JP2009513146A - 膜結合ポリペプチドの無細胞合成法 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質合成はポリペプチド治療、診断、および産業用酵素の開発の根底にある基礎的な生物学的過程である。組み換えDNA(rDNA)技術を伴い、所望のタンパク質を生産するために細胞の触媒的機構を利用することが可能になってきている。これは細胞環境内で、または細胞由来の抽出産物を使用したインビトロで成し遂げられうる。
米国特許第6,337,191 B1号;Swartz et al. 米国特許出願公開第20040209321号;Swartz et al. 国際出願公開第WO 2004/016778号;Swartz et al. 米国特許出願公開第2005-0054032-A1号;Swartz et al. 米国特許出願公開第2005-0054044-A1号;Swarltz et al. 国際出願公開第WO 2005/052117号;Calhoun and Swartz (2005) Biotechnol Bioeng 90(5): 606-13;Jewett and Swartz (2004) Biotechnol Bioeng 86(1): 19-26;Jewett et al. (2002) Prokaryotic Systems for In Vitro Expression. In: Weiner M, Lu Q, editors. Gene cloning and expression technologies. Westborough, MA: Eaton Publishing. P391-411; Lin et al. (2005) Biotechnol Bioeng 89(2): 148-56。
膜結合タンパク質の高収率無細胞合成のための方法を提供する。本発明の方法において、小胞は無細胞合成反応に添加され、新生ポリペプチドの生物膜への直接挿入を提供し、従って膜環境での折り畳みを提供する。共翻訳折り畳みを許容するため、一般的に、合成は共役した転写および翻訳反応として遂行される。これらの方法は高収率の活性タンパク質を提供する。この方法は合成タンパク質の膜結合状態での単離をさらに含んでもよい。
膜結合タンパク質の高収率合成は、膜小胞が存在し、かつ反応条件が酸化的リン酸化のインビトロ活性化を提供する無細胞反応において、共役した転写および翻訳反応を遂行することにより達成される。関心対象のタンパク質は、共翻訳折り畳みおよび新生ポリペプチドの膜への直接挿入を許容する様式で合成され、従って、膜環境での折り畳みを提供する。本方法では、膜結合状態の合成タンパク質の単離をさらに含んでもよい。
本発明は特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、および記載された試薬に限定されず、多様であってよいことが理解されるべきである。本明細書において使用された用語は、特定の態様のみを記載する目的のものであり、本発明の範囲の限定を意図するものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
膜タンパク質は、膜-タンパク質相互作用の性質に基づいて、内在性(integral)(内因性(intrinsic))および表在性(peripheral)(外因性(extrinsic))の二つの広範なカテゴリーに分類されることが可能である。本発明の目的のためには、膜結合タンパク質は典型的には内在性膜タンパク質であり、内因性タンパク質とも呼ばれ、リン脂質二重層に埋め込まれている1つまたは複数の部位を有している。ほとんどの内在性タンパク質は、膜リン脂質の脂肪酸アシル基と相互作用し、従ってタンパク質を膜に固定する、疎水性側鎖を伴う残基を含む。ほとんどの内在性タンパク質はリン脂質二重層全体を貫通する。これらの膜貫通タンパク質は1つまたは複数の膜貫通ドメインならびに4から数百残基の長さにおよび、二重層のそれぞれの側の水溶性媒体へと伸長するドメインも含む。
で存在する。
分泌および膜タンパク質の原核生物細胞膜または真核生物の小胞体への共翻訳ターゲティングは、リボヌクレオタンパク質複合体、シグナル識別粒子(SRP)、およびその膜結合受容体(SR)により媒介される。SRPはリボソームの出口トンネルから出現する際、新生タンパク質のシグナル配列に結合する。SRPおよびリボソーム-新生鎖複合体(RNC)から成る、生成されたターゲティング複合体は、GTP依存性様式でSRにドッキングする。複雑な一連の立体配座状態を経過して、SRPおよびSRはRNCをトランスロコン(translocon)へと運搬し、次に膜を隔ててのタンパク質の移動または膜への内在を媒介する。移動が進行するにつれ、シグナル配列はシグナルプロテアーゼにより切断されてもよく、かつポリペプチドは小胞体内腔へ放出される。あるいは、膜貫通タンパク質の形成のためタンパク質は膜に挿入される可能性がある。
反応は大規模反応器を利用してもよいし、小規模でもよく、または同時合成を複数遂行するため多重化されてもよい。連続的反応では試薬の流れを導入するため供給機構が利用され、かつ工程の一部として最終産物が単離されてもよい。バッチシステムも関心対象であり、そこではさらなる試薬が活性のある合成の期間を延長させるため導入されてもよい。反応器はバッチ(batch)、拡張バッチ、半バッチ、半連続的、フェドバッチ(fed-batch)および連続的のように任意の様式で実施されてもよく、および適用目的に従って選択される。
実施例1
これらの実施例のためのタンパク質合成反応は、わずかな改変を伴う、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2004/016778号に記載されているCytomim(商標)プロトコールを使用する。この反応の構成成分は以下を含む。13.3 μg/mL鋳型プラスミド、1.2 mM ATP、0.86 mM CMP、0.86 mM GMP、0.86 mM UMP、34 μg/mLフォリン酸、170.6 μg/mL大腸菌tRNA混合物、各々2 mMの標識されていない20種のアミノ酸、0.33 mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、0.27 mM コエンザイムA、 1 mMプトレシン、1.5 mMスペルミジン、4mMシュウ酸ナトリウム、1 mMジチオスレイトール、10 mM グルタミン酸アンモニウム、130 mMグルタミン酸カリウム、8 mMグルタミン酸マグネシウム、10 mMリン酸カリウム pH 7.2、12 μM [14C]-ロイシン、0.1 mg/mL T7 RNAポリメラーゼ、0.24倍量の大腸菌S30抽出産物、および0.41倍量の小胞溶液(詳細は以下)。T7 RNAポリメラーゼはGrodberg and Dunn (J of Bacteriology, 170: 1245-1253; 1988)の記載にあるように調製される。大腸菌S30抽出産物は、Zawada, et al. in Fermentation Biotechnology, B. Saha, Editor. 2003, American Chemical Society; Washington, DC. P. 142-156に従い増殖され、かつ、Jewett, et al. in Gene Cloning and Expression Technologies, M. Weiner and Q. Lu, Editors. 2002, Eaton Publishing: Westborough, MA. P. 391-411に従い調製されたKC6株(A19 ΔtonA ΔtnaA ΔspeA ΔendA ΔsdaA ΔsdaB ΔgshA met+)(Calhoun and Swartz, Biotechnology Progress 2005. 21(4): p. 1146-53)より調製される。
TetA活性アッセイ:
TetA活性アッセイはYamaguchi, et al (1990) J Biol Chem, 265 (9): p. 4809-13の記載と同様に遂行された。TetAは細胞の天然のプロトン勾配を駆動力として用い、金属-テトラサイクリン複合物の細胞質外への輸送を触媒するプロトン対向輸送体である。
MtlA活性定量:
MtlAによるマンニトール輸送は2つの他の細胞質酵素、HPr(熱安定性のヒスチジンリン酸化タンパク質)およびPTS酵素Iを含むPEP駆動過程である。MtlA活性をアッセイするため、小胞はマンニトールにより事前負荷される。これは(a)MtlAの無細胞合成前の小胞溶液調製段階においてマンニトールを含む緩衝液中で細胞をホモジェナイズする、または(b)無細胞反応後にマンニトールを含む緩衝液中にMtlAを含む小胞を排出する、のいずれかにより達成される。100 kDa MWCO透析バッグ中での透析による粗精製の後、細胞抽出産物から持ち越されたいかなる残存のHPr(9 kDa)または酵素I(63 kDa)も除去される。
アクアポリン(Aquaporin)の発現:
上述の方法を使用して、膜タンパク質アクアポリンZ(AqpZ)が高収率で生産され、かつ界面活性剤の使用または再度折り畳み段階を経ることなく、大腸菌内膜小胞に直接挿入される。
Claims (14)
- 以下の段階を含む、無細胞インビトロ反応における膜結合ポリペプチドの合成のための方法:
反応混合物が該ポリペプチドの直接挿入のための小胞を含み、反応条件が酸化的リン酸化のインビトロ活性化を提供する、無細胞インビトロ翻訳反応において膜結合ポリペプチドを合成する段階。 - 反応混合物が少なくとも約50μg/mlの膜結合ポリペプチドを生産する、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドがインビボにおいて達成される以上の濃度で合成される、請求項1記載の方法。
- 膜結合を維持する条件下において、反応混合物由来の膜結合ポリペプチドを直接的に単離する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
- 反応混合物がシグナル識別粒子(SRP)を含む、請求項1記載の方法。
- 反応混合物がFtsYタンパク質をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 合成がバッチ(batch)反応またはフェドバッチ(fed-batch)反応として遂行される、請求項1記載の方法。
- 合成が連続的な反応として遂行される、請求項1記載の方法。
- 反応混合物がグルコース含有培地で増殖した大腸菌由来の抽出産物を含む、請求項1記載の方法。
- 大腸菌がグルコースおよびリン酸含有培地で増殖する、請求項5記載の方法。
- 反応混合物が約5mMから約20mMの濃度のマグネシウムを含む、請求項6記載の方法。
- 反応混合物が実質的にポリエチレングリコールを含まない、請求項7記載の方法。
- 反応混合物がスペルミン、スペルミジン、およびプトレシンのうち1つまたは複数を含む、請求項8記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項記載の方法における使用のためのキット。
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