JP2009517013A5 - - Google Patents
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Description
続いて、本発明の好都合な実施形態において、検出プローブは、分子プローブとして既知である「分子ビーコン」から成る。分子プローブは、当業者はよく知っているステムループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの形態の検出プローブである。そのループは標識配列（通常は増幅産物）に相補的なプローブ配列を含み、そのステムはプローブの両端にそれぞれ位置するアームを形成する２つの配列のハイブリダイゼーションによって形成される。蛍光物質は、２つのアームの一方の端に共有結合で結合され、クエンチャー（蛍光吸収体）は他方のアームの端に共有結合で結合される。分子プローブは、それらが溶液中で遊離しているとき、蛍光を発しない。しかしながら、相補的な増幅産物の存在下で、これらの標的にハイブリダイゼーションする時には、蛍光を発しうる構造転換を起こす。標的の不存在下では、ステムはクエンチャーのすぐ近くに蛍光物質を保ち、それによって蛍光物質からクエンチャーへの蛍光の移動が誘導される。該クエンチャーは、蛍光から受け取ったエネルギーを熱として散らす無蛍光色基である。プローブが分子標的に遭遇した時、プローブ-標的のハイブリダイゼーションが形成され、このハイブリダイゼーションはステムの２つのアームによって作られるハイブリダイゼーションよりも、より長くより安定である。プローブ-標的のハイブリダイゼーションの堅固性と長さはステムハイブリダイゼーションの同時存在を妨げる。必然的に、分子プローブは自発的に、ステムハイブリダイゼーションを分離させるように強制し、蛍光物質とクエンチャーをお互いから遠ざける構造上の再構成を生じ、それによって蛍光を復活させる。
Claims (20)
- インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子及びＮ１遺伝子にそれぞれ位置する２つの標的配列を増幅するための２対のオリゴヌクレオチドであって、Ｈ５遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの対は、
・長さ５０ヌクレオチドまでの第一オリゴヌクレオチドであって、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
・長さ５０ヌクレオチドまでの第二オリゴヌクレオチドであって、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第二オリゴヌクレオチドからなり、
一方で、Ｎ１遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの対は：
・長さ５０ヌクレオチドまでの第一オリゴヌクレオチドであって、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
・長さ５０ヌクレオチドまでの第二オリゴヌクレオチドであって、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第二オリゴヌクレオチド
からなる２対のオリゴヌクレオチド。 - インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子に位置する標的配列を増幅するための１対のオリゴヌクレオチドであって、
・長さ５０ヌクレオチドまでの第一オリゴヌクレオチドであって、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
・長さ５０ヌクレオチドまでの第二オリゴヌクレオチドであって、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第二オリゴヌクレオチド
からなる１対のオリゴヌクレオチド。 - インフルエンザＡウイルスのゲノムのＮ１遺伝子に位置する標的配列を増幅するための１対のオリゴヌクレオチドであって、
・長さ５０ヌクレオチドまでの第一オリゴヌクレオチドであって、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
・長さ５０ヌクレオチドまでの第二オリゴヌクレオチドであって、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第二オリゴヌクレオチド
からなる１対のオリゴヌクレオチド。 - 第一オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されることができるプロモーター配列を付加的に含んでなることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。
- ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されることができるプロモーター配列はＴ７ポリメラーゼであることを特徴とする、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドの対。
- Ｈ５遺伝子に位置する標的配列を増幅するための第一オリゴヌクレオチドが本質的に以下の配列：
配列番号５：ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列からなることを特徴とする、請求項４及び５のどちらか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。 - Ｎ１遺伝子に位置する標的配列を増幅するための第一オリゴヌクレオチドが本質的に以下の配列：
配列番号６：ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列からなることを特徴とする、請求項４から６の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。 - 増幅に必要な増幅試薬の存在下で、請求項１に記載の２対のオリゴヌクレオチドを使用した核酸の増幅反応に試料を供すること、及び
それぞれインフルエンザＡウイルスのＨ５及びＮ１遺伝子に位置する２つの標的配列を検出すること
を含んでなる試料に存在する可能性があるインフルエンザＡウイルスの核酸を検出するための方法であって、
Ｈ５遺伝子を検出するための検出プローブは配列番号７に示す配列又はその相補配列からなる標的を結合する配列を含み、Ｎ１遺伝子を検出するための検出プローブは配列番号８に示す配列又はその相補配列からなる標的を結合する配列を含み、各々の検出プローブは少なくとも一つの標識手段を含むものである、方法。 - 増幅に必要な増幅試薬の存在下で、請求項２に記載の１対のオリゴヌクレオチドを使用した核酸の増幅反応に試料を供すること、及び
インフルエンザＡウイルスのＨ５遺伝子に位置する標的配列を検出すること
を含んでなる試料に存在する可能性があるインフルエンザＡウイルスの核酸を検出するための方法であって、
Ｈ５遺伝子を検出するための検出プローブは配列番号７に示す配列又はその相補配列からなる標的を結合する配列を含み、該検出プローブは少なくとも一つの標識手段を含むものである、方法。 - 増幅に必要な増幅試薬の存在下で、請求項３に記載の１対のオリゴヌクレオチドを使用した核酸の増幅反応に試料を供すること、及び
インフルエンザＡウイルスのＮ１遺伝子に位置する標的配列を検出すること
を含んでなる試料に存在する可能性があるインフルエンザＡウイルスの核酸を検出するための方法であって、
Ｎ１遺伝子を検出するための検出プローブは配列番号８に示す配列又はその相補配列からなる標的を結合する配列を含み、該検出プローブは少なくとも一つの標識手段を含むものである、方法。 - 前記検出プローブは、分子ビーコンを含有する分子プローブである請求項８から１０の何れか一項に記載の方法。
- 前記検出プローブが、Ｈ５遺伝子を検出するための
配列番号９：[6-FAM]-ｃｇａｔｃｇａＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡｔｃｇａｔｃｇ-[DabSyl]、及び／又は
Ｎ１遺伝子を検出するための
配列番号１０：[6-FAM]-ｃｇａｔｃｇＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡｃｇａｔｃｇ-[DabSyl]
である、請求項８から１０の何れか一項に記載の方法。 - 核酸を増幅するための方法であって、請求項１に定義した２対のオリゴヌクレオチドとインフルエンザＡウイルスを含むことが疑われる生物試料からの核酸を組合わせること、及びＨ５及びＮ１遺伝子の少なくとも一つが存在するときは増幅について十分な条件下で少なくとも一つの核酸を増幅することを含む、方法。
- 試料に存在する可能性があるインフルエンザＡウイルスの核酸を検出するための方法であって、
増幅に必要とされる増幅試薬の存在下で、請求項１に記載の２対のオリゴヌクレオチドを使用した核酸の増幅反応に試料を供すること、及び
Ｈ５及びＮ１遺伝子の少なくとも一つが存在するときに興味のあるアンプリコンの存在を検出することを含む、方法。 - 使用する増幅反応がＲＴ−ＰＣＲである、請求項１４に記載の方法。
- 使用する増幅反応が転写増幅技術である、請求項１４に記載の方法。
- 使用する増幅反応はＮＡＳＢＡ技術である、請求項１６に記載の方法。
- 試料に存在する可能性があるインフルエンザＡウイルスのＨ５及びＮ１遺伝子を増幅するための方法であって、
Ｈ５遺伝子のための２つの増幅プライマーの存在下で、及びＮ１遺伝子のための２つの増幅プライマーの存在下で、増幅バッファー中で試料をインキュベートする工程であって、
Ｈ５遺伝子のための２つの増幅プライマーは、
・長さ５０ヌクレオチドまでの第一オリゴヌクレオチドであって、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
・長さ５０ヌクレオチドまでの第二オリゴヌクレオチドであって、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第二オリゴヌクレオチドからなり、Ｈ５遺伝子のための２つの増幅プライマーのうちの一つは付加的にプロモータ配列を含んでなり、
Ｎ１遺伝子のための２つの増幅プライマーは、
・長さ５０ヌクレオチドまでの第一オリゴヌクレオチドであって、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
・長さ５０ヌクレオチドまでの第二オリゴヌクレオチドであって、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡに示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含む第二オリゴヌクレオチドからなり、Ｎ１遺伝子のための２つの増幅プライマーのうちの一つは付加的にプロモータ配列を含んでなる、工程、
試料に、以下の試薬を加える工程：
・ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
・ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、
・ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
及び
前記のとおり作成した反応混合物を、最適な条件下で増幅が起こるために十分な時間にわたって維持する工程を含んでなる方法。 - −請求項１に記載の２対のオリゴヌクレオチド、
−配列番号７に示すヌクレオチド配列又はその相補配列からなる標的を結合する配列を含むＨ５遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示すヌクレオチド配列又はその相補配列からなる標的を結合する配列を含むＮ１遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、各々の検出オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの標識手段を含むオリゴヌクレオチド及び
−増幅反応を行うために必要である試薬
を含む、試料に存在する可能性があるインフルエンザＡウイルスのＨ５及びＮ１遺伝子の検出用キット。 - 増幅反応を行うために必要である試薬がＮＡＳＢＡ増幅用試薬である、請求項１９に記載のキット。
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