JP2009519450A - バイオチップ自己較正方法 - Google Patents
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Abstract
Description
−DNAチップのための主な既知技術の最新の概要を示している、Wang J. による概説の論文 (Nucleic Acids Research, 28, 16, 3011-3016, 2000)、およびチップ設計者が直面する問題点を列挙しているSchubhart et al.の文献 (Nucleic Acids Rearch, 28, 10, e47, 2000);
−スルフヒドリルまたはジスルフィド基により修飾された核酸のメルカプトシラン処理した表面でのグラフトを記載した米国特許第6,030,782 号、および複合分子、DNA−チオールを自己組織化単層、即ちSAM 中に導入することによりDNAを有する表面を得る方法を記載した、Bamdadの論文 (Biophysical Journal, 75, 1997-2003, 1998) ;
−グラフトの密度の増加を可能にする多官能性ポリマーによるオリゴヌクレオチドなどの固定化分子を示唆している国際特許出願 WO 00/43539。これらのポリマーはヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミドまたはビニルピロリドンなどのモノマーから得ることができる;
−ピロールまたは官能化ピロール共重合体の金属層型基体への重合、官能化ピロール上への網状化剤の固定、次いで生物学的プローブ (例、オリゴヌクレオチド) の固定を含むDNAチップの製造方法を記載している国際特許出願 WO 00/36145。網状化剤は2官能性であって、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基およびマレイミド官能基を有していてもよい;
−チオール基を含む核酸をこのチオール基と反応する基を呈示している支持体に接触させることにより、おそらく網状化剤の中間体を介して、固体支持体へ核酸を高密度で固定化することを記載している国際特許出願 WO 98/20020。
本発明者等は、特にDNAバイオチップの場合には、標的化合物 (Cc) に特異的なプローブ化合物 (Cs) に加えて較正用標的化合物 (Ccc)に特異的な較正用プローブ化合物 (Csc)を、同じプロット中に、また必要であれば複数のプロットに導入することが可能であることを見出した。化合物Ccc を含有する溶液の1回の通過により、各ピクセルのための利用可能なCsプローブの有効密度を定量することが可能となり、次いでその値を個々の標準化パラメーターとして使用する。かかるプロセスについて、本発明者等は、同じプロットでのまたは複数の相補的プロット間の各ピクセルについてなされた測定値の分散を著しく減少させることが可能であり、従って、これらのバイオチップに関する測定の改善、およびより高い正確さをもたらすことを見出した。
−予め官能化され組み立てられた表面上の、プローブ:標的複合体形成反応の動的読み取り方法による連続的読み取り;および
−少なくとも1つの較正用プローブと1つの特異的なプローブを含む多官能化プローブによる、この表面の適切な官能化。
−該化合物Ccを含むであろう試験試料を、特異的複合体Cc/Csの形成を可能にする条件下で該支持体に接触させることからなる工程a)、
−工程a)において形成されたであろう特異的複合体Cc/Csの形成を、好ましくは動的無標識測定方法により測定するための工程b):
ここで、
−該固体支持体はまた、較正用標的Ccc に特異的に結合しうる較正用プローブ化合物Csc をこの上面に付着して含み、該化合物Csc と該化合物Csのモル比は既知であり、そして該方法は工程a)およびb)の前または後に以下の工程を含む:
−c)該化合物Ccc の試料を、特異的複合体 Csc/Ccc の形成を可能にする条件下で該支持体と接触させる工程:
−d)工程b)で用いた測定方法により工程c)の複合体 Csc/Ccc の生成を測定する工程、
ここで試験試料中の該標的化合物Ccの存在及び/又は量の測定は工程b)および工程d)で得られた測定値に基づく。
(1) 5×SSC(1×SSC は、0.15M NaCl+0.015M クエン酸ナトリウムの溶液に相当する) 、50%ホルムアミド、7%ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、10×Denhardt、5%硫酸デキストランおよび1%サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液 (20mM、pH7.5)中での3時間42℃での予備的ハイブリダイゼーション;
(2) プローブのサイズに応じた温度 (即ち、>100 ヌクレオチドのサイズのプローブでは42℃) での20時間のハイブリダイゼーション、次いで2×SSC +2%SDS 中20℃での洗浄を2×20分、0.1 ×SSC +0.1 %SDS 中20℃での洗浄1×20分。後者の洗浄は、>100 ヌクレオチドのサイズのプローブでは0.1 ×SSC +0.1 %SDS 中60℃で30分間行われる。所定の大きさのヌクレオチドについて上記した高ストリンジェントな条件は、当業者によりSambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の記載に従って、より大きいまたはより小さいオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行う場合、固体支持体から複合体Csc /Ccc の化合物Ccc を除去するために、工程d)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する;または
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の後に行う場合、固体支持体から複合体Cs/Ccの化合物Ccを除去するために、工程b)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する。
特に、プローブ化合物CsおよびCsc が核酸である場合、グラフトされたプローブに移動性を付与するために、プローブ化合物が結合される支持体とプローブ化合物との間にスペーサーアームを結合させることが有利でありうる。特に短い配列のオリゴヌクレオチドについては、支持体にグラフトされた核酸 (吸着または共有結合により) はハイブリダイゼーションの間に常に標的化合物に十分接近可能であるとは限らない。スペーサー化合物は一般的に、まず支持体への結合のためにプローブ化合物の末端に結合される。この化合物の性質は変化し得る。これは、標的配列CcもしくはCcc またはその相補的配列と相同性をもたない核酸配列であっても、あるいはポリエチレングリコール型の化合物 (WO 03/068712参照) であってもよい。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、Csc が共有結合を介して化合物Csに結合していることを特徴とする。
ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、化合物Csc が化合物Csとは独立に固体支持体表面に付着し、この付着した化合物Csc とこの付着した化合物Csとのモル比は既知であることを特徴とする。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、化合物Csc および化合物Csが、同じ分子への固定により固体支持体の表面に付着しており、後者は支持体に付着していることを特徴とする。
−同じCsおよびCsc 化合物が支持体上の同じ区画の表面 (プロットまたはスポットという) に付着している;
−化合物Ccc の試料、および工程c)の化合物Ccを含有すると思われる試験試料を支持体上の該プロットと接触させる;
−該プロット上のポイントまたはピクセルのセットについて、工程b)およびd)の測定を行う;そして
−試験試料中の該標的化合物Ccの存在及び/又は量の測定を、該プロット上の測定されたポイントまたはピクセルのそれぞれについて工程b)および工程d)で得た測定値のセットを考慮に入れて行う。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、該支持体がn個のプロットを含み、nは2〜108 、好ましくは2〜107 、2〜106 、2〜105 、2〜104 、2〜103 または2/103 プロットであることを特徴とする。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、使用するCsc およびCcc 化合物が少なくとも2個のプロットについて異なることを特徴とする。
ある好ましい態様では、本発明の方法は、使用するCsおよび調べるCc化合物が異なる2個のプロット、好ましくは固体支持体上の全プロットについて、複合体Cc/CsまたはCcc /Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする。
− (核酸、核酸)
− (核酸、ポリペプチド)
− (ポリペプチド、、核酸)
− (ポリペプチド、ポリペプチド)
好ましい (Cs、Cc) の対は (核酸、核酸) である。
−前記化合物Csおよび前記化合物Ccが核酸である場合、化合物Csc およびCcc は核酸である、
−前記化合物Csおよび前記化合物Ccがポリペプチドである場合、化合物Csc およびCcc はポリペプチドである、
−前記化合物Csが核酸であり、前記化合物Ccがポリペプチドである場合、化合物Csc は核酸である。
これらの支持体の中で、検出のために標的の標識を必要とするものを挙げると、例えば:
−マクロアレイ型支持体、
支持体:ナイロン膜;スポットサイズ:0.5 〜1mm、密度:数百スポット/cm2 ;プローブ:例えばPCRまたは合成産物;標的:例えば32P で放射性標識した DNA ;
−スポットされたマイクロアレイ型支持体、
支持体:化学的被覆をもつスライドガラス、スポットサイズ:〜100 μm ;密度:1000〜10000 スポット/cm2 ;プローブ:例えばPCRまたは合成オリゴヌクレオチド (20〜70マー) ;標的:例えば蛍光標識した (Ct3 およびCy5 による) cDNAまたはPCR産物;
−Affymetrix遺伝子チップ型支持体、
支持体:化学的被覆をもつスライドガラス、スポットサイズ:〜20μm ;密度:250000スポット/cm2 以下;プローブ:例えば、in situ 合成した20〜25マーのオリゴヌクレオチド;標的:ビオチン−ストレプトアビジンでの蛍光標識した DNA またはPCR産物;
スポットされたチップの製造方法は現在、十分に確立されている (DeRisi et al., Science 278(5338): p.680-686, 1997)。標的化合物がDNA型核酸である場合、DNA溶液はPCR増幅またはオリゴヌクレオチド合成のいずれかにより調製される。次いで、これらの溶液の微小液滴を規定された配置マトリックスに従い、ロボットにより、DNAプローブがマトリックス上の各スポット (またはプロット) に付着することを可能にする化学的層で処理したスライドガラス上に置く。
本発明のバイオチップ自己較正法で使用できる無標識動的読み取り方法には以下の方法があるが、それらに限定されない:
・表面プラズモン共鳴 (SPR);
・金属:誘導性界面でではなく、高い光学的インデックス案内帯域周囲での被きょう導波 (guided wave)の使用;
・表面音波の使用;
・集積電子工学化合物の使用;
・インピーダンスの使用;
・磁気抵抗の使用;または
・デフレクターマイクロミラーの使用。
Dharuman et al.,≪電子化学的レドックスプローブを用いる交互嵌合超ミクロ電極上でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの無標識インピーダンス検出≫, Biosens. and Bioelect. 21, 645-654, 2005;
Cheng et al., " 多層自己組織化金ナノ粒子によるDNAの電気的検出のためのアレイによるCMOSバイオチップ", Sensors and Actuators, B 109, 249-255, 2005;
Nikitin et al., " ピコスコープ、新規な無標識バイオセンサー", Sensors and Actuators, B 111-112, 500-504, 2005;
または一般的概説の文献≪機能性蛋白質マイクロアレイ上の相互作用のリアルタイム無標識検出のための新たな手段≫, Ramachadran et al. (FEBS Jounal (Federation of European Biochemical Society) vol.272, p.5412-5425, 2005)、およびこれらの方法に適用される支持体で方法を行うための、この文献で参照として引用されている文献。
本発明方法が、標的化合物の予備標識を必要とする測定システム (即ち、蛍光または放射性シグナルの測定) を使用する場合、検出及び/又は定量すべき標的化合物CcおよびCcc は、直接または間接的に検出しうるシグナル、好ましくは蛍光で検出可能なシグナルを生じ得る標識で予備標識される。
従って、ある好ましい態様によれば、本発明の方法は、標識が蛍光標識であることを特徴とする。
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行う場合、固体支持体から複合体Csc /Ccc の化合物Ccc を除去するために、工程d)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する;または
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の後に行う場合、固体支持体から複合体Cs/Ccの化合物Ccを除去するために、工程b)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する。
例えば、標識が蛍光型のものであり、化合物CcおよびCcc が核酸である場合、化合物CcおよびCcc はそれぞれCy3 およびCy5 、あるいはその逆に標識することができる。
さらに別の面では、本発明は、測定値の較正もしくは自己較正のためのキットもしくは必要な器具、または固体支持体の上部表面に付着した前記化合物Ccとプローブ化合物Csとの間の特異的複合体の形成の測定のためのシステムにより試料中の標的化合物Ccの存在を測定及び/又は定量するためのキットもしくは必要な器具を包含し、該化合物Csは該標的化合物Ccに特異的に結合することができ、複合体の形成の測定が、動的読み取り方法、好ましくは無標識の方法により行われることを特徴とし、またキットもしくは必要な器具が以下を含むことを特徴とする:
a)−上部表面に、プローブ化合物Cs、およびこのプローブ化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が結合され、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知である、固体支持体、または必要であれば、
−固体支持体、化合物Csを含む試薬Rs、および化合物Csc を含む試薬Rc、この2つの化合物CsおよびCsc は既知のモル比で該支持体の上部表面に固定するめたに使用される、および
b)再構成のための乾燥形態もしくは溶液であるのが必要な場合、較正用標的化合物Ccc を、好ましくは既知の濃度で含む試薬Rcc 、ここで化合物Ccc は前記化合物Csc に特異的に結合しうる。
好ましい態様によれば、本発明のキットまたは必要な器具は、前記支持体および前記化合物Cs、Csc 、Ccc およびCcがさらに、本発明の上記方法において独立に規定された特性を有することを特徴とする。
最後の面によれば、本発明は、以下の特徴とする、上部表面に、前記標的化合物Ccに特異的に結合し得るプローブ化合物Csが付着した固体支持体上での化合物Ccの特異的形成を測定するための装置を含む:
−上部表面に、化合物Ccとは異なる較正用標的化合物Ccc に特異的に結合しうる、化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が付着し、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知であり、該化合物Csc および該化合物Csが同じ方法で該支持体の上部表面に独立に付着するか、または、該化合物Csc が化合物Csの末端の一方に共有結合により該支持体の上部表面に付着している、固体支持体、
−再構成のための乾燥形態もしくは溶液であるのが必要な場合、前記化合物Csc に特異的に結合しうる、較正用標的化合物Ccc を含む試薬;および
−支持体の上部表面で得られる特異的複合体Cs/CcおよびCsc /Ccc の形成の測定を可能にする、該支持体の上部または下部表面の動的読み取り方法を用いる読み取りシステム。
比較遺伝子発現プロフィールを得るために同定された変異の遺伝子型決定のための、健康分野における、また、例えばGMO (genetically modified organism、遺伝的改変生物) のトレーサビリティーおよび質の制御の点での健康監視のための、本発明のキットまたは装置の使用も本発明の範囲内である。
材料および方法
・動的DNA/DNAバイオチップの場合における適切な官能化の例
約2nmのクロムの層および約50nmの金の層を被覆したスライド型顕微鏡のガラス基体からチップを製造した。Bassil et al., 2003 の文献に記載のようにして、この被覆にMUA (11-メルカプトウンデカン酸) /PEI(ポリエチレンイミン) /エキストラアビジン型、または11- メルカプトウンデカノール/デキストラン/アビジン型(Biorad)の分子自己組織化システムを加えた。最後の層はアビジン基に富むので、ビオチンと官能化する新規な基の被覆に特に適している (アビジン/ビオチン複合体は特に安定である) 。ビオチン化プローブ配列をスポットすることによりバイオチップを官能化した (プローブ配列はPBS 1×および1.5 M ベタイン溶液中で7μM 濃度に希釈した) 。使用した製品はすべて市販のものである。
例えば、膵臓繊維症に関連するCFTR遺伝子のエキソンn10 の「MV470 」変異の遺伝子型を特定決定するために、以下の配列を有する構造を使用した。
M470V-WT: 5'ビオチン(T)16 TTC TAA TGA TGA TTA gac cgg tat gcg 3'
M470V-MT: 5'ビオチン(T)16 TTC TAA TGG TGA TTA gac cgg tat gcg 3'
陰性対照: 5'ビオチン(T)18 CAC TTC GTG CCT T gac cgg tat gcg 3'
較正用配列は、その長さが、形成される相補的二本鎖が十分に安定であり、好ましくはバイオチップで使用されるその他の配列と交差反応を示さないようになれば採用できる。かかる較正用プローブ配列を選択する方法を簡単にするために、それらは、「zip 」として紹介され (Gerry et al., J. Mol. Biol., vol.292, pp.251-262, 1999参照) 、原則としてヒトゲノムに存在する配列とは相互作用しないことが見出されているものから選択できる。Csc 化合物としてのこの種の配列は、所望の標的化合物が何であろうと、修飾の必要なく利用できるという特別な利点を有する。
・使用する測定システム
読み取りはSPR イメージングモード (SPR)で行う。測定の規模はTE偏光 (transverse electric)に関して、TM偏光 (transverse megnetic)における反射率 (R)のレベルである。この物理的現象は、我々の測定値に関連して6次元を与える:2つの空間的次元(xおよびyと称する)1つの時間的次元(t)、1つのスペクトルの次元 (λ) 、1つの角の次元( θ) および1つの偏光の次元 (TMi)。共鳴の状態は、表面に近い光学的インデックスnにおける変化、特に生化学分子のハイブリダイゼーションにより生じ、平均厚さの薄膜を形成する変化により影響される。サブ−ナノメトリック (sub-nanometric) の解像度は多くの用途、特にDNA配列ハイブリダイゼーションの測定を必要とする用途にとって十分である。
複数の測定を連続的および一時的に行うことができる動的バイオチップの一般的な場合では、較正段階と、興味ある生体分子の相互作用を監視する段階を組み合わせることができる。これにより、生の実験測定値を補正し、これらの測定がなされた条件における局所的変動を考慮することが可能となる。
A)1プロットの100 ピクセル (または多分同じである100 のプロット) で得られた測定値の記録の例
図2Aおよび2B参照。
同じピクセル (プロット) については、対応する較正用測定値は記号+で与えられる。
本件においては、較正用測定の値は100 を中心とするガウス分布の結果であり、10のマグニチュードであり、測定の値はマグニチュード1のガウス分布を有する較正用測定値と関連している。これは、我々が補正データ中に当然に単独で見出す桁である。
B) 較正用測定により補正された生の測定値のヒストグラム
図3Aおよび3B参照。
較正用測定値で補正された生のデータは有意に分散が少ない。
Claims (25)
- 試験試料中の標的化合物Ccの存在及び/又は量を表面プラズモン共鳴イメージグ(SPRイメージング) により測定するための方法であり、上面に試験試料中に含まれるであろう該化合物Ccに特異的に結合しうるプローブ化合物Csが付着している、金属層で被覆された固体支持体を用い、以下の工程を含む方法:
−該化合物Ccを含むであろう試験試料を、特異的複合体Cc/Csの形成を可能にする条件下で該支持体に接触させることからなる工程a)、
−工程a)において形成されたであろう特異的複合体Cc/Csの形成のSPR イメージングを含む工程b):
ここで、
−固体支持体はまた、較正用標的化合物Ccc に特異的に結合しうる較正用プローブ化合物Csc がこの上面に付着され、該化合物Csc と該化合物Csのモル比が既知であり、そして該方法が工程a)およびb)の前または後に以下の工程を含むことを特徴とする:
−c)該化合物Ccc の試料を、特異的複合体 Csc/Ccc の形成を可能にする条件下で該支持体と接触させる工程:および
−d)工程c)の複合体 Csc/Ccc の生成をSPR イメージングにより測定する工程、
ここで試験試料中の該標的化合物の存在及び/又は量の測定は工程b)および工程d)で得られた測定値に基づく。 - 以下を特徴とする請求項1記載の方法:
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行う場合、固体支持体から複合体Csc /Ccc の化合物Ccc を除去するために、工程d)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する;または
−工程c)およびd)を工程a)およびb)の後に行う場合、固体支持体から複合体Cs/Ccの化合物Ccを除去するために、工程b)の後、固体支持体を適宜条件下で洗浄する。 - 工程c)およびd)を工程a)およびb)の前に行うことを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- スペーサー化合物が前記支持体に付着し、化合物Csおよび化合物Ccが該スペーサー化合物によって支持体に付着していることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかの項記載の方法。
- 化合物Csc が共有結合により化合物Csに結合していることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかの項記載の方法。
- 化合物Csc が化合物Csc の支持体の遊離の非結合末端に結合していることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- 化合物Csc が独立して化合物Csの固体支持体の表面に付着していることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかの項記載の方法。
- 化合物Csc および化合物Csが、同じ分子への固定化により固体支持体の表面に付着しており、後者は支持体に付着していることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 化合物Csc および化合物Csが付着している同じ分子がポリマーであることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 以下を特徴とする請求項1〜9のいずれかの項記載の方法:
−同じ化合物CsおよびCsc が支持体上の区画された表面 (プロットと称する) に付着している;
−化合物Ccc の試料および工程c)の化合物Ccを含有すると思われる試験試料を支持体上の該プロット全部と接触させる;
−該プロット上のポイントまたはピクセルのセットについて工程b)および工程d)での測定を行う;そして
−試験試料中の該標的化合物Ccの存在及び/又は量の測定を、該プロット上のポイントまたはピクセルのそれぞれについて工程b)および工程d)で得られた測定値のセットを考慮して行う。 - 同じプロットについては、複合体Cc/CsおよびCcc /Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする、請求項10記載の方法。
- 前記支持体がn個のプロットを含み、nは2〜108 であることを特徴とする、請求項10または11記載の方法。
- 使用する化合物Csc およびCcc がn個のプロットについて同じであることを特徴とする、請求項10〜12のいずれかの項記載の方法。
- 使用する化合物Csc およびCcc が少なくとも2個のプロットについて異なることを特徴とする、請求項10〜12のいずれかの項記載の方法。
- 使用する化合物Csおよび調べるCc化合物が少なくとも2個のプロットについて異なることを特徴とする、請求項10〜14のいずれかの項記載の方法。
- 使用する化合物Csおよび調べるCc化合物が異なる2個のプロットについて、複合体Cc/CsまたはCcc /Csc の特異的形成を可能にする条件が同じであることを特徴とする、請求項15記載の方法。
- 前記化合物Csおよび前記化合物Ccが核酸、特に二本鎖DNA、一本鎖DNA、またはRNAなどの該DNAの転写産物を有する一本鎖および二本鎖型核酸の混合物、および非天然ヌクレオチドを含むか含まない任意の核酸からなる核酸の群より選ばれることを特徴とする、請求項1〜16のいずれかの項記載の方法。
- 化合物Csc およびCcc が、付着した化合物Csおよび調べられる化合物Ccまたはそれらの相補的配列とあまり相同性をもたない核酸であることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- 化合物Csc および必要であれば化合物Ccc が、6〜30ヌクレオチドの長さの核酸であることを特徴とする、請求項17または18記載の方法。
- 前記支持体が透明な固体支持体、好ましくはスライドガラスであることを特徴とする、請求項1〜19のいずれかの項記載の方法。
- 上部表面に付着した、試料中に含まれると思われる標的化合物Ccに特異的に結合しうる第1のプローブ化合物Cs、および別の標的化合物Ccc に特異的に結合しうる第2のプローブ化合物Csc を含む、金属層で被覆された固体支持体の使用であり、該化合物Csc と該化合物Csのモル比は既知であり、この固体支持体は、標的化合物Ccを含むと思われる試料を支持体の上部表面に接触させた後に、前記測定の較正または自己較正のために、特異的複合体Cs/Ccの形成を測定することにより標的化合物Ccの存在をSPRイメージンクにより測定及び/又は定量するのに使用される、前記使用。
- 前記化合物Csc が、化合物Csの一方の末端へ共有結合により結合されていることを特徴とする、請求項21記載の固体支持体の使用。
- 測定値の較正のためのキットもしくは必要な器具、またはSPRイメージングによる、前記化合物Ccと、固体支持体の上部表面に付着したプローブ化合物Csとの間の特異的複合体の形成の測定により、試料中の標的化合物Ccの存在を測定及び/又は定量するためのキットもしくは必要な器具であり、該化合物Csは該標的化合物Ccに特異的に結合することができ、以下を含むことを特徴とする、前記キットもしくは必要な器具:
a)−上部表面に、プローブ化合物Cs、およびこのプローブ化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が付着し、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知である、金属層で被覆された固体支持体、または必要であれば、
−金属層で被覆された固体支持体、化合物Csを含む試薬Rs、および化合物Csc を含む試薬Rc、この2つの化合物CsおよびCsc は既知のモル比で該支持体の上部表面に固定するために使用される、および
b)較正用標的化合物Ccc を、好ましくは既知の濃度で含む試薬Rcc 、ここで化合物Ccc は前記化合物Csc に特異的に結合しうる。 - 化合物Csc が、化合物Csの末端の一方に、共有結合で結合していることを特徴とする、請求項23記載のキットまたは必要な器具。
- 以下を含むことを特徴とする、上部表面に、標的化合物Ccに特異的に結合し得るプローブ化合物Csが付着した、金属層で被覆された固体支持体上での化合物Ccの特異的形成をSPRイメージングにより測定するための装置:
−上部表面に、化合物Ccとは異なる較正用標的化合物Ccc に特異的に結合しうる、化合物Csとは異なる較正用プローブ化合物Csc が付着し、該化合物Csc と該化合物Csとのモル比が既知であり、、該化合物Csc が化合物Csの末端の一方に共有結合により該支持体の上部表面に結合している、固体支持体、
−前記化合物Csc に特異的に結合しうる、較正用標的化合物Ccc を含む試薬;および
−支持体の上部表面で得られる特異的複合体Cs/CcおよびCsc /Ccc の形成の測定を可能にする、該支持体のSPRイメージング読み取りシステム。
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