KR20080071194A - 펩타이드 함유 항암제 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 항암제는 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함한다. 상기 항암제는 대장, 췌장, 유방, 폐, 뇌, 전립선, 편평 상피세포, 림프 세포, 또는 백혈구로부터 유래하는 암을 억제하는 데 사용될 수 있다.
펩타이드, FPR, FPRL1, 항암, 아미노산, 면역, 조절, 펩타이드

Description

펩타이드 함유 항암제{ANTICANCER AGENT COMPRISING A PEPTIDE}
본 발명은 면역 조절 펩타이드(immune-modulating peptide)에 관한 것이다. 호중구(neutrophil) 및 모노사이트와 같은 식세포(phagocytic cell)에서 발현되는 포르밀 펩타이드 수용체 족(formyl peptide receptor (FPR) 및 formyl peptide receptor-like 1(FPRL1))은 병원균 감염에 대한 숙주의 대항(defense)에서 중요한 역할을 한다(1, 2). 상기 수용체는 백일해 톡신-민감성(pertussis toxin-sensitive) Gi 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있다(1, 2). FPR의 활성화는 Gαi 서브유닛에서 Gβγ 서브유닛의 분리를 유도하고, βγ-서브유닛은 포스포리파제 Cβ 또는 포스포이노시타이드 3-카이나제의 활성화를 유도한다 (1, 2). 이러한 분자들의 활성화는 복잡한 하부(downstream) 시그널링을 유도하여 주화성 이동(chemotactic migration), 탈과립화(degranulation), 및 수퍼옥사이드 생성(superoxide generation)와 같은 세포 반응을 다양화한다.
대부분의 주요 작용제(agonists)는 복잡한 면역 반응을 유발하는 많은 복잡한 세포 시그널링(cellular signaling)을 유도한다. 상기 면역반응중 대부분이 침입 병균을 제거하기 위한 숙주 세포의 적합한 기능에 필수적으로 필요하지만, 몇몇 반응은 면역 반응에서 바람직하지 않은 부작용이 될 수도 있다. 약제 개발 분야에 서 약제 후보물질의 부작용을 감소시키거나 제거하는 것이 주요 관심사이다. 이를 위하여 선택적인 면역반응 조절인자 또는 몇 개의 접근 경로를 통한 선택적인 대항제(antagonists)를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다(3, 4).
FPR의 다양한 작용제는 내인성 공급원(endogenous source) 또는 인공합성으로 확인되었다(1, 2). 이들의 예로는 박테리아 펩타이드 (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLF)), HIV-외피 도메인(T20 및 T21), 및 숙주-유도성 작용제(host-derived agonists; Annexin I 및 Aβ42) (5-7) 등이 있다. 이전에 본 발명자는 합성 모노사이트 및 호중구(neutrophil)와 같은 백혈구 세포를 증가시키는(stimulate)하는 펩타이드 리간드(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2)(이하에서는 "WKYMVm"이라 함)를 발표하였다 (8-11). Le 등은 WKYMVm이 FPR(formyl peptide receptor) 및 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)에 결합한다고 발표하였다(12). WKYMVm은 넓은 범위의 수용체에 대하여 높은 친화도를 가지는 짧은 펩타이드이므로 FPR- 또는 FPRL1-매개된 시그널링의 연구에 유용할 수 있다. 그러나 특이적 수용체에 대한 선택적인 면역 조절인자 또는 선택적인 대항제를 개발하기 위한 연구뿐만 아니라 분자 다양성을 스크린하는 연구는 작은 화합물로 이루어져 이제까지 매우 제한적으로 이루어졌으므로 새로운 화합물을 규명하려는 계속적인 요청이 있어왔다.
본 발명은 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 항암제를 제공하기 위한 것이다.
상기 항암제는 대장, 췌장, 유방, 폐, 뇌, 전립선, 편평 상피세포(squamous cell), 림프 세포, 또는 백혈구에서 유래하는 암을 억제하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들의 유사체를 환자에 유효한 양으로 투여하여 암세포 증식을 억제하거나 암세포 사멸을 증가시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들의 유사체는 유효한 양으로 이를 필요로 하는 환자에 투여된다.
상기 증식이 억제되거나 세포 사멸이 증가되는 암세포는 대장암 세포이다. 증식이 억제되거나 세포사멸이 증가되는 암세포는 췌장, 유방, 폐, 뇌, 전립선, 편평 상피세포, 림프세포, 또는 백혈구로부터 유도되는 암세포일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 또는 이의 유사체, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형체를 포함하는 암세포 증식을 억제하거나 암세포 사멸을 증가시키는 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 하기 상세한 설명에 의하여 보다 명백하여 질 것이다.
도 1A와 도 1B는 FPR-발현 RBL-2H3 세포(도 1A) 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포(도 1B)에서 [Ca2 +]i 에 대한 WKYMVm, 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18)), 또는 fMLF의 영향을 보인 도면이다.
도 2A와 도 2B는 WKYMVm, 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18)), 및 fMLF에 의한 FPR or FPRL1에 결합된 125I-표지된 WKYMVm의 치환정도(displacement)를 보인 도면이다.
도 3A, 도 3B 및 도 3C는 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서의 ERK 포스포릴레이션에 미치는 WKYMVm, 본 발명의 펩타이드 (WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18)), fMLF, 및 wkymvm의 효과를 보인 도면이다.
도 4A, 도 4B 및 도 4C는 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 Akt 포스포릴레이션에 미치는 WKYMVm, 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18)), fMLF, 및 wkymvm의 효과를 보인 도면이다.
도 5A와 도 5B는 WKYMVm이 세포내 칼슘 증가를 통하여 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 엑소시토시스(exocytosis)를 자극하는 것을 보인 도면이다.
도 6A와 도 6B는 펩타이드-유도된 [Ca2 +]i 증가시 N-포르밀-메치오닐-류실-페닐알라닌 (fMLF)의 엑소시토시스에 대한 WKYMVm, 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18)), fMLF, 및 wkymvm의 효과를 보인 도면이다.
도 7A와 도 7B은 WKYMVm이 PI3K 및 MEK 활성을 통하여 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포의 주화성 이동을 자극하는 것을 보인 도면이다.
도 8A와 도 8B는 주화성(chemotaxis)에 미치는 WKYMVm, 본 발명의 펩타이드 (WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18)), fMLF, 및 wkymvm의 효과를 보인 도면이다.
도 9A 및 도 9B는 WRYMVm(SEQ ID NO: 4) 및 WKRMVm(서열번호: 11)가 CT26-주입된 마우스에서 종양 성장을 약화시키는 것을 보여주는 도면이다.
도 10A 및 도 10B는 WRYMVm(서열번호: 4)이 EL4-주입된 마우스에서 종양 성장을 약화시키는 것을 보여주는 도면이다.
도 11A 및 도 11B는 WRYMVm(서열번호: 4)을 소량 투여하는 경우 CT26 모델에서 가장 효과적임을 보여주는 도면이다.
도 12A 및 도 12B는 WRYMVm(서열번호: 4)과 빙크리스틴(vincristine)을 조합사용하는 경우 항종양 효과를 향상시키는 것을 보여주는 도면이다.
FPR(formyl peptide receptor) 및 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)은 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 본 발명은 WKYMVm에서 유도된 펩타이드를 제공한다. 많은 펩타이드는 FPR 또는 FPRL1을 자극하여 칼슘을 증가시키나 WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), 및 6th D-Met 치환 펩타이드는 FPRL1-발현 세포에서만 칼슘을 증가시키고 FPR-발현세포에서는 그렇지 않다. 125I-WKYMVm을 사용한 경쟁(competition) 분석은 FPR-발현 세포에서 많은 단백질이 칼슘을 증가시키는 효과를 가질 뿐만 아니라 WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), 및 6th D-Met 치환 펩타이드도 FPR에 대한 결합에서 125I-WKYMVm와 경쟁할 수 있다는 것을 보여주었다. 포스포리파아제 C-매개된 칼슘 증가와는 달리, WKGMVm, WKRMVm, 및 6th D-Met 치환 펩타이드는 FPR-발현 세포에서 세포외 조절된 단백질 카이나제(extracellular regulated protein kinase; ERK) 및 Akt 활성화를 자극할 수 있다. WKYMVm 펩타이드는 FPR 세포에서 Ca2 + 및 ERK 경로를 통하여 탈과립화 및 세포의 주화성을 자극한다. 그러나 WKGMVm, WKRMVm, 및 6th D-Met 치환 펩타이드는 주화성 이동의 유도에 의해서만 FPR 세포를 자극하나 탈과립화에 의해서는 그렇지 않다. 중요한 화학주성물질(chemoattractant) 수용체로서 FPR 은 리간드 특이적으로 서로 구별되는 펩타이드 리간드에 의하여 조절될 수 있다는 사실이 처음으로 밝혀졌다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 서열번호: 1 내지 서 열번호: 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열번호: 1 내지 서열번호: 24의 펩타이드에서 유도되는 물질(substance)을 포함한다. 서열번호: 1 내지 서열번호: 24는 다음과 같다:
Trp-Lys-Gly-Met-Val-D-Met-NH2 (WKGMVm; 서열번호: 1), Trp-Lys-Tyr-Met-Gly-D-Met-NH2 (WKYMGm; 서열번호: 2) Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly-NH2 (WKYMVG; 서열번호: 3), Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2 (WRYMVm; 서열번호: 4), Trp-Glu-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2 (WEYMVm; 서열번호: 5), Trp-His-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2 (WHYMVm; 서열번호: 6), Trp-Asp-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2 (WDYMVm; 서열번호: 7), Trp-Lys-His-Met-Val-D-Met-NH2 (WKHMVm; 서열번호: 8), Trp-Lys-Glu-Met-Val-D-Met-NH2 (WKEMVm; 서열번호: 9), Trp-Lys-Trp-Met-Val-D-Met-NH2 (WKWMVm; 서열번호: 10), Trp-Lys-Arg-Met-Val-D-Met-NH2 (WKRMVm; 서열번호: 11), Trp-Lys-Asp-Met-Val-D-Met-NH2 (WKDMVm; 서열번호: 12), Trp-Lys-Phe-Met-Val-D-Met-NH2 (WKFMVm; 서열번호: 13), Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-D-Met-NH2 (WKYMYm; 서열번호: 14), Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-D-Met-NH2 (WKYM(F/W)m; 서열번호: 15), Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu-NH2 (WKYMVE; 서열번호: 16), Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Val-NH2 (WKYMVV; 서열번호: 17), Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg-NH2 (WKYMVR; 서열번호: 18), Trp-Lys- Tyr-Met-Val-Trp-NH2 (WKYMVW; 서열번호: 19), Trp-Lys-Tyr-Met-Val-NH2 (WKYMV; 서열번호: 20), Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2 (KYMVm; 서열번호: 21), Lys-Tyr-Met-Val-NH2 (KYMV; 서열번호: 22), Tyr-Met-Val-D-Met-NH2 (YMVm; 서열번호: 23), 및 Met-Val-D-Met-NH2 (MVm; 서열번호: 24).
서열번호: 1 내지 서열번호: 24의 펩타이드는 분리된(isolated) 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.
상기 펩타이드는 카르복실기에서 -NH2 기로 선택적으로 치환된 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 하기 특성중 적어도 하나를 가진다:
(a) 인간의 모노사이트 또는 호중구에서 수퍼옥사이드 생성을 유도한다;
(b) 인간 말초혈 모노사이트 또는 호중구에 의한 세포내 칼슘 증가를 유도한다;
(c) FPR(formyl peptide receptor) 또는 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)에 결합한다;
(d) 시험관내에서 인간의 모노사이트 또는 호중구의 주화성 이동을 유도한다;
(e) FPR(formyl peptide receptor) 발현 세포 또는 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1) 발현 세포 에서 탈과립화를 유도한다;
(f) FPR(formyl peptide receptor) 또는 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)의 활성화를 통하여 세포외 신호-조절된 단백질 카이나제 포스포릴레이션을 증가시킨다.
(g) FPR(formyl peptide receptor) 또는 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)의 활성화를 통하여 Akt 포스포릴레이션을 증가시킨다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 서열번호: 1 내지 서열번호: 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 서열번호: 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드에서 유도되는 물질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드 또는 물질을 활성 성분으로 포함하는 약학 조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올에서 선택되는 약학적 희석제중 1종 이상 포함할 수 있으며, 희석제는 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 투여목적 및 질병에 따라 상이하게 적용될 수 있다. 실질적으로 투여되는 활성 성분의 양은 다양한 관련 요소, 즉 치료하고자 하는 질병, 환자상태의 정도, 다른 약제(예를 들어 주화성 약제)와 공동 투여여부, 환자의 나이 성별, 체중, 음식, 투여시간, 투여경로, 및 조성물의 투여비율(ratio)을 고려하여 결정하여야 한다. 상기 조성물은 투여량 및 투여경로가 질병의 형태 및 심각성에 따라 조절될 수 있기는 하지만 하루에 한번 또는 1-3번 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 물질을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 경구이외의 투여경로, 즉 직장, 정맥, 복막 및 근 육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구, 및 피하를 통한 약제 투여를 의미한다.
상기 펩타이드 또는 물질을 포함하는 약학 조성물은 경구 투여 형태, 주입 가능한 용액 또는 국소제제와 같은 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다. 제제화는 경구 및 주입 가능한 투여(진용액(true solution), 현탁액 또는 에멀젼)에 적합하도록 제조되는 것이 바람직하며, 정제, 캡슐, 연질캡슐, 수성 약제, 환제, 과립 등과 같은 경구 형태로 제조되는 것이 가장 바람직하다.
상기 제제화에서 본 발명의 펩타이드는 부형제(excipient)없이 연질 캡슐에 충전되며, 담지체와 혼합되거나 희석된 후에 적당한 제제로 만들어진다. 적합한 담지체의 예로는 전분, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 등이 있다.
WRYMVm(서열번호: 4) 또는 WKRMVm(서열번호: 11)의 아미노산 펩타이드는 마우스 종양 모델, CT26, EL4 등의 종양 성장을 약화시킬 수 있다. 또한 WRYMVm의 종양 약화 효과는 소량의 투여량에서도 효과적으로 나타나며 오히려 투여량을 높이면 효과적이지 않다. WRYMVm은 다른 항암제, 빙크리스틴(vincristine)과 함께 조합하여 사용하면 종양 크기를 억제하고 생존률을 높이는 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 백혈구의 수 또는 활성화 상태의 변화를 수반하거나 그러한 변화에 의해 유발되는 질병의 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 상기 질병의 치료를 필요로 하는 숙주에 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 질병은 박테리아, 미코플라즈마(mycoplasma), 효모, 곰팡이, 바이러스에 의한 감염, 또는 염증일 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 백혈구의 수를 증가시키거나 활성화 상태를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 백혈구의 수의 증가 또는 높은 활성화 상태를 필요로 하는 질병의 치료를 요하는 숙주에 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 백혈구에서의 세포외(extracellular) 칼슘 증가를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로(prophylactically) 유도 또는 탈감작(desensitization)을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 인간 모노사이트 또는 호중구에 의한 수퍼옥사이드 생성을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로 유도 또는 탈감작을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 인간의 말초혈 단핵 세포에 의한 주화성 이동(chemotactic migration)을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로 유도 또는 탈감작을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, FPR 발현 세포 또는 FPRL1 발현 세포에서의 탈과립화를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로 유도 또는 탈감작을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, FPR 발현 세포 또는 FPRL1 발현 세포에서의 FPR 또는 FPRL1에 결합에 대하여 WKYMVm보다 펩타이드의 결합력을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로 유도 또는 탈감작을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, FPR 발현 세포 또는 FPRL1 발현 세포에서의 세포외 신호에 의해 조절되는 단백질 카이나제를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로 유도 또는 탈감작을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, FPR 발현 세포 또는 FPRL1 발현 세포에서의 Akt를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 서열번호: 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도되는 물질을 환자에 치료학적으로 유효한 양으로 또는 예방학적으로 유도 또는 탈감작을 얻을 수 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다.
상기 실시예에서 치료되는 숙주 또는 환자는 감염에 의해 유발되는 질병, 특히, 사이토메갈로바이러스 감염(cytomegalovirus infection), 류머티즘성 관절염, 라임관절염(Lyme's arthritis), 통풍(gout), 패혈증(sepsis syndrome), 고열(hyperthermia), 궤양성 결장염(ulcerative colitis), 소장결장염, 골다공증, 치주병(periodontal disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 만성 비감염성 폐염증(chronic non-infectious inflammation of the lung), 사르코이드증(sarcoidosis), 흡연자의 폐(smoker's lung), 육아종 형성(granuloma formation), 간의 섬유증(fibrosis of the liver), 폐의 섬유증, 이식 거부(transplant rejection), 거부반응(graft vs. host disease), 만성 골수 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 골수 백혈병(acute myeloid leukemia), 종양성 질병(neoplastic diseases), 기관지천식(asthma bronchiale), 타입 I 인슐린 의존성 당뇨(diabetes mellitus), 동맥경화증(arteriosclerosis), 죽상경화증(atherosclerosis), 건선(psoriasis), 만성 B 림프구 백혈병, 분류불능형 면역부전증(common variable immunodeficiency), 파종성 혈관내응고증(disseminated intravascular coagulation), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 폐염증(lung inflammation), 과 IgE 증후군(hyper IgE syndrome), 암 전이(cancer metastasis), 암 성장(cancer growth), 입양면역요법(adoptive immune therapy), 후천성 호흡 곤란 증후군(acquired respiratory distress syndrome), 패혈증(sepsis), 재관류 증후군(reperfusion syndrome), 수술후 염증(postsurgical inflammation), 기관 이식(organ transplantation), 또는 탈모증(alopecia)을 가진 숙주나 환자일 수 있다.
본 발명은 서열번호: 1 내지 서열번호: 24의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 코드하는 분리된 뉴틀레오티드를 제공한다 .
본 발명은 서열번호: 1 내지 서열번호: 24의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 코드하는 분리된 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 서열번호: 1 내지 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명된다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예에 사용된 물질 및 방법
물질
Fmoc 아미노산은 Millipore (Bedford, MA)에서 구입하였다. Rapidamide 수지는 듀퐁사(Boston, MA)에서 구입하였다. 말초혈 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 분리배지(Histopaque-1077), 시토크롬 c, 및 fMLF는 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다. Fura-2 펜타아세톡시메틸에스테르(fura-2/AM)는 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 구입하였다. RPMI 1640는 Life Technologies (Grand Island, NY)에서 구입하였다. 투석된 소 태아 혈청(Dialyzed fetal bovine serum) 및 보충된 소 혈청(supplemented bovine serum)은 Hyclone Laboratories Inc. (Logen, UT)에서 구입하였다. PTX, GF109203X, 및 PD98059은 Calbiochem (San Diego, CA)에서 구입하였다. LY294002는 BIOMOL 연구소(Polymouth Meeting, PA)에서 구입하였다.
펩타이드는 고상법으로 합성하였다(8, 9). 간단히 설명하면, 펩타이드를 rapidamide 지지체 수지 상에서 합성하여 표준 Fmoc/t-butyl 법에 따라 산-불안정성 링커(acid-labile linker)로 조립하였다. 펩타이드 조성은 아미노산 분석법으로 확인하였다(8).
RBL-2H3, FPR-발현 RBL-2H3, 및 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포는 20% FBS 및 200 g/ml 의 G418로 보충된 DMEM으로 배양하였다(13).
RPMI1640는 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. 희석된 우 태아 혈청(fetal bovine serum)과 보충된(supplemented) 소 혈청은 Hyclone Laboratories Inc. (Logan, UT)에서 구입하였다. CpG ODN(모두 포스포로티오에이트 백본을 가지는 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3')은 Genotech Inc.(Daejon, Korea)에서 합성되었다.
종양세포주 ( Tumor cell line ) 제조
CT26, EL4 를 37℃ 에서 20 % (vol/vol) 열활성화된 우 태아 혈청으로 보충된 RPMA1640 배지에서 습윤화된 5 % CO2 분위기에서 유지되도록 하였다. 동물 시험을 위해 냉동 저장고에서 재성장시킨 후 상기 세포를 2-5회 계대배양하였다. 로그상(log phase) CT26 세포를 0.25% 트립신과 0.03% EDTA 로 조직 배양 플라스크에서 분리하였다. CT26 및 EL4를 세척하고 주입 직전에 PBS에 재현탁시켰다.
동물 실험
특이적 병원균이 없는 수컷 Balb/c 마우스 및 C57/BL6 마우스를 효창 바이오사이언스(대구, 한국)에서 구입하였다. 모든 마우스는 Immunomodulation Research Center(University of Ulsan, Korea)의 동물 시설소의 특이적 병원균이 없는 조건에서 유지하였고, 6-8 주령에 사용하였다. CT26 및 EL4을 Balb/c 마우스 및 C57/BL6 마우스의 피하(s.c.)로 각각 주입하였다(0 일째). WRYMVm(서열번호: 4) 및 CpG ODN을 6일째부터 4일마다 온몸(i.p.; 200 ㎕)에 주입하였다. 대조군은 PBS 또는 100 ㎍/마우스의 CpG ODN을 주입하였다. 빙크리스틴은 펩타이드 또는 CpG ODN를 주입하기 8시간 전에 동일 날짜에 복강(i.p.) 주사로 투여하였다. 접종 후 2일마다 종양 질량(tumor mass)을 디지털 배리어 캘리퍼(Varier caliper)로 측정하였다. 종양 부피는 길이 x 폭 x 높이 x π/6로 계산하였다. 마우스가 종양으로 쓰러지거나 죽어가는 상태로 희생된 날 또는 종양의 폭(종양이 더 이상 작아지지 않을 때의 폭)이 20mm가 되었을 때를 사망일로 기록하였다.
통계
측정결과를 10 mice/group의 평균 SE로 표현하였다. 도 9 내지 12에서 , *는 비히클 (PBS) 처리된 대조군에 비하여 p<0.01를 나타내고 ** 는 p<0.05를 나타낸다.
실시예 1: 호중구의 분리
말초혈 백혈구 농축액을 울산 적십자 혈액 센터에서 기증받았다. 인간의 호중구는 덱스트란 침강법(dextran sedimentation), 적혈구의 저삼투압의 세포용해(hypotonic lysis), 및 림프구 분리 매질 구배(lymphocyte separation medium gradient)의 표준절차에 따라 분리하였다(9). 분리된 인간의 호중구는 즉시 사용되었다.
실시예 2: 인간 호중구에서의 펩타이드가 수퍼옥사이드 생성에 대한 효과
WKYMVm, 서열번호: 1 내지 24의 펩타이드 및 wkymvm의 인간 호중구에서 수퍼옥사이드 생성에 미치는 펩타이드의 활성을 측정하였다. 수퍼옥사이드 음이온 생성을 마이크로타이터 96-웰 플레이트 ELISA 리더를 사용하여 시토크롬 c의 환원(reduction)을 측정하여 정량하였다(Bio-Tekinstruments, EL312e, Winooski, VT) (14). 인간의 호중구(96 웰 플레이트의 각 웰당 1 x 106 cells/100 μl의 RPMI 1640 배지)는 37℃에서 1분간 50 μM 시토크롬 c와 미리 배양하고, 그런 다음 표시된 농도의 펩타이드로 배양하였다. 수퍼옥사이드 생성은 1 분 간격으로 5분에 걸쳐 550nm 빛 흡수의 변화로 측정하였다. 적어도 4번의 독립된 실험에서 각 위치에서의 활성 아미노산을 가지는 펩타이드를 선정하였다. 이들 결과는 표 1에 기재되어 있다.
다양한 농도의 WKYMVm 펩타이드로 호중구를 자극(stimulation)하면 농도-의존적인 방법으로 수퍼옥사이드 생성을 야가하며 100nM의 펩타이드에서 최대의 활성을 보였다(데이터는 생략). WRYMVm(서열번호: 4), WEYMVm(서열번호: 5), WKFMVm(서열번호: 13), 및 KYMVm(서열번호: 21)와 같은 몇몇 펩타이드는 세포에서 수퍼옥사이드 생성을 자극하였고, 많은 펩타이드는 100nM의 펩타이드에서 수퍼옥사이드 생성에 대하여 약한 활성을 보였다.
표 1: 인간 호중구에서 수퍼옥사이드 생성 a 에 대한 펩타이드의 효과
서열번호 서열 b O2 - (nmol/106 cells) 서열번호 서열 O2 -(nmol/106 cells)
WKYMVm-NH2 37.3 ±6.94 13 WKFMVm-NH2 37.3 ±3.56
1 WKGMVm-NH2 14.2 ±3.42 14 WKYMYm-NH2 25.8 ±3.89
2 WKYMGm-NH2 1.1 ±0.05 15 WKYM(F/W)m-NH2 6.1 ±0.77
3 WKYMVG-NH2 4.4 ±0.54 16 WKYMVE-NH2 5.0 ±0.43
4 WRYMVm-NH2 47.1 ±11.23 17 WKYMVV-NH2 5.0 ±0.21
5 WEYMVm-NH2 52.9 ±12.78 18 WKYMVR-NH2 16.3 ±1.57
6 WHYMVm-NH2 20.7 ±7.85 19 WKYMVW-NH2 11.5 ±1.62
7 WDYMVm-NH2 25.8 ±6.56 20 WKYMV-NH2 9.2 ±0.55
8 WKHMVm-NH2 29.5 ±7.71 21 KYMVm-NH2 36.0 ±3.56
9 WKEMVm-NH2 4.1 ±0.21 22 KYMV-NH2 7.5 ±0.61
10 WKWMVm-NH2 11.5 ±0.97 23 YMVm-NH2 30.2 ±2.74
11 WKRMVm-NH2 15.9 ±2.48 24 MVm-NH2 0
12 WKDMVm-NH2 16.3 ±1.67 wkymvm-NH2 0
a 수퍼옥사이드 생성은 시토크롬 c 환원을 조사하여 측정함.
b 처리된 펩타이드의 농도는 100 nM임.
10 μM 농도의 수퍼옥사이드 생성에 대한 펩타이드의 효과를 또한 측정하였다. 그 결과를 표 2에 기재하였다. wkymvm을 제외한 모든 펩타이드가 10 μM 농도의 WKYMVm과 같이 강력하게 수퍼옥사이드 생성을 자극하였다. 그 중에서 WKWMVm(서열번호: 10), WKFMVm(서열번호: 13), 및 WKYMVW(서열번호: 19)은 WKYMVm보다 더 강한 활성을 보였다.
표 2: 인간 호중구에서의 수퍼옥사이드 생성에 대한 펩타이드의 효과 a
서열번호 서열 b O2 - (nmol/106 cells) 서열번호 서열 O2 -(nmol/106 cells)
WKYMVm-NH2 39.0 ±3.58 13 WKFMVm-NH2 0.2 ±5.57
1 WKGMVm-NH2 37.6 ±4.57 14 WKYMYm-NH2 42.9 ±3.34
2 WKYMGm-NH2 27.3 ±2.61 15 WKYM(F/W)m-NH2 45.6 ±7.76
3 WKYMVG-NH2 27.3 ±1.40 16 WKYMVE-NH2 33.6 ±6.43
4 WRYMVm-NH2 38.2 ±6.54 17 WKYMVV-NH2 36.3 ±2.29
5 WEYMVm-NH2 35.3 ±2.88 18 WKYMVR-NH2 44.8 ±3.65
6 WHYMVm-NH2 20.7 ±7.85 19 WKYMVW-NH2 56.8 ±4.60
7 WDYMVm-NH2 37.3 ±5.66 20 WKYMV-NH2 25.6 ±2.20
8 WKHMVm-NH2 39.3 ±4.10 21 KYMVm-NH2 49.2 ±5.82
9 WKEMVm-NH2 39.2 ±4.71 22 KYMV-NH2 35.4 ±2.13
10 WKWMVm-NH2 65.0 ±12.10 23 YMVm-NH2 41.8 ±3.46
11 WKRMVm-NH2 41.7 ±8.32 MVm-NH2 42.4 ±2.47
12 WKDMVm-NH2 37.3 ±2.78 wkymvm-NH2 0
a 수퍼옥사이드 생성은 시토크롬 c 환원을 조사하여 측정함.
b 처리된 펩타이드의 농도는 10 μM 임.
실시예 3: FPR - 또는 FPRL1 -발현 RBL -2 H3 세포에서의 [ Ca 2 + ] i 증가에 대한 펩타이드의 효과
FPR-발현 RBL-2H3 세포에서, WKYMVm, 서열번호: 1 내지 24의 펩타이드, 및 wkymvm의 펩타이드가 [Ca2 +]i 증가에 미치는 활성을 측정하였다. FPR-발현 RBL-2H3 세포를 10 μM 의 펩타이드로 자극하고 [Ca2 +]i 를 측정하였다. [Ca2 +]i 의 수준은 fura-2/AM 을 사용하여 Grynkiewicz 방법으로 형광측정하여(fluorometrically) 결정하였다(15). 제조된 세포를 신선한 무혈청 RPMI 1640 배지에서 계속 교반하면서 50분 동안 37℃에서 3 μM fura-2/AM로 배양하였다. 2 x 106 세포를 Ca2 +가 없는 Locke's 용액(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.3, 10 mM 글루코오스, 및 0.2 mM EGTA) 에서 각 분석에 사용되도록 분취(aliquote)하였다. 340 nm 및 380 nm에서의 이중 여기 파장의 형광 변화 및 500nm의 발광 파장을 측정하여 보정된 형광율을 [Ca2 +]i.로 바꾸었다 증가된 [Ca2 +]i 피크 수준을 측정하였다. 그 결과를 표 3 및 도 1A에 보였다. 데이터는 세개의 독립적이 실험의 대표값이다.
표 3: FPR-발현 RBL-2H3 세포에서의 세포내 칼슘 증가에 대한 펩타이드의 효과a
서열번호 서열 EC50 (nM) 서열번호 서열 EC50 (nM)
WKYMVm-NH2 47.4 ±10.94 13 WKFMVm-NH2 17.7 ±4.79
1 WKGMVm-NH2 비활성 14 WKYMYm-NH2 665.4 ±81.53
2 WKYMGm-NH2 비활성 15 WKYM(F/W)m-NH2 57.3 ±10.30
3 WKYMVG-NH2 비활성 16 WKYMVE-NH2 비활성
4 WRYMVm-NH2 54.9 ±8.33 17 WKYMVV-NH2 비활성
5 WEYMVm-NH2 317.4 ±29.33 18 WKYMVR-NH2 비활성
6 WHYMVm-NH2 31.7 ±3.36 19 WKYMVW-NH2 비활성
7 WDYMVm-NH2 98.9 ±17.51 20 WKYMV-NH2 비활성
8 WKHMVm-NH2 279.8 ±35.86 21 KYMVm-NH2 384.8 ±33.13
9 WKEMVm-NH2 1332.8 ±88.75 22 KYMV-NH2 비활성
10 WKWMVm-NH2 18.8 ±5.31 23 YMVm-NH2 569.1 ±63.38
11 WKRMVm-NH2 비활성 24 MVm-NH2 비활성
12 WKDMVm-NH2 1329.5 ±207.20 wkymvm-NH2 비활성
a 세포내 칼슘 증가는 fura-2 로드된 세포로부터 측정함.
FPR-발현 RBL-2H3 세포에서, WKYMVm 펩타이드는 농도-의존적인 방법으로 [Ca2+]i 증가를 유도하였으며, 300 nM에서 최대 활성을 보였다(데이터는 보이지 않음). FPR 세포에서 [Ca2 +]i-증가 활성에 대한 WKYMVm의 EC50 은 47 nM이었다(표 3). 본 발명의 펩타이드 중에 WHYMVm(서열번호: 10), WKWMVm(서열번호: 13), 및 WKFMVm(서열번호: 19)은 WKYMVm 펩타이드에 대항하여 FPR에 좀 더 증가된 친화도를 보였으나 다른 펩타이드는 WKYMVm 만큼 활성을 보이지 않았다(표 3). 특히, WKGMVm(서열번호: 1), WKYMGm(서열번호: 2), 및 6th D-Met 치환된 펩타이드는 FPR-발현 RBL-2H3 세포에서 20 μM 처리시까지 [Ca2 +]i 에 영향을 미치지 않았다(표 3 및 도 1A). N-말단 또는 C-말단이 절단된 펩타이드 또한 FPR 세포에서 [Ca2 +]i 증가 활성에 대하여 비활성을 보였다(표 3). 이들 결과는 [Ca2 +]i 증가에서 FPR의 활성화에 대하여 Tyr3 및 D-Met6 이 중요하다는 사실을 보여주는 것이다.
WKYMVm, 서열번호: 1 내지 24의 펩타이드, 및 wkymvm가 [Ca2 +]i 증가에 미치는 효과를 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 측정하였다. FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 10 μM의 펩타이드로 자극하여 [Ca2 +]i 를 결정하였다. [Ca2 +]i 의 수준은 상기에서와 동일한 방법으로 결정하였다. 증가된 [Ca2 +]i 의 정점 수준(peak level)을 조사 하였다. 그 결과는 표 4 및 도 1B에 보였다. 데이터는 세개의 독립된 실험의 대표값이다.
FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서, WKYMVm은 10nM의 농도에서 최대활성을 보였다 (데이터는 보이지 않음). FPRL1 세포에서 [Ca2 +]i-증가 활성에 대한 WKYMVm의 EC50 은 0.6 nM이었다(표 4). FPR 세포에서와는 달리, 모든 펩타이드가 FPRL1 세포에서 [Ca2+]i-증가 활성에 대하여 활성을 가지는 것으로 나타났다(표 4). WRYMVm(서열번호: 4), WKWMVm(서열번호: 10), WKFMVm(서열번호: 13), WKYMYm(서열번호: 14), 및 WKYM(F/W)m(서열번호: 15)와 같은 몇몇 펩타이드는 FPRL1에 대하여 더 높은 친화도를 보였다(표 4). FPR 세포에서 [Ca2 +]i 증가에 영향을 미치지 않는 WKGMVm(서열번호: 1), WKYMGm(서열번호: 2), 및 6th D-Met-치환도니 펩타이드도 FPRL1 세포에서 [Ca2+]i-증가 활성을 보이나 FPRL1 에 대하여 낮은 친화도를 가지는 것으로 나타났다(표 4 및 도 1B). N-말단 또는 C-말단 절단된 펩타이드는 FPRL1 세포에서 [Ca2 +]i 증가를 향상시키는 것으로 나타났다(표 4). 이들 결과는 FPR 에 대항하여 FPRL1의 활성화시키고, 이로써 [Ca2 +]i 을 증가시키는 것에 Tyr3 및 D-Met6 이 중요하다는 것을 보여준다.
표 4: FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서의 세포내 칼슘 증가에 대한 펩타이드의 효과 a
서열번호 서열 EC50 (nM) 서열번호 서열 EC50 (nM)
WKYMVm-NH2 0.60 ±0.090 13 WKFMVm-NH2 0.23 ±0.042
1 WKGMVm-NH2 21.32 ±2.104 14 WKYMYm-NH2 0.29 ±0.061
2 WKYMGm-NH2 18.11 ±1.308 15 WKYM(F/W)m-NH2 0.12 ±0.015
3 WKYMVG-NH2 5945.8 ±176.100 16 WKYMVE-NH2 502.87 ±64.965
4 WRYMVm-NH2 0.12 ±0.010 17 WKYMVV-NH2 1259.15 ±95.750
5 WEYMVm-NH2 5.23 ±0.196 18 WKYMVR-NH2 177.52 ±26.035
6 WHYMVm-NH2 0.72 ±0.075 19 WKYMVW-NH2 194.48 ±19.210
7 WDYMVm-NH2 14.28 ±1.225 20 WKYMV-NH2 917.85 ±45.610
8 WKHMVm-NH2 1.94 ±0.268 21 KYMVm-NH2 3.01 ±0.232
9 WKEMVm-NH2 28.30 ±1.354 22 KYMV-NH2 > 30000
10 WKWMVm-NH2 0.16 ±0.027 23 YMVm-NH2 17.15 ±0.889
11 WKRMVm-NH2 2.06 ±0.256 24 MVm-NH2 > 30000
12 WKDMVm-NH2 8.73 ±1.210 wkymvm-NH2 비활성
a 세포내 칼슘 증가는 fura-2 로드된 세포로부터 측정함.
실시예 4: FPR 또는 FPRL1 에 [ 125 I] WKYMVm 결합에 대한 펩타이드의 효과
몇몇 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), D-Met6 치환 펩타이드)가 사이토졸(cytosolic) 칼슘 증가를 유도할 수 없다는 사실로부터 상기 펩타이드가 FPR에 결합할 수 있는지 조사하였다. FPR 또는 FPRL1에 대한 125I-표지된 WKYMVm 결합의 치환정도를 조사하였다. 표지되지 않은 WKYMVm 또는 서열번호: 1 내지 24의 펩타이드의 양을 증가시키거나 또는 이들 펩타이드가 존재하지 않도록 하여 FPR-발현 RBL-2H3 세포를 [125I] WKYMVm와 배양하였다.
리간드 결합 분석을 종래 알려진 방법을 변형하여 실시하였다(16). 125I-표지된 WKYMVm은 NEN Lifesciences (Boston, MA)에서 구입하였다. FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 24-웰 플레이트에 대하여 각 웰당 1X105 세포를 접종하고 하룻밤동안 배양하였다. 블록킹 버퍼(blocking buffer; 33 mM HEPES, pH 7.5, 0.1% BSA in RPMI)로 세포를 2시간동안 블록킹한 후, 바인딩 버퍼(PBS 함유 0.1% BSA)와 함께 50 μM의 표지되지 않은 펩타이드가 존재 또는 부존재하는 상황에서 단일 농도의 125I-표지된 WKYMVm을 세포에 첨가하여 계속 진탕하면서 4℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 시료를 차가운 바인딩 버퍼 및 200 μl 의 용해성 버퍼(lysis buffer; 20 mM Tris, pH 7.5, 1% Triton X-100)로 5번 세척하였다. 상온에서 20분 용해한 후, 용해물(lysate)을 모았다. 결합된 125I-표지된 WKYMVm는 γ-선 계수기로 방사성 활성을 측정하였다.
리간드 결합 분석 결과는 도 2A와 도 2B에 도시하였다(도 2A: FPR 발현 RBL-2H3 세포l, 도 2B: FPRL1-발현 RBL-2H3 세포). 도 2A와 도 2B에 도시된 바와 같이, 표지되지 않은 WKYMVm 뿐만 아니라 WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), 및 WKYMVm의 D-Met6 치환된 펩타이드는 농도-의존적으로 [125I] WKYMVm의 결합을 방해하였다. 이들 결과는 WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), 또는 WKYMVm의 D-Met6-치환 펩타이드는 FPR 에 결합할 수 있기는 하지만 모든 펩타이드가 FPR-발현 RBL 세포에서 사이토졸 칼슘 증가를 유도할 수 있는 것은 아니라는 사실을 보여준다.
실시예 5: FPR 또는 RPRL1 발현 RBL -2 H3 세포에서 ERK 포스포릴레이션에 대한 펩타이드의 효과
i) 펩타이드에 의한 세포자극
배양된 RBL-2H3 세포를 2 X 106 세포로 분취하여 표시된 농도의 WKYMVm 및 본 발명의 펩타이드로 표시된 시간동안 자극하였다. FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포는 다양한 시간동안 1 μM의 WKYMVm으로 자극하였다(도 3A). 두개의 세포를 1 μM 의 WKYMVm 처리 전에 비이클(vehicle) 또는 100 ng/ml의 PTX(24시간), 50 μM 의 LY294002 (15 분), 5 μM 의 GFX (15 분), 10 μM BAPTA/AM (60 분), 또는 50 μM PD98059 (60 분)로 미리 배양하였다(도 3B). FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL2H3 세포를 10 μM의 본 발명의 펩타이드로 2분 또는 5분 동안 자극하였다(도 3C).
상기 자극 후에 세포를 무혈청 RPMI로 세척하고 용해성 버퍼(20 mM Hepes, pH 7.2, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 용해하였다. 분해제(detergent)-비용해성 물질을 원심분리(12,000 X g, 15 분, 4℃)하여 펠렛화하고, 용해성 상층 분액을 제거하고 -80℃에서 보관하거나 즉시 사용하였다. 용해물에서의 단백질 농도를 Bradford 단백질 분석제로 측정 하였다.
ii ) 전기영동 및 면역블롯 분석
각각의 시료(30 g의 펩타이드)를 10% SDS-PAGE를 실시하여 포스포릴화된 ERK 를 항-포스포-ERK 항체로 면역 블롯에 의하여 측정하였다. 단백질 시료는 농축된 시료 버퍼를 첨가하여 전기영동하기 위해 제조하였다. 시료중 일부를 Laemmli에 기재된 버퍼 시스템을 사용하여 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 의하여 분리하였다(17).
전기영동에 이어, 항-ERK2 항체로 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 동일한 양의 시료가 실험에 사용되었음을 확인하였다. 단백질을 나이트로셀룰로오스 막에 블롯하였다. 상기 나이트로셀룰로오스 막을 5% 비지방성 건유(non-fat dry milk)를 포함하는 TBS (Tris-buffered saline, 0.05% Tween-20)와 배양하여 블록킹하였다. 그런 다음 막을 TBS로 세척된 항-포스포-ERK 항체, 항-포스포- Akt 항체 또는 항- Akt 항체와 함께 배양하였다. PKC 트랜스로케이션(translocation) 분석에서, PKC 이소자임-특이성인 항체를 배양하였다. 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다아제에 결합된 1:5000 희석된 염소 항-토끼 IgG 또는 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 막을 배양한 후 증가된 화학발광(chemiluminescence) 검출 시스템을 사용하여 항원-항체 복합체를 가시화하였다.
iii ) 결과
FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 FPR 또는 RPRL1를 통한 세포 시그널링에 대한 펩타이드의 효과를 평가하여 그 결과를 도 3A 내지도 3C에 도시하였다. 도 3A 내지도 3C의 결과는 3번의 독립된 실험의 대표값이다.
몇몇 펩타이드는 FPR에 결합할 수 있기는 하지만, PLC-매개된 칼슘 증가를 향상시킬 수는 없기 때문에, GPCRs의 하류(downstream)에서 PLC에 독립적인 다른 시그널링(ERKs and Akt)에 미치는 효과를 조사하였다. FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 1 μM WKYMVm로 자극하면 ERKs의 일시적 활성화를 유도하였고 각각 펩타이드 처리 후 2분 또는 3분 경과후 최대의 활성을 나타내었다(도 3A). FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 WKYMVm 자극 전에 저해제로 미리 처리하는 경우, WKYMVm-유도된 ERKs 활성화는 PTX 및 PD98059에 민감한 것으로 나타났고 이러한 현상이 PTX-민감성 G-단백질(들) 및 MEK-의존성인 것을 보여주는 것이다(도 3B). a PI3K 저해제(LY294002), PKC 저해제(GF109203X 또는 Ro-31-8220), 또는 칼슘 킬레이터(BAPTA/AM)의 전처리는 WKYMVm-유도된 ERK 활성화에 영향을 미치지 않는다(도 3B). 상기와 같은 결과는 이러한 현상이 PI3K, Ca2 +, 및 PKC 활성화와 독립적이라는 것을 시사한다. 그러므로 WKYMVm이 독립적인 시그널링 경로를 통하여 [Ca2 +]i 증가 및 ERK 활성화를 유도하는 것처럼 보인다. 본 발명의 펩타이드가 ERK 활성화에 미치는 효과를 항-포스포-ERKs 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 조사하였다. 사이토졸 칼슘 증가 활성과는 달리 펩타이드(WKGMVm(서열번호:1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVR(서열번호: 18), 및 WKYMVE(서열번호: 16))는 FPR-발현 RBL-2H3 세포에서 ERKs 포스포릴레이션을 자극하였다(도 3C). 상기 펩타이드가 PLC-매개된 [Ca2 +]i 증가 활성에 영향을 미칠 수 없는데 이것은 매우 흥미로운 결과이다. FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 WKYMVm 및 본 발명의 펩타이드로 자극할 경우 대부분의 펩타이드는 FPRL1 세포에서 ERKs 포스포릴레이션을 유발하였다(도 3C). 이 결과는 모든 펩타이드가 FPRL1-발현 세포에서 사이토졸 칼슘 증가를 자극할 수 있다는 이전의 결과와 상호관련있는 것이다(도 1B).
실시예 6: FPR - 또는 RPRL1 -발현 RBL -2 H3 세포에서의 Akt 포스포릴레이션에 미치는 펩타이드의 효과
화학주성물질(chemoattractant) 수용체의 활성화는 PI3K을 통하여 Akt 활성화를 유도하는 것은 잘 알려져 있다(19). 상기 펩타이드로 세포의 자극, 전기영동 및 면역블롯 분석은 실시예 5와 동일하게 실시하였다.
FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 다양한 시간동안 1 μM WKYMVm로 자극하였다(도 4A). 두개의 세포를 1 μM 의 WKYMVm로 처리하기 전에 비이클(vehicle) 또는 100 ng/ml의 PTX (24 시간), 50 μM 의 LY294002(15 분), 5 μM의 GFX (15 분), 10 μM BAPTA/AM (60 분), 또는 50 μM PD98059 (60 분)으로 미치 배양하였다(도 4B). FPR- 및 FPRL1-발현 RBL2H3 세포를 10 μM 의 WKYMVm 및 본 발명의 펩타이드로 각각 2분 또는 5분동안 자극하였다(도 4C). 각각의 시료(30 μg 의 단백질)를 10 % SDS-PAGE를 실시하고 포스포릴화된 Akt를 항-포스포-Akt 항체로 면역블롯 분석에 의하여 결정하였다. 항- Akt 항체로 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 동일 한 양의 시료가 실험에 사용되는 것을 확인하였다. 이 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시되어 있다. 도 4A 내지 도 4C의 결과는 3개의 독립적인 실험의 대표값이다.
WKYMVm 자극은 FPR- 및 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 시간 의존적으로 Akt 포스포릴레이션을 유도하였다(도 4A). WKYMVm-유도된 Akt 포스포릴레이션은 PTX, LY294002에 민감하나 GFX 및 BAPTA/AM에는 민감하지 않았다. 이것은 PTX-민감성 G-단백질(들) 및 PI3K-의존성임을 나타낸다(도 4B). WKYMVm 뿐만 아니라 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), 및 WKYMVR(서열번호: 18)) 로 FPR-발현 RBL-2H3 세포를 자극하면 Akt 포스포릴레이션을 유도하였다(도 4C). WKYMVm 및 본 발명의 펩타이드는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 Akt 포스포릴레이션을 자극하였다(도 4C). 이들 결과는 두가지 형태의 세포에서 펩타이드에 의한 ERKs 포스포릴레이션과 상호관련이 있다(도 3C). WKYMVm-유도된 ERKs 및 Akt 활성화는 PI3K 활성화에 의하여 매개되므로, WKGMVm, WKRMVm, WKYMVE, 및 WKYMVR은 FPR의 하류(downstream)에서 PI3K-매개된 시그널링을 유도하는 것으로 보인다.
실시예 7: 엑소시토시스에 대한 펩타이드의 효과
과립 분비는 비만 세포에서 가장 중요한 작용이다(20). WKYMVm의 과립 분비에 미치는 효과를 β-헥소사미나제(hexosaminidase) 분비를 측정하여 알아보았다 (18). FPR 또는 FPRL 1을 발현하는 RBL-2H3 세포 (2 x 105 /웰) 를 24-웰 조직 배양 플레이트에서 하룻밤동안 배양하였다. 세포를 Tyrode's 버퍼(137 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 5.6 mM glucose, 2.7 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.4 mM NaH2PO4, 0.1g/100 ml BSA, and 25 mM HEPES, pH 7.4)로 2번 세척하고 각각의 펩타이드로 자극하였다. 다양한 농도의 WKYMVm 가 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 처리되었다(도 5A). 1 μM의 WKYMVm을 10 μM BAPTA/AM 의 존재 또는 부존재하에서 두개의 세포주를 자극하는 데 사용하였다(도 5B). 얼음에 플레이트를 방치함으로써 자극 후 20분에 반응이 종료되도록 하였다. β-헥소사미나제의 배지로의 분비는 50 μl 의 상층액 또는 세포 용해액을 0.1 M의 소듐 시트레이트 버퍼(pH 3.8)에서 37℃에서 2시간 동안 25 μl 의 5 mM p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미드와 배양하여 측정하였다. 배양 말기에 50 μl 의 0.4 M Na2CO3 를 첨가하였다. 405nm에서의 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 5A 및 도 5B에 도시하였다. 데이터는 세번 반복 실시한 세번의 실험의 대표값의 평균값 ± S.E.이다. 수치(평균값 ±S.E.)는 세포에 존재하는 전체의 β-헥소사미나제에 대한 백분율로 표시하였다.
FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 다양한 농도의 WKYMVm으로 자극하면 농도-의존적으로 β-헥소사미나제 방출을 유도하였다(도 5A). FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 각각 100 nM 또는 10 nM 펩타이드일 때 최대 활성을 보였다(도 5A). 사이토졸 칼슘 증가는 RBL-2H3 과 같은 비만 세포에서 과립의 분비에 매우 중요하다고 보고되어 있다(18, 20). 또한 펩타이드 자극 전에 BAPTA/AM 처리에 의한 세포내 칼슘의 킬레이션은 거의 WKYMVm-유도된 과립 분비를 거의 완전히 저해 하는 것도 확인되었다(도 5B).
사이토졸 칼슘 증가가 WKYMVm(서열번호: 1) 및 WKYMVm(서열번호: 11)의 많은 치환된 펩타이드에 의하여 유도되지만 이들중 몇몇(WKGMVm, WKRMVm, D-Met6 치환 펩타이드)은 그렇지 않다는 새로운 발견으로부터, RBL 세포에서의 과립 분비에 대한 상기 펩타이드의 효과를 조사하였다. 10 μM 의 각각의 펩타이드를 FPR- (도 6A) 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 처리하였다(도 6B). β-헥소사미나제의 펩타이드-유도된 분비는 상기에서와 같이 결정하였다. 데이터는 세번 반복하여 실시한 세번의 실험의 대표값의 평균값±S.E.이다.
FPR 세포를 펩타이드(WKYMVm, WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18))로 자극할 경우, WKGMVm-, WKRMVm-, 및 D-Met6-치환 펩타이드를 제외하고 몇몇 치환 펩타이드에서 과립 분비가 관찰되었다(도 6A). 상기 WKGMVm-(서열번호: 1), WKRMVm-(서열번호: 11), 및 D-Met6-치환된 펩타이드는 FPR-발현 RBL-2H3 세포에서 과립 분비에 영향을 미치지 않았다(도 6A). 이러한 결과는 WKGMVm-(서열번호: 1), WKRMVm-(서열번호: 11) 및 D-Met6-치환 펩타이드가 사이토졸 칼슘 증가를 유도할 수 없다는 이전의 결과와 매우 상관관계가 깊은 것이다(도 1A). FPR-발현 RBL-2H3 세포와는 달리, fMLF 또는 wkymvm을 제외한 모든 펩타이드(WKYMVm, WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), WKYMVR(서열번호: 18))는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 과립 분비를 자 극하였다 (도 6B). 이것도 또한 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 상기 펩타이드가 사이토졸 칼슘 증가를 자극한다는 이전의 결과와 상호 관련있는 것이다(도 1B).
실시예 8: 세포 주화성에 대한 펩타이드의 효과
주화성 분석은 다중웰 챔버(modified Boyden chamber assay) (Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD)를 사용하여 실시하였다(18). 폴리카보네이트 필터 (8 μm pore size)를 HEPES-버퍼 RPMI 1640 배지에서 50 μg/ml의 래트 타입 I 콜라겐 (Collaborative Biomedicals)으로 미리 코팅하였다. 건조 코팅된 필터를 서로 다른 농도의 펩타이드를 포함하는 96-웰 챔버 상에 방치하였다. FPR 또는 FPRL1을 발현하는 RBL-2H3 세포는 1 x 106 cells/ml의 무혈청 RPMI의 농도로 RPMI에 현탁되었고, 25 μl의 현탁액은 96-웰 주화성 챔버의 상부 웰 상에 방치되었다. 37℃에서 4시간 동안 배양한 후에, 이동하지 않은 세포를 스크랩핑하여 제거하고 필터를 통과하여 이동된 세포를 탈수, 고정하고 헤마톡실린(hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO))으로 염색하였다. 상기 웰에서 5개의 무작위로 선택된 HPF(high power fields) (400 X) 에서 염색된 세포를 계수하였다. 도 7A는 상기 주화성 분석결과를 보인 도면이다. 비이클, 50 μM LY294002 (15 분), 및 50 μM PD98059 (60 분)으로 미리 처리된 세포를 1 μM WKYMVm을 사용한 주화성 분석에 사용하였다. 그 결과를 도 7B에 도시하였다. 이동된 세포의 수를 HPF(high power fields) (400 X) 에서 계수하여 결정하였다. 데이터는 각각 두번 실시한 세번의 독립된 실험의 평 균값 ± SE로 표현된 것이다.
WKYMVm는 모노사이트 및 호중구와 같은 식세포(phagocytic cells)의 주화성 이동을 유도할 수 있다는 사실은 알려져 있다 (11). Le et al.은 FPR and FPRL1에 결합을 통하여 WKYMVm-유도된 세포의 주화성을 밝혔다(12). 예상된 바와 같이 WKYMVm은 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 종-모양의 농도 의존적인 방법으로 주화성 이동 활성을 보였다(도 7A). WKYMVm-유도된 세포 주화성은 LY294002 및 PD98059에 민감하였다(도 7B). 이러한 결과는 WKYMVm-유도된 세포의 주화성의 PI3K- 및 MEK-의존성임을 시사한다. WKYMVm는 PI3K 및 MEK 활성을 통하여 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포의 주화성 이동을 자극한다.
FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서 세포 주화성에 대한 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하였다. 다양한 농도의 각각의 펩타이드를 FPR- 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 이용한 주화성 분석에 사용하였다. 이동된 세포의 수는 HPF(high power fields) (400 X)에서 계수하여 결정하였다. 데이터는 각각 두번 실시한 두번의 독립된 실험의 평균값 ± SE로 표현된 것이다.
FPR-발현 RBL-2H3 세포에서, WKYMVm 뿐만 아니라 치환된 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), 및 WKYMVR(서열번호: 18))도 세포 주화성을 유도하였다(도 8A). 치환된 펩타이드에 의한 주화성에 필요한 농도는 WKYMVm에 의한 것보다 더 높았다(도 8B). 치환된 펩타이드-유도된 주화성에 관여하는 시그널링 경로에서, PI-3 카이나제 및 MEK-매개된 시그널링의 관여정도에 대하여 시험하였다. FPR-발현 RBL 세포가 LY294002 또는 PD98059로 전처리 될 경우, WKYMVm 및 치환된 펩타이드-유도된 RBL 세포 이동은 거의 완전히 저해되었다(도 7B 및 데이터는 보이지 않음). FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서, WKYMVm 및 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), WKYMVE(서열번호: 16), 및 WKYMVR(서열번호: 18)) 은 또한 농도-의존적으로 세포 주화성을 유도하였다(도 8B).
본 발명에서 FPR이 서로 다른 리간드에 의하여 조절될 수 있고 서로 다른 세포 시그널링 및 작용을 한다는 사실이 처음으로 밝혀졌다. FPR의 리간드 특이적 조절을 알아보기 위하여 다양한 펩타이드, 표 1에 기재된 FPR에 대한 강력한 리간드를 제조하였다. 상기 펩타이드 중, WKGMVm-(서열번호: 1), WKRMVm-(서열번호: 11), 및 D-Met6-치환 펩타이드는 PI-3 카이나제-매개된 Akt 및 MEK-매개된 ERK 활성화를 유도하는 함으로써 FPR에 결합하여 세포의 주화성 이동이 이루어진다. 이들 펩타이드는 사이토졸의 칼슘 증가에 효과를 미치지 않는다. WKYMVm 펩타이드는 ERKs 활성화 뿐만 아니라 사이토졸 칼슘 증가를 자극하여 주화성 및 탈과립화되도록 하므로 FPR 은 서로 다른 리간드에 의하여 서로 다르게 조절될 수 있다는 사실을 시사한다.
최근, 몇몇 보고에 따르면, GPCRs은 서로 다른 리간드에 의하여 조절될 수 있다는 사실이 기재되어 있다(21, 22). GPCR의 리간드-특이적 조절의 과정에서 서로 다른 리간드는 수용체의 서로 다른 형태적 변화를 유도하고 일정한 효과(effector) 분자 또는 G-단백질을 가지는 수용체의 선택적 결합을 유도한다는 것 을 시사한다. 표 3 및 도 1A에서, WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), 및 D-Met6 치환 펩타이드는 FPR-발현 RBL-2H3 세포에서 PLC-매개된 사이토졸 칼슘 증가를 자극하지 못함을 알 수 있다. 그러나, 이들 펩타이드는 FPR-발현 RBL-2H3 세포에서 ERKs 및 Akt 포스포릴레이션을 자극하였다(도 3C). WKYMVm 및 본 발명의 펩타이드-매개의 세포 시그널링에서 사이토졸 칼슘 증가는 PLC-β 활성화를 통하여 PI의 가수분해에 의하여 유도되나, ERK 및 Akt 포스포릴레이션은 각각 MEK 및 PI3 카이나제의 활성화에 의하여 조절된다. 이들 결과에서 FPR에 펩타이드 리간드가 결합하면 FPR에 형태적 변화를 유도하고 이러한 형태 변화는 G-단백질-매개의 PLC-β 또는 G-단백질-매개의 PI-3 카이나제와 수용체의 결합을 제공한다. 사이토졸 칼슘 증가를 유도할 수 없는 몇몇 본 발명의 펩타이드(WKGMVm(서열번호: 1), WKRMVm(서열번호: 11), 및 D-Met6 치환 펩타이드)는 PI-3 카이나제-의존성 경로를 통하여 ERKs 포스포릴레이션을 자극할 수 있기 때문에, 상기 펩타이드는 FPR 에 결합하여 PI-3 카이나제 및 MEK-매개된 시그널링의 활성화에 필요한 형태 변화를 유도하여 RBL-2H3 세포의 주화성 이동이 이루어지도록 하는 것으로 보인다.
두개의 서로 다른 포르밀 펩타이드 수용체족(FPR 및 FPRL1)은 본질적인(innate) 면역 반응에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되어 있다(1, 2). 현재까지, 몇몇 포르밀 펩타이드 리폭신(lipoxin) A4를 포함하는 서로 다른 리간드 기원(origins)은 FPR 또는 FPRL1에 결합하는 것으로 보고되어 있다(1). Le 등은 WKYMVm이 FPR 및 FPRL1에 결합한다고 보고하였다(12).
본 발명자들은 Tyr3 또는 D-Met6 을 다른 아미노산으로 치환하면 FPR 의 PLC-매개의 사이토졸 칼슘-증가 활성을 제거하나 FPRL1의 경우에는 그렇지 않음을 알게 되었다(도 1). 이들 결과는 Tyr3 및 D-Met6 이 FPR에 의한 PLC의 활성화에는 중요하나 FPRL1에 의한 경우에는 그렇지 않음을 나타낸다. 이러한 결과에서 FPR 및 FPRL1의 리간드 결합 자리가 서로 다름을 알 수 있다.
FPR을 포함하는 GPCRs은 헤테로트라이머 G-단백질에 결합을 통하여 세포내 시그널링을 유도하며, G-단백질 결합에 관여하는 수용체의 중요한 아미노산 잔기를 밝히기 위한 다수의 연구가 진행되고 있다(23, 24). FPR에서 Miettinen 등은 35 돌연변이 FPRs을 제조하여 G-단백질 결합 및 FPR의 세포 시그널링에서 돌연변이 정도를 조사하였다. 그 결과, S63, D71, R123, 및 C124/C126가 FPR에 대한 G-단백질 결합에 중요한 것으로 나타났다(24). 상기 돌연변이 중에는 칼슘 가동화(calcium mobilization)를 조절할 수 없는 R123A 돌연변이가 fMLF의 ERKs 포스포릴레이션을 유도할 수 있었다(24). 또한 보존된(conserved) (D/E)RY 모티프 (DRC in FPR)를 형성하는 Asp122 및 Arg123가 수용체의 비활성 형태를 안정화하는 수소 결합 네트워크에 관여한다고 가정되었다 (24). 이러한 가정에서, 수용체에 대한 리간드 결합은 수소 결합 네트워크의 변형을 유도하고 및 일정 아미노산 잔기, 예를 들어 DRY 모티브에서의 아지닌이 G-단백질과 상호작용할 수 있도록 노출된다(24). WKGMVm와 같은 몇몇 펩타이드는 ERKs 포스포릴레이션을 유도하나 칼슘 가동화는 유도하지 못하는 것으로 나타났다. WKYMVm 또는 WKGMVm(서열번호: 1)가 FPR에 결합하면 수용체 의 서로 다른 형태 변화를 유도하는지, 즉 WKYMVm이 DRY 모티브의 수소 결합의 변형을 비롯한 FPR의 형태적 변화를 유도하지만, WKGMVm(서열번호: 1)이 단지 DRY 수소 결합에 영향을 미치지 않고 수용체의 특징적인 형태 변화만 유도하는지를 결정하는 것이 중요할 것이다. FPRL1의 경우에, DRY 모티브를 포함하지만(DRC in FPRL1), G-단백질 결합에서의 역할은 조사되지 않았다. 이 결과에서 WKYMVm 뿐만 아니라 WKGMVm(서열번호: 1)도 FPRL1-발현 RBL 세포에서 칼슘 가동화를 유도하였다(도 1B). 이들 결과는 WKYMVm 또는 WKGMVm(서열번호: 1)이 FPR 또는 FPRL1에서 DRY 모티브의 수소결합에 영향을 미치지 않음을 시사한다. 다른 결합 포킷(pocket)들이 펩타이드 결합에 관여하며, 더 나아가서 FPR 에 대한 WKYMVm 또는 WKGMVm(서열번호: 1)의 서로 다른 결합 패턴에 관여하는 잔기를 알아내는 것이 중요할 것이다.
현재까지 서로 다른 천연 리간드가 FPR을 서로 다르게 조절하는 것은 보고되어 있지 않다. 면역계에서 과립화 또는 주화성 이동의 서로 다른 조절은 좀더 한정된 조절에 필요할 것이다. 이런 관점에서 본 발명에서와 같이 FPR을 서로 다르게 조절하는 리간드를 알아내는 것이 중요하다.
실시예 9: WRYMVm 은 CT26 -주입된 마우스에서 종양 성장을 약화시킨다
면역 조절 펩타이드 Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-CONH2(WRYMVm; 서열번호: 4)의 항종양 효과를 평가하기 위하여, CT26, 대장암을 Balb/c 마우스 모델을 이용하 여 시험하였다. 종양 질량은 종양 세포 접종 후 6일 후에 2일 마다 크기를 측정하였다. 도 9A 및 9B에 도시된 바와 같이, 2 ㎍/mouse의 WRYMVm이 22일째에 성공적으로 종양 질량 성장을 억제시켰다(PBS 대조군에 비하여 50 %). 100 ㎍/mouse의 CpG 올리고디옥시뉴클레오티드(ODN)를 비교 테스트하였으나 CpG ODN-처리된 군은 종양 성장에 효과적인 결과를 보이지 못했다. 이러한 결과는 WRYMVm 면역 조절 펩타이드가 CT26 종양을 유의성 있게 억제함을 보여주는 것이다.
실시예 10: WRYMVm 은 EL4 -주입 마우스에서 종양 성장을 약화시킨다
다른 종양 모델 EL4, 림프 세포에서의 WRYMVm의 항종양 효과를 시험하였다. EL4의 종양 질량을 형성하기 위하여, EL4 (2 x 105 cells/mouse)을 C57/BL6 마우스의 피하(s.c.)로 주입하였다. 도 10A 및 10B에 도시된 바와 같이, WRYMVm은 EL4의 종양 질량을 억제할 수 있다. 이 결과는 CT26 실험과 상관성이 있는 것이다. 따라서, WRYMVm은 마우스 모델에서 종양 성장 억제 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.
실시예 11: WRYMVm 을 소량 투여하면 CT26 모델에서 가장 효과적이다
WRYMVm의 효과적인 종양 억제 투여량을 확인하기 위하여, 0.1 ㎍/mouse, 0.25 ㎍/mouse, 및 1㎍/mouse의 WRYMVm을 CT26/Balb/c 모델에 투여하였다. 도 11A 및 11B에 도시된 바와 같이, 0.1㎍/mouse 처리된 군은 가장 높은 종양 억제 효과를 나 타내었다. 이에 비하여 1㎍/mouse 투여량에서는 종양 억제 효과가 낮아졌다. 이런 결과는 WRYMVm의 항종양 성능은 고농도에서는 탈감작되는 것으로 매우 민감하다는 것을 강하게 시사한다. 유사한 현상이 류코사이트의 주화성 이동에서도 쉽게 발견된다. WRYMVm의 표적 수용체인 FPRL1이 주화성 이동에 관여한다는 사실에서 WRYMVm-유도된 항종양 효과는 류코사이트 침윤(infiltration) 현상에 의해 유도된다고 볼 수 있다. 그러므로 WRYMVm-유도된 항종양 효과와 류코사이트 침윤 현상의 직접적인 관계를 밝힐 필요가 있다.
실시예 12: WRYMVm 과 빙크리스틴을 조합하여 사용하면 항종양 효과를 증가시킨다
WRYMVm의 항종양 효과를 증가시키기 위하여, 항암제인 빙크리스틴을 조합하여 사용하였다. 빙크리스틴은 미세소관 항상성(microtubule homeostasis)을 파괴하고 그 결과 세포 사멸을 가져온다. 빙크리스틴을 사용함으로써, 면역 시스템에 대한 종양 특이적 항원을 제공할 수 있다. 그러므로, 펩타이드 주입 8시간 전에 2 ㎍/mouse의 빙크리스틴을 복강(i.p.) 주입하였다. 빙크리스틴 단독 처리군은 WRYMVm-처리군과 유사한 종양 성장 억제 패턴을 보였다(도 12A). 예상된 바와 같이, WRYMVm과 빙크리스틴을 함께 처리하면 가장 효과적인 항종양 활성을 나타내었다. 상기 조합사용은 WRYMVm 단독 또는 빙크리스틴 단독 사용보다 15% 향상되었다. 생존율에서도 유사한 결과를 보였다(도 12B). 조합사용은 단독 사용에 비하여 유의성 있는 개선점을 나타내지는 않았지만, 조합사용 처리군, WRYMVm-처리군, 및 빙 크리스틴-처리군의 세개의 처리군은 종양 성장을 억제할 수 있었다. 이에 비하여 PBS 대조군 및 CpG ODN은 사멸을 막지 못했다. 이로부터 면역 조절 펩타이드 WRYMVm은 항암 활성을 가진다고 할 수 있다.
상기 WRYMVm은 종양 성장을 억제할 수 있다. 따라서 WRYMVm은 빙크리스틴과 조합하여 더 잘 성능을 발휘하며, 이것은 WRYMVm이 다른 약제들과 암치료제로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다. 그러므로, 면역 세포를 조절하는 펩타이드(short peptide)-유도된 항암 효과는 본 발명에서 처음으로 얻어진 것이다.
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Claims (11)

  1. 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 항암제.
  2. 제2항에 있어서,
    상기 항암제는 대장암을 억제하는 데 사용되는 것인 항암제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항암제는 췌장, 유방, 폐, 뇌, 전립선, 편평 상피세포(squamous cell), 림프 세포, 또는 백혈구에서 유래하는 암을 억제하는 데 사용되는 것인 항암제.
  4. 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들의 유사체를 환자에 암세포 증식을 억제하거나 암세포 사멸을 증가시키기 위한 유효한 양으로 투여하여 암세포 증식을 억제하거나 암세포 사멸을 증가시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 환자에 유효한 양으로 투여하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열의 유사체를 환자에 유효한 양으로 투여하는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 증식이 억제되거나 사멸이 증가되는 암세포는 대장암 세포인 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 증식이 억제되거나 세포사멸이 증가되는 암세포는 췌장, 유방, 폐, 뇌, 전립선, 편평 상피세포, 림프세포, 또는 백혈구로부터 유도되는 암세포인 것인 방법.
  9. 서열번호: 4, 서열번호: 11, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 또는 이의 유사체, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암세포 증식을 억제하거나 암세포 사멸을 증가시키는 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 대장암을 억제하는 데 사용되는 것인 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 항암제는 췌장, 유방, 폐, 뇌, 전립선, 편평 상피세포, 림프 세포, 또는 백혈구에서 유래하는 암을 억제하는 데 사용되는 것인 약학 조성물.
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