のモノサイトまたは好中球の走化性移動を誘導する;
(e)FPR(ホルミルペプチド受容体)発現細胞またはFPRL1(ホルミルペプチド受容体-like1)発現細胞から脱顆粒化を誘導する;
(f)FPR(ホルミルペプチド受容体)またはFPRL1(ホルミルペプチド受容体-like1)の活性化を通じて細胞外信号-調節された蛋白質キナーゼリン酸化を促進する。
(g)FPR(ホルミルペプチド受容体)またはFPRL1(ホルミルペプチド受容体-like1)の活性化を通じてAktリン酸化を促進させる。
物質
Fmocアミノ酸はミリポア(Millipore、Bedford、MA)で購入した。Rapidamide樹脂はデュポン社(Boston、MA)から購入した。末梢血単核細胞(PBMC)分離培地(Histopaque-1077)、シトクロムc及びfMLFはSigma(St.Louis、MO)から購入した。ペンタアセトキシメチルエステル(fura-2/AM)はMolecular Probes(Eugene、OR)から購入した。RPMI1640はLife Technologies(GrandIsland、NY)から購入した。透析されたウシの胎児血清及び補充されたウシの血清はHyclone Laboratories Inc.(Logen、UT)から購入した。PTX、GF109203X及びPD98059はCalbiochem(San Diego、CA)から購入した。LY294002はBIOMOL研究所(Polymouth Meeting、PA)から購入した。
RPMI1640はInvitrogen Corp.(Carlsbad、CA)で購入した。希釈されたウシの胎児血清と補充されたウシの血清はHyclone Laboratories Inc.(Logan、UT)で購入した。CpG ODN(全てホスホロチオエートバックボーンを有する5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3')はGenotech Inc.(Daejon、Korea)で合成された。
CT26、EL4を37℃で20%(vol/vol)熱活性化されたウシの胎児血清で補充されたRPMA1640培地で湿潤化された5%のCO2雰囲気で維持させた。動物試験のために冷凍貯蔵庫で再成長させた後、前記細胞を2〜5回継代培養した。ログ相(log phase)CT26細胞を0.25%のトリプシンと0.03%のEDTAで組織培養フラスコから分離した。CT26及びEL4を洗浄して注入する直前にPBSに再懸濁させた。
特異な病原菌のない雄Balb/cマウス及びC57/BL6マウスをヒョチャンバイオサイエンス(Hyo Chang Bioscience、大邱、韓国)で購入した。すべてのマウスはImmunomodulation Research Center(University of Ulsan、Korea)の動物施設所の特異的病原菌のない条件で維持し、6〜8週齢に使用した。CT26及びEL4をBalb/cマウス及びC57/BL6マウスの皮下(s.c.)にそれぞれ注入した(0日目)。WRYMVm(配列番号:4)及びCpGODNを6日目から4日ごとに全身(i.p.;200μl)に注入した。対照群はPBSまたは100μg/マウスのCpGODNを注入した。ビンクリスチンはペプチドまたはCpGODNを注入する8時間前に同一日付で腹腔(i.p.)注射で投与した。接種した後、2日ごとに腫瘍質量(tumor mass)をデジタルバリエルカリパー(Varier caliper)で測定した。腫瘍体積は長さ×幅×高さ×π/6で計算した。マウスが腫瘍で倒れたり死ぬ状態で犠牲になった日または腫瘍の幅(腫瘍がそれ以上小さくならない時の幅)が20mmになった時を死亡日として記録した。
測定結果を10mice/groupの平均SEで表現した。図9乃至12で*はビヒクル(PBS)処理された対照群に比べてp<0.01を示し、**はp<0.05を示す。
末梢穴白血球濃縮液の寄贈は韓国蔚山(ウルサン)赤十字血液センターから受けた。人間の好中球はデキストラン沈降法(dextran sedimentation)、赤血球の低浸透圧の細胞溶解(hypotonic lysis)及びリンパ球分離媒質勾配(lymphocyte separation medium gradient)の標準手続にじたがって分離した(9)。分離された人間好中球は直ちに使用された。
WKYMVm、配列番号:1乃至24のペプチド及びwkymvmの人間好中球でスーパーオキシド生成に与えるペプチドの活性を測定した。スーパーオキシド陰イオン生成をマイクロタイター96-ウェルプレートELISAリーダーを使用してシトクロムcの還元を測定して定量した(Bio-Tekinstruments、EL312e、Winooski、VT)(14)。人間の好中球(96ウェルプレートの各ウェル糖1×106cells/100μlのRPMI1640培地)は37℃で1分間50Μmのシトクロムcと予め培養し、その後、表示された濃度のペプチドで培養した。スーパーオキシド生成は1分間隔で5分にわたって550nm光吸収の変化で測定した。少なくとも4回の独立した実験で各位置での活性アミノ酸を有するペプチドを選定した。これらの結果は表1に記載されている。
FPR-発現RBL-2H3細胞でWKYMVm、配列番号:1乃至24のペプチド及びwkymvmのペプチドが[Ca2+]iの増加に与える活性を測定した。FPR-発現RBL-2H3細胞を10μMのペプチドで刺激し、[Ca2+]iを測定した。[Ca2+]iの水準はfura-2/AMを使用してGrynkiewicz方法で蛍光測定して決めた(15)。製造された細胞を新鮮な無血清RPMI1640培地で継続して攪拌しながら、50分間37℃で3μMのfura-2/AMで培養した。2×106細胞をCa2+のないLocke’s溶液(154mMのNaCl、5.6mMのKCl、1.2mMのMgCl2、5mMのHEPES、pH7.3、10mMのブドウ糖及び0.2mMのEGTA)で各分析に用いられるように分取した。340nm及び380nmでの二重励起波長の蛍光変化及び500nmの発光波長を測定して補正された蛍光率を[Ca2+]i.に変え、増加した[Ca2+]iピーク水準を測定した。その結果を表3及び図1Aに示した。データは3つの独立的な実験の代表値である。
いくつかのペプチド(WKGMVm(配列番号:1)、WKRMVm(配列番号:11)、D-Met6置換ペプチド)がサイトゾル(cytosolic)カルシウム増加を誘導することができないという事実から、前記ペプチドがFPRに結合できるかどうかについて調査した。FPRまたはFPRL1に対する125I-標識されたWKYMVm結合の置換程度を調査した。標識されていないWKYMVmまたは配列番号:1乃至24のペプチドの量を増加させたりまたはこれらペプチドが存在しないようにしてFPR-発現RBL-2H3細胞を[125I]WKYMVmと培養した。
i)ペプチドによる細胞刺激
培養されたRBL-2H3細胞を2×106細胞に分取して標識された濃度のWKYMVm及び本発明のペプチドで標識された時間だけ刺激した。FPR-またはFPRL1-発現RBL-2H3細胞は多様な時間で1μMのWKYMVmで刺激した(図3A)。2つの細胞を1μMのWKYMVm処理前にビークルまたは100ng/mlのPTX(24時間)、50μMのLY294002(15分)、5μMのGFX(15分)、10μMBAPTA/AM(60分)または50μMPD98059(60分)で予め培養した(図3B)。FPR-またはFPRL1-発現RBL2H3細胞を10μMの本発明のペプチドで2分または5分間刺激した(図3C)。
各々の試料(30gのペプチド)を10%のSDS-PAGEで処理してリン酸化されたERKを抗-ホスホ-ERK抗体で免疫ブロットによって測定した。蛋白質試料は濃縮された試料バッファーを添加して電気泳動用に製造した。試料のうちの一部をLaemmliに記載されたバッファーシステムを使用して10%のSDS-ポリアクリールアミドゲルによって分離した(17)。
FPR-またはFPRL1-発現RBL-2H3細胞のFPRまたはRPRL1を通じた細胞シグナリングに対するペプチドの効果を評価して、その結果を図3A乃至図3Bに示した。図3A乃至図3Cの結果は3回の独立した実験の代表値である。
走化性物質受容体の活性化はPI3Kを通じてAkt活性化を誘導することはよく知られている(19)。前記ペプチドで細胞の刺激、電気泳動及び免疫ブロット分析は実施例5と同一に実施した。
顆粒の分泌は肥満細胞で最も重要な作用である(20)。WKYMVmの顆粒分泌に与える効果をβ-ヘキソサミニダーゼ分泌を測定して調べてみた(18)。FPRまたはFPRL1を発現するRBL-2H3細胞(2×105/ウェル)を24-ウェル組織培養プレートで一夜培養した。細胞をTyrode’sバッファー(137MmのNaCl、12mMのNaHCO3、5.6mMのグルコース、2.7mMのKCl、1mMのCaCl2、0.5mMのMgCl2、0.4mMのNaH2PO4、0.1g/100mlのBSA及び25mM HEPES、pH7.4)で2回洗浄し、それぞれのペプチドで刺激した。多様な濃度のWKYMVmがFPR-またはFPRL1-発現RBL-2H3細胞で処理された(図5A)。1μMのWKYMVmを10μM BAPTA/AMが存在または存在しない環境で2つの細胞株を刺激するのに使用した(図5B)。氷上にプレートを放置することによって刺激後20分後に反応を終了させた。β-ヘキソサミニダーゼの培地への分泌は50μlの上層液または細胞溶解液を0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.8)で37℃、2時間25μlの5mMのp-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミドで培養して測定した。培養末期に50μlの0.4MのNa2CO3を添加した。405nmでの吸光度を測定してその結果を図5A及び図5Bに示した。データは3回反復実施した3回の実験の代表値の平均値±S.E.である。数値(平均値±S.E.)は細胞に存在する全体のβ-ヘキソサミニダーゼに対する百分率で示した。
走化性分析は多重ウェルチャンバー(Neuroprobe Inc.,Gaithersburg,MD)を使用して実施した(18)。ポリカーボネートフィルター(8μm pore size)をHEPES-バッファーRPMI1640培地で50μg/mlのラットタイプIコラーゲンで予めコーティングした。乾燥コーティングされたフィルターを互いに異なる濃度のペプチドを含む96-ウェルチャンバー上に放置した。FPRまたはFPRL1を発現するRBL-2H3細胞は1×106cells/mlの無血清RPMIの濃度でRPMIに懸濁され、25μlの懸濁液は96-ウェル走化性チャンバーの上部ウェル上に放置された。37℃で4時間培養した後、移動しなかった細胞をスクラッピングして除去し、フィルターを通過して移動した細胞を脱水及び固定し、ヘマトキシリン(hematoxylin(Sigma、St.Louis、MO))で染色した。前記ウェルで5個の無作為で選択されたHPF(high power fields、400X)で染色された細胞を計数した。図7Aは前記走化性分析結果を示した図面である。ビークル、50μMのLY294002(15分)及び50μMのPD98059(60分)で予め処理された細胞を1μMのWKYMVmを使用した走化性分析に使用した。その結果を図7Bに示した。移動した細胞の数をHPF(400X)で計数して測定した。データは各々2回実施した3回の独立した実験の平均値±SEで示された。
免疫調節ペプチドTrp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-CONH2(WRYMVm;配列番号:4)の抗腫瘍効果を評価するために、CT26、大腸癌をBalb/cマウスモデルを利用して試験した。腫瘍質量は腫瘍細胞接種の6日後、2日ごとに大きさを測定した。図9A及び9Bに示されたように、2μg/マウスのWRYMVmが22日目に成功的に腫瘍質量成長を抑制させた(PBS対照群に比べて50%)。100μg/マウスのCpGオリゴジオキシヌクレオチド(ODN)を比較テストしたが、CpGODN-処理された群は腫瘍成長に効果的な結果を示さなかった。このような結果はWRYMVm免疫調節ペプチドがCT26腫瘍を有意性あるように抑制することを示す。
他の腫瘍モデルEL4、リンパ細胞でのWRYMVmの抗腫瘍効果を試験した。EL4の腫瘍質量を形成するためにEL4(2×105cells/mouse)をC57/BL6マウスの皮下(s.c.)に注入した。図10A及び10Bに示されているように、WRYMVmはEL4の腫瘍質量を抑制することができる。この結果はCT26実験と相関性がある。したがって、WRYMVmはマウスモデルで腫瘍成長抑制効果を有することを確認することができる。
WRYMVmの効果的な腫瘍抑制投与量を確認するために0.1μg/mouse、0.25μg/mouse及び1μg/mouseのWRYMVmをCT26/Balb/cモデルに投与した。図11A及び11Bに示されているように、0.1μg/mouse処理された群は最も高い腫瘍抑制効果を示した。これに比べて1μg/mouse投与量では腫瘍抑制効果が低くなった。このような結果はWRYMVmの抗腫瘍性能が高濃度では脱減作されて非常に敏感であるということを強く示唆する。類似の現象が白血球の走化性移動でも容易に発見される。WRYMVmの標的収容体であるFPRL1が走化性移動に関与するという事実でWRYMVm-誘導された抗腫瘍効果は白血球浸潤(infiltration)現象によって誘導されると見られる。したがって、WRYMVm-誘導された抗腫瘍効果と白血球浸潤現状の直接的な関係を明らかにする必要がある。
WRYMVmの抗腫瘍効果を増加させるために抗癌剤であるビンクリスチンを組み合わせて使用した。ビンクリスチンは微小管恒常性(microtubul ehomeostasis)を破壊し、その結果、細胞死滅をもたらす。ビンクリスチンを使用することで免疫システムに対する腫瘍特異な抗原を提供することができる。したがって、ペプチド注入8時間前に2μg/mouseのビンクリスチンを腹腔(i.p.)注入した。ビンクリスチン単独処理群はWRYMVm-処理群と類似な腫瘍成長抑制パターンを示した(図12A)。予想した通り、WRYMVmとビンクリスチンを共に処理すると最も効果的な抗腫瘍活性を示した。前記組み合わせ使用はWRYMVm単独またはビンクリスチン単独使用より15%向上した。生存率でも類似の結果を示した(図12B)。組み合わせ使用は単独使用に比べて有意性のある改善点を示さなかったが、組み合わせ使用処理群、WRYMVm-処理群及びビンクリスチン-処理群の3つの処理群は腫瘍成長を抑制することができた。これに比べてPBS対照群及びCpG ODNは死滅を防止することはできなかった。これから免疫調節ペプチドWRYMVmは坑癌活性を有すると言える。
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Claims (11)
- 配列番号:4、配列番号:11及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む抗癌剤。
- 前記抗癌剤は大腸癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項1に記載の抗癌剤。
- 前記抗癌剤は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞(squamous cell)、リンパ細胞または白血球から由来する癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項2に記載の抗癌剤。
- 配列番号:4、配列番号:11及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列またはこれらの類似体を患者に癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させるための有効な量で投与して癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させる方法。
- 配列番号:4、配列番号:11及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を患者に有効な量で投与することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 配列番号:4、配列番号:11及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列の類似体を患者に有効な量で投与することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記増殖が抑制されたり死滅が増加する癌細胞は大腸癌細胞であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記増殖が抑制されたり細胞死滅が増加する癌細胞は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から誘導される癌細胞であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 配列番号:4、配列番号:11及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその類似体及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む癌細胞増殖を抑制したり癌細胞死滅を増加させることを特徴とする薬学組成物。
- 前記薬学組成物は大腸癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項9に記載の薬学組成物。
- 前記抗癌剤は膵臓、乳房、肺、脳、前立腺、扁平上皮細胞、リンパ細胞または白血球から由来する癌を抑制するのに使用されることを特徴とする、請求項9に記載の薬学組成物。
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