JP2009517087A - プライマー及びプローブを設計するための方法及びシステム - Google Patents

Abstract

【要約書】
本発明は、候補核酸配列中の特定のヌクレオチドに対して、正又は負の優先又は「加重」を提供するスコア化及び／又は順位決定工程を採用することによって、複数の標的核酸バリアントとハイブリッド形成するために最適化されるポリヌクレオチドプライマー及びプローブを設計するための方法を提供する。実行される具体的なスコア化又は順位決定工程は、プライマー及び／又はプローブに関して企図される使用、具体的な標的核酸配列及び前記標的核酸配列のバリアント数に依存する。本発明の方法は、先行技術におけるプライマー及びプローブよりも多くの標的核酸バリアントとハイブリッド形成するため、最適なプライマー及びプローブ配列を提供する。

Description

本発明は、複数の標的核酸バリアントとハイブリッド形成するために最適化される核酸プライマー及びプローブを設計するための方法に関する。

核酸プライマー及びプローブを選択するための現在の市販のソフトウェアは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅反応において使用するための適合性に基づいて配列を同定する。一般的に、プライマー又はプローブの選択は、配列Ｔｍ、％ＧＣ含有量、ある種の塩基の連続的な走行等のパラメータによって決定され、ソフトウェアは、標的配列の各ヌクレオチド位置を、等しく重要であり又は代表しているものとして処理する。

プライマー及びプローブの設計に対するこのアプローチは、標的核酸が、遺伝的に多様である場合、限られた成功を収めるに過ぎない。ウイルス及び細菌等の多くの微生物のゲノムは、かなりの種内変動を示す。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに列挙されているヒトＡ型インフルエンザには、少なくとも２０００個の異なるバリアントが存在する。核酸配列のわずかな変化は、新たな及び潜在的により危険性の高い微生物の存在を表し得る。同様に、これらの変化は、微生物のタンパク質を変化させ、これにより抗体を用いた迅速な診断検査による前記微生物の認識が妨げられ得る。単一種内でのこのような遺伝的変動は、核酸を標的として使用する診断検査のためのプローブを設計する者にとって、著しい障害となり得る。

遺伝的に多様な配列を有する核酸を検出するためのプライマー又はプローブを設計するために、標的核酸配列の多重整列化を使用して共通配列を発生させる。次に、共通配列は、プライマー及び／又はプローブを選択するソフトウェアを使用して評価される。既存のソフトウェアは、配列のどの領域がプライマー又はプローブを選択するために使用可能であるかを限定する配列の注釈付けの幾つかの形態を有するが、これは、通常、非常に限定的であり、手動入力を要する。さらに、このアプローチによって選択されるプライマー又はプローブは、ＰＣＲを実施する能力（すなわち、プライマー又はプローブとしてどれほど十分に機能するか）によってのみ評価され、プライマー又はプローブが結合し得る多数の標的バリアントがどのくらい多いかによるものではない。具体的な候補プライマー又はプローブが結合し得る標的バリアントが何％であるかを決定することは、手動で実行可能であるが、時間が非常にかかり、再現可能ではなく、誤差を受けやすく、最適なプライマー若しくはプローブの配列又はプライマー若しくはプローブの配列のセットをおそらく同定しない。

それゆえ、遺伝子の多様な標的核酸を合成、増幅及び／又は同定する上で有用なプライマー及びプローブを設計するための迅速で再現可能な方法が必要とされている。

本発明は、標的核酸バリアント配列中の特定のヌクレオチドに対して、正又は負の優先又は「加重」を提供するスコア化及び／又は順位決定工程を採用することによって、複数の標的核酸バリアントとハイブリッド形成するために最適化されるポリヌクレオチドプライマー及びプローブを設計するための方法を提供する。実行される具体的なスコア化又は順位決定工程は、プライマー及び／又はプローブに関して企図される使用、具体的な標的核酸配列及び前記標的核酸配列のバリアント数に依存する。プライマー及びプローブ配列が、先行技術におけるプライマー及びプローブよりも多くの標的核酸バリアントとハイブリッド形成するために、本発明の方法は、最適なプライマー及びプローブ配列を提供する。本発明の最適なプライマー及びプローブは、例えば、ヒトの疾病症状の具体的なセットの病因又は関与因子を同定及び診断するのに有用である。これらの因子は、（例えば、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫等の）感染性微生物、（例えば、薬剤抵抗性１６ｓリボソームＲＮＡ等の）感染の補助マーカー及び（例えば、薬物動態マーカー及び炎症マーカー等の）宿主因子を含み得る。

一態様において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの標的微生物又は遺伝子（例えば、病原体又は対立遺伝子バリアント）を代表する少なくとも２つの標的核酸バリアント配列間でヌクレオチド同一性を同定すること；（ｂ）前記少なくとも２つの標的核酸バリアント配列とハイブリッド形成することが可能であるプライマーを規定する少なくとも２つの候補プライマー配列を選択すること；及び（ｃ）標的核酸バリアント配列又はその相補対に対する候補プライマー配列の百分率同一性に従って、前記候補プライマー配列を順位付けし、これにより、複数の標的核酸バリアントを合成するための最適な候補プライマー配列を決定することによって、複数の標的核酸バリアントを合成する（例えば、増幅する）ためのプライマーを設計するための方法を提供する。別の実施形態において、順位決定工程は、保存スコアに従ってプライマーを順位決定することを含む。

別の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの標的微生物又は遺伝子（例えば、病原体又は対立遺伝子バリアント）を代表する少なくとも２つの標的核酸バリアント配列間でヌクレオチド同一性を同定すること；（ｂ）前記少なくとも２つの標的核酸バリアント配列とハイブリッド形成することが可能であるプローブを規定する少なくとも２つの候補プローブ配列を選択すること；及び（ｃ）標的核酸バリアント配列又はその相補対に対する候補プローブ配列の百分率同一性に従って、前記候補プローブ配列を順位付けし、これにより、複数の標的核酸バリアントを同定するための最適な候補プローブ配列を決定することによって、複数の標的核酸バリアントを同定するためのプローブを設計するための方法を提供する。別の実施形態において、順位決定工程は、保存スコアに従ってプローブを順位決定することを含む。

本発明は、（ａ）少なくとも２つの標的生物又は遺伝子バリアントを代表する少なくとも２つの標的核酸バリアント配列間でヌクレオチド同一性を同定すること；（ｂ）前記少なくとも２つの標的核酸バリアント配列とハイブリッド形成することが可能である順方向プライマーを規定する少なくとも２つの候補順方向プライマー配列を選択すること；（ｃ）前記少なくとも２つの標的核酸バリアント配列とハイブリッド形成することが可能である逆方向プライマーを規定する少なくとも２つの候補逆方向プライマー配列を選択すること；（ｄ）標的核酸バリアント配列又はその相補対に対する順方向プライマー配列の百分率同一性に従って、前記順方向プライマー配列を順位付けし、これにより複数の標的核酸バリアントを増幅するための最適な順方向プライマー配列を決定すること；及び（ｅ）標的核酸バリアント配列又はその相補対に対する逆方向プライマー配列の百分率同一性に従って、前記逆方向プライマー配列を順位付けし、これにより複数の標的核酸バリアントを増幅するための最適な逆方向プライマー配列を決定することによって、複数の標的核酸バリアントを増幅するためのプライマー対を設計するための方法も提供する。

別の実施形態において、本発明は、複数の標的核酸バリアントを増幅するためのプライマー対と、増幅によって生じる単位複製配列を検出するためのプローブとのセットを設計するための方法を提供する。前記方法は、（ｆ）少なくとも２つの標的核酸バリアント配列とハイブリッド形成することが可能であるプローブを規定する少なくとも２つの候補プローブ配列を選択すること及び（ｇ）標的核酸バリアント配列又はその相補対に対するプローブ配列の百分率同一性に従って、前記プローブ配列を順位付けし、これにより、複数の標的核酸バリアントを同定するための最適なプローブ配列を決定することというさらなる工程を含む。

本発明の方法において使用されるスコア化工程又は順位決定工程には、例えば、（ｉ）標的核酸配列に関して標的配列スコアを決定すること；（ｉｉ）標的核酸配列に関して平均保存スコアを決定すること；（ｉｉｉ）標的核酸配列に関して平均適用範囲スコアを決定すること；（ｉｖ）標的核酸配列の一部（例えば、５’末端、中心、３’末端）の１００％保存スコアを決定すること；（ｖ）種のスコアを決定すること；（ｖｉ）系のスコアを決定すること；（ｖｉｉ）サブタイプのスコアを決定すること；（ｖｉｉｉ）血清型のスコアを決定すること；（ｉｘ）関連した疾病のスコアを決定すること；（ｘ）年のスコアを決定すること；（ｘｉ）生産国のスコアを決定すること；（ｘｉｉ）二つ組のスコアを決定すること；（ｘｉｉｉ）特許のスコアを決定すること；及び（ｘｉｖ）最小定性化スコアを決定することの少なくとも１つの工程が含まれる。これらのスコアは、ヌクレオチド又は標的核酸配列全体の優先性を決定する一方で、プライマー及び／又はプローブの配列を調整し、これにより前記プライマー及び／又はプローブの配列が、複数の標的核酸バリアントとハイブリッド形成する上での工程を表す。本発明の方法は、候補プライマー及びプローブの配列と標的核酸バリアント配列若しくはその相補対との間の同一性を決定する際、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの変化が可能となる工程も含み得る。

別の実施形態において、本発明の方法は、候補プライマー及び／又はプローブ核酸配列を排除核酸配列と比較し、前記候補プライマー及び／又はプローブ核酸配列が、前記排除核酸配列と同一性を共有する場合、前記候補核酸配列を排斥する工程を含む。

別の実施形態において、本発明の方法は、候補プライマー及び／又はプローブ核酸配列を包含核酸配列と比較し、前記候補プライマー及び／又はプローブ核酸配列が、前記包含核酸配列と同一性を共有しない場合、前記候補核酸配列を排斥する工程を含む。

一実施形態において、標的核酸配列は、病原体核酸、例えばＡ型インフルエンザマトリクスタンパク質遺伝子（ＩＮＦＡ−ＭＰ）；Ｂ型インフルエンザ非構造タンパク質遺伝子（ＩＮＦＢ−ＮＳ）；Ａ型呼吸器多核体ウイルス糖タンパク質遺伝子（ＲＳＶＡ−Ｇ）；Ｂ型呼吸器多核体ウイルス糖タンパク質遺伝子（ＲＳＶＢ−Ｇ）；Ａ型呼吸器多核体ヌクレオカプシド遺伝子（ＲＳＶＡ−Ｎ）；Ｂ型呼吸器多核体ヌクレオカプシド遺伝子（ＲＳＶＢ−Ｎ）；１型パラインフルエンザＨＮ遺伝子（ＰＩＶ１−ＨＮ）；２型パラインフルエンザＨＮ遺伝子（ＰＩＶ２−ＨＮ）；３型パラインフルエンザＨＮ遺伝子（ＰＩＶ３−ＨＮ）；Ｂ型アデノウイルスヘキソン遺伝子（ＡＤＶＢ−Ｈ）；Ｃ型アデノウイルスヘキソン遺伝子（ＡＤＶＣ−Ｈ）；Ｅ型アデノウイルスヘキソン遺伝子（ＡＤＶＥ−Ｈ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）及びモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）等の偏好性及び呼吸性細菌のリボソームＲＮＡサブユニット等の疾病マーカーであり；出生時疾病と関連した病原体に関して、これらには、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）並びにヒト単純ヘルペスウイルス１型及び２型のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群ストレプトコッカス）の連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ遺伝子、ＤＮＡギラーゼＡ型サブユニット（ｇｙｒＡ）、グルタミン合成酵素（ｇｌｎＡ）、外膜ポリンタンパク質（ｐｏｒＡ）、ナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に関するナイセリアＡ型表面タンパク質（ｎｓｐＡ）、及びクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に関する主要外膜Ａ型タンパク質（ｏｍｐＡ）が含まれる。

別の実施形態において、標的核酸は、例えば微生物薬剤抵抗性等の遺伝子マーカー（βラクタマーゼ、ｍｅｃＡ／ＰＢＰ２ａ遺伝子、バンコマイシン耐性−ｖａｎＡ及びｖａｎＢ、リファンピン耐性、イソニアジド耐性）、薬理ゲノミクス、炎症、（急性相反応体核酸又は炎症関連核酸等の）感染、アレルギー、腫瘍（例えば、ｐ５３及びＢＲＡＣ１等の疾病感受性と関連した遺伝子）、自己免疫、免疫不全、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び黄疸のヒトマーカーである。標的核酸は、全ての疾病関連核酸、例えば、感染病原体又は微生物、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、原生動物及び（藻類又は花粉等の）植物細胞を代表する核酸であり得る。標的核酸は、検査されている対象の遺伝子障害を示す特異的な遺伝子配列でもあり得る。例えば、遺伝子障害は、遺伝子の変異、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）、正常な染色体若しくは遺伝子の余分なコピー又は欠損した遺伝子によって標識されることが可能である。標的は、具体的な薬物に対する抵抗性、寛容又は感受性を提供する微生物の遺伝子等の治療最適化因子のためのマーカーでもあり得る。このような治療最適化因子は、具体的な薬物に対して対象を抵抗性、寛容又は不耐にさせる対象の遺伝的特性でもあり得る。

多くの自己免疫疾患において、個体の集団における具体的なＨＬＡ抗原と特定の疾病との関係がある。プライマー及びプローブは、ＨＬＡ Ｂ２７；ＨＬＡ Ｂ３８；ＨＬＡ ＤＲ８；ＨＬＡ ＤＲ５；ＨＬＡ Ｄｗ４／ＤＲ４；ＨＬＡ Ｄｗ３；７ＨＬＡ ＤＲ３；ＨＬＡ ＤＲ４；ＨＬＡ Ｂ５；ＨＬＡ Ｃｗ６；ＨＬＡ Ａ２６；ＨＬＡ Ｂ５１；ＨＬＡ Ｂ８；ＨＬＡ Ｄｗ３；ＨＬＡ Ｂ３５；ＨＬＡ ＤＲ２；ＨＬＡ Ｂ１２；及びＨＬＡ Ａ３等のＨＬＡを検出するよう設計される。本発明の方法及び核酸は、Ｆａｓ；ＦａｓＬ等の自己免疫症候群；及び自己免疫疾患と関連した初期及び後期補体成分の欠乏を含むカナーレ・スミス（Ｃａｎａｌｅ−Ｓｍｉｔｈ）症候群に影響を及ぼす遺伝子変異を検出するために使用されることが可能である。次の遺伝子、すなわちＣ１（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ）；Ｃ４；Ｃ２；Ｃ１阻害剤；Ｃ３；Ｄ；プロペルジン；Ｉ；Ｐ；Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９における変異は、補体欠乏及び／又は自己免疫症候群と関係している。さらに、免疫不全に至る変異／対立遺伝子変動には、Ａ）欠損サイトカインシグナル伝達と関連したＳＣＩＤ−γｃ；Ｊａｋ３；ＩＬ−２；ＩＬ−２Ｒａ；及びＩＬ−７Ｒａ；Ｂ）ＴＣＲ関連欠損と関連したＳＣＩＤ−ＣＤ３ｇ；ＣＤ３ｅ；及びＺＡＰ７０；Ｃ）ＨＬＡクラスＩＩ欠乏−ＣＩＩＴＡ；ＲＦＸ５；及びＲＦＸＢ；Ｄ）ＨＬＡクラスＩ欠乏（露出白血球症候群）−ＴＡＰ１及びＴＡＰ２；Ｅ）キナーゼ以外の酵素における欠損と関連した免疫不全−ＡＤＡ欠乏及びＰＮＰ欠乏；Ｆ）Ｘ連鎖ハイパーＩｇＭ−ＣＤ４０リガンド；Ｇ）Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ブロトン型）−Ｂｔｋ；Ｈ）非Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症−ｍ重鎖；Ｉ）ウィスコット・アルドリッチ症候群−ＷＡＳＰ；Ｊ）毛細血管拡張性運動失調症−ＡＴＭ；Ｋ）ディジョージ奇形−２１ｑ；Ｌ）自己免疫リンパ増殖性症候群−Ｆａｓ；Ｍ）ＸＬＰ−ＳＨ２Ｄ１Ａ／ＳＡＰ；Ｎ）ＴＲＡＰＳ−ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；及び／又はＯ）微生物感染に対する感受性−ＩＦＮ−γＲ１；ＩＦＮ−γＲ２；ＩＬ−１２ｐ４０が含まれる。

標的核酸は、例えば、２つの異なる界、門、綱、目、科、属、種、サブタイプ及び遺伝子型等の少なくとも２つの群において、核酸と相同性、類似性又は同一性を共有し得る。別の実施形態において、標的は、多くの血清型又は表現型を含む。本発明のプライマー及びプローブは、上述の群の少なくとも２つのメンバー又はその組み合わせ、好ましくはその複数とハイブリッド形成することができる。

一実施形態において、本発明の方法において標的核酸バリアント同一性を同定する工程は、標的核酸バリアント配列を整列化することを包含する。例えば、（例えば、公共の及び注釈付きの）データベース由来の標的核酸バリアント配列の手動整列化が実施される。本発明の方法の実施形態において使用されるデータベースには、本明細書に記載されているＰｒｉＭＤ（商標）データベース等の注釈付きデータベースが含まれる。あるいは、データベースは、例えば、インフルエンザ配列データベース、リボソームデータベースプロジェクト、ＳＴＤデータベース及び／又はＧｅｎｂａｎｋデータベース等の多くの核酸データベースの何れかであり得る。あるいは、整列化は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＰｉｌｅＵｐ（ＧＣＧ）、ＭＵＬＴＡＬＩＧＮ、ＤＮＡＳｔａｒ’ｓ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ及びＴｃｏｆｅｅ等のプログラムを使用して実施される。一実施形態において、整列化は、対合計スコア化法及び／又は進化系統樹を使用する最適化を使用して実施される。本発明の同定工程はさらに、配列が整列化に適合しない場合、少なくとも１つの５’ヌクレオチド及び／又は少なくとも１つの３’ヌクレオチドを少なくとも１つの核酸配列から除去することによって、整列化を編集することを含み得る。整列化はまた、編集工程後に反復され得る。

本発明の方法の一実施形態において、選択工程（ｂ）は、プライマーＴｍ−最適なＴｍ；プライマーＴｍ間の差異；単位複製配列長−最小単位複製配列長；及びプライマーとＴａｑＭａｎプローブとの間の距離、の加重された合計の少なくとも１つを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ペナルティースコア式を使用することを含む。

一実施形態において、選択工程は、最も多くの標的核酸バリアント配列（例えば、最も多くの標的生物又は遺伝子）とハイブリッド形成する候補配列の能力を決定することを含む。別の実施形態において、選択工程は、１に最も近い平均保存スコアをどの配列がゆするかを決定することを含み、その中で平均保存スコアに関する標準偏差も比較される。

他の実施形態において、方法はさらに、どの感染病原体標的核酸バリアント配列が、最適な順方向プライマー及び最適な逆方向プライマーによって、例えば、データベース中の標的核酸バリアント配列間の塩基差の数を決定することによって、ハイブリッド形成されるかを評価する工程を含む。例えば、評価工程は、（１）包含基準又は排除基準と合致しない場合、順方向プライマー及び／又は逆方向プライマーを排斥すること；（２）医学的に価値のある核酸を増幅しない場合、順方向プライマー及び／又は逆方向プライマーを排斥すること；（３）ＢＬＡＳＴ分析を実施して、刊行及び／又は特許化された配列と重複する順方向プライマー配列及び／又は逆方向プライマー配列を同定すること；及び／又は（４）順方向プライマー、逆方向プライマー及び／又は標的の二次構造を決定することを包含する、インシリコでのポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含み得る。一実施形態において、評価工程には、順方向プライマー配列、逆方向プライマー配列及び／又はプローブ配列が、標的バリアントを代表する核酸配列以外のデータベース中の配列とハイブリッド形成するかどうかを評価することが含まれる。

別の態様において、本発明は、本発明の設計工程を自動化するソフトウェアプログラムを提供する。ＰｒｉＭＤ（商標）ソフトウェアなどの、本明細書で指定されるプログラムは、ＰｒｉＭＤ（商標）データベースと呼ばれるデータベースも含む統合型ＰｒｉＭＤ（商標）システムの一部であり得る。本発明のデータベースは、将来の使用のために本発明の方法において使用され、及び本発明の方法に由来する両者の情報を保存する。

別の態様において、本発明は、プライマー及びプローブの核酸並びにプライマーによる標的核酸バリアントの増幅によって生じる単位複製配列核酸を提供する。

一実施形態において、本発明は、配列番号１ないし９４の何れか１つの配列又はその相補対と少なくとも約６０ないし７０％の同一性を共有する配列を含む核酸（例えば、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１ないし９４の何れか１つの配列又はその相補対と少なくとも約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％の同一性を共有する配列を含む核酸を提供する。本発明のプローブ及び／又はプライマー核酸配列は、例えば、標的病原体由来の標的核酸の多くのバリアントを同定するのに最適である。一実施形態において、本発明の核酸は、標的核酸バリアントの合成（例えば、増幅）のためのプライマー及び／又は標的核酸バリアント、例えば、本発明のプライマーを使用して増幅される増幅された標的核酸バリアントの同定、単離、検出又は分析のためのプローブである。

標的病原体には、以下に限定されるものではないが、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）科；（回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）を含む）回虫（Ａｓｃａｒｉｓ）科；（アセトバクター・アウランチウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｓ）を含む）酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）科；（マストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、トリアデノウイルス（Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アタデノウイルス（Ａｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）及びシアデノウイルス（Ｓｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を含む）アデノウイルス科；エロモナス科；（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む）アグロバクテリウム科；（ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌ）を含む）鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）科；（溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）を含む）アルカノバクテリア科；（イッピウイルス（Ｉｐｐｙ ｖｉｒｕｓ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ ｖｉｒｕｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）及びマバラウイルス（Ｍｏｂａｌａ ｖｉｒｕｓ）を含む）アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）科；（回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）を含む）回虫（Ａｓｃａｒｉｓ）科；（アバストロウイルス（Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）及びママストロウイルス（Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）を含む）アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）科；（アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）を含む）アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）科；（アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）を含む）アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）科；（バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・フシホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）科；（バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｌｉｓ）、バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びバクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）を含む）バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）科；（大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）を含む）バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）科；（バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）及びバルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）を含む）バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）科；（ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ ｈｏｍｉｎｉｓ）を含む）ブラストシスチス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ）科；（ブラストミセス・デルマティティディスを含む）ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）科；（ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）を含む）ボルデテラ科；（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を含む）ボレリア（Ｂｏｒｅｌｌｉａ）科；（アボルタス（ａｂｏｒｔｕｓ）科、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）及びブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）を含む）ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）科；（マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）及びチモール糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｔｉｍｏｒｉ）を含む）ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）科；（フレボウイルス（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）、ナイロウイルス（Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）及びトスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）を含む）ブニアウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）科；（バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）及びバークホルデリア・シュードマレイを含む）バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）科；（ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ）及びＥ型肝炎を含む）カルシウイルス（Ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科；（肉芽腫カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）を含む）カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）科；（カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）及びカンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を含む）カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）科；（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を含む）カンジダ科；（クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）及びクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を含む）クラミジア科；（クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びクラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）を含む）クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）科；
（シナ肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）を含む）肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ）科；（クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ウェルチ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｅｌｃｈｉｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を含む）クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）科；（コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）を含む）コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）科；（コロナウイルス及びトロウイルスを含む）コロナウイルス科；（コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）及びコリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）を含む）コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）科；（Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）を含む）コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）科；（クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）を含む）クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）科；クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）科；（Ｄ型肝炎を含む）デルタウイルス（Ｄｅｌｔａｖｉｒｕｓ）科；（広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ）を含む）ジフィロボスリウム（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）科；エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）科；（エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）を含む）エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）科；（赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）を含む）エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）科；（ギョウチュウ（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）を含む）エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）科；（エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）及びエンテロコッカス・マロラツス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｒａｔｕｓ）を含む）エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）科；（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を含む）エシェリキア科；（アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）を含む）ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉａｃｅａｅ）科；（肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）を含む）ファスキオラ科；（ファシオロプシス・ブスキ（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋｉ）を含む）ファシオロプシス（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ）科；（エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ）を含む）フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）科；（アルボウイルス（ａｒｂｏｖｉｒｕｓ）Ｂ群、Ｃ型肝炎及びデング熱を含む）フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）科；（野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）を含む）フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）科；（ヌクレアタム（ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）を含む）フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）科；（ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を含む）ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）科；（ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）を含む）ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）科；（ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）を含む）ギムノアスクス科；（ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・パータシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びヘモフィルス・バギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を含む）ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）科；（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を含む）ヘリコバクター科；（Ｂ型肝炎を含む）ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａ ｖｉｒｕｓ）科；（αヘルペスウイルス、βヘルペスウイルス及びγヘルペスウイルスを含む）ヘルペスウイルス科；（小型条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ）を含む）膜様条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ）科；（イソスポーラ・ベリ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ）を含む）イソスポーラ科；（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む）クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）科；（ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）を含む）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）科；（レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）を含む）レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）科；（ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）を含む）リーシュマニア科；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）科；（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含む）リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）科；（メタノバクテリウム・エクストロクエンス（Ｍｅｔａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）を含む）メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）科；（ミクロバクテリウムマルチフォルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）を含む）ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）科；（ルテウス菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）を含む）ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）科；（モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）を含む）モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）科；（マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｔａｅ）、マイコバクテリウム・レプラムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む）マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）科；（マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）及びマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む）マイコプラズマ科；ネグレリア科；（アメリカ鉤虫（Ｎｅｇａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）を含む）ネカトール科；（ナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）及びナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含む）ナイセリア科；（ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）を含む）ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）科；（回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）を含む）オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）科；（ヒト及びトリＡ型、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスを含む）オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）科；（南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む）パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）科；（パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）、モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）及びニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）を含む）パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）科；（ヒトパピローマウイルス、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスを含む）パポーバウイルス科；（南アメリカ分芽菌を含む）パラコクシジオイデス科；（ウエステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）を含む）パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）科；（デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）及びパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）を含む）パルボウイルス科；（パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）及び野兎病菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）を含む）パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）科；（ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｎｇｕｓ）、ペプトストレプトコッカス・プレボッティ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ）及びペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）を含む）ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）科；（エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）及びヘパトウイルス（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）を含む）ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ ｖｉｒｕｓ）科；（ピチロスポルム・フォリクリチス（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｔｉｓ）を含む）ピチロスポルム（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ）科；プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）科；（ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）を含む）ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）科；（天然痘及び伝染性軟属腫ウイルスを含む）ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）科；（ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を含む）ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）科；（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）を含む）プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）科；（プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を含む）プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）科；（シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びシュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）を含む）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）科；（オルビウイルス（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）及びロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を含む）レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）科；（αレトロウイルス、βレトロウイルス、γレトロウイルス、δレトロウ
イルス、εレトロウイルス、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）及びスプーマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）を含む）レトロウイルス科；（ベシキュロウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス（ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ノビラブドウイルス（ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、サイトラブドウイルス（ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）及びヌクレオラブドウイルス（ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）を含む）ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）科；（リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）を含む）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）科；（リケッチア・リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッチア・コノリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉｉ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・クインターナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッチア・トラコーマ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｒａｃｈｏｍａ）、リケッチア・チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）及び恙虫病リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）を含む）リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）科；（ロシャリメア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）及びロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）を含む）ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）科；（ロチア・デントカリオーサを含む）ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）科；（腸炎菌、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｉ）及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含むサルモネラ科；ＳＡＲＳ様ウイルス科；（ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）及び日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を含む）シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）科；（セプタタ・インテスティナリス（Ｓｅｐｔａｔａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）を含む）セプタタ（Ｓｅｐｔａｔａ）科；（セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を含む）セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）科；（志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）を含む）シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）科、（スピリルム・マイナス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ）を含む）スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）科；スピロヘータ科；（スポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）を含む）スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）科；（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及びスタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む）スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）科；（ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）−ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティオール（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）及びストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）を含む）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）科；（無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）及び有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）を含む）テニア（Ｔａｅｎｉａ）科；（癜風（Ｔｉｎｅａ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）を含む）白癬（Ｔｉｎｅａ）科；（αウイルス−脳炎ウイルス、及びルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）−風疹及びドイツ麻疹を含む）トゴウイルス（Ｔｏｇｏｖｉｒｕｓ）科；（イヌ回虫を含む）トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）科；（トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）を含む）トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）科；（梅毒トレポネーマを含む）トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）科；（旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）を含む）トリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）科；（膣トリコモナスを含む）トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）科；（鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒｉａ）を含む）トリチュリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）科；（トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ及びトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）を含む）トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）科；（ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）を含む）ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）科；（ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｍｍａ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）及びビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を含む）ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）科；（バンクロフロ糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）を含む）ウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）科；（ザントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）を含む）ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）科；（エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）及びエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む）エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）科；（アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リゾムコール・プシラス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）及びリゾプス・アリザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）を含む）接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）科が含まれる。

一実施形態において、本発明の核酸は、少なくともＮ個の異なる標的核酸バリアントとハイブリッド形成し、Ｎは、１から標的核酸の公知のバリアントの総数までの何れかの整数である。それゆえ、Ｎは、（例えば、新たなバリアントが発見される場合）付与された標的核酸に関して、経時的に変動し得る・本発明の方法が、利用可能なプライマー及びプローブよりも多くの標的バリアントとハイブリッド形成することが可能である最適なプライマー及びプローブ並びにそのセット並びにそのセットの組み合わせの同定に提供されるため、Ｎは、現在使用される市販のプライマー及びプローブに対するよりも本発明のプライマー及びプローブに対して大きい。

別の実施形態において、本発明は、配列番号１ないし７１の何れか１つの配列を含む核酸又はその相補対を含むか及び／又は前記核酸若しくはその相補対とハイブリッド形成する核酸を提供する。一実施形態において、核酸は、ストリンジェンシーの低いハイブリッド形成条件下で、標的核酸とハイブリッド形成する。別の実施形態において、核酸は、ストリンジェンシーの高いハイブリッド形成条件下で、標的核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、本発明は、配列番号４９ないし７１の配列を含む核酸又はその相補対を含むか及び／又は前記核酸若しくはその相補対とハイブリッド形成する核酸を提供する。これらの領域は、保存の高いレベルを有するものとして同定され、候補プライマー及びプローブの由来する標的核酸バリアントにおける領域である。

別の実施形態において、本発明は、配列番号７２ないし９４（図６）の何れか１つの共通配列の保存されたヌクレオチド又はその相補対を含むか及び／又は前記ヌクレオチド若しくはその相補対とハイブリッド形成する核酸を提供する。一実施形態において、本発明のこれらの核酸は、本発明の標的核酸又はその相補対とハイブリッド形成できる。

他の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明の配列の何れかを含むベクター（例えば、プラスミド、ファージ、発現）、細胞系（例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、細菌）及びキットも提供する。本発明は、例えば本発明の方法を使用して同定される標的核酸バリアント配列も提供する。一実施形態において、標的核酸バリアント配列は、増幅産物である。別の実施形態において、標的核酸バリアント配列は、天然核酸又は合成核酸である。プライマー、プローブ、及び標的核酸バリアント配列、ベクター、細胞系、及びキットは、診断、研究、確証、モニタリング、予測又は予後等の使用の全ての数を有し得る。

多様なヒト診断キットは、本明細書に記載される方法および核酸を使用して作製されることが可能である。これらのキットは、患者によって表される特定の症状又は症状のクラスターに関する原因についての情報を、臨床医又は医師へ提供する。ヒト診断キットの具体的な例には、頭痛／発熱／髄膜症（髄膜炎）キット、咳／発熱／胸部不快／呼吸困難（肺炎）キット、黄疸（肝不全）キット、再発性感染（免疫不全）キット、関節痛キット及びその他の多くのものが含まれる。

ヒト検出キットは、患者の免疫化若しくは免疫能の状態又は身体中の疾病の存在（例えば、まだ症状を示していない疾病）等の患者の病状の最新の状態、又は輸血若しくは提供臓器等の医学的産物の状態についての情報を提供する。

動物診断及びスクリーニングキットによって、具体的な症状に関する動物の臨床的呈示に基づいた数多くの先天性及び後天性疾病に関する包括的な、対費用効果の高い、及び迅速な診断が可能となる。さらに、異なる病原体又は病原体産物（例えば、毒素）への動物の曝露は、改良された育種（例えば、産仔数、及び食肉／乳の生産）へ連結された具体的な遺伝子及び／又は疾病と同様に評価されることが可能である。一実施形態において、これらのキットは種特異的である。例には、研究用マウスキット、ヒツジキット、研究用ラットキット、イヌキット、サルキット、競走馬キット、ウシキット、ニワトリキット、ブタキット、子ヒツジキット、魚キットが含まれる。

農業用キットによって、具体的な症状に関する患者の臨床的呈示に基づいた数多くの先天性及び後天性疾病に関する包括的な、対費用効果の高い、及び迅速な診断が可能となる。さらに、異なる病原体への植物の曝露は、改良された植物の成長（例えば、植物の大きさ、トウモロコシ／コメの生産量等）へ連結された具体的な遺伝子及び／又は疾病と同様に評価される。一実施形態において、これらのキットは種特異的である。例には、トウモロコシキット、ワタキット、タバコキット、及びコメキットが含まれる。

本発明は、次のようなさらなるより具体的なキットを対象とする。すなわち、食物経由の病原体（例えば、ウイルス及び微生物）及び抗生物質耐性キット；輸入製品の検査−農産物及び家畜キット；化粧品の検査（例えば、狂牛病）のキット；バイオテロキット（例えば、天然痘、炭疽、ペスト、ボツリヌス中毒、野兎病、及び危険な化学薬品）；及び（例えば、インフルエンザの公知の全ての系をスクリーニングする）インフルエンザ調査キットである。

一実施形態において、本発明のプローブは、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、ビオチン、金、デンドリマー、アプタマー、酵素、タンパク質及び分子モーター等の標識を含む。一実施形態において、プローブは、例えばＴａｑＭａｎプローブ等の加水分解プローブである。他の実施形態において、本発明のプローブは、分子ビーコン、ＳＹＢＲグリーンプライマー又は蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブである。

一実施形態において、本発明の核酸は、例えば、マイクロアレイ、複数ウェルプレート、カラム、ビーズ、ガラススライド、ポリマーメンブレン、ガラスミクロファイバー、プラスチックチューブ、セルロース及び炭素ナノ構造等の固体支持体へ付着される。

別の実施形態において、本発明は、標的核酸バリアントを増幅するためのプライマー対を提供する。一実施形態において、プライマー対は、順方向（例えば、第一）プライマー及び逆方向（例えば、第二）プライマーを含む。例えば、順方向プライマーは、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、７３、７６、８０、８２、８５、８８、９１及び９３の配列の少なくとも１つ又はその相補対と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列によって規定される。逆方向プライマーは、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、７４、７７、７９、８３、８６、８９、９２、９５、９８及び１０１の配列の少なくとも１つ又はその相補対と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列によって規定される。一実施形態において、プライマー対は、少なくともＮ個の異なる標的核酸バリアントを増幅し、その中で、Ｎは、特定の標的核酸配列に関する公知のバリアントの少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を含む。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７及び１００の配列の少なくとも１つ又はその相補対を含む核酸とハイブリッド形成し、逆方向プライマーは、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８及び１０１の配列の少なくとも１つ又はその相補対を含む核酸とハイブリッド形成する。一実施形態において、プライマーは、ストリンジェンシーの低いハイブリッド形成条件下で、核酸とハイブリッド形成する。別の実施形態において、プライマーは、ストリンジェンシーの高いハイブリッド形成条件下で、核酸とハイブリッド形成する。一実施形態において、プライマー対は、少なくともＮ個の異なる標的核酸バリアントを増幅し、その中で、Ｎは、特定の標的核酸配列に関する公知のバリアントの少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を含む。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＣＡＡＧＡを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号４９の配列又はその相補対を含むＩＮＦＡ−ＭＰ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＡＴＡＧＡを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５１の配列又はその相補対を含むＩＮＦＢ−ＮＳ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＡＡＡＣＡを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５２の配列又はその相補対を含むＲＳＶＡ−Ｇ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＴＣＡＴＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５４の配列又はその相補対を含むＲＳＶＢ−Ｇ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＡＴＣＴＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５６の配列又はその相補対を含むＲＳＶＡ−Ｎ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＡＧＧＡＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５７の配列又はその相補対を含むＲＳＶＢ−Ｎ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＡＣＴＣＡを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５９の配列又はその相補対を含むＰＩＶ１−ＨＮ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＴＴＣＴＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６１の配列又はその相補対を含むＰＩＶ２−ＨＮ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＣＴＡＴＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６４の配列又はその相補対を含むＰＩＶ３−ＨＮ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＡＧＡＴＧを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６７の配列又はその相補対を含むＡＤＶＢ−Ｈ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＣＴＣＧＧを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６９の配列又はその相補対を含むＡＤＶＣ−Ｈ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、順方向プライマーは、配列ＧＡＡＣＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号７１の配列又はその相補対を含むＡＤＶＥ−Ｈ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＧＧＡＣＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５０の配列又はその相補対を含むＩＮＦＡ−ＭＰ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＧＴＡＡを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５１の配列又はその相補対を含むＩＮＦＢ−ＮＳ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＣＴＧＣＡを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５３の配列又はその相補対を含むＲＳＶＡ−Ｇ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＴＡＧＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５５の配列又はその相補対を含むＲＳＶＢ−Ｇ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＡＡＡＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５６の配列又はその相補対を含むＲＳＶＡ−Ｎ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＧＧＡＧＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号５８の配列又はその相補対を含むＲＳＶＢ−Ｎ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＧＣＴＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６０の配列又はその相補対を含むＰＩＶ１−ＨＮ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＣＡＴＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６３の配列又はその相補対を含むＰＩＶ２−ＨＮ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＡＴＡＡＣを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６６の配列又はその相補対を含むＰＩＶ３−ＨＮ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＡＡＴＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号６８の配列又はその相補対を含むＡＤＶＢ−Ｈ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＴＴＣＡＧを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号７０の配列又はその相補対を含むＡＤＶＣ−Ｈ核酸とハイブリッド形成する。

別の実施形態において、逆方向プライマーは、配列ＧＡＴＧＴを含み、その中で、オリゴヌクレオチドは、配列番号７１の配列又はその相補対を含むＡＤＶＥ−Ｈ核酸とハイブリッド形成する。

別の態様において、本発明は、本発明のプライマー対を使用して、試料中の標的核酸バリアントの少なくとも一部を増幅することによって、複数の標的核酸バリアントを増幅するための方法を提供する。本発明は、天然標的核酸バリアント配列（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）、天然標的核酸バリアント配列のｃＤＮＡコピー、又は増幅産物の存在又は不存在を検出することによって、試料中の標的核酸バリアントの存在又は不存在を決定するための方法も提供する。一実施形態において、プライマー対及び標的天然核酸バリアントの増幅産物の検出は、試料中の天然標的バリアントの存在を示す。

試料は、例えば、血液、血清、血漿、痰、尿、糞便、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃分泌物及び涙液等の組織試料であり得る。一実施形態において、試料は、中咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、鼻内吸引物、鼻内洗浄物、又は耳、眼、口若しくは気道から回収される液体によって得られる。組織試料は、新鮮であるか、固定されているか、保存されているか、又は凍結されているかであり得る。

増幅されている標的核酸バリアントは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はその修飾産物であり得る。一実施形態において、増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応等の等温性又は非等温性反応、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマー、分子ビーコン、ＳｉｍｐｌｅＰｒｏｂｅｓ、ＨｙＢｅａｃｏｎｓ、サイクリングプローブ技術、インベーダーアッセイ、自己持続型配列複製、核酸配列ベースの増幅、分枝増幅法、ハイブリッド形成シグナル増幅法、回転サークル増幅、多置換増幅、好熱性鎖置換増幅、転写仲介性増幅、リガーゼ連鎖反応、ＲＮＡのシグナル仲介性増幅技術、開裂プロモーター増幅反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑβレプリカーゼ、等温性連鎖反応、単切断事象増幅システム、ループ仲介性等温性増幅、分子反転プローブ、Ａｍｐｌｉｐｒｏｂｅ、ヘッドループＤＮＡ増幅及び連結活性化型転写を含む。一実施形態において、増幅工程は、複数ウェルプレート、アレイ、カラム、ビーズ、ガラススライド、ポリマーメンブレン、ガラスミクロファイバー、プラスチックチューブ、セルロース及び炭素ナノ構造等の固体支持体上で実施される。一実施形態において、増幅工程は、インサイツハイブリッド形成を含む。検出工程は、ゲル電気泳動、蛍光共鳴エネルギー転移、又はビオチン、少なくとも１つの蛍光部分、抗原、分子量タグ及びプローブの修飾因子Ｔｍで標識されたプローブ等の、標識されたプローブとのハイブリッド形成を含み得る。一実施形態において、検出工程は、蛍光、質量、電荷及び／又は化学発光を測定することを含む。

別の態様において、本発明は、細胞中で標的核酸バリアントの発現を調節できる化合物を同定するための方法を提供する。方法は、（ｉ）標的核酸バリアント遺伝子に与える検出可能な制御影響を検査化合物が発揮できる条件下で、細胞を前記化合物とともにインキュベートし、これにより標的核酸バリアント遺伝子発現を変化させること；及び（ｉｉ）標的核酸バリアント遺伝子発現における変化を検出することを含む。

別の実施形態において、本発明は、異常な標的核酸バリアント遺伝子のＤＮＡレベル、異常な標的核酸バリアント遺伝子のＲＮＡレベル、又は異常な標的核酸バリアント遺伝子の活性と関連した障害の存在、又は前記障害の発達の素因を診断するための方法を提供する。本発明は、疾病又は障害に関する標的核酸バリアント遺伝子発現特性を確立するための方法、及びこのような発現特性を使用して疾病又は障害を診断及び治療するための方法も提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、（例えば、食物、環境、飲料又は獣医学的原因の）生物を同定するための方法、予後を決定するための方法、薬物療法を監視するための方法、病原性、薬剤抵抗性、又はバイオテロの脅威の存在を定量化又は定性化するための方法を提供する。

さらに別の実施形態によると、標的の多数のバリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドを同定するための、コンピュータにより実行されるシステムには、標的を指定するためのユーザーインターフェイスがある。システムにはさらに、標的の複数の培アントに関する核酸配列の多重整列化を読み取るためのソフトウェア、及び多重整列化に少なくとも一部基づいた候補配列を発生させるためのソフトウェアが含まれる。システムにはさらに、候補配列の一部と相補的な複数のオリゴヌクレオチドの配列を算出するためのソフトウェア、及び個々のオリゴヌクレオチドが標的の各バリアントと整列化する程度に応じて、算出された各オリゴヌクレオチドへ性質測定基準を割り当てるためのソフトウェアが含まれる。

さらなる実施形態によると、標的核酸バリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドセットを同定するための、コンピュータにより実行されるシステムが提供される。システムには、標的を指定するためのユーザーインターフェイス及び複数のデータを保存するためのデータ収集が含まれる。データ収集には、複数の公知の標的に関する核酸配列、核酸配列又はその相補対に相当するオリゴヌクレオチドセット、並びに整列化データ、人口動態データ、特許データ及び商業データの少なくとも１つを含むさらなるデータが含まれる。システムにはさらに、特定の標的核酸を検出するための候補であるデータ収集における全てのオリゴヌクレオチドセットを同定するためのソフトウェア、及びデータ収集において保存されたさらなるデータの何れかに応じて同定された各オリゴヌクレオチドセットに関して少なくとも１つの性質測定基準を算出するためのソフトウェアがある。

別の実施形態によると、標的核酸バリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドセットを同定するための、コンピュータにより実行されるシステムが提供される。システムには、標的を指定するためのユーザーインターフェイス、及び複数の公知の標的に対応するオリゴヌクレオチドセットを含む複数のデータを保存するためのデータ収集が含まれる。システムにはさらに、指定された標的を検出するための候補であるデータ収集における全てのオリゴヌクレオチドセットを同定するためのソフトウェア、及び同定された各オリゴヌクレオチドセットをスコア化するための複数の性質測定基準が含まれる。各性質測定基準は、デフォルト加重が割り当てられ、各性質測定基準の加重は、ユーザーインターフェイスを介して調整可能である。

別の実施形態によると、データ収集には、標的の複数のバリアントに関する核酸配列が含まれる。データ収集にはさらに、標的の複数のバリアントに関する核酸配列の多重整列化が含まれる。

さらなる実施形態によると、データを保存するためのデータベースには、公知の標的に相当するオリゴヌクレオチドまたはその相補対が含まれる。データベースにはさらに、公知の標的の少なくとも１つを検出するための各オリゴヌクレオチドの適合性を示すための少なくとも１つのスコアが含まれる。

さらなる実施形態によると、標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドセットを同定するための、コンピュータにより実行されるシステムが提供される。システムには、標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドを選択するためのソフトウェア、及びデータを保存するためのデータベースが含まれる。データベースには、複数の公知の標的に相当するオリゴヌクレオチドセット又はその相補対を示すデータ、及び各標的に関して、個々の標的を検出するためのオリゴヌクレオチドを選択するための決定に関するデータが含まれる。ソフトウェアには、具体的な標的のためのオリゴヌクレオチドを選択するための決定に関するデータベースデータへ書き込むための符号が含まれる。

（発明の詳細）
別段の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同一の意味を有する。簡便さのため、明細書、実施例及び上述の特許請求の範囲において採用される特定の用語及び語句の意味は、本発明の実施において読み手を助けるために以下に提供される。

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」という用語は、２つの核酸分子間の配列関係性を指し、比較の目的にために整列化される場合、各配列中のヌクレオチド位置を比較することによって決定されることが可能である。「相同性」という用語は、２つの核酸又はタンパク質配列の進化上の関連性を指す。「同一性」という用語は、２つの配列間で核酸が同一であるという程度を指す。比較された配列中のヌクレオチドの位置が、同一の塩基によって占有される場合、分子は前記位置で同一である。「類似性」という用語は、核酸が同一であるという程度を指すが、本分野で周知のように、コドンのアミノ酸同一性を変化させずに、コドン内で置換されることが可能である天然の縮重ヌクレオチドを含む。「非類似の」、「非同一の」又は「非相同的な」配列は、約４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは本発明の標的配列の１つと約２５％未満の同一性を共有する。あるいは、百分率同一性、相同性又は類似性は、特定の長さの配列中のヌクレオチドの差異の数によって決定される。例えば、２０個のヌクレオチドの差異を有する１００ヌクレオチドの配列は、８０％同一であると定義され、その中で、差異は、異なるヌクレオチド又はヌクレオチドの欠失を意味する。

「実質的な配列同一性」という語句は、視覚的検査又は整列化によって決定される少なくとも約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％及び約１００％のヌクレオチドの同一性を有する２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。２つの核酸配列は、それらの全長（例えば、それらが実質的に異なる長さである場合、２つの配列のより短いほうの長さ）又は配列の一部にわたって比較されることが可能である。実質的な配列同一性は、２つの核酸が、互いにハイブリッド形成するときにも存在し、典型的に、各核酸由来の少なくとも約６個の連続したヌクレオチドのアニーリングを必要とする。

「Ｔｍ」という用語は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖へと解離する温度を意味する。核酸のＴｍを算出するための方法は、本分野で周知である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｋ，（２ｎｄ ｅｄ．）Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）。標準的な参考文献によって示されるように、Ｔｍ値の単純な概算は、核酸が１Ｍ ＮａＣｌで水溶液中にある場合、等式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５））。他の参考文献には、Ｔｍの算出に関して構造及び配列の特徴を考慮に入れるより洗練された算出が含まれる。混成体のＴｍは、溶液中に存在しようと固定されていようと、核酸及び標的の長さ及び性質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、塩及び他の化合物（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、及びポリエチレングリコール）の濃度等の多様な因子によって影響される。これらの因子の効果は周知であり、本分野における標準的な参考文献において論議されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上述）及びＡｕｓｕｂｅｌ（上述）を参照されたい。

典型的には、ハイブリッド形成条件は、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ約７．０ないし約８．３での約０．０１Ｍないし約１．０Ｍのナトリウムイオンの塩濃度、及び短いプローブ（例えば、約６ないし約５０のヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０を超えるヌクレオチド）に関しては少なくとも約６０℃の温度である。ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃での約２．０ないし約６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）後の約５０℃での約２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に公知であるか又は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），ｓｅｃｔｉｏｎｓ ６．３．１−６．３．６に見出されることが可能である。洗浄工程における塩濃度は、約６．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから約０．１×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択されることが可能である。さらに、洗浄工程における温度は、室温（すなわち約２２℃）での低ストリンジェンシー条件ないし約６５℃での高ストリンジェンシー条件で実施されることが可能である。ホルムアミドは、ハイブリッド形成工程及び洗浄工程へ添加され、１％ホルムアミドが添加されるのにつき１℃だけ温度の必要条件を低下させることが可能であり、「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」という語句は一般的に、標的配列の融解温度（Ｔｍ）を下回る約５℃から約２０℃又は２５℃までの範囲にある条件を指す。

「実質的に純粋な」又は「単離された」という語句は、核酸に関して参照される場合、一般的に会合している夾雑物質、例えば脂質、タンパク質及び他の核酸から分離された核酸を一般的に指す。本発明の実質的に純粋な又は単離された核酸は、約５０％を超える純度にある。典型的には、これらの核酸は、約６０％超の純度、より典型的には約７５％から約９０％までの純度、及び好ましくは約９５％から約９８％までの純度にある。

プライマー又はプローブを設計するための方法
本発明の方法は、手作業で実施され得るが、ＰｒｉＭＤ（商標）ソフトウェアとして本明細書に参照されるソフトウェアプログラムによっても実施され得る。方法がどのように実施され得るかに関する詳細は、以下に記載される。

保存された領域の同定
生物、感染病原体、変異又は多形性等の具体的な標的を最良に保存されるか又は代表する遺伝子又はゲノム領域が選択される。この保存された領域は、例えば５０ないし３００ヌクレオチド領域内で１５ないし４０の連続したヌクレオチドの２つ又は３つの一続きのみを有する。より頻繁に配列決定された遺伝子又はゲノムは、遺伝的変動性をより良好に示し得る。科学文献中に十分な情報がない場合、整列化は、付与された標的中の各遺伝子に関して実施されることが可能である。ヌクレオチド位置に対する保存のプロットは、候補領域を良好に示す。一実施形態において、この工程は、何れかの専用データベース（例えば、インフルエンザ配列データベース又はリボソームデータベースプロジェクト）を使用して手作業で実施される。別の実施形態において、前記工程は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列を採用し、ＢＬＡＳＴ分析又はその等価物を実行して関連した全ての配列を同定することによって実施される。別の実施形態において、標的と関連した公共的に利用可能な全ての配列がデータベース中に配置されるか又は、データベース中へと入力され、最適な配列を選択するためのパラメータを提供するよう利用可能な非常に適切な情報で各々注釈を付けられる。このようなデータベースは、標的とともに存在し得る起こり得る全ての配列も含有する。例えば、標的がＡ型インフルエンザウイルスである場合、データベースは、気道中に存在することが公知の（他のウイルス、細菌、正常宿主細菌叢及び動物相等の）他の生物に対する候補のＡ型インフルエンザプライマー又はプローブ、及び交差ハイブリッド形成配列が排除されることが可能であるよう関連性のある宿主遺伝マーカーをスクリーニングする。

整列化
一実施形態において、１つの配列は、参照配列として作用し、それと検査（例えば、他のバリアント）配列が比較され、整列化される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査配列及び参照配列をコンピュータへ入力し、サブシーケンス座標を指定し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する検査配列に関する百分率配列同一性を算出する。

比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のための検索によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行によって、又は視覚的検査（一般的にはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９年を通じて補完された。）参照）によって実施されることが可能である。これらの参考文献及びアルゴリズムの各々は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる。上述のアルゴリズムの全てを使用する場合、ウインドウ長、間隙罰則等に関するデフォルトパラメータが一般的に使用される。

一実施形態において、保存された遺伝子又は領域に関連する配列を、例えばＦａｓｔＡファイル等の保存ファイル中に取り込み、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ等の整列化プログラム中に取り込み、多重配列整列化を実行する。ファイルは、例えばＧｅｎＤｏｃプログラムを使用して、末端にある外来性ヌクレオチド及び明確に整列化していない配列を除去するよう編集され得る。配列が除去される場合、多重配列整列化が反復される。配列の限定された数を有する標的に関し、より徹底的な整列化（例えば、進化のスコア化、エントロピーのスコア化、一貫性のスコア化又は「訪問販売員」のスコア化を使用する一対の大きさの分析）を提供する代替的なプログラムがある。しかしながら、一度配列の数が大きい場合（例えば、１００超）又は配列自体が大きい場合（例えば、５０００超の塩基）、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムに対する代替プログラムは非常に少ない。

共通配列
次に、プライマー及び／又はプローブを選択するため標的配列として、共通配列を選択する。両鎖を典型的に分析し、全ての複製物を除去する。ＰＣＲ罰則式を使用して、一対の最適なプライマー及び次の測定結果、すなわち（１）Ｔｍ−プライマーの至適Ｔｍ；（２）プライマーＴｍ間の差異；（３）単位複製配列長；及び（４）プライマーとＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブとの差異の加重された合計等の、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲに関する内部プローブを同定し得る。

利用可能なプライマー又はプローブ結合部位ごとに関して標的配列をチェックし、候補のプライマー及びプローブを割り当て、特定のパラメータ、例えば、プライマー融解温度（Ｔｍ）−約５８℃ないし約６０℃の範囲であり、最適には約５９℃だが、各対は、約１℃を超えるほどには異なってはならない。；プライマー組成−約３０％ないし約８０％ＧＣ；プライマー長−約９塩基ないし約４０塩基；プライマー二次構造；及び単位複製配列長（２５０塩基までの何れかの長さ）；及びＴｍ−約０℃ないし約８５℃；４つ以上の同一のヌクレオチドの一続きを有するプライマー、特にＧが排斥される。；並びにプライマーの３’末端での最後の５個のヌクレオチド中のＧ及びＣの総数が２を超過するべきではないことに基づいたスコアが割り当てられる。プローブは、プライマーよりも約１０℃高い融解温度を有する。Ｇが切断後でさえリポーターの蛍光を消光することが可能であるため、５’末端でＧを有するプローブは排斥される。プローブ中にはＧよりも多くのＣもあるべきである。これらのパラメータは、プライマー及びプローブの得られる全てのセットによって、ＰＣＲが効率的になることが可能になるよう指定される。プライマー及びプローブの良好なセットが、順位を同定する能力に基づいて同定されていない場合、パラメータは緩和される（例えば、単位複製配列の大きさが増し、プライマーＴｍの差異が増すなど。）。

「排除／包含」機能
データベース中の全ての配列を、Ｐｒｉｍｅｒ３の排除／包含機能に割り当てることが可能である。例えば、標的に関する結果配列を生じるのに使用される配列は、包含ファイルの一部を形成する。標的に関する共通配列が一度選択されると、コンセンサスを生じるために使用されなかったデータベース中の配列は、排除ファイルの一部となることが可能である。データベース中の配列は、起こり得る標的だけでなく、実験試料中に存在すると期待され得る生物由来の配列及び偽陽性の結果を生じ得る密接に関連した生物由来の配列も表す。各セットが同定されるように標的がプライマー及びプローブの複数のセットを必要とする場合、その後のプライマー及びプローブのセットに関する排除ファイルの一部となる（多重化という表題の節参照）。言い換えれば、本発明の方法及びソフトウェアによって選択されるあらゆるプライマー又はプローブは、ＢＬＡＳＴ処理されているか、又はミスプライミング若しくは偽陽性の結果を排除するために、排除ファイルに対してスクリーニングされている。この機能性が実施されることが可能である場合、選択過程には異なる段階がある。例えば、可能なあらゆるプライマー及びプローブをスクリーニングするよりもむしろ、排除機能は、例えばプライマー及びプローブの最良の１０００セットに対して実行され得る。

スコアの割り当て
選択されたプライマー及びプローブの各セットは、個々のプライマー及びプローブ並びにプライマー／プローブセットのような方法の組み合わせによって順位決定される。これは、プライマー及びプローブのセットが次の基準、すなわち、（Ａ）標的バリアントに対する百分率同一性；（Ｂ）保存スコア；（Ｃ）適用範囲スコア；（Ｄ）系／サブタイプ／血清型スコア；（Ｅ）関連疾病スコア；（Ｆ）複製物配列スコア；（Ｇ）年及び生産国のスコア；（Ｈ）特許スコア、及び（Ｉ）疫学スコアの何れかの組み合わせに基づいて排除又は包含され、加重された順位決定が、次の基準の何れかの組み合わせに再度基づいている順位決定（例えば、併合順位決定、階層性順位決定及び連続的順位決定）の１つ又はそれ以上の方法を包含する。

Ａ．百分率同一性
百分率同一性スコアは、プライマー対及びプローブセットの各プライマー又はプローブと完全な保存で（配列は完全に相補的である。）ハイブリッド形成することが可能である標的核酸バリアント（例えば、天然の）配列の数に基づいている。スコアが１００％未満である場合、プログラムは、完全には保存されていないさらなるプライマー対及びプローブセットを順位決定する。これは、完全な相補性から始まり、次いで、１塩基縮重から１００％に最も近いスコアを与える縮重塩基の数に至る百分率同一性の階層的尺度である。次に、これらの縮重塩基の位置が順位決定される。保存を算出するための方法は、セクションＢのもとに記載されている。

（ｉ）個々の塩基保存スコア
保存スコアのセットは、共通配列中の各ヌクレオチド塩基に関して生じ、これらのスコアは、どれだけ多くの標的核酸バリアント配列が、この位置で具体的な塩基を有するかを表す。例えば、アデノシンを有するヌクレオチドに関する０．９５のスコア、及びシチジンを有するヌクレオチドに関する０．０５は、もとの配列の９５％が、その位置でＡを有し、５％が、その位置でＣを有することを意味する。完全に保存された塩基の位置は、全ての標的核酸バリアント配列が、その位置で同一の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕの何れか）を有する箇所である。１つの位置に塩基の等しい数がある場合（例えば、５０％Ａ及び５０％Ｔ）、それは、Ｎとみなされる。

（ｉｉ）候補プライマー／プローブ配列の保存
標的核酸バリアント配列のどれくらい多くがプライマー又はプローブとハイブリッド形成するかを表す各候補プライマー又はプローブ配列に関して、全体的な保存スコアを生じる。プログラムは、相補的標的核酸バリアント配列とハイブリッド形成する場合、完全に相補的な配列が、不適正な配列よりも優れていると想定する。全ての標的核酸バリアント配列と完全に相補的な候補配列は、１．０のスコアを有し、最高位に並ぶ。

例えば、以下に示されるのは、共通標的核酸バリアント配列の異なる領域へ標的化された３つの異なる１０塩基の候補プローブ配列である。各候補プローブ配列を合計１０個の天然配列と比較する。

完全に相補的な標的核酸バリアント配列の数は７である。１０個の配列のうちの３つは、位置１でＡを有しない。

完全に相補的な標的核酸バリアント配列の数は７、８又は９である。少なくとも１つの標的核酸バリアントは、位置２でＣを、位置４でＴを、又は位置５でＧを有しない。これらの差異は、１つの標的核酸バリアント分子上に全てあり得るか、又は２つ若しくは３つの個々の分子上にあり得る。

完全に相補的である標的核酸バリアント配列の数は−７又は８である。少なくとも１つの標的核酸バリアントは、位置６でＡを有さず、少なくとも２つの標的核酸バリアントは、位置７でＣを有しない。これらの差異は、１つの標的核酸バリアント分子上に全てあり得るか、又は２つの個々の分子上にあり得る。

各候補配列に関する単純な相加平均は、０．９８５の同一値を生じる。しかしながら、各候補プローブ配列によって同定された標的核酸バリアント配列の数は、非常に異なり得る。配列第１番は、第一塩基Ａによる（１．０のうちの）０．７のスコアのため、７個の天然配列を同定することのみが可能である。配列第２番は、０．９のスコアを各々有する３つの塩基を有し；これらの各々は、異なる又は共有された標的核酸バリアント配列を表し得る。その結果、配列第２番は、７、８又は９個の標的核酸バリアント配列を同定することが可能である。同様に、配列第３番は、７、８又は９個の標的核酸バリアント配列を同定することが可能である。それゆえ、配列第２番は、０．９のスコアを有する３つの塩基全てが、同一の９個の標的核酸バリアント配列を表した場合、最良の選択である。

（ｉｉｉ）プライマー及びプローブセットの全体的な保存スコア−百分率同一性
完全なプライマー対及びプローブセットへ適用される場合、（ｉｉ）に記載されている同一の方法は、前記セットに関する百分率同一性を生じる（上述のＡ参照）。例えば、上述に示される同一配列を使用して、配列第１番及び第２番がプライマーであり、配列第３番がプローブである場合、標的に関する百分率同一性は、標的核酸バリアント配列のどれだけ多くが３つのプライマー／プローブ配列全てによって完全な相補性で同定されるかから算出可能である。百分率同一性は、０．７（１０個の標的核酸バリアント配列のうちの７個）以下であり得るが、各縮重塩基が、異なる標的核酸バリアント配列を反映する場合、０．１と小さい。さらに、これらの３つの配列の相加平均は、０．９８５である。上述の例の何れもが、縮重（１．０未満のスコア）のために標的核酸バリアント配列を全て捕捉できないため、順位決定システムは、縮重の特定の量が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応中の正常なハイブリッド形成条件下で許容されることが可能であることを考慮に入れる。これらの縮重の順位決定は、以下の（ｉｖ）に記載されている。

インシリコの評価は、どれだけ多くの天然配列（例えば、公共のデータベースへ供されたもとの配列）が、付与された候補プライマー／プローブセットによって同定されるかを決定する。理想の候補プライマー／プローブセットは、ＰＣＲを実行することが可能であり、及び配列が、共通配列を生じるのに使用された公知の天然配列全てに完全に相補的であるものである。このような候補がない場合、セットは、どれだけ多くの縮重塩基が許容されることが可能であり、ＰＣＲ中に標的配列のみとなおもハイブリッド形成することが可能であり、さらに、天然配列全てを同定することが可能であるかに従って順位決定される。

別の例において、さらなるプローブは、第一プローブによって認識されない天然配列全てとハイブリッド形成するＰｒｉＭＤによって設計されることが可能である。同一のプライマー対は、全てのプローブに関して使用されることが可能である。複数のプローブは、多重化反応として機能するよう設計される。

別の例において、プライマー及びプローブのさらなるセットは、プライマー及びプローブの第一セットによって認識されない天然配列全てとハイブリッド形成するＰｒｉＭＤによって設計されることが可能である。セットは、多重化反応として機能するよう設計される。

一例として、ＴａｑＭａｎのためのハイブリッド形成条件は、１０ないし５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ないし０．２％トリトン（登録商標）Ｘ−１００又は０．１％トゥイーン（登録商標）、１ないし５ｍＭ ＭｇＣｌ_２である。ハイブリッド形成は、プライマーに関して５８ないし６０℃で、プローブに関して６８ないし７０℃で実施される。インシリコのＰＣＲは、候補プライマー及びプローブセットを使用して増幅できない天然配列を同定する。規則は、ＰｒｉＭＤ（商標）ソフトウェアによって使用されるＰＣＲ基準を利用することに基づいたより洗練されたアプローチに対して、縮重塩基の数を計数すること同じくらい単純であり得る。各標的核酸バリアント配列は、値又は加重を有する（上述のスコアの割り当て参照）。失敗した標的核酸バリアント配列が、医学的に価値のある場合、プライマー／プローブセットは排斥される。このインシリコ分析は、付与された遺伝子型に関する信頼性の程度を提供し、新たな配列がデータベースへ付加される場合重要である。新たな標的核酸バリアントア配列は、「包含」及び「排除」の両カテゴリーへと自動的に入る。例えば、新たなＡ型インフルエンザ配列は、包含カテゴリーにおいて本発明のＡ型インフルエンザウイルスプライマー／プローブセットに対して検査されるが、インフルエンザウイルスなど、他のプライマー／プローブセットに対して検査される場合、排除カテゴリーへ付加される。公表されたプライマー及びプローブも、ＰｒｉＭＤソフトウェアによって順位決定される。

（ｉｖ）塩基保存スコアの位置（５’ないし３’）
一実施形態において、プライマーは、１未満のスコアを有する３’末端での５つの末端位置にある何れの塩基も有するべきではない。これは、方法が、全ての候補配列を選択し損ねる場合、弛緩されるべき最後のパラメータのうちの１つである。完全に保存されたプライマーを有する次の最良の候補は、あまり保存されていない位置が、５’末端にある末端塩基に限定される場合のものである。あまり保存されていない位置が、５’末端に対して近ければ近いほど、スコアはより最良になる。プローブに関して、位置基準は異なる。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブによって、最も不安定な効果が、プローブの中心で生じる。標的とのハイブリッド形成の後、配列特異的シグナルを生じるためにポリメラーゼによって切断されなければならないリポーター分子を含有するため、プローブの５’末端も重要である。３’末端は、あまり重要ではない。それゆえ、完全に保存された中間領域を有する配列は、より高いスコアを有する。プローブの残りの末端は、プライマーの５’末端に対して同様の形式で順位決定される。従って、完全に保存されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに対する次の最良の候補は、あまり保存されていない位置が、５’末端又は３’末端の何れかにある末端塩基に限定される場合のものである。階層性スコア化は、まず１つの縮重のみを有するプライマーを選択した後、次に２つの縮重を有するプライマーを選択するなどである。次に、各縮重の相対的な位置は、プライマーの５’末端に最も近いもの及びＴａｑＭａｎプローブの３’末端に最も近いものを好むよう順位決定される。プライマー及びプローブのセットに２つ以上の縮重塩基がある場合、順位決定は、縮重が異なる配列において生じるセットを初期的に選択する。

Ｂ．適用範囲スコア
整列化された配列の総数が、適用範囲スコアの下で考えられる。値は、位置が何回報告又は配列決定されたかに基づいて各位置へ割り当てられる。あるいは、適用範囲は、配列が公知の系、サブタイプ等、又は特定の疾病に対するそれらの関連性をどれだけ代表するかとして定義されることが可能である。例えば、具体的な遺伝子に関する標的核酸バリアント配列は、非常によく保存され得、完全な適用範囲を示すが、特定の系は前記配列において表されていない。

配列は、共通配列の何れかの一部と整列する場合、又はこの遺伝子を代表するものとして記載されている場合、包含される。塩基の位置が、完全に保存されていても、（例えば、非常にわずかな配列がある場合、）配列の総数の一画分を表すのみであり得る。例えば、遺伝子の領域Ａが、２０の配列エントリー由来の１００％の保存を示すのに対し、同一遺伝子中の領域Ｂは、９８％の保存を示すが、２００の配列エントリー由来である。配列がある持続的な変動性を示す場合、保存と適用範囲との間に関係性がある。より多くの配列が整列化されると、保存スコアは低下するが、この効果は、配列数がより大きくなるにつれ、より小さくなる。配列数が非常に小さい場合（例えば、１０未満）を除き、適用範囲スコアの値は、保存スコアの値と比較して小さい。最良の共通配列を得るため、人工的な空間が導入可能である。このような空間は、適用範囲スコアにおいて考慮されない。

Ｄ．系／サブタイプ／血清型スコア
値は、疾病に対する関連性に基づいて各系又はサブタイプ又は血清型に割り当てられる。例えば、大流行に関連付けられたＩＮＦ−Ａの系は、一般的に良性と見なされるか又は最新のワクチン中に含まれる系よりも高いスコアを有する。スコアは、具体的な系を疾病と自動的に関連付ける十分な証拠に基づいている。例えば、アデノウイルスの特定の系は、上気道系の疾病と関連付けられていない。従って、上気道系の疾病と関連付けられていない共通配列中に含まれる配列がある。

Ｅ．関連付けられた疾病のスコア
関連付けられた疾病のスコアは、（上述のＤと区別するために）具体的な疾病と関連することが公知ではない系に関する。ここで、提出された配列が疾病と直接関係し、前記疾病がアッセイと関係がある場合にのみ、値が割り当てられる。

Ｆ．複製配列スコア
具体的な配列が２回以上配列決定された場合、代表物、例えば、６個が同一であり他の６個が固有であるＧｅｎｂａｎｋにおける１２のエントリーによって表される系に及ぼす効果を有する。同一の配列が、（通常、他の遺伝子を配列決定することによって又は免疫学の方法によって）異なる系／サブタイプへ割り当てられることが可能でない限り、同一の配列は、スコア化から排除される。

Ｇ．年及び生産国のスコア
年及び生産国のスコアは、ヒトの集団の年齢及び地球規模市場に生産物を提供する必要性の点において重要である。例えば、何年も前に同定又は回収された系は、現在と関係がないかもしれない。さらに、これらのより古い系を含有する試料を得ることは、おそらく困難である。さらに、幾つかの系は、現在の集団のほとんどが免疫性を有しない場合（例えば、特定のＡ型インフルエンザ系）、流行病を作る可能性を有し得る。より不明瞭な国又は源由来の特定の多岐にわたる系も、臨床検査を実施しそうな地域とあまり関連性があり得ず、又は特定の国（例えば、北米、欧州又はアジア）にとってより重要であり得る。

Ｈ．特許スコア
特許中に公表された候補標的バリアント配列は、電子検索されるか、又は特許化された領域が排除されるように注釈付けされる。あるいは、候補配列は、特許化された配列のデータベースに対してチェックされる。

Ｉ．最小定性化スコア
最小定性化スコアは、起こり得る全ての天然配列が呈される（すなわち、定性化ヒットを有する）まで、候補プライマー及びプローブの各セットにおいて許容される不適正塩基対の数を拡張することによって決定される。

Ｊ．その他
スコアは、特定の患者（例えば、小児患者、免疫無防備患者）又は特定の治療法（例えば、治療に反応する系を標的化）又は疫学との関連性等の他のパラメータに基づいて付与される。生物／系の有病率及び地域社会で検査された回数は、値を候補配列の選択へ付加することが可能である。具体的な系が、より普遍的に検査される場合、前記系の選択はより有望である。系の同定は、より良好なワクチンを選択するために使用されることが可能である。

プライマー／プローブの評価
一度候補プライマー及びプローブが、それらのスコアを受け、順位決定されると、ＢＬＡＳＴ分析及び二次構造分析等の、本発明の方法の多くの何れかを使用して評価される。

Ａ．ＢＬＡＳＴ分析
候補プライマー／プローブセットをＢＬＡＳＴ分析へ供し、包含／排除機能によって見逃され得る公表された全ての配列との起こり得る重複に関してチェックする。これもまた有用な要約を提供する。

Ｂ．二次構造
本発明の方法及びソフトウェアは、核酸二次構造の分析も組み込むことが可能である。これには、プライマー及び／又はプローブの構造、及びそれらの意図される標的バリアント配列が含まれる。本発明の方法及びソフトウェアは、アニーリングのための最適温度を予測するが、標的（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）が何れの有意な二次構造も有しないことを想定する。例えば、出発材料がＲＮＡである場合、第一段階は、特異的プライマーを使用するＤＮＡの相補鎖（ｃＤＮＡ）の生成である。これは、ＲＮＡテンプレートが、有意な二次構造を有し、これによりプライマーのアニーリングを防止することが可能である温度で通常実施される。同様に、二本鎖ＤＮＡ標的（例えば、ＰＣＲ後の単位複製配列）の変性後、プローブの結合は、単位複製配列中に主要な二次構造がないことに依存する。

本発明の方法及びソフトウェアは、プライマー及びプローブを選択するための基準としてこの情報を使用するか又は、例えば候補プライマー又はプローブ配列を切断して、ＭＦＯＬＤ等の二次構造の分析専用のソフトウェアを使用する市販のインターネットリンクへと貼り付けることによって、選択された配列の何れかの二次構造を評価するかのいずれかが可能である（Ｚｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｉｎ ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｂ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ，ｅｄｓ．，ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。

Ｃ．プライマー及びプローブの配列評価
本発明の方法及びソフトウェアはまた、全ての核酸配列を分析して、核酸増幅ベースのアッセイにおけるその適合性を決定し得る。例えば、競合者のプライマーセットを受容して、次の情報を決定することが可能である。（１）本発明のプライマーとどのように比較するか（例えば、全体的な順位、ＰＣＲ及び保存順位決定等）；（２）排除ライブラリとどのように整列化するか（例えば、交差ハイブリッド形成の評価）−プライマー及びプローブのセットを新たに公表された配列と比較するためにも使用される；及び（３）配列が既に刊行されているかどうか、である。この工程は、科学雑誌、ポスター及び他の呈示物中に刊行される配列のデータベースを保持することを必要とする。

多重化
排除／包含能は、多重化反応を設計するのに理想的に適している。複数のプライマー及びプローブセットを設計するためのパラメータは、初期の排除／包含機能に使用されるものよりもより厳密なパラメータセットを厳守する。プライマー及びプローブの各セットは、得られた単位複製配列とともに、多重化反応を構成する他のセットに対してスクリーニングされる。新たな標的が受容されるため、それらの配列は排除カテゴリーへ自動的に付加される。

データベースは、オンラインデータベースに問い合わせて、必要であれば、標的と関連する全ての新たな配列を決定及び獲得するよう設計される。これらの配列は、最適なプライマー／プローブセットに対して評価される。前記配列が新たな遺伝子型又は系を表す場合、複数の配列整列化が必要とされ得る。

本発明のソフトウェアシステム
本明細書及び具体的には特許請求の範囲において使用されるように、「ソフトウェア」という語は、コンパイルされていようとなかろうと、コンピュータ又は他の計算システムにおいて機能を実行する全てのコンピュータ読み取り可能符号として広範に規定される。従って、「ソフトウェア」には、コードの単一系又は単一の符号化された表現が含まれ得る。前記ソフトウェアには、より大きなモジュール又はセクション、異なるモジュール又はセクション間で分配される符号、及びより大きなソフトウェアシステム及びアプリケーションも含まれ得る。

ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアとして本明細書で参照される本発明のソフトウェアによって、ユーザーは、上述のプライマー及びプローブのセットの選択を自動化できる。例えば、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアは、プライマー、プローブ、プライマーセット及びプライマー／プローブセットを設計して、感染性生物又は他の疾病関連遺伝子の系を表す遺伝子の群を同定することが可能である。ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアは、何百ものプライマー及び／又はプローブセットの組み合わせを作成及び評価する効率的な高処理量の自動化システムである。標的バリアント配列の整列化及び排除する配列のセットを考えると、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアは、標的バリアントを同定するプライマー及び／又はプローブセットの順位決定されたリストを生じる。プライマー及び／又はプローブのセットは、上述のような基準の組み合わせによって順位決定され、それには、百分率同一性、ＰＣＲ罰則、保存、及び適用範囲のスコアが含まれる。プライマーを設計することに加え、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアは、ソフトウェアを実行する各インスタンスのキーデータを保存するデータベースへ連結される。ＰｒｉＭＤＴＭデータベースによってユーザーは、各プライマー及び／又はプローブセットを作製することに入るデータ及び決定を保存することができる。ＰｒｉＭＤＴＭデータベースは、有用な質問を尋ね、例えば各プライマー及び／又はプローブのセットが、公共の配列データベース中に現れる新たな配列とどれだけ最新に関連しているかを決定するよう問い合わせを実行され得る。

ＰｒｉＭＤ（商標）データベース
本発明のデータベースは、標的バリアントア配列と関連する全ての配列を含む。これには、各標的に関して派生した共通配列、各標的に関して記載されている全ての配列、全ての宿主配列、及び標的と関連すると期待され得る全ての配列が含まれる。各配列は、系統発生（例えば、系、サブタイプ及び遺伝子型）、生産国、源（すなわち、感染性材料の種類）、疾病の関係、年、これらの配列と連結される全ての特許、及び情報又は複製配列を欠失する場合の注釈に関する情報を有する。

ソフトウェア構成要素
図１は、本発明の実例となる実施形態に従ったソフトウェアシステムの概略を示す。図１に示されるように、ソフトウェアシステムには、データベース１１０（ＰｒｉＭＤＴＭデータベース）等のデータ収集がある。データベース１１０は、データベースから読み取られ、及びデータベース１１０へ書き込む両者の能力を有するソフトウェアアプリケーション１２０と通信して提供される。ソフトウェアアプリケーション１２０はさらに、データを受信するための入力データソース１１２及び１１４と、及び出力データ位置１１６及び１１８と通信して提供される。

一実施形態において、ソフトウェアアプリケーション１２０は、Ｌｉｎｕｘオペレーションシステムを実行するコンピュータにインストールされる。ソフトウェアシステム１２０は、２つのユーザーインターフェイス、すなわち第一ユーザーインターフェイス１３０及び第二ユーザーインターフェイス１３２を介してユーザーに対して利用可能とされる。第一ユーザーインターフェイス１３０は、Ｌｉｎｕｘコマンド回線インターフェイスである。このインターフェイスは、ユーザーによって手動で入力されたコマンドを受信し、ユーザーのコンピュータスクリーンへデータを出力する。このインターフェイスのユーザーは、一般的に、コンピュータに対してローカルであるが、また、リモートコントロールプログラム又は末端エミュレーションプログラムを介するなどして、コンピュータへ遠隔にアクセスし得る。第二インターフェイス１３２は、ウェブインターフェイスである。このインターフェイスは、ＨＴＴＰを介してユーザーへのアクセスを提供する。ウェブインターフェイスには、ユーザーのウェブブラウザが含まれ、インターネットを通じてアクセスされ得る。

データベース１１０は、好ましくは、Ｏｒａｃｌｅ、ＭｙＳＱＬ又はＳＱＬサーバーデータベース等のリレーショナルデータベースである。しかしながら、これは必要とされない。あるいは、スプレッドシート、スプレッドシートの収集、ＸＭＬファイル、ＸＭＬファイルの収集等のデータ収集の全ての形態が使用されることが可能である。一実施形態において、データベース１１０は、ディレクトリ構造中に保存されるテキストファイルの収集として実装される。

入力データ源１１２は好ましくは、多重整列化ファイルである。ファイルのこの種類の適切な例は、Ｃｌｕｓｔａｌコンピュータプログラムによって作製されるＦａｓｔＡファイルである。他のファイルフォーマット及び／又はコンピュータプログラム外で使用され得る。さらに、多重整列化データは、ファイルの形態に提供される必要がない。例えば、データは、（データベース１１０を含む）データベースの１つ又はそれ以上のフィールド中に保存されるか又は手動でユーザーによって入力されることも可能である。

入力データ源１１４は、設定ファイルである。このファイルは好ましくは、異なるオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドセットをスコア化及び／又は順位決定することと関連付けられた全ての性質測定基準のリスト、各性質測定基準に関する理想値、及び各性質測定基準へ適用されるべき加重因子を含有する。好ましくは、ファイルは、加重因子に関するデフォルト値を提供する。ユーザーは、第一及び／又は第二ユーザーインターフェイス上での調節を介して、それらのデフォルトからこれらの値を変動することが可能である。一実施形態において、データ源１１４は、データベース１１０の一部として提供され、個別のファイルは必要とされない。

出力データ１１６及び１１８は、好ましくはファイル中に保存される。出力データ１１６は、ユーザーの検討する順位決定されたオリゴヌクレオチドセットを列挙する。出力データ１１８は、要約形態でソフトウェアの実行の結果を提供する。これらのデータは、ユーザーインターフェイス１３０又は１３２を介してアクセスされ得、ユーザーのコンピュータスクリーン上に表示され得る。ローカルユーザーも、Ｌｉｎｕｘファイルシステムを介して、これらのファイルへ直接アクセスすることが可能である。

ソフトウェアアプリケーション１２０には好ましくは、多様な構成要素が含まれる。これらは、３つのカテゴリー、すなわち、中心アプリケーション１２２、（その改変を含む）第三パーティソフトウェア１２４、ＨＴＴＰ通信を管理するためのＧＵＩ（グラフィカルユーザーインターフェイス）ソフトウェア１２６において広範に分類されることが可能である。

中心アプリケーション１２２は、オリゴヌクレオチドの設計及び評価と関連した数多くの機能を実行する。一実施形態において、中心アプリケーション１２２は、対象指向型Ｐｅｒｌ中に書き込まれたクラスの収集である。この収集には、次の構成要素が含まれ得る：
・他のクラスを呼び出す主要ドライバクラス
・有効な一重化（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）オリゴヌクレオチドセットを生じるクラス
・オリゴヌクレオチドセットの多重化した組み合わせを生じるクラス
・第三パーティオリゴヌクレオチドセットを評価するためのクラス
・データベース１１０と通信するためのクラス
・オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドセットを排除するためのクラス
・インシリコのＰＣＲを評価するためのクラス
・Ｐｒｉｍｅｒ３の改変されたバージョンと通信するためのクラス
・複数の方法でオリゴヌクレオチドセット及びオリゴヌクレオチドセットの多重化の組み合わせを順位決定するためのクラス
・各増幅／検出技術（例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）のためのクラス

さらに、第三パーティソフトウェア１２４には、次の構成要素が含まれ得る：
・Ｐｒｉｍｅｒ３の改変されたバージョン
・ＢｉｏＰｅｒｌ
・Ｃｌｕｓｔａｌ／ＧｅｎｅＤｏｃ
・Ｂｌａｓｔ
・二次構造のためのソフトウェア
・アパッチウェブサーバー

さらに、ＧＵＩソフトウェア１２６には、次の構成要素が含まれ得る：
・主要ＣＧＩプログラム
・主要Ｊａｖａベースサーブレット
データベース１１０からの情報を呈示するための符号
・ユーザー入力を受領するための符号
・グラフ化のための符号
・リポート発生のための符号
・Ｐｅｒｌ呈示クラス
・Ｊａｖａ呈示クラス

図１のソフトウェアシステムの構成要素は全て、単一のコンピュータ上に常駐し得る。しかしながら、ソフトウェアシステムは、この配置に限定されるものではない。

図２は、図１のソフトウェアシステムを実装するための他の多様な配置を示す。一配置において、データベース１１０は、データベースサーバー２２４にインストールされ、ソフトウェアアプリケーション１２０は、ウェブサーバー２１６にインストールされる。コンピュータ２１０ａないし２１０ｃ等のコンピュータは、ウェブブラウザを使用してイントラネット２２２を介してソフトウェアアプリケーション１２０へアクセスする。イントラネットの外側にあるコンピュータも、システムへアクセスする。例えば、コンピュータ２４０ａ及び２４０ｂは、インターネット２２２を介してウェブサーバー２１６へアクセスすることが可能である。

別の配置において、データベースサーバー２２４及びウェブサーバー２１６は、単一サーバー中へ組み込まれる。データベースを含む全体のアプリケーションは従って、単一コンピュータから供給されることが可能である。

ソフトウェアシステムの構成要素は、数多くの方法で分配及びアクセスされ得る。図２に示されるものは、単に説明のために提供されており、本発明の範囲を制限するよう企図されるものではない。

図３ないし５は、図１のソフトウェアシステムが、好ましくは実施することが可能である多様なプロセスを示す。これらのプロセスは、例として提供されるものであり、ソフトウェアシステムの能力に関する包括的なリストとして企図されるものではない。

図３は、具体的な増幅及び／又は検出技術のための順位決定されたオリゴヌクレオチドを生じるためのプロセスを示す。工程３１０で、ソフトウェアは集積し、ユーザー入力を処理する。入力には、プライマー及び／プローブが同定されるべき標的核酸配列の異なるバリアントの多重整列化を提供する多重整列化データ１１０が含まれる。入力には場合により、排除データ等の他のデータ、例えば、オリゴヌクレオチドが整列すべきではない配列、並びに市場データ、患者層、（系等の）各標的配列についての情報、地理的考慮及び重要性が含まれ得る。

工程３１２において、ソフトウェアは、多重整列化データを分析する。この工程には、多重整列化データから代表的な配列を生じることが含まれる。「代表的な配列」は、上述の共通配列と同様である。代表的な配列は、代表的な配列が公知ではないもの（Ｘのもの）を含有する共通配列とは異なる。各塩基位置が、１つの値、すなわちＡ、Ｔ、Ｃ又はＧの１つを割り当てる。いずれかの塩基位置に割り当てられた値は、多重整列化データにおいて前記塩基位置に関して最も頻繁に生じる値である。

工程３１４において、ソフトウェアは、望ましい増幅及び／又は検出技術に関して有効な全てのここのオリゴヌクレオチドを決定する。この工程には好ましくは、増幅及び／検出技術の必要条件を付与された代表的な配列と有効にハイブリッド形成し得る起こり得る各オリゴヌクレオチド（例えば、各順方向プライマー、各逆方向プライマー及び各プローブ）を算出することが含まれる。代表的な配列と相補的であり、選択されるプロセスのオリゴヌクレオチドに関する化学的及び情報上の必要条件を満たす全ての鎖が、好ましくは同定される。さらに、ソフトウェアは、この時点で排除ファイルにおいて同定される全ての配列を除去する。

工程３１６で、ソフトウェアは、工程３１４において同定されたオリゴヌクレオチドのセットを構築する。各セットは、望ましい増幅及び／又は検出技術の必要条件と一致した様式で全体として互いに機能するよう組み立てられる。例えば、ＴａｑＭａｎのために組み立てられたセットには、ＴａｑＭａｎ順方向プライマーとして適した１つのオリゴヌクレオチド、ＴａｑＭａｎ逆方向プライマーとして適した１つのオリゴヌクレオチド、及びＴａｑＭａｎプローブとして適した１つのヌクレオチドが含まれなければならない。ソフトウェアは好ましくは、セット中の何れかのオリゴヌクレオチドがセット中の何れかの他のオリゴヌクレオチドと交差ハイブリッド形成するかどうかなど、セットに関するさらなる化学的因子及び情報因子を考慮する。

工程３１８で、ソフトウェアは、有効な全てのオリゴヌクレオチドセットに関して少なくとも１つの性質測定基準を算出する。好ましくは、ソフトウェアは、上述の「スコアの割り当て」のもとにある「基準」として同定される設定データ１１４によって規定される性質測定基準の各々に関して、各オリゴヌクレオチドセット及び工程３１６によって生じる各セットに含まれる各個々のオリゴヌクレオチドをスコア化する。

工程３２０で、ソフトウェアは、工程３１４で同定されたオリゴヌクレオチドを公知の配列のライブラリと比較する。この工程の目的は、同定されたいずれかのオリゴヌクレオチドが、望ましい標的又はそのバリアント以外の標的とハイブリッド形成しそうであるかどうかを決定することである。この工程は従って、診断用キットに含まれる場合、同定されたオリゴヌクレオチドの何れかが、誤った正の結果を生じ得るかどうかについての重要な情報を付与する。ソフトウェアは好ましくは、誤った正の結果を生じる見込みに基づいて、各オリゴヌクレオチドスコアを割り当てる。

本工程の別の目的は、同定されたオリゴヌクレオチドの何れかが特許化されるかどうかを確認することである。オリゴヌクレオチドに関する特許は、使用するための障害を表し得る。ソフトウェアは好ましくは、１つ又はそれ以上の特許によって保護されているかどうかに依存する特許スコアを各オリゴヌクレオチドへ割り当てる。この工程を完了するため、ソフトウェアは好ましくは、同定された各オリゴヌクレオチドと個々のライブラリ中に保存される全ての配列との間の相同性の程度を自動的に決定し、特許情報を得るために、ＢＬＡＳＴ等のプログラムを実行する。ＧｅｎＢａｎｋ、Ｄｅｒｗｅｎｔ及びデータベース１１０（ＰｒｉＭＤＴＭデータベース）を含む多様なライブラリが使用されることが可能である。

工程３２２で、ソフトウェアは、オリゴヌクレオチドセットが性質測定基準に関して受信したスコアに基づいて、工程３１６で決定されたオリゴヌクレオチドセットを順位決定する。併合順位決定、階層性順位決定、連続的順位決定及び実際の測定基準スコアと理想スコアとの間の相違を測定する順位決定等の順位決定の多様な種類が実行されることが可能である。これらは、以下により詳細に記載される。ソフトウェアは好ましくは、（単一測定基準を含む）性質測定基準のサブセットに基づいて、又は性質測定基準の全てに基づいて、オリゴヌクレオチドセットを順位決定するためにユーザー設定が可能である。

順位決定の目的は、オリゴヌクレオチドセットが、標的のバリアントのほとんど又は全てを最良に検出する点において、診断用アッセイに最も適したオリゴヌクレオチドセットの収集をユーザーへ提示することである。順位決定は、望ましいヌクレオチドセットの特徴又は基準に基づいている。これらの特徴は、１つの特徴を最大化することがその他の特徴を最大化し得ない点で、時には互いに競合し得る。順位決定の目標は、各オリゴヌクレオチドセットが、望ましい全ての特徴を最大化するか又はこれらの特徴間の矛盾を最良に平衡化する程度を同定した後、従って、セットを選別することである。順位決定の別の目標は、各オリゴヌクレオチドセットの適合性について関連性のある全てのデータを決定し、これによりユーザーが、起こり得る競合特徴間の矛盾を理解できることである。ソフトウェアシステムによって生じる多様な順位決定に基づいて、ユーザーは、ユーザーの優先度に従って、望ましい特徴の最適な平衡を表す単一の最良のオリゴヌクレオチドセット（又はセットの収集）を選択し得る。前記目的に向け、ユーザーは、デフォルト設定を無効にする（例えば、加重の形態にある）多様な特徴の重要性に関する代わりとなる程度を特定することが可能である。

工程３２４で、ソフトウェアは、実行結果をユーザーへ報告する。これらの結果には、図１と関連して記載されている順位決定されたオリゴヌクレオチド１１６及び結果の要約１１８が含まれる。

工程３２６で、ソフトウェアは、データベース１１０中でその実行から派生した多様な情報を保存する。この保存された情報の例には以下が含まれる：
・工程３１０で集積された多重整列化データ
・共通配列
・代表的な配列
・最良に順位決定されたオリゴヌクレオチドセットのリスト
・各性質測定基準に使用される加重
・保存、適用範囲及び他の整列化関連規準を含む、性質測定規準の各々に関する各オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドセットに関するスコア
・排除される全てのオリゴヌクレオチド
・ソフトウェアが実行される日付

データベース１１０中にこのデータを保存する目的は、ソフトウェアの各実行を取り囲む環境の記録を提供することである。この記録は、特定のオリゴヌクレオチドセットを選択する背景にある論理的根拠を検討するための時間通過として参考にされ得る。また、前記記録は、オリゴヌクレオチドセットのより最新の組み合わせを生じるために、ユーザーがソフトウェアを再実行したいと願い得る程度まで、もとのソフトウェアの実行を取り囲む環境が変化したかどうかを決定するためにも役立ち得る。

工程３２８で、ユーザーは、例えば最も適したオリゴヌクレオチドセットを決定するために結果を相互作用的に調査するソフトウェアシステムによって生じるデータを検索する選択肢を有する。

処理工程３１０ないし３２８は、図３に示される精確な順序に準拠する必要はない。例えば、派生したオリゴヌクレオチドを公知の配列のライブラリと比較する工程３２０は、全ての有効な個々のオリゴヌクレオチドを決定する工程３１４の後及びオリゴヌクレオチド工程を順位決定する工程３２２の前の全ての地点で実施され得る。同様に、排除ファイル中で説明される全てのオリゴヌクレオチドセットをフィルター処理する作用は、上述のように、工程３１４で実施される必要はないが、工程３２２の前の全ての地点で実施され得る。性質測定基準を算出する工程３１８は、単一工程において一度に全て実施される必要はないが、むしろ情報が利用可能になるまで算出され得る。従って、保存及び適用範囲等の、整列化に関する性質測定基準は、工程３１２（縫う力整列化の分析）と同じくらい初期に計算されることが可能である。同様に、個々のオリゴヌクレオチドと関連した測定基準は、工程３１４の後の全ての地点で計算されることが可能である。同様の傾向に沿って、結果がデータベース中に保存される（工程３２６）前に出力を報告する（工程３２４）必要はない。結果は、それらが保存された後にちょうど都合よく報告され得る。それゆえ、図３で説明された工程の順序が限定しているのではなく、プロセスが、本発明に従ってどのように実施され得るかという単なる一例に過ぎないことは理解されるべきである。

図４は、ユーザーの指定したオリゴヌクレオチドセットを評価して、具体的な増幅及び／又は検出技術を介して、標的配列及びそのバリアントを検出するための前記セットの適合性を決定するためのプロセスを示す。本プロセスは、好ましくは、図３に関連して記載されるプロセスと同様であるが、例外は、この場合、ユーザーが具体的なオリゴヌクレオチドセットを供給し、前記セットをスコア化するようソフトウェアを方向付けることである。

プロセスは、ソフトウェアが、ユーザー入力を集積及び加工することで始まり（工程４１０）、入力の整列化を分析する（工程４１２）。これらの工程は好ましくは、上述の工程３１０及び３１２と同様である。

工程４１４で、ソフトウェアは、望ましい増幅及び／又は検出技術に関して、ユーザーにより指定されたオリゴヌクレオチドが有効であるかどうかを決定する。この工程には、個々のオリゴヌクレオチドが、望ましいプロセスの必要条件と合致するかどうかを決定することが含まれる。実質的に同一の方法が、上述の工程３１４に関連して説明されたように、個々のオリゴヌクレオチドの有効性を決定するための工程４１４において使用される。この工程には、全体としてのオリゴヌクレオチドセットが、望ましいプロセスの必要条件と合致するかどうかを決定することも含まれる。実質的に同一の方法が、上述の工程３１６に関連して説明されたように、オリゴヌクレオチドセットの有効性を決定するために使用される。

工程４１６で、ソフトウェアは、指定されたオリゴヌクレオチドセットに関する性質測定基準を算出する。この工程は好ましくは、上述の工程３１８と同様であるが、例外は、性質測定基準が、有効な全てのセットに関してよりもむしろユーザー指定のオリゴヌクレオチドセットに関して算出される必要があるのみである。

工程４１８で、ソフトウェアは、指定されたオリゴヌクレオチドセットを公知の配列のライブラリと比較する。この工程は好ましくは、上述の工程３２０と同様であるが、例外は、ソフトウェアが、ユーザー指定のオリゴヌクレオチドセットを、派生した全てのオリゴヌクレオチドセットよりもむしろライブラリと比較することのみを要することである。

工程４２０で、ソフトウェアは、ユーザーにより選択されたオリゴヌクレオチドセットの全体的な性質を表す要約スコアを算出する。要約スコアは、個々の性質測定基準、例えば、異なる加重又は、上述のような、スコアを生じるために使用される異なるアルゴリズム又は式に関するスコアを組み合わせる異なる方法を表す。

図４の工程４２２、４２４及び４２６は好ましくは、図３の工程３２４、３２６及び３２８と同様である。

図３のように、図４に示される工程の順序は、説明のために提供されるものであり、本発明を制限するよう企図されるものではない。図４における工程の順序は、図３に関連して論議されるものと同様の方法で変動することが可能である。

図５は、多重化反応を介して異なる標的及びそのバリアントのセットを検出するためのオリゴヌクレオチドセットの組み合わせを発生及び順位決定するためのプロセスを示す。

工程５１０で、ソフトウェアは、一重化反応に関するものと同様に、図１に示されるプロセスを使用して、各標的（及びそのバリアント）に関する個々のオリゴヌクレオチドセットを発生及び順位決定する。工程５１０の完了時に、順位決定されたオリゴヌクレオチドセットの異なる群を各標的（及びそのバリアント）に関して作製する。

工程５１２で、ソフトウェアは、工程５１０から提供される群からのオリゴヌクレオチドセットの起こり得る全ての組み合わせを決定する。全ての標的が表されることを確実にするため、各組み合わせには、各標的に関して提供される群からの１つのオリゴヌクレオチドセットが含まれる。

工程５１４で、ソフトウェアは、工程５１２から作製されるオリゴヌクレオチドセットの各組み合わせに関して性質測定基準を計算する。この工程は、上述の工程３１８と同様であるが、例外は、工程５１４も、異なる標的に関するオリゴヌクレオチド間の相互作用の程度に関連する１つ又はそれ以上の性質測定基準を計算することである。これらには好ましくは、交差ハイブリッド形成の見込み、並びに各組み合わせが、望ましい増幅及び／又は検出技術とともに全体として以下に十分作用するかと関連する他の化学的及び情報上の因子が含まれる。

工程５１６で、ソフトウェアは、性質測定基準に基づいたオリゴヌクレオチドセットの組み合わせを順位決定する。この工程は、上述の図３に関連して記載される順位決定工程３２２と同様である。

出力を報告すること、データベース中に結果を保存すること及びデータを検索することに関連する工程５１８なしい５２２は、上述の工程３２４ないし３２８と好ましくは同様である。

さらなるソフトウェア内容
ワークフローアプリケーションは、重要な地点でデータベースから読み取り又はデータベースへ書き込む連続した一連の工程を呼び出す。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー及びプローブを発生させる場合、ソフトウェアはまず、起こり得るあらゆるプライマー及び起こり得るあらゆるプローブを発見する。次に、ソフトウェアは、「前記プライマー及び前記プローブを互いに配置し」、最良のプライマー対／プローブセットを作製する。しかしながら、この最良のセットを作製する各プライマー及びプローブは、最良の個々の順方向配列、逆方向配列又はプローブ配列である必要は必ずしもないかもしれず、すなわち、プライマー及びプローブセットは、付与された標的に関してできる限り多くの異なる系、サブタイプ等を認識（ハイブリッド形成）しないかもしれない。例えば、ソフトウェアは、データベース中のあらゆる公知のＩＮＦ−Ａ配列を認識するプライマー及びプローブの１セットを同定するよう試行する（これらの配列は、包含ファイルとしてデータベース中にある。）が、その他のウイルス、細菌等を認識しない（これらの配列は、データベース中にあるが、排除ファイルとしてタグ付けされる。）。認識される天然配列の数に基づいたプライマー及びプローブのセットをスコア化することは、保存及び適用範囲の両者を反映するが、より関連性のある正確な様式でそれを表す。

例えば、本発明の核酸プローブ及びプライマーは、競合因子プローブ及びプライマーよりも多くの標的核酸バリアントとハイブリッド形成する。例えば、マトリクスタンパク質遺伝子に対して設計されたＡ型インフルエンザプライマー及びプローブセット（ＩＮＦＡ−ＭＰセット）は、Ｇｅｎｂａｎｋ内で同定されている０．５４８４（６０９個のうちの３３４個）のマトリクスタンパク質核酸配列バリアントと完全な相補性でハイブリッド形成する。このＩＮＦＡ−ＭＰセットは、同一ではないさらなるマトリクスタンパク質配列バリアントともハイブリッド形成する。

順方向プライマー：５’−ＣＴＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１）
プローブ：５’−ＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴ−３’（配列番号２）
逆方向プライマー：５’−ＧＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣ−３’（配列番号３）

比較により、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎに対する米国特許第６，０１５，６６４号に記載されているＡ型インフルエンザマトリクスタンパク質遺伝子プライマー及びプローブ（配列番号３０、３２及び３４）は、たったの０．４３５１（Ｇｅｎｂａｎｋ内で同定された６０９個のマトリクスタンパク質配列のうちの２６５個）に対し完全な相補性でハイブリッド形成する。

プライマー番号３０−ＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＣＧＴＡ（配列番号９５）
プライマー番号３４−ＣＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣ（配列番号９６）
プローブ番号３２−ＧＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＡ（配列番号９７）

天然標的バリアントを全て認識する単一のプライマー／プローブセットを同定することは必ずしも可能ではない。それゆえ、（ａ）ＰＣＲを実施する配列の能力又は（ｂ）天然配列のみを認識するための配列の特異性を損なわずに、１００％に近く認識するプライマー及びプローブを同定するパラメータが選択される。特異性に関する順位決定は、（ｉ）どれだけ多くの縮重塩基が許容されるか；（ｉｉ）それが生じるのはどこか、及び（ｉｉｉ）プライマー／プローブセットによって同定されているか又は同定されていない天然配列の順位決定を考慮に入れる。図６は、ｘで標識されているプライマー及びプローブ中の縮重塩基を示す。「縮重」という語は、２つ以上の塩基が、天然配列中で生じることが公知である塩基位置を意味する。「天然配列を順位決定する」という語句は、各天然配列に関する注釈（例えば、系の種類、国、年等）を加重することを意味する。

順位決定は、何れの縮重塩基もない最も天然の配列を認識したプライマー／プローブセットを選択することによって始まる。プライマー／プローブセットは、（ｉ）縮重塩基の最小数（１を超える場合、縮重塩基は、同一のプライマー又はプローブで生じない。）；（ｉｉ）縮重塩基の位置（例えば、プライマーの３’末端の最後の５塩基ではない、プローブの中間の３番目にはない。）に従って順位決定される。ほかのどこかでは、それらの位置に従って加重され、例えば、最もあまり重要ではないのは、プライマーの５’末端に最も近い縮重塩基であり、次に、プローブの３’末端に最も近いものであり；次は、プローブの５’末端に最も近いものであり、及び（ｉｉｉ）天然配列の医学的重要性は、重要な候補プライマー及びプローブセットによって同定されていないことである。

これらのパラメータが全て、天然配列を認識する同一の能力を有する２つ以上のプライマー／プローブセットを生じる場合、前記パラメータは、それらのＰＣＲペナルティースコアに基づいて順位決定される。上述のＰＣＲパラメータは、（Ａ）前記パラメータが、何れのプライマー／プローブセットも生じない場合又は（Ｂ）プライマー／プローブセットが、天然配列の十分量を認識する場合、弛緩されるのみである（例えば、より長い単位複製配列）。それが失敗する場合、２つのプライマー／プローブセット又はさらなるプライマー又はプローブは、組み合わされたセットが、天然配列を全て認識する同一標的で使用されることが可能である。

配列の選択及び分類
具体的な標的の関連配列を回収及び分類し、どの配列が下流プライマーデザインのための候補であるべきかを決定する。

整列化及びスコア化
工程１の標的／天然配列を整列化し、共通配列を発生させ、この配列中の各塩基の位置を百分率同一性、保存及び適用範囲に従ってスコア化し、共通配列のどの領域がプライマーによって標的化されるべきかを決定した。一実施形態において、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して、配列の整列化を手動で実施し、配列を整列化し、ＧｅｎｅＤｏｃプログラムを使用して、関心対象の領域又は最大の適用範囲の領域に対して整列化された配列を得た。次に、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアを整列化ファイルとともに提供し、前記ソフトウェアが候補プライマー及びプローブを選択する。次に、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアは、候補プライマー又はプローブの各塩基に関して同一性、保存及び適用範囲のスコアを決定する。次に、この情報を使用して、配列のセットを順位決定する。ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアは、プライマーを選択するためにＰｒｉｍｅｒ３と同一のアルゴリズムを使用する。Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｒ．Ｄ．Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｒ．Ｗａｔｓｏｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ．１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０によって既に記載されている基準を使用して、ＴａｑＭａｎプローブを選択する。プライマー及びプローブセットをＰＣＲペナルティースコアに従って順位決定する。このＰＣＲ罰則は、同様に、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアの全体的な順位決定システムの一構成要素である。

プライマー及びプローブデザイン
ＰｒｉＭＤＴＭのこの構成要素は、起こり得るプライマー及びプローブセットの全ての可能性を評価し、有効な全てのプライマーセットを包括的に出力する。（１）排除配列のセットではなく標的整列化配列を検出する能力；及び（２）具体的なＤＮＡ増幅技術、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲに対する高次構造を含む多くの基準に従って、プライマーセットを順位決定する。他の技術には、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマー、分子ビーコン、ＳｉｍｐｌｅＰｒｏｂｅｓ、ＨｙＢｅａｃｏｎｓ、サイクリングプローブ技術、インベーダーアッセイ、自己持続型配列複製、核酸配列ベースの増幅、分枝増幅法、ハイブリッド形成シグナル増幅法、回転サークル増幅、多置換増幅、好熱性鎖置換増幅、転写仲介性増幅、リガーゼ連鎖反応、ＲＮＡのシグナル仲介性増幅技術、開裂プロモーター増幅反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑβレプリカーゼ、等温性連鎖反応、単切断事象増幅システム、ループ仲介性等温性増幅、分子反転プローブ、Ａｍｐｌｉｐｒｏｂｅ、ヘッドループＤＮＡ増幅、連結活性化型転写を使用することが含まれる。

プライマー及びプローブセットの順位決定
有効なプライマー及びプローブセットを上述の基準に従って順位決定する。ＰｒｉＭＤは、具体的な順位決定のための１つ又はそれ以上の測定基準を採用し得る。ＰｒｉＭＤは、幾つかの方法を使用して、次のものを含む測定基準を組み合わせる。
１．併合順位決定−各オリゴヌクレオチドに関する測定基準の併合収集のために、単一の値を計算する。
２．階層性順位決定−１つの測定基準に従ってオリゴヌクレオチドセットを選別し、次に、同一の順位決定を有するオリゴヌクレオチドセットの各収集を別の測定基準に従ってさらに順位決定する。階層性順位決定の幾つもの層が使用され得る。
３．連続的順位決定−全てのオリゴヌクレオチドセットを単一測定基準に従って選別し、次に、最良のものが第一の順位決定を保存する様式で、得られた順位決定を別の順位決定に従って選別する。多重順位決定は、連続して使用され得る。

一順位決定スキームにおいて、ＰｒｉＭＤは、順位決定アルゴリズムの種類又は具体的な順位決定に関する測定基準に関わらず、単一の方法で各順位決定を算出する。具体的な順位決定に関し、各オリゴセットは、前記順位決定に採用される性質測定基準のベクトルとして表される。各順位決定は、各性質測定基準のための最良値を表す理想ベクトルも割り当てられる。ベクトルの各構成要素は、デフォルト加重を割り当てられる。ユーザーは、代替的な加重を提供することによってこれらのデフォルトを無効にする。次に、ＰｒｉＭＤは、ベクトルデータを標準化し得る。次に、ＰｒｉＭＤは、各オリゴヌクレオチドセットのベクトルと理想ベクトルとの相違点の程度を測定する数値を算出する。最後に、ＰｒｉＭＤは、この相違点の程度に従ってオリゴヌクレオチドセットを選別する。この相違点の程度を決定するための一方法は、以下に示されるユークリッド距離関数を使用することである。

式中、式中、ｘ_１は、性質測定基準１を表し、ｘ_２は、性質測定基準２を表すなどであり、ｗ_１は、測定基準１に関する加重を表し、ｗ_２は、測定基準２に関する加重を表すなどであり、及びｐ_１は、測定基準１の理想値を表し、ｐ_２は、測定基準２の理想値を表すなどである。

ＰｒｉＭＤ（商標）データベース
ＰｒｉＭＤＴＭデータベースは、ＰｒｉＭＤＴＭシステムの構成要素であり、前記システムにはＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアもある。前記データベースは、ＰｒｉＭＤＴＭソフトウェアを実行するために使用される全ての情報及び各プライマー／プローブセットを作製する全てのデータの中央収納庫である。データベースによって、ユーザーは、それらの処理をログすることができ、それらの蓄積しているデータに問い合わせを行うことができる。例えば、データベースによって、ユーザーは、より新しい配列と比較して、各オリゴヌクレオチドセットがどれだけ最新であるかを決定することができる。データベースには、（１）上述のさらなる情報を含む（Ｇｅｎｂａｎｋ、インフルエンザ配列データベース等からダウンロードされる）配列；（２）（例えばＣｌｕｓｔａｌによって実行される）整列化；（３）市販のデータ（例えば、競合因子のプライマー及びプローブ、並びにそれらに関する本発明者の分析）；（４）特許；（５）各ＰｒｉＭＤＴＭ生成実行に関するデータ及び結果；及び（６）各最終生成物に関する決定及びデータが含まれる。

プライマー及びプローブ
本発明は、本明細書で開示される核酸又はその相補対と実質的な配列同一性を有する核酸プライマー、プローブ、プライマーセット及びプライマー／プローブセットも提供する。従って、本発明は、配列番号１ないし９４の何れか１つの核酸配列に対する１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を有するヌクレオチド配列を提供する。１−９４． 本発明の核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ又はキメラ）は、一本鎖、二本鎖又は混合されたハイブリッドであり得る。

本発明は、核酸を含む発現ベクター、細胞系及び生物も提供する。ベクター、細胞又は生物の幾つかは、コードされた核酸を発現できる。本開示の誘導を使用して、本発明の核酸は、組換え手段によって生成されることが可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。あるいは、核酸又は断片は、本分野で周知の所定の方法を使用して化学的に合成されることが可能である（例えば、Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９参照）。

本発明の幾つかの核酸は、例えば、Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８に記載されている方法を使用して調製される非天然に生じる塩基（例えば、デオキシイノシン）又は修飾された主鎖残基若しくは連結を含有する。例えば、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（商標）、ペプチド核酸、イノシン、メチル化されたヌクレオチド、チオリン酸塩ヌクレオチド、アミノアリル修飾されたヌクレオチド、Ｓｕｐｅｒ Ｇ（商標）及びＳｕｐｅｒ Ｎ（商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するヌクレオチドの使用が企図される。

本発明は、標的核酸を検出及び／又は増幅するための核酸プローブ及び／又はプライマーを提供する。核酸の幾つかは、配列番号１ないし９４の何れか１つと同一であるか又は実際に相補的である少なくとも１０個の連続した塩基を含み、通常は、少なくとも約１０個の塩基、少なくとも約１２個の塩基、少なくとも約１４個の塩基、少なくとも約１６個の塩基、少なくとも約１８個の塩基、少なくとも約２０個の塩基、少なくとも約２２個の塩基、少なくとも約２４個の塩基、少なくとも約２６個の塩基、少なくとも約２８個の塩基、少なくとも約３０個の塩基、少なくとも約３２個の塩基、少なくとも約３４個の塩基、少なくとも約３６個の塩基又は少なくとも約３８個の塩基を含む。配列番号１ないし９４の１つの配列又はその断片を有するプローブ及びプライマーの幾つかは、本発明の方法（例えば、診断方法）にいて又は診断用組成物の調製において使用される。

一実施形態において、プローブ及びプライマーは、例えばプローブ又はプライマーへ制限部位を付加することによって修飾される。別の実施形態において、本発明のプライマー又はプローブは、リンカー等のさらなる配列を含む。プライマー又はプローブ配列は、標的ＲＮＡ又はその遺伝子に相当する関連の標的核酸に対する特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限り、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、転移、転位若しくは修飾、又は他の核酸配列の変化若しくは非核酸部分も含み得る。

別の実施形態において、本発明のプライマー又はプローブは、検出可能な標識で修飾される。例えば、プライマー及びプローブは、化学的に修飾され、例えば誘導体化され、修飾されたヌクレオチド塩基を組み込み、又は抗リガンド（例えば、ビオチン）によって結合することのできるリガンドを含有する。

本発明のプライマーは、多くの目的のために、例えば検出用の生物試料中の標的核酸を増幅するために、又は多様な種から標的遺伝子をクローニングするために使用されることが可能である。本開示の誘導を使用して、プライマーは、標的核酸遺伝子の一部の増幅又は他の標的核酸バリアントの単離のために設計されることが可能である。

本発明の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾物及び類縁体）は、本明細書に開示される化学合成及び組換え方法等の、核酸を生成するための何れかの適切な方法を使用して生成されることが可能である。本発明の幾つかの核酸は、新規の化学合成又はクローニングによって調製される。例えば、標的核酸とハイブリッド形成する核酸は、ベクター（例えば、プラスミド）中のプロモーターへ作用可能に連結された逆向きにある標的ＤＮＡ配列（例えば、配列番号１ないし９４の１つ又はその断片）を挿入（連結）することによって生成されることが可能である。ただし、プロモーター及び好ましくは終結シグナル及びポリアデニル化シグナルが適切に配置される場合、非コード鎖に対応する挿入された配列の鎖は転写され、本発明のプライマー又はプローブとして作用する。

プローブ
ＴａｑＭａｎ反応は、従来のＰＣＲプライマー対及びＰＣＲ産物の内部領域に結合する配列特異的プローブからなる。プローブは、５’塩基に蛍光リポーター色素、及び３’末端に消光色素を含有する。色素は、リポーター色素の発光が、消光剤の吸光度と重複するよう選択される。消光剤は、異なる波長での蛍光の形態で又は熱の形態でエネルギーを放出することが可能である。照明されると、リポーター色素の蛍光エネルギーは、２つの色素が、蛍光がほとんどないか全く検出不可能となることに非常に近いままである限り効果的に消光される。これは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の一例である。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼの内在性５’ヌクレアーゼ活性を活用して、標的の量に比例した蛍光リポーターを遊離する。ＴａｑＭａｎプローブが結合する標的をＤＮＡポリメラーゼが複製する場合、その５’ヌクレアーゼ活性はプローブを切断し、これにより消光剤を放出し、リポーター色素が蛍光を発することができる。重合化に関するこの依存性は、標的配列が増幅される場合にのみプローブの切断が生じ、従って非特異的増幅及びプライマーのオリゴマー化を無視することを確実にする。このシグナルは、反応中のＰＣＲ産物の量に直接比例して増加し、リアルタイムで生じる。

ＦＲＥＴプローブの他の例は、標的配列に非常に近接してハイブリッド形成する一対の蛍光プローブからなる。ドナープローブは、３’末端でフルオロフォアにより、及び５’末端でアクセプタープローブにより標識される。ＰＣＲの間、２つの異なるオリゴヌクレオチドが、標的核酸の近接領域とハイブリッド形成し、これによりオリゴヌクレオチドと共役するフルオロフォアが、ハイブリッド構造において非常に近接するようになる。ドナーフルオロフォアは、外部光源によって励起された後、その冷機エネルギーの一部を近接するアクセプターフルオロフォアへ通過させる。励起されたアクセプターフルオロフォアは、異なる波長で光を発光した後、それが検出及び測定されることが可能である。

ＦＲＥＴプローブの別の種類は、ヘアピンループを使用して、蛍光を変調する。これらの分子ビーコンプローブは、一本鎖ヘアピン形状オリゴヌクレオチドプローブである。ビーコンの片端は、フルオロフォアでタグ付けされ、もう一方の端は、消光剤でタグ付けされる。相補的な標的の存在において、ビーコンの「基部」部分は、プローブがその標的とハイブリッド形成することが可能であるよう分離する。相補的な標的核酸の不存在下で、ビーコンは、閉じられたままであり、有意な蛍光は全くない。ビーコンが、相補的な標的配列の存在下で解ける場合、フルオロフォアはもはや消光されず、分子ビーコンは蛍光を発する。

Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、二機能性であり、プローブへ共有結合したプライマーからなる。分子はまた、リポーター蛍光及び消光剤フルオロフォアを使用してＦＲＥＴを活用する。標的の不存在下で、消光剤は、フルオロフォアによって発光された蛍光を吸収する。ＰＣＲ反応の間、分子は、標的とハイブリッド形成し、フルオロフォアと消光剤とを分離し、蛍光を増大させる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマーは、５’末端にプローブ要素を含有する。プローブは、片端にフルオロフォアを有し、もう片端に消光剤を有する自己相補的基部配列である。プライマー配列は、ＰＣＲ遮断剤により５’末端で修飾される。

プローブの他の種類には、単離方法及びマイクロアレイのために設計された単純捕捉プローブ；融点曲線又は終点プローブ（これらは、ＰＣＲ標的へ結合する場合に蛍光が著しく増大することを示す。）がある。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｐｅａｎ−ｐａｔｅｎｔ−ｏｆｆｉｃｅ．ｏｒｇ／ｆｉｌｌｉｎｇｓｏｆｔ／ｓｔｒａｎｄ／ｔａｂｌｅ＿ａ＿ｂ．ｈｔｍ参照）

診断アッセイ
本方法は、対象が、異常な標的遺伝子活性、例えば標的ＤＮＡ、ＲＮＡ又はたんｐ買う室の異常なレベル、異常な生物活性、又は標的遺伝支柱の変異又は具体的な多形性バリアントの存在と関連する疾病、状態又は障害を発達させる危険を有する（診断）か又は前記危険にある（予後）かどうかを決定するための手段を提供する。

全ての体液、細胞又は組織は、本発明の診断アッセイにおいて使用するための核酸を得るために使用されることが可能であり、例えば、血液、血清、血漿、痰、尿、糞便、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃分泌物及び涙等がある。組織試料は、新鮮であるか、固定されているか、保存されているか、又は凍結されているかであり得る。あるいは、核酸検査は、乾燥試料（例えば、毛髪又は皮膚）に関して実施されることが可能である。出生前診断のため、胎生期の核酸試料は、ＷＯ９１／０７６６０に記載されている母系性血液から得られることが可能である。あるいは、羊膜細胞又は絨毛膜絨毛は、胎生期検査を実施するために得られることが可能である。

診断手法は、生検又は切除から得られる患者の組織の（例えば、新鮮な、固定された又は凍結された）組織切片に関して直接、生体内原位置で実施されることも可能であり、これにより核酸精製が必要ではない。核酸試薬は、このような生体内原位置での手法のためのプローブ及び／又はプライマーとして使用されることが可能である（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｉｊｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０：１−４参照）。

本発明の特定の実施形態において、標的タンパク質の異常なｍＲＮＡレベルは、ノザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、インサイツハイブリッド形成、免疫沈降、ウェスタンブロットハイブリッド形成、又は免疫組織化学、マイクロアレイ又は上述の組み合わせ等の手段によって検出される。特定の実施形態において、細胞が対象から得られ、標的遺伝子ｍＲＮＡレベルが決定され、健常対象者中の標的遺伝子ｍＲＮＡレベルのレベルと比較される。標的遺伝子ｍＲＮＡの異常なレベルは、異常な標的遺伝子活性を示す可能性がある。

幾つかの方法において、標的遺伝子の少なくとも１つにおける遺伝子変化の存在が検出される。検出されるべき遺伝子変化には、例えば、欠失、挿入、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、標的遺伝子の全体の染色体再編成、標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物のレベルにおける変化、又は標的遺伝子ポリペプチドの不適切な翻訳後修飾が含まれる。遺伝子変化は、本分野で所定どおり実施される多様な方法で検出されることが可能であり、配列分析、サザンブロットハイブリッド形成、制限酵素部位マッピング、ＲＦＬＰ分析及びそれらの類似法、及び分析される核酸とプローブとの間のヌクレオチド対形成の不存在下の検出を包含する方法等がある。このような方法は、対象からの試料から単離されたポリヌクレオチドがまず、自己持続型配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）；転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）；又はＱ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８），ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）等の増幅手法で増幅されることが可能である。

幾つかの方法において、標的遺伝子中の変化は、例えばＪａｃｏｂｓに対する米国特許第６，９０５，８１６号及びＣｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ．７：２４４に記載されているオリゴヌクレオチドを含むチップ（「ＤＮＡプローブアレイ」）を使用する変異検出分析によって検出される。変異の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプローブ／プライマーを利用することも可能である。米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，６８３，２０２号；Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４を参照されたい。幾つかの方法において、遺伝子変化は、質量分析による配列決定等の自動配列決定手法を含む多様な配列決定スキームを使用する直接的な配列決定によって検出される（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；及びＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９参照）。

特異的な疾病又は障害は、変異されていないタンパク質を必ずしもコードしない特定の標的遺伝子の多形性領域の特異的な対立遺伝子バリアントと関連付けられることが可能である。従って、対象中の単一ヌクレオチド多形性（「ＳＮＰ」）等の、標的遺伝子の多形性領域の特異的な対立遺伝子バリアントの存在は、対象を特異的な疾病又は障害を発達させやすくすることが可能である。遺伝子、例えば標的遺伝子中の多形性領域は、個体の集団において遺伝子のヌクレオチド配列を決定することによって同定されることが可能である。多形性領域、例えばＳＮＰが同定される場合、特異的な疾病との関連は、個体、例えば特異的な疾病を発達させた個体の特異的な集団を研究することによって決定されることが可能である。

本発明はさらに、異常な標的遺伝子活性と関連した疾病又は状態のための、又はどの標的遺伝子治療薬が対象へ、例えば生物試料中の標的遺伝子ｍＲＮＡ又はタンパク質の存在を検出することによって投与されるべきであるかを決定するための診断又は予後方法における使用のためのキットを提供する。キットは、標的タンパク質、ＲＮＡ又は標的タンパク質若しくはＲＮＡの分解産物の異常なレベル又は異常な活性を検出することが可能である。キットの幾つかは、標的遺伝子ポリペプチドに対する自己抗体を検出する。

キットは、少なくとも１つの核酸プライマー又はプローブを含有することが可能である。例えば、幾つかのキットは、生物試料中の標的遺伝子ｍＲＮＡを検出できる標識された化合物又は薬剤；試料中の標的タンパク質の量を決定するための手段；及び試料中の標的タンパク質の量を標準物質と比較するための手段を含有する。化合物又は薬剤は、適切な容器中に包装されることが可能である。キットはさらに、キットを使用して標的遺伝子ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するための説明書を含むことが可能であうｒ。幾つかのキットは、標的遺伝子若しくはその対立遺伝子バリアント又はその変異を受けた形態の少なくとも一部と特異的にハイブリッド形成できる１つ又はそれ以上の核酸プローブを含有する。好ましくは、キットは、正常標的遺伝子と、１つ又はそれ以上のヌクレオチド差異を有する標的遺伝子との間を識別できる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。

本発明の実施例は、説明のためにのみ本明細書に表され、どのような方法においても本発明を制限するものとして解釈されるべきではない次の実施例からさらにより完全に理解されるものである。

実施例

典型的なプライマー及びプローブのセット
ウイルス及び細菌等の微生物のゲノムは、それらの大きな集団サイズ、高い変異率及び短い寿命周期のために、かなりの種内変動を示す。例えば、ＧｅｎｂａｎｋにおけるヒトＡ型インフルエンザには少なくとも２０００個の異なる系又はサブタイプがある。単一種内でのこれらの遺伝子変異は、核酸を標的として使用する全ての診断用検査に関して有意な障害であり得る。

一実施形態において、本発明は、臨床的に重要なウイルスの全ての遺伝的に多様な群（例えば、系、サブタイプ、血清型等）を増幅及び検出するよう設計されている核酸配列に関する。以下に提供されるのは、Ａ型インフルエンザ（ＩＮＦ−Ａ）、Ｂ型インフルエンザ（ＩＮＦ−Ｂ）、Ａ型呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ−Ａ）、Ｂ型呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ−Ｂ）、１型パラインフルエンザ（ＰＩＶ−１）、２型パラインフルエンザ（ＰＩＶ−２）、３型パラインフルエンザ（ＰＩＶ−３）、Ｂ型アデノウイルス（ＡＤＶ−Ｂ）、Ｃ型アデノウイルス（ＡＤＶ−Ｃ）及びＥ型アデノウイルス（ＡＤＶ−Ｅ）を含む典型的なウイルス標的のための順方向プライマー、逆方向プライマー及びプローブ配列を含む核酸のセットである。

各配列は、最適なＰＣＲを実施するための、及び前記配列が標的生物中でどのように十分発現し又は保存されているかのためのプライマーとして又はプローブとして機能する前記配列の能力に関して選択される。プライマーは、具体的なウイルスに対して特有であり高度に保存されている相補的な配列とハイブリッド形成するよう設計される。標的ウイルスの存在下で、プライマーは、標識化されたプローブとのハイブリッド形成又は従来のゲル電気泳動を使用する分子量の何れかによって認識されることが可能である配列をアニール及び増幅する。標的がＲＮＡ（例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルスまたはパラインフルエンザウイルス）である場合、増幅は、一本鎖ウイルスＲＮＡゲノムの逆転写で開始し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成した後、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ（例えば、アデノウイルス）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と続く。プローブ配列は、増幅された材料又は単位複製配列の内部領域に結合するよう設計される。プローブは、多様なリポーター分子で標識される。プローブは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）プローブとして、又はマイクロアレイのための捕捉配列として、従来のインサイツハイブリッド形成と適合性がある。以下に示される典型的な配列において、使用されるプローブは、加水分解又はＴａｑＭａｎ（登録商標）の変種である。

これらの配列は全て、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用する多重配列整列化から生じた共通配列由来である。もとの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ又は他の公共に利用可能なデータベースから得た。

本実施例は、種レベルでの差異を表すが、ＰｒｉＭＤＴＭは、全ての標的を、定義される全ての遺伝的差異に至るまで考慮することが可能である。例えば、標的が例えばＨ５Ｎ１系であった場合、プライマー及びプローブセットは、Ｈ５Ｎ１配列の多く（包含ファイル）として同定することは可能であるが、その他の系（排除ファイル）では不可能である。

次のプライマー／プローブセットの例において、プライマー及びプローブ配列はまた、単位複製配列内に箱で囲まれて示されている。

典型的な保存された領域
実施例１におけるプライマー及びプローブを、遺伝子のより大きな保存された領域という脈絡内で示す。幾つかの場合、プライマー又はプローブは、示される鎖の相補鎖の配列を含む。プライマー及びプローブと隣接する領域は、候補プライマー及びプローブに関するさらなる配列を提供する。

マトリクスタンパク質遺伝子からのＡ型インフルエンザセット（ＩＮＦＡ−ＭＰセット）
順方向プライマーに関して：

逆方向プライマー及びプローブ（相補鎖）に関して：

非構造タンパク質遺伝子由来のＢ型インフルエンザセット（ＩＮＦＢ−ＮＳセット）
順方向プライマー、プローブ及び逆方向単位複製配列：

Ａ型呼吸器多核体ウイルス糖タンパク質遺伝子（ＲＳＶＡ−Ｇセット）
順方向プライマー及びプローブ：

逆方向プライマー（相補鎖）に関して：

Ｂ型呼吸器多核体ウイルス糖タンパク質遺伝子（ＲＳＶＢ−Ｇセット）
順方向プライマー及びプローブ：

逆方向プライマー（相補鎖）：

Ａ型呼吸器多核体ウイルスヌクレオカプシド遺伝子（ＲＳＶＡ−Ｎセット）
順方向プライマー、プローブ及び逆方向単位複製配列：

Ｂ型呼吸器多核体ウイルスヌクレオカプシド遺伝子（ＲＳＶＢ−Ｎセット）
順方向プライマー及びプローブ：

逆方向プライマー（相補鎖）：

１型パラインフルエンザＨＮ遺伝子（ＰＩＶ１−ＨＮセット）
順方向プライマー：

逆方向プライマー及びプローブ（相補鎖）に関して：

２型パラインフルエンザＨＮ遺伝子（ＰＩＶ１２−ＨＮセット）
順方向プライマー：

プローブ（センス鎖）：

逆方向プライマー（相補鎖）：

３型パラインフルエンザＨＮ遺伝子（ＰＩＶ３−ＨＮセット）
順方向プライマー：

プローブ（相補鎖）：

逆方向プライマー（相補鎖）：

Ｂ型アデノウイルスヘキソン遺伝子（ＡＤＶＢ−Ｈセット）
順方向プライマー：

プローブ及び逆方向プライマー（相補鎖）：

Ｃ型アデノウイルスヘキソン遺伝子（ＡＤＶＣ−Ｈセット）
順方向プライマー及びプローブ：

逆方向プライマー（相補鎖）：

Ｅ型アデノウイルスヘキソン遺伝子（ＡＤＶＥ−Ｈセット）
順方向プライマー、プローブ及び逆方向プライマー：

典型的な共通配列
実施例１に記載されている核酸のバリアントを整列化させ、共通配列を同定した（図６）。記号「ｘ」は、塩基が縮重又は可変性であったことを示し、それゆえ、何れかのヌクレオチド、例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ若しくはＵ又はその機能的等価物を表す。

参照による組み込み
本願を通じて引用され得る（参考文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。）引用される参照の全ての内容は、本明細書によって明確に参照により組み込まれる。本発明の実施は、別段の記載がなければ、本分野で周知である、核酸技術、ソフトウェア技術及びコンピュータ技術に関する従来技術を採用する。

均等物
本発明は、その精神若しくは本質的な特性から逸脱せずに他の特定の形態において具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、全ての点において、本明細書に記載されている本発明を限定するものではなく、むしろ限定するものと考慮されるべきである。本発明の範囲は、従って、前述の明細書によらず、前述の特許請求の範囲によって示され、前記特許請求の範囲の等価物の意味及び範囲内に収まる全ての変化は、それゆえ、本明細書に包含されるものとする。

本発明の上述の及び他の目的、特性及び利点並びに本発明自体は、付随する図と共に読まれる場合、好ましい実施形態に関する次の記述からより完全に理解される。
、本発明の実例となる実施形態に従ったソフトウェアシステムのブロック線図である。 図１のソフトウェアシステムがコンピュータネットワーク上に実装されることが可能である多様な方法を示すブロック線図である。 どのようにして図１のソフトウェアが採用され、具体的な増幅及び／又は検出技術に関して順位決定されたオリゴヌクレオチドセットを生じることが可能であるかを示す流れ図である。 どのようにして図１のソフトウェアが採用され、ユーザー指定のオリゴヌクレオチドセットを評価することが可能であるかを示す流れ図である。 どのようにして図１のソフトウェアが採用され、多重化反応を介して標的の１セットを検出するためのオリゴヌクレオチドセットの順位決定された組み合わせを生じることが可能であるかを示す流れ図であり；及び ｘ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ若しくはＵ又は機能的等価物である、縮重ヌクレオチドを含む典型的なプローブ及びプライマー共通配列のリストを提供する。

Claims (143)

1. 配列番号１の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
2. 配列番号２の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
3. 配列番号１の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成する、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
4. 配列番号２の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成する、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
5. 配列番号３の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
6. 配列番号３の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成する、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
7. 配列ＣＴＣＡｘＧＧＡｘＴＧＧＣＴＡＡＡｘＡＣｘＡｘＡＣ（配列番号７３）又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
8. 配列ｘＧＣｘｘＴｘＴＧｘＡＣＡＡＡｘＣＧＴｘＴＡＣ（配列番号７４）又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチド。
9. 配列ＣＴＣＡｘＧＧＡｘＴＧＧＣＴＡＡＡｘＡＣｘＡｘＡＣ（配列番号７３）又はその相補対、及びｘＧＣｘｘＴｘＴＧｘＡＣＡＡＡｘＣＧＴｘＴＡＣ（配列番号７４）又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を検出するためのポリヌクレオチドセット。
10. Ａ型インフルエンザウイルス核酸が、増幅産物である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
11. 標識をさらに含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
12. 標識が、蛍光エネルギー転移ドナーである、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
13. 固体支持体へ付着されている、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
14. 固体支持体が、マイクロアレイである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
15. ポリヌクレオチドが、加水分解プローブである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
16. 第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、前記第一のプライマーが、配列番号１の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含み、及び前記第二のプライマーが、配列番号３の配列と少なくとも約７０％の配列同一性を共有する配列又はその相補対を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を増幅するためのプライマー対。
17. 第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、前記第一のプライマーが、配列番号１の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成し、及び前記第二のプライマーが、配列番号３の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成する、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を増幅するためのプライマー対。
18. 第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、前記第一のプライマーが、配列番号７３の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成し、及び前記第二のプライマーが、配列番号７４の配列を含む核酸又はその相補対とハイブリッド形成する、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を増幅するためのプライマー対。
19. 第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、前記第一のプライマーが、配列番号１の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含み、及び前記第二のプライマーが、配列番号３の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含むプライマー対を使用して、Ａ型インフルエンザウイルス核酸の断片を増幅する工程
    を含む、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を増幅するための方法。
20. （ａ）第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、前記第一のプライマーが、配列番号１の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含み、及び前記第二のプライマーが、配列番号３の配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する配列又はその相補対を含むプライマー対を使用して、Ａ型インフルエンザウイルス核酸の断片を試料から増幅する工程；及び
    （ｂ）増幅産物を検出する工程
    を含む、試料中のＡ型インフルエンザウイルス核酸の存在又は不存在を決定するための方法。
21. 試料が、組織試料を含む、請求項２０の方法。
22. 組織試料が、血液、血清、血漿、痰、尿、糞便、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃分泌物、涙、中咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、鼻内吸引物、鼻内洗浄物並びに耳、眼、口及び気道から回収される液体からなる群から選択される、請求項２１の方法。
23. 組織試料が、固定されるか又は凍結される、請求項２１の方法。
24. 核酸が、ＲＮＡを含む、請求項１９又は２０の方法。
25. 核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１９又は２０の方法。
26. 増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１９又は２０の方法。
27. 増幅工程が、ＴａｑＭａｎ反応を含む、請求項１９又は２０の方法。
28. 増幅工程が、等温性増幅を含む、請求項１９又は２０の方法。
29. 増幅工程が、アレイ上で実施される、請求項１９又は２０の方法。
30. 増幅工程が、インサイツハイブリッド形成を含む、請求項１９又は２０の方法。
31. 検出工程が、ゲル電気泳動を含む、請求項２０の方法。
32. 検出工程が、標識されたプローブとのハイブリッド形成を含む、請求項２０の方法。
33. 標識が、ビオチン、少なくとも１つの蛍光成分、抗原、分子量タグ及びＴｍプローブの修飾因子からなる群から選択される、請求項２０の方法。
34. 検出工程が、インサイツハイブリッド形成を含む、請求項２０の方法。
35. 検出工程が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を含む、請求項２０の方法。
36. 検出工程が、蛍光を測定することを含む、請求項２０の方法。
37. 検出工程が、質量を測定することを含む、請求項２０の方法。
38. 検出工程が、電荷を測定することを含む、請求項２０の方法。
39. 検出工程が、化学発光を測定することを含む、請求項２０の方法。
40. （ａ）少なくとも２つの標的バリアントを代表する少なくとも２つの核酸配列間でヌクレオチド同一性を同定する工程；
    （ｂ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能であるプローブを規定する少なくとも２つの候補プローブ配列を選択する工程；及び
    （ｃ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従って前記プローブの配列を順位付けし、これにより、複数の標的バリアントを同定するための最適なプローブ配列を決定する工程
    を含む、複数の核酸バリアントを同定するためのプローブを設計するための方法。
41. （ａ）少なくとも２つの標的バリアントを代表する少なくとも２つの核酸配列間でヌクレオチド同一性を同定する工程；
    （ｂ）少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能であるプローブを規定する少なくとも２つの候補プローブ配列を選択する工程；及び
    （ｃ）プローブ配列に関する保存スコアに従ってプローブ配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適なプローブ配列を決定する工程
    を含む、複数のマーカーバリアントを同定するためのプローブを設計するための方法。
42. （ａ）少なくとも２つの標的バリアントを代表する少なくとも２つの核酸配列間のヌクレオチド同一性を同定する工程；
    （ｂ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能であるプライマーを規定する少なくとも２つの候補プライマー配列を選択する工程；及び
    （ｃ）核酸配列に対する百分率同一性に従って前記プライマーの配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適なプライマー配列を決定する工程
    を含む、複数のマーカーバリアント中の核酸鎖を合成するためのプライマーを設計するための方法。
43. （ａ）少なくとも２つの標的バリアントを代表する少なくとも２つの核酸配列間のヌクレオチド同一性を同定する工程；
    （ｂ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能である順方向プライマーを規定する少なくとも２つの候補順方向プライマー配列を選択する工程；
    （ｃ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能である逆方向プライマーを規定する少なくとも２つの候補逆方向プライマー配列を選択する工程；
    （ｄ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従って順方向プライマー配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適な順方向プライマー配列を決定する工程；及び
    （ｅ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従って逆方向プライマー配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適な逆方向プライマー配列を決定する工程
    を含む、複数のマーカーバリアント中の核酸を増幅するためのプライマー対を設計するための方法。
44. （ａ）少なくとも２つの標的バリアントを代表する少なくとも２つの核酸配列間のヌクレオチド同一性を同定する工程；
    （ｂ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能である順方向プライマーを規定する少なくとも２つの候補順方向プライマー配列を選択する工程；
    （ｃ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能である逆方向プライマーを規定する少なくとも２つの候補逆方向プライマー配列を選択する工程；
    （ｄ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能であるプローブを規定する少なくとも２つの候補プローブ配列を選択する工程；
    （ｅ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従って順方向プライマー配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適な順方向プライマー配列を決定する工程；
    （ｆ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従って逆方向プライマー配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適な逆方向プライマー配列を決定する工程；及び
    （ｇ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従ってプローブ配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための最適なプローブ配列を決定する工程
    を含む、複数の標的バリアント中の核酸を増幅するためのプライマー対、及びこれにより生じた単位複製配列を検出するためのプローブを設計するための方法。
45. （ｉ）候補配列に関する標的配列スコアを決定すること；（ｉｉ）候補配列に関する平均保存スコアを決定すること；（ｉｉｉ）候補配列に関する平均適用範囲スコアを決定すること；（ｉｖ）候補配列の一部の１００％の保存を決定すること；（ｖ）種のスコアを決定すること；（ｖｉ）系統スコアを決定すること；（ｖｉｉ）サブタイプのスコアを決定すること；（ｖｉｉｉ）血清型スコアを決定すること；（ｉｘ）関連疾病スコアを決定すること；（ｘ）年齢スコアを決定すること；（ｘｉ）生産国スコアを決定すること；（ｘｉｉ）複製スコアを決定すること；（ｘｉｉｉ）特許スコアを決定すること；及び（ｘｉｖ）最小定性化スコアからなる群から選択される工程の少なくとも１つをさらに含む、請求項４０ないし４４の何れかに記載の方法。
46. 一部が、配列の中心の周りに配置される、請求項４５に記載の方法。
47. 一部が、配列の５’末端の周りに配置される、請求項４５に記載の方法。
48. 一部が、配列の３’末端の周りに配置される、請求項４５に記載の方法。
49. 候補配列と核酸配列との間の同一性を決定する場合に、１つ又はそれ以上のヌクレオチド変化を可能とする工程をさらに含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
50. 候補配列を排除配列と比較し、及び前記候補配列が前記排除配列と同一性を共有する場合、最適なものとして、前記候補配列を排斥する工程をさらに含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
51. 候補配列を包含配列と比較し、及び前記候補配列が前記包含配列と同一性を共有しない場合、最適なものとして、前記候補配列を排斥する工程をさらに含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
52. 核酸配列が、感染病原体を代表する、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
53. 感染病原体が、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
54. 標的が、疾病マーカーである、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
55. 標的が、遺伝子マーカーである、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
56. 標的が、少なくとも２つの異なる界、門、綱、目、科、属、種、サブタイプ及び遺伝子型を含む感染病原体を含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
57. 標的が、多くの血清型又は表現型を含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
58. 標的が、薬剤抵抗性又は薬物感受性に関するマーカーを含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
59. 同定する工程（ａ）が、核酸配列を整列化することを含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
60. 同定する工程（ａ）が、データベース中、由来の核酸配列の手動整列化を含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
61. 整列化が、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＰｉｌｅＵｐ（ＧＣＧ）、ＭＵＬＴＡＬＩＧＮ及びＴｃｏｆｆｅｅからなる群から選択されるプログラムを使用して実行される、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
62. 整列化が、対合計スコア化方法及び／又は進化系統樹を使用する最適化を使用して実行される、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
63. 整列化が、ＤＮＡＳｔａｒのＬａｓｅｒｇｅｎｅを使用して実行される、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
64. データベースが、注釈付きデータベースである、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
65. データベースが、ＰｒｉＭＤ（商標）データベースである、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
66. データベースが、インフルエンザ配列データベース、リボソームデータベース及びＧｅｎｂａｎｋデータベースからなる群から選択される、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
67. 同定する工程（ａ）が、ＢＬＡＳＴ分析を含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
68. 同定する工程（ａ）が、少なくとも１つの核酸配列から少なくとも１つの５’ヌクレオチド及び／又は少なくとも１つの３’ヌクレオチドを除去することによって、整列化を編集する工程をさらに含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
69. 同定する工程（ａ）が、整列化しない核酸配列を除去することによって整列化を編集する工程をさらに含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
70. 整列化が、編集工程後に反復される、請求項６８に記載の方法。
71. 選択する工程（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応ペナルティースコア式を使用することを含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
72. ポリメラーゼ連鎖反応ペナルティースコア式が、プライマーＴｍと最適Ｔｍとの間の差異の加重された合計、プライマーＴｍ間の差異、単位複製配列長及びプライマーとＴａｑＭａｎプローブとの間の距離の少なくとも１つを含む、請求項７１に記載の方法。
73. 第一の選択工程（ｄ）が、どの配列又は配列のセットが１に最も近い平均保存スコアを有するかを決定することを含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
74. 各配列に関する平均保存スコアの標準偏差が比較される、請求項７３に記載の方法。
75. 第一の決定工程が、どの配列が、最も標的配列とハイブリッド形成するかを決定することを含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
76. 最も感染病原体の核酸配列とハイブリッド形成する候補配列の能力が決定される、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
77. どの感染病原体配列が、最適な順方向プライマー及び最適な逆方向プライマーによってハイブリッド形成されるかを評価する工程をさらに含む、請求項４３ないし４４の何れか一項に記載の方法。
78. 評価工程が、データベース中の核酸配列間の塩基差異の数を決定することを含む、請求項７７に記載の方法。
79. 公共のデータベースが使用される、請求項７８に記載の方法。
80. ＰｒｉＭＤ（商標）データベースが使用される、請求項７８に記載の方法。
81. 評価工程が、インシリコでのポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、請求項７７に記載の方法。
82. 評価工程が、包含基準または排除基準に合致しない場合、順方向プライマー及び逆方向プライマーを排斥することを含む、請求項７７に記載の方法。
83. 評価工程が、医学的に価値のある核酸を増幅しない場合、順方向プライマー及び逆方向プライマーを排斥することを含む、請求項７７に記載の方法。
84. 評価工程が、公表された及び／または特許化された配列と重複する順方向プライマー配列及び逆方向プライマー配列を同定するために、ＢＬＡＳＴ分析を実施することを含む、請求項７７に記載の方法。
85. 評価工程が、順方向プライマー配列及び／又は逆方向プライマー配列の二次構造を決定することを含む、請求項７７に記載の方法。
86. プローブ配列及び／又は標的配列の二次構造が決定される、請求項７７に記載の方法。
87. 順方向プライマー配列、逆方向プライマー配列及び／又はプローブ配列が、標的バリアントの代表である核酸配列以外のデータベース中の配列とハイブリッド形成するかどうかを評価する工程をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
88. （ａ）請求項４０ないし４５の何れか一項に記載の方法に従って、疾病を示す核酸とハイブリッド形成できる少なくとも１つの最適なプライマー又は最適なプローブを同定する工程；及び
    （ｂ）前記最適なプライマー又は最適なプローブが、試料中に存在する場合の核酸とハイブリッド形成するような適切なハイブリッド形成条件下で、試料を前記最適なプライマー又は最適なプローブへ曝露する工程；及び
    （ｃ）ハイブリッド形成反応を検出する工程
    を含む、疾病を示す核酸の存在又は不存在に関して試料をスクリーニングするための方法。
89. 試料が、組織試料を含む、請求項８８に記載の方法。
90. 組織試料が、血液、血清、血漿、痰、尿、糞便、細胞、皮膚、脳脊髄液、唾液、胃分泌物、涙、中咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、鼻内吸引物、鼻内洗浄物、並びに耳、眼、口及び気道から回収される液体からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
91. 核酸が、ＲＮＡを含む、請求項８８に記載の方法。
92. 核酸が、ＤＮＡを含む、請求項８８に記載の方法。
93. 検出工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項８８に記載の方法。
94. 検出工程が、ＴａｑＭａｎ反応を含む、請求項８８に記載の方法。
95. 検出工程が、等温性増幅を含む、請求項８８に記載の方法。
96. 検出工程が、アレイ上で実施される、請求項８８に記載の方法。
97. 検出工程が、インサイツハイブリッド形成を含む、請求項８８に記載の方法。
98. 検出工程が、ゲル電気泳動を含む、請求項８８に記載の方法。
99. 検出工程が、標識を含むプローブとのハイブリッド形成を含む、請求項８８に記載の方法。
100. 標識が、ビオチン、少なくとも１つの蛍光成分、抗原、分子量タグ及びＴｍ修飾因子からなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。
101. 検出工程が、蛍光共鳴エネルギー転移を含む、請求項８９に記載の方法。
102. 検出工程が、蛍光を測定することを含む、請求項８９に記載の方法。
103. 検出工程が、質量を測定することを含む、請求項８９に記載の方法。
104. 検出工程が、電荷を測定することを含む、請求項８９に記載の方法。
105. 検出工程が、化学発光を測定することを含む、請求項８９に記載の方法。
106. （ａ）少なくとも２つの標的バリアントを代表する少なくとも２つの核酸配列間のヌクレオチド同一性を同定する工程；
     （ｂ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能である順方向プライマーを規定する少なくとも１つの候補順方向プライマー配列を選択する工程；
     （ｃ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能である逆方向プライマーを規定する少なくとも１つの候補逆方向プライマー配列を選択する工程；
     （ｄ）前記少なくとも２つの核酸配列とハイブリッド形成することが可能であるプローブを規定する少なくとも１つの候補プローブ配列を選択する工程；
     （ｅ）前記核酸配列に対する百分率同一性に従って、順方向プライマー、逆方向プライマー及びプローブ配列を順位付けし、これにより複数の標的バリアントを同定するための、順方向プライマー、逆方向プライマー及びプローブ配列を含む最適なプライマー／プローブセットを決定する工程
     を含む、複数の標的バリアント中の核酸を増幅するためのプライマー対、及びこれにより生じた単位複製配列を検出するためのプローブを設計するための方法。
107. 標的を特定するためのユーザーインターフェイス；
     標的の複数のバリアントに関して核酸配列の多数の整列を読み取るためのソフトウェア；
     多数の整列に少なくとも一部基づいた代表的な配列を発生させるためのソフトウェア；
     代表的な配列の一部と相補的である複数のオリゴヌクレオチドを計算するためのソフトウェア；及び
     それぞれのオリゴヌクレオチドが標的のバリアントの各々と整列化する程度に応じて計算された各オリゴヌクレオチドへ、品質測定法を割り当てるためのソフトウェア
     を含む、標的の多数のバリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドを同定するための、コンピュータにより実行されるシステム。
108. 計算されたオリゴヌクレオチドをセット中へ組織化するためのソフトウェア；及び
     個々のセット中の前記オリゴヌクレオチドが互いに、所定の検出／増幅技術を使用して標的のバリアントを検出することができる程度に応じて、各セットへ品質測定法を割り当てるためのソフトウェア
     をさらに含む、請求項１０７に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
109. 特許新規性、
     オリゴヌクレオチドが検出することが可能である任意の系、
     前記オリゴヌクレオチドが検出することが可能である任意の系が単離された年、
     前記系の地理的流行の領域、
     前記系によって感染された患者の医学的需要、
     前記オリゴヌクレオチドと関連した全ての疾病、及び
     前記オリゴヌクレオチドと関連した全ての疾病に関する治療能力
     の何れかに応じて、前記各オリゴヌクレオチドへ品質測定法を割り当てるためのソフトウェアをさらに含む、請求項１０７に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
110. 標的の多数のバリアントを検出するための複数のオリゴヌクレオチドセットを計算するためのソフトウェア；
     前記複数のオリゴヌクレオチドセットの各々へ少なくとも１つの品質測定法を割り当てるためのソフトウェア；及び
     前記少なくとも１つの品質測定法に応じて、前記複数のオリゴヌクレオチドセットを順位決定するためのソフトウェア
     を含む、コンピュータにより実行されるシステム。
111. 順位決定のためのソフトウェアが、少なくとも１つの品質測定法に応じて作動する数学関数又はアルゴリズムを含む、請求項１１０に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
112. 少なくとも１つの品質測定法が、複数の品質測定法であり、及び関数又はアルゴリズムが、異なる品質測定法を異なって加重するためのソフトウェアをさらに含む、請求項１１１に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
113. 数学関数又はアルゴリズムが、少なくとも１つの各品質測定法と少なくとも１つの各品質測定法に関する理想値との間の相違点の程度を計算するために準備される、請求項１１１に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
114. 相違点の程度が、Ｄ＝ｓｑｒｔ（ｗ_１（ｘ_１−ｐ_１）^２＋ｗ_２（ｘ_２−ｐ_２）^２＋ｗ_３（ｘ_３−ｐ_３）^２＋・・・）である距離Ｄとして表されることが可能であり、
     式中、ｗ_ｉが、ｉ番目の品質測定法に付与される加重であり、ｘ_ｉは、ｉ番目に測定法に関して付与されるスコアであり、及びｐ_ｉは、ｉ番目の測定法に関する完全なスコアである、請求項１１３に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
115. 順位決定のためのソフトウェアが、複数のオリゴヌクレオチドセットの多種順位決定、階層性順位決定及び連続的順位決定の何れかを実行する、請求項１１０に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
116. 少なくとも１つの品質測定法が、複数の品質測定法であり、及び順位決定のためのソフトウェアが、品質測定法の異なるグループ化に応じて複数の順位決定を発生させるためにユーザーにより調節可能である、請求項１１０に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
117. 標的を指定するためのユーザーインターフェイス；
     複数の公知の標的に関する核酸配列、
     前記核酸配列又はその相補対に相当するオリゴヌクレオチドセット、及び
     整列化データ、人口統計データ、特許データ、及び商業データの少なくとも１つを含む、付加的なデータ
     を含む、複数のデータを保存するためのデータ収集；
     指定された標的核酸を検出するための候補であるデータ収集において何れかのオリゴヌクレオチドセットを同定するためのソフトウェア；及び
     データ収集に保存される前記付加的なデータの何れかに応じて同定された各オリゴヌクレオチドセットに関して少なくとも１つの品質測定法を計算するためのソフトウェアを含む、標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドセットを同定するための、コンピュータにより実行されるシステム。
118. 同定された各オリゴヌクレオチドに関して少なくとも１つの品質測定法を計算するためのソフトウェアが、少なくとも１つの品質測定法に応じて同定された全てのオリゴヌクレオチドを順位決定するためのソフトウェアをさらに含む、請求項１１７に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
119. 標的を特定するためのユーザーインターフェイス；
     公知の標的の複数に相当するオリゴヌクレオチドセットを含むデータの複数を保存するためのデータ収集；
     指定された標的を検出するための候補である前記データ収集において、何れかのオリゴヌクレオチドセットを同定するためのソフトウェア；及び
     同定された各オリゴヌクレオチドセットをスコア化するための品質測定法の複数を含み、各品質測定法が、デフォルト加重を割り当てられ、及び各品質測定法の加重が、前記ユーザーインターフェイスを介して調整可能である、
     標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドセットを同定するための、コンピュータにより実行されるシステム。
120. 品質測定法の複数の少なくとも１つが、指定された標的に対する個々のオリゴヌクレオチドセットの整列化に関する、請求項１１９に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
121. 複数の品質測定基準が、具体的な増幅及び／又は検出技術に関する適合性に関連した少なくとも１つの測定基準を含む、請求項１１９に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
122. 適合性と関連した少なくとも１つの測定基準が、
     ＴｍとＯｐｔＴｍとの間の差異、
     プライマーＴ_ＭＳ間の差異、
     単位複製配列長、
     プライマーとプローブとの間の差異、
     ＰＣＲスコア、及び
     ハイブリッド形成の質
     の何れかを含む、請求項１２１に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
123. 複数の品質測定基準が、整列化と関連した少なくとも１つの測定基準を含む、請求項１１９に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
124. 整列化と関連した少なくとも１つの測定基準が、
     保存、
     適用範囲、
     セットのオリゴヌクレオチドとのミスマッチの程度、
     セットのオリゴヌクレオチドに対するＮ個までのミスマッチを呈する標的配列の画分を測定するスコアのＩＳＩ−Ｎファミリー、
     セットのオリゴヌクレオチドに対するミスマッチを呈する可能性のある全ての塩基以外の塩基の画分、
     起こり得る全ての標的配列を同定することが許容可能なミスマッチの最小数、
     ハイブリッド形成の質、及び
     前記標的配列を検出するための医学的需要
     の何れかを含む、請求項１２３に記載のコンピュータにより実行されるシステム。
125. 標的の複数のバリアントに関する核酸配列；
     及び
     標的の複数のバリアントに関する核酸配列の多重整列化
     を含む、データ収集。
126. 複数のバリアント間の保存の程度を示す保存データ、及び
     複数のバリアント間の適用範囲の程度を示す適用範囲データ
     の何れかをさらに含む、請求項１２５に記載のデータ収集。
127. 多重整列化の共通配列をさらに含む、請求項１２５に記載のデータ収集。
128. 核酸配列と結合するための候補である複数のオリゴヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１２５に記載のデータ収集。
129. 核酸配列との結合のための各オリゴヌクレオチド配列の適合性の少なくとも１つの基準をさらに含む、請求項１２８に記載のデータ収集。
130. 所定の増幅及び／検出技術とともに使用するための各オリゴヌクレオチド配列の適合性の少なくとも１つの基準をさらに含む、請求項１２８に記載のデータ収集。
131. 所定の増幅及び／又は検出技術が、Ｔａｑｍａｎである、請求項１３０に記載のデータ収集。
132. 特許の新規性、
     オリゴヌクレオチドが検出することが可能である任意の系、
     前記系の齢、
     前記系の地理的流行の領域、及び
     前記系によって感染された生物の医学的需要
     の何れかの少なくとも１つの基準を前記オリゴヌクレオチドの各配列に関してさらに含む、請求項１２８に記載のデータ収集。
133. 市販のプライマー及びプローブに関連したデータをさらに含む、請求項１２８に記載のデータ収集。
134. 多重整列化が、コンピュータプログラムの出力である、請求項１２５に記載のデータ収集。
135. 複数の異なる標的のバリアントを含む、複数の異なる標的に関する核酸配列をさらに含む、請求項１２５に記載のデータ収集。
136. データ収集が、リレーショナル・データベースとして実装される、請求項１２５に記載のデータ収集。
137. データ収集が、コンピュータシステムの複数のディレクトリ中に組織化される複数のファイルとして実装される、請求項１２５に記載のデータ収集。
138. 複数の公知の標的に相当するオリゴヌクレオチド、又はその相補対、及び
     前記公知の標的の複数の少なくとも１つを検出するための各オリゴヌクレオチドの適合性を示すための少なくとも１つのスコア
     を含む、複数のデータを保存するためのデータベース。
139. オリゴヌクレオチドがセットとして組織化され、公知の標的の複数の少なくとも１つを検出するための各オリゴヌクレオチドセットの適合性を示すための少なくとも１つのスコアをさらに含む、請求項１３８に記載のデータベース。
140. 各オリゴヌクレオチドセットが、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、及び少なくとも１つのプローブを含む、請求項１３９に記載のデータベース。
141. 各オリゴヌクレオチドセットが、具体的なゲノム領域を検出及び／又は増幅するための複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４０に記載のデータベース。
142. 標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドを選択するためのソフトウェア；
     公知の標的の複数に相当するオリゴヌクレオチドセット又はその相補対を示すデータ、及び
     各標的に関する、個々の標的を検出するためのオリゴヌクレオチドを選択するための決定に関するデータ、
     を含む、複数のデータを保存するためのデータベース
     を含み、
     前記ソフトウェアが、具体的な標的のためのオリゴヌクレオチドを選択するための決定に関するデータベースデータへ書き込むための符号を含む、
     標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドセットを同定するための、コンピュータにより実行されるシステム。
143. オリゴヌクレオチドを選択するためのソフトウェアが、整列化を実行するためのソフトウェアを含み、及びオリゴヌクレオチドを選択するための決定に関するデータが、前記ソフトウェアによって実行される整列化を含む、請求項１４２に記載のコンピュータにより実行されるシステム。

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