JP2009511565A - 1つ以上の部位特異的に結合体化されたヒドラジノニコチンアミド(hynic)部分を介して標識されたインターロイキン−8、ならびに感染および炎症の診断におけるその使用 - Google Patents
1つ以上の部位特異的に結合体化されたヒドラジノニコチンアミド(hynic)部分を介して標識されたインターロイキン−8、ならびに感染および炎症の診断におけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
感染症及び炎症の診断において使用するための、1個または5個を超える内部リジン及び/またはN末端アミノ酸に部位特異的に結合体化される1つ以上のヒドラジノニコチンアミド(HYNIC)部分を介して標識されるインターロイキン−8またはその類似体もしくは誘導体が、提供される。IL−8は、好ましくは放射性標識によって標識される。より好ましくは、放射性標識は99mTc及び94mTcから選択される。最も好ましくは、放射標識は99mTcである。
Description
本発明は、N末端アミノ酸に、及び/あるいはインターロイキン−8(IL−8)またはその類似体もしくは誘導体の1つ以上の内部リジンに選択的に結合体化される、1つ以上のヒドラジノニコチンアミド(HYNIC)部分を介して標識される新規化合物に関する。
急性、亜急性及び慢性の感染症及び炎症の局在化のシンチグラフィーによる検出は、感染性または炎症性疾患患者の管理に重要な影響をもたらす可能性があることから、臨床診療における困難な問題となっている。臨床医が最適な処置を早急に開始できるようにするには、これらの患者における炎症性病巣の適切な描写が臨床上重要となる。臨床歴及び理学的検査が決定的でない場合、臨床医は、疾患の局在化、範囲及び重症度を測定するために幾つかの診断法から選択することができる。磁気共鳴イメージング及びスパイラルコンピュータ断層撮影のような新しい高感度の放射線検査は、比較的小さな病巣の異常を位置決定することが可能である。しかし、これらの放射線法は形態変化に依存する。従って、これらは感染の初期段階では精度が低く、感染の治癒によるまたは外科手術後(瘢痕組織)の解剖学的変化と活発なプロセスを区別することができない。
核医学では、放射性標識化合物(放射性医薬品)が注射され、体全体にわたる放射能の分布が、専用のガンマカメラを使用して視覚化される。シンチグラフィー画像は、形態的変化に依存せず、組織内の生理化学的なプロセスに基づく。従って、シンチグラフィー技術は又、形態変化がまだはっきり見えない初期段階に感染病巣を視覚化することもできる。更に、シンチグラフィーによるイメージングは、体全体にわたる感染性または炎症性疾患の程度を測定することできる、優れた非侵襲性の全身スキャニング方法である。
ヒトIL−8は、小さな走化性タンパク質であり、好中球上の受容体に高い親和性で結合する。ヒトIL−8には2種類のアイソフォームが天然に存在する。最も豊富な形状は、単球によって産生される72アミノ酸の改変型である。IL−8の77アミノ酸の改変型は、内皮細胞によって産生され、N末端で5個のアミノ酸によって伸長される。短い形状の方が長い形状よりも好中球の誘引及び活性化が強力であるが、何れの形状もナノモル濃度で活性を有する。以前に感染症及び炎症のイメージングの前臨床及び臨床研究で使用されていたのは、IL−8の72アミノ酸アイソフォームだけであった。放射性標識IL−8が炎症をイメージングする潜在能力については、非特許文献1において最初に報告された。クロラミンT法により放射性ヨウ素標識されたIL−8の、ラットにおけるカラゲナン誘発無菌炎症における取り込みは、注射後1〜3時間でピークに達し、その後低下した。8名の糖尿病患者による予備実験では、123I−IL−8が活動性の足の感染症を視覚化できることを研究者等が示した[非特許文献2]。
この標識法は、放射性ヨウ素標識IL−8のin vivoにおける生体内分布に大きな影響を与えるように思われた。ボルトンハンター法により標識されたIL−8のシンチグラフィーイメージングの特性は、in vitroにおいて細胞結合特性が類似するのにもかかわらず、ヨードジェン法により標識されたIL−8よりも明らかに優れていた[非特許文献3]。このIL−8製剤の比放射能は比較的低く、123I−IL−8のイメージング線量(25μg/kg)は、末梢白血球数を45%まで一時的に低下させた後、数時間にわたって白血球増加(注射前レベルの170%)が生じた。
最近になって、キレート剤としてHYNICを使用する99mTc標識IL−8製剤の開発が報告された[非特許文献4〜非特許文献9]。この製剤は、ウサギの4種類の感染症及び炎症モデルにおいて感染症をイメージングするに当たり優れた特性を示した。大腸菌により誘発された筋肉内感染症に罹患するウサギでは、膿瘍内における99mTc標識IL−8の取り込みが早く且つ多かった。更に、99mTc標識IL−8では、非標的組織からの除去が著しく早いことが示された。膿瘍対筋肉比は、注射から6時間後に200を越えた。
化学的に急性結腸炎を誘発させたウサギでは、99mTc標識したIL−8または精製顆粒球の何れかを注射した後、シンチグラフィーにより炎症性病変を視覚化した。注射後数時間以内に、99mTc標識IL−8では、炎症を起こした結腸の適切な評価が可能となった。結腸の炎症巣における絶対取り込みは、99mTc標識顆粒球よりも99mTc標識IL−8の方が遥かに高かった。
第3の研究では、99mTc標識IL−8の能力がウサギの急性骨髄炎実験モデルで評価された。これらの評価結果を、従来の十分に確立された薬剤である111In−顆粒球、67Ga−クエン酸塩、及び99mTc−MDP(MDP=メチレンジホスホネート)を使用して得た結果と比較した。この骨髄炎ウサギモデルでは、99mTc−IL−8が骨髄炎の病巣をはっきりと描写した。骨髄炎領域における絶対取り込みは、67Ga−クエン酸塩及び99mTc−MDPで得た取り込みよりも低かったが、標的対バックグラウンド比は、99mTc−IL−8の方が有意に高かった。
そして最後に、3種類のウサギ実験モデル(免疫無防備状態ウサギのアスペルギルス症モデル、免疫応答性ウサギの肺炎球菌性(グラム陽性)肺炎モデル及び大腸菌誘発性(グラム陰性)肺炎モデル)で、肺感染をイメージングする99mTc標識IL−8の潜在能力を試験した。99mTc−IL−8は、3つの肺感染実験モデルそれぞれで、肺感染の局在化及び範囲の早期(注射後2時間以内)且つ優れた視覚化を可能にした。感染巣における99mTc−IL−8の取り込みは、殆どの場合で高く、大腸菌モデルでは、感染巣における取り込みが、主要な除去器官である腎臓における取り込みを遥かに上回った。
IL−8は、炎症促進性の走化性サイトカインである。シンチグラフィーの用途では、投与するタンパク質の用量を、副作用を生じるレベル未満にしなければならない。ニコチン酸をコリガンドとして使用した場合、高比放射能(80MBq/μg)及びin vitroでの高安定性を有する製剤を調製することができたことを示した。投与するタンパク質の用量は、わずか70ng/体重kgであった。このような低用量のタンパク質での副作用は、ヒトの系では予想されない。感染性及び炎症性障害の患者に99mTc−IL−8を使用した初期の結果により、99mTc−IL−8が実際にこれらの用量レベルで安全に投与できることが証明された。
99mTc−IL−8は、標的組織内における迅速な蓄積、並びに血液及び非標的組織からの迅速な除去といった、感染症の造影剤として長所を有する。放射能は主として腎臓を介して除去され、これは肝胆道における除去を上回る利点である。肝臓及び腸の放射能が高いと、この薬剤が腹部のイメージングに好適でなくなると考えられてきた。
99mTc−IL−8には、感染症のイメージングに最も一般的に使用される2つの放射性医薬品である67Ga−クエン酸塩及び放射性標識白血球に優る利点が幾つかある。放射性核種99mTcは、その実質的に理想的な物理的特性(短い半減期、理想的なエネルギー、及び低い放射線負荷)、費用対効果、並びに一般的な可用性ゆえに、67Gaよりも好まれる。67Gaは、より長い物理的半減期及び高エネルギーガンマ線を有し、高い放射線吸収線量を引き起こし、且つ低解像度の画像を生成する。通常、67Ga−クエン酸塩は、比較的遅効性の薬物動態を示す。その結果、放射性医薬品の注射とイメージングの間には長い間隔が必要となる。一般的に、67Gaのイメージングは、注射後48〜72時間の間に行われる。99mTc−IL−8を使用するウサギのイメージングでは、注射とイメージングの間に2時間の間隔があれば十分であった。
放射性標識白血球に比べて、99mTc−IL−8の調製は、簡単且つ短時間に行うことができ、30分以内に準備ができ、更なる精製の必要がない。111Inまたは99mTcの何れかを使用する放射性標識白血球の準備は、煩雑で、時間を要し、顆粒球減少患者には使用できない。患者からの採血、白血球の精製、及びこれらの細胞の標識化の手順には、訓練を受けた技術者でも約3時間を要する。細胞は、再注射の際、炎症部位に移動するそれらの能力を保つために、慎重に扱われなければならない。更に、汚染された可能性がある血液を扱わなければならない必要性があることから、HIV等の血液感染病原体の感染をもたらす可能性があり、職員及び患者の双方に深刻な危険をもたらす。99mTc−IL−8を使用して白血球をin vivoで標識化する簡便な方法は、上に詳述した新規の方法の利点全てを利用して、従来のex vivoにおける標識化方法を反映する。
Hay,ら,Nucl.Med.Commun.,1997,18;367−378 Gross,ら,J.Nucl.Med.Chem.,2001;42;1656−1659 van der Laken,ら,J.Nucl.Med.Chem.,2000;41;463−469 Rennen,ら,J.Nucl.Med.,2001;42;117−123 Rennen,ら,Bioconjug.Chem.,2002;13;370−377 Rennen,ら,J.Nucl.Med.,2003;44;1502−1509 Gratz,ら,J.Nucl.Med.,2001;42;917−923 Gratz,ら,J.Nucl.Med.,2001;42;1257−1264 Rennen,ら,Chest.2004 Dec,126(6),1954−1961
Hay,ら,Nucl.Med.Commun.,1997,18;367−378 Gross,ら,J.Nucl.Med.Chem.,2001;42;1656−1659 van der Laken,ら,J.Nucl.Med.Chem.,2000;41;463−469 Rennen,ら,J.Nucl.Med.,2001;42;117−123 Rennen,ら,Bioconjug.Chem.,2002;13;370−377 Rennen,ら,J.Nucl.Med.,2003;44;1502−1509 Gratz,ら,J.Nucl.Med.,2001;42;917−923 Gratz,ら,J.Nucl.Med.,2001;42;1257−1264 Rennen,ら,Chest.2004 Dec,126(6),1954−1961
現在までにHYNICを99mTcキレート基として使用して実施、発表された研究では、HYNIC基が、IL−8分子の第1級アミノ基に無作為に結合された。IL−8は、1つのαアミノ基(N末端)と9つのεアミノ基(リジン側鎖)を含んでいる。ペプチドの活性部位が化学的に改変されると、IL−8の受容体結合親和性が低下する可能性があった。本発明者等は、異なる結合体モル比(IL−8:HYNIC=1:1〜1:10)及び異なる反応時間(3〜60分)を使用して、一連のHYNIC−IL−8結合体を調製した。それにより、より多くのHYNIC部分がIL−8に結合体化されると、99mTc標識HYNICに結合体化したIL−8の白血球受容体結合能力が大幅に低下することが示された。このことは、IL−8分子のεアミノ基のいくつかは、受容体結合時に悪影響を及ぼすことなくこのように改変できないことを示している。
それゆえ、本発明に従って、所定の方法で改変されたIL−8であって、前記IL−8が、内部リジン及び/またはIL−8分子のN末端アミノ酸に部位特異的に結合体化された1つ以上のヒドラジノニコチンアミド(HYNIC)部分を介して標識されている、IL−8、またはその類似体もしくは誘導体を提供する。
本発明によれば、HYNIC部分は、N末端アミノ酸に結合体化され、そして1つ以上の内部リジンに部位特異的に結合体化される場合がある。或いは、HYNIC部分は、N末端アミノ酸または1つ以上の内部リジンにのみ結合体化される場合がある。好ましくは、HYNIC部分は、少なくともN末端アミノ酸に、及び0、1、2、3、4、5、6、7、8または9個の内部リジンの何れかに結合体化される。
本発明は、既存の無作為の結合体化よりもむしろ、特異的で十分に規定されたHYNIC IL−8結合体の合成を可能にする。十分に規定されたHYNIC−IL−8結合体が全体生成物の約80%を超える量を構成する、HYNIC−IL−8結合体の合成が可能である。選択性は、好ましくは約85%を超え、より好ましくは約90%を超え、更に好ましくは約95%を超える。最も好ましくは、HYNIC−IL−8結合体は、98%を超える量の十分に規定されたHYNICに結合体化されるIL−8生成物を含む。
IL−8は、好ましくは放射性標識によって標識される。より好ましくは、放射性標識は99mTc及び94mTcから選択される。最も好ましくは、放射標識は99mTcである。
72及び77アミノ酸の両アイソフォームを本発明に従って改変することができるが、好ましいのは72アミノ酸アイソフォームである。
IL−8の類似体及び誘導体とは、ヒト天然IL−81−72の残基1〜3及び67〜72に改変、欠失または交換を有するIL−8を意味する。IL−8の生物活性に必須なのは、IL−84−66コア(core)である。従って、残基1〜3及び67〜72は、IL−8の生物学的機能に重要な影響を与えることなく、欠失、改変または交換することができる。
又、本発明に従って、1つ以上のHYNIC部分をインターロイキン−8に部位特異的に結合体化する方法であって、
a)保護、固定されたIL−8を提供する;
b)ヒドラジノニコチン酸を固定されたIL−8にカップリングする;
c)HYNICに結合体化したIL−8を脱保護する;
d)脱保護したHYNICに結合体化したIL−8を固体支持体から切断する、
ことを含む、方法も提供する。
a)保護、固定されたIL−8を提供する;
b)ヒドラジノニコチン酸を固定されたIL−8にカップリングする;
c)HYNICに結合体化したIL−8を脱保護する;
d)脱保護したHYNICに結合体化したIL−8を固体支持体から切断する、
ことを含む、方法も提供する。
この方法は又、1つより多くのHYNIC部分をIL−8に段階的且つ部位特異的に結合体化するのにも使用できる。これは、手順(a)で、1つ以上のHYNIC部分によって既に部位特異的に結合体化され、保護、固定されたIL−8を提供することにより達成することができる。
好ましくは、この方法を使用して、1つのHYNIC部分をN末端アミノ酸と結合体化する。この方法は、好ましくは固相ペプチド合成を使用して実施される。
本発明の方法は、結果として得られる生成物が、約80%を超える量、好ましくは約85%を超える量、より好ましくは約90%を超える量、更により好ましくは約95%を超える量、及び最も好ましくは約98%を超える量の、所望のHYNICに結合体化したIL−8有するように、HYNIC結合体化の選択性を達成することができる。
この方法は、最も好ましくは、N末端アミノ酸のみへの1つのHYNIC部分の結合体化のために使用される。
好ましくは、この方法は更に、手順(d)により得られた生成物を標識源と接触させることも含む。標識源は、好ましくは、99mTc等の放射性標識を含む。99mTcの好ましい線源は、99mTcO4 −である。
ペプチドIL−8は、自動ペプチドシンセサイザーで合成される。ペプチドIL−8は、任意の好適な支持体上に固定することができる。ヒドラジノニコチン酸(これはヒドラジン基を保護するのに必須である)をIL−8にカップリングした後、固定させたHYNICに結合体化したペプチドを脱保護して、固体支持体から切断する。
IL−8の活性化は、好ましくは1つ以上のカップリング剤の存在下で実施される。その他のカップリング剤も使用できるが、好ましく使用されるカップリング剤は、O−ベンゾトリアゾール−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt)、2−(1H−7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)、または1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)である。
IL−8の脱保護は、ピペリジン等の任意の好適な第2級アミンを使用した後、例えばN−メチル−2−ピロリジン(NMP)で洗浄してアミンを除去することにより実施することができる。
脱保護、固定されたHYNICに結合体化したIL−8の固体支持体からの切断は、例えばトリフルオロ酢酸、水、1,2−エタンジチオール、及びトリイソプロピルシランの混合物を使用することにより行うことができる。IL−8は次いで精製される。
手順(a)で提供されるIL−8は、樹脂等の任意の好適な固体支持体上に固定される場合がある。
IL−8は、好ましくは、FmocまたはBocを保護基として使用して保護される。固相合成時にHYNICをIL−8に結合体化することが必須である。
本発明は又、感染症及び炎症を診断するための薬学的組成物の調製におけるIL−8の使用も含む。
N末端アミノ酸及び/または1つ以上の内部リジンに結合体化されるHYNIC部分を介して、例えば99mTcで標識されるヒトIL−8類似体は、以下の異なる利点の1つ以上を提供する場合がある:
− 99mTc−キレートHYNIC基は、十分に規定された部位特異的様式でIL−8に結合する;
− 導入されるHYNIC基は、受容体の相互作用に干渉しないような位置に配置されることで、IL−8の高い受容体結合親和性を維持する;及び
− HYNIC−IL−8結合体は、HYNIC部分の所定量(例えば、N末端だけが標識される場合の正確な量)を含み、この量は、より高い比放射能(MBq/nmol)の99mTc−IL−8製剤の調製を可能にする量であり、患者にペプチド低用量の投与を可能にする量であって、それによって望ましくない副作用の発生を低減する。
− 99mTc−キレートHYNIC基は、十分に規定された部位特異的様式でIL−8に結合する;
− 導入されるHYNIC基は、受容体の相互作用に干渉しないような位置に配置されることで、IL−8の高い受容体結合親和性を維持する;及び
− HYNIC−IL−8結合体は、HYNIC部分の所定量(例えば、N末端だけが標識される場合の正確な量)を含み、この量は、より高い比放射能(MBq/nmol)の99mTc−IL−8製剤の調製を可能にする量であり、患者にペプチド低用量の投与を可能にする量であって、それによって望ましくない副作用の発生を低減する。
本発明のHYNIC−IL−8化合物は、70%を超える、好ましくは80%を超える、より好ましくは85%を超える、更に好ましくは90%を超える、及び最も好ましくは95%を超える受容体結合能を達成することができる。
本発明を更に、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を一切制限することなく、単に説明を目的としたものである。
(実施例1 N末端に結合体化されるHYNIC1−IL−8の合成:)
ヒト72アミノ酸IL−8のアミノ酸配列は、以下の通りである。
ヒト72アミノ酸IL−8のアミノ酸配列は、以下の通りである。
(ペプチドIL−8の合成:)
ABI FastMoc0.25mmolプロトコル(参考文献1、2)(但し、カップリング時間は20分ではなく45分)を使用し、ABI 433A自動ペプチドシンセサイザーで固定化ペプチドを構築した。合成はArgoGel−Wang樹脂(Argonaut Technologies、容量0.37mmol/g)上で行った。
ABI FastMoc0.25mmolプロトコル(参考文献1、2)(但し、カップリング時間は20分ではなく45分)を使用し、ABI 433A自動ペプチドシンセサイザーで固定化ペプチドを構築した。合成はArgoGel−Wang樹脂(Argonaut Technologies、容量0.37mmol/g)上で行った。
N−メチル−2−ピロリドン(=NMP)中の20%ピペリジン溶液によってFmoc基を切断した後(3分及び7.6分)、樹脂をNMPで洗浄した(5回)。その後、4当量(1mmol)の適切なアミノ酸をNMP(2mL)に溶解した後、NMP中のHBTU/HOBt(1mmol、0.36Mの2.78mL)を加えた。この混合物にNMP中のN,N−ジイソプロピルエチルアミン(=DiPEA)(1mL、2M)を加えた後、活性化されたアミノ酸を反応槽に移した。45分後、この反応槽の液体を捨て、樹脂をNMPで洗浄した(3回)。脱保護及びカップリング反応が行われたら、301nmでジベンゾフルベン−ピペリジン付加物のモニタリングを行った。最後のアミノ酸カップリングサイクルの後、Fmoc基を除去して、樹脂に結合した保護ペプチドの遊離N末端にFmoc−6−ヒドラジノニコチン酸をカップリングさせた(4当量、NMP中のHBTU/HOBt(4当量)、DiPEA(8当量)、45分間)。Fmoc−6−ヒドラジノニコチン酸のカップリングをもう一度繰り返し、確実に反応を完了させた。最後のカップリングサイクル後、ピペリジン溶液でFmoc基を除去し、樹脂をNMP(5回)及びジクロロメタン(DCM)(6回)で洗浄した。最後に、樹脂を反応槽から取り出し、DCM、MeOH、及びエーテルで洗浄して、P2O5上で真空乾燥させた。
このようにして得た固定ペプチドを脱保護して、45mLのトリフルオロ酢酸(=TFA)、2.5mLの水、1.25mLの1,2−エタンジチオール(=EDT)、及び1.25mLのトリイソプロピルシラン(=TIS)により室温にて3時間処置することによって、固体支持体から切断させた。次いで、混合物をろ過し、残渣をTFAで完全に洗浄した(5mLで3回)。この反応混合物を約10mLの容積まで真空濃縮し、残渣を90mLのMTBE/n−ヘキサン溶液(1/1、容積/容積)に滴加した。そして沈澱物を遠心分離(3000rpmで10分間)によって回収し、上澄みをデカントし、ペレットをMTBE(100mL)溶液で再懸濁させて、再び遠心分離させた。これを2回繰り返した。その後ペレットをアセトニトリル/水溶液(1/1、容積/容積)(約60mL)に溶解して凍結乾燥させ、線毛状の白色固体である粗ペプチドを得た。
50mgのバッチで、この粗ペプチドを4mLの6M グアニジンHCl、0.1M Tris HCl、20%メルカプトエタノールによりpH8.5で溶解して処置し、45℃で2時間攪拌した後、1mLの酢酸で酸性化した。
還元した粗ペプチドを含むこの混合物をPhenomenex分取カラム(250×21.2mm、C18、110Å、10μm)に充填し、島津自動分取LCMSシステムを使用して、12.5mL/分の流速で240分間にわたり、保持した物質を0.1% TFA中で0〜60%の水−アセトニトリル勾配にて溶出させた。正しい質量ピークを含む画分を、純度評価のためにPhenomenexカラム(250×4.6mm、C18、110Å、5μm)上に再度通し、主要ピークを含む画分をプールして、凍結乾燥させた。ペプチドを折りたたみ及び酸化させるため、この物質をリン酸緩衝化生理食塩水中で一晩再構成させた。
(参照文献:)
HBTU=2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt=1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
MTBE=tert−ブチルメチルエーテル
(N末端に結合体化したHYNIC1−IL−8の99mテクネチウムによる標識化)
凍結乾燥させたコリガンドキットを、30μgのSnSO4、45mgのトリシン、及び4mgのニコチン酸を含有させて、調製した。放射性標識の開始直前に600μLの0.9% NaCl溶液をコリガンドキットに加えた。
10μgのHYNIC1−IL−8試料に、400μLの再構成させたコリガンドキットを生理食塩水中の400MBqの99mTcO4 −と共に加えた。この混合物を70℃で30分間インキュベートした。この製剤の放射化学的純度を、移動相の0.1Mクエン酸塩(pH6.0)と共にITLC−SGストリップ(Gelman Laboratories[米国ミシガン州アン・アーバー])で、インスタント薄層クロマトグラフィー法(ITLC)により測定した。
標識反応の後、反応混合物をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)で40MBq/mLの終濃度に希釈し、ウサギに静脈内投与できる状態にした。
(実施例2 1つ以上の内部リジンに結合体化したHYNICを有するIL−8の合成:)
HYNIC基を9個の内部リジン(IL−8のアミノ酸配列では「K」に省略)の1つ以上に結合体化する。ここで、HYNICx−IL−8の特定の位置「X」にHYNIC基を導入するために、固相ペプチド合成のアミノ酸の構築ブロックとして、Fmoc−Lys(BOC)−OHの代わりにFmoc−Lys(HYNIC−BOC)−OHを使用する。
HYNIC基を9個の内部リジン(IL−8のアミノ酸配列では「K」に省略)の1つ以上に結合体化する。ここで、HYNICx−IL−8の特定の位置「X」にHYNIC基を導入するために、固相ペプチド合成のアミノ酸の構築ブロックとして、Fmoc−Lys(BOC)−OHの代わりにFmoc−Lys(HYNIC−BOC)−OHを使用する。
更に、(実施例1と同様に)N末端に並びに(実施例2と同様に)1つ以上の内部リジンに結合体化したHYNICを使用して、固相ペプチド合成によりIL−8の誘導体を合成することも可能である。
(動物試験)
動物試験は現地の動物愛護委員会のガイドラインに従って実施した。10匹の雌のニュージーランド白ウサギ(2.4〜2.7kg)の左大腿筋に、0.5mL中の大腸菌(Escherichia coli)の1011のコロニー形成単位(cfu)で膿瘍を誘発させた。処置の間に、ウサギを0.315mg/mLのフェンタニル及び10mg/mLのフルアニソン(Hypnorm、Janssens Pharmaceutical[英国バッキンガムシャー])の混合物0.6mLを皮下注射することによって鎮静させた。
動物試験は現地の動物愛護委員会のガイドラインに従って実施した。10匹の雌のニュージーランド白ウサギ(2.4〜2.7kg)の左大腿筋に、0.5mL中の大腸菌(Escherichia coli)の1011のコロニー形成単位(cfu)で膿瘍を誘発させた。処置の間に、ウサギを0.315mg/mLのフェンタニル及び10mg/mLのフルアニソン(Hypnorm、Janssens Pharmaceutical[英国バッキンガムシャー])の混合物0.6mLを皮下注射することによって鎮静させた。
24時間後、筋肉の腫張が見て取れた際に、5匹のウサギに耳静脈から40MBqの99mTc−HYNIC1−IL−8を注射した。そのうち3匹のウサギをガンマカメライメージングに使用した。イメージングに当たっては、ウサギを固定して、ガンマカメラ上に腹臥位に置き、耳側部の静脈に99mTc−HYNIC1−IL−8または99mTc−HYNICx−IL−8(x=2〜10)の何れかを注射した。注射後(p.i.)1分、1時間、3時間及び5時間の段階で、平行孔・低エネルギーの汎用コリメーターを搭載したシングルヘッド型ガンマカメラ(Orbiter、Siemens Medical Systems Inc.[米国ホフマンエステート])で画像を記録した。画像(1画像当たり200,000〜300,000カウント)は256×256マトリックスにて、デジタル形式で、収集し保存した。
最後のイメージング及び採血(注射5時間後)が完了したら、ウサギを致死量のフェノバルビタールナトリウムで安楽死させた。血液、感染した大腿筋、非感染の対側大腿筋、肺、脾臓、肝臓、腎臓及び腸の試料を、収集した。解剖した組織の重量を測り、ガンマカウンターで測定した。又、放射性崩壊の補正のために、注射標準を同時に測定した。試料で測定した放射能の量は、組織1g当たりの注射用量の割合(%ID/g)として表した。そして膿瘍対対側筋及び膿瘍対血液の比率を算出した。
(結果)
(HYNIC1−IL−8の99mTc標識化)
インスタント薄膜クロマトグラフィーで測定した99mTc−HYNIC1−IL−8の放射化学的純度は、98%であった。本試験で使用した製剤の比放射能は、IL−8 1μg当たり40MBqであった。
(HYNIC1−IL−8の99mTc標識化)
インスタント薄膜クロマトグラフィーで測定した99mTc−HYNIC1−IL−8の放射化学的純度は、98%であった。本試験で使用した製剤の比放射能は、IL−8 1μg当たり40MBqであった。
(動物試験)
筋肉内感染症のウサギにおける99mTc−HYNIC1−IL−8の生体内分布を、以下の表に要約する。
筋肉内感染症のウサギにおける99mTc−HYNIC1−IL−8の生体内分布を、以下の表に要約する。
又、本発明を、添付の図を参照して説明する。
図1は、N末端でIL−8に結合体化されるHYNICの構造を示す。
図2は、注射から1時間、3時間及び5時間後における代表的な筋肉内感染症を有するウサギ(ウサギ5匹の群の内の1匹)のシンチグラフィー画像を示す。
Claims (18)
- 1つ以上の内部リジン及び/またはN末端アミノ酸に部位特異的に結合体化される1つ以上のヒドラジノニコチンアミド(HYNIC)部分を介して標識されるインターロイキン−8またはその類似体もしくは誘導体。
- 前記N末端アミノ酸及び1つ以上の内部リジンに部位特異的に結合体化されるHYNIC部分を含む、請求項1に記載のインターロイキン−8。
- 前記N末端アミノ酸及び1つの内部リジンに部位特異的に結合体化されるHYNIC部分を含む、請求項2に記載のインターロイキン−8。
- 前記N末端アミノ酸にのみ結合体化されるHYNIC部分を含む、請求項1に記載のインターロイキン−8。
- 1つ以上の内部リジンにのみ部位特異的に結合体化されるHYNIC部分を含む、請求項1に記載のインターロイキン−8。
- 前記インターロイキン−8が放射性標識によって標識される、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−8。
- 前記放射性標識が99mTcである、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−8。
- 前記インターロイキン−8の72アミノ酸アイソフォームを含む、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−8。
- 約80%を超える量の、1つの特定のHYNICに結合体化したインターロイキン−8を含む、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−8。
- 1つ以上のHYNIC部分をインターロイキン−8に部位特異的に結合体化する方法であって、
a)保護、固定されたインターロイキン−8を提供する;
b)ヒドラジノニコチン酸を固定されたインターロイキン−8にカップリングする;
c)該HYNICに結合体化したインターロイキン−8を脱保護する;
d)脱保護したHYNICに結合体化したインターロイキン−8を固体支持体から切断する、
ことを含む、方法。 - 手順(a)で提供される前記保護、固定されたインターロイキン−8が、1つ以上のHYNIC部分によって予め部位特異的に結合体化されている、請求項10に記載の方法。
- 約80%を超える量の、1つの特定の十分に規定されたHYNICに結合体化したインターロイキン−8を含む、HYNICに結合体化したインターロイキン−8生成物を生成する、請求項10または請求項11に記載の方法。
- 1つのHYNIC部分が、前記インターロイキン−8のN末端アミノ酸にのみ結合体化される、請求項10〜請求項12の何れかに記載の方法。
- 前記方法が、固相ペプチド合成を使用して実施される、請求項10〜請求項13の何れかに記載の方法。
- 手順(d)により得られた生成物を標識源と接触させることを更に含む、請求項10〜請求項14の何れかに記載の方法。
- 前記標識源が放射性標識を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記放射性標識が99mTcである、請求項16に記載の方法。
- 感染症及び炎症を診断するための薬学的組成物の調製における、請求項1〜請求項9の何れかに記載のインターロイキン−8の使用。
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