JP2009511073A - インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 - Google Patents
インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009511073A JP2009511073A JP2008535808A JP2008535808A JP2009511073A JP 2009511073 A JP2009511073 A JP 2009511073A JP 2008535808 A JP2008535808 A JP 2008535808A JP 2008535808 A JP2008535808 A JP 2008535808A JP 2009511073 A JP2009511073 A JP 2009511073A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- influenza
- cells
- amino acid
- influenza virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
特に明記しない場合は、すべての科学用語及び技術用語は、それらが関係する分野で通常使用されているものと同じ意味を有すると理解される。本発明の目的において以下の用語が下記に定義される。
インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原性ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、及び6つのコアポリペプチド(ヌクレオカプシド核タンパク質(NP);マトリックスタンパク質(M);非構造タンパク質(NS);及び3つのRNAポリメラーゼ(PA、PB1、PB2)タンパク質)をコードする線状(−)鎖リボ核酸(RNA)の8つのセグメントからなる。複製中、ゲノムウイルスRNAは、宿主細胞の核内の(+)鎖メッセンジャーRNAおよび(−)鎖ゲノムcRNAに転写される。8つの各ゲノムセグメントは、RNAに加えて、NPとポリメラーゼ複合体(PB1、PB2、及びPA)とを含むリボ核タンパク質複合体にパッケージングされる。
発現されるべきインフルエンザウイルスゲノムセグメントは、mRNA合成を指令するための適切な転写制御配列(プロモーター)に機能できる形で結合される。種々のプロモーターが、インフルエンザウイルスゲノムセグメントの転写を調節するために、発現ベクターで使用するのに適している。特定の実施形態において、例えばベクターがプラスミドpAD3000である場合、サイトメガロウイルス(CMV)DNA依存性RNAポリメラーゼII(Pol II)が使用される。所望であれば、例えば条件発現を調節するために、特定の条件下で又は特定の組織もしくは細胞中でRNA転写を誘導する他のプロモーターを代用することができる。無数のウイルスおよび哺乳動物(例えばヒト)プロモーターが利用可能であるか、又は意図される具体的な用途に従って単離することができる。例えば動物及びヒトウイルスのゲノムから得られる別のプロモーターとして、アデノウイルス(例えば2型アデノウイルス)、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、及び種々のレトロウイルスプロモーターなどのプロモーターが挙げられる。哺乳動物のプロモーターとして、特に、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどが挙げられる。さらに、バクテリオファージプロモーターを同種のRNAポリメラーゼ(例えばT7プロモーター)とともに使用することができる。
一般的には、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするゲノムセグメントは、その発現(機能的ウイルスタンパク質への翻訳を含む)に必要な任意の追加の配列を含む。他の状況では、ウイルスタンパク質(例えばHA又はNAタンパク質)をコードするミニ遺伝子又は他の人工的構築物を使用することができる。この場合、異種コード配列の効率的な翻訳を助ける特定の開始シグナルを含むことがしばしば望ましい。これらのシグナルとして、例えばATG開始コドン及び隣接配列を挙げることができる。インサート全体の翻訳を確実にするために、開始コドンはウイルスタンパク質に対して正しいリーディングフレームで挿入される。外因性の転写要素及び開始コドンは様々な起源(天然及び合成)であることができる。発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーを含むことにより増強することができる。
歴史的に、インフルエンザウイルスワクチンは、関連する株の経験的予測に基づいて選択されたウイルス株を使用して、発育鶏卵で製造されている。さらに最近は、認可された弱毒化、温度感受性マスター株の関連で、選択されたヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ抗原を組み込んだ再集合ウイルスが製造されている。鶏卵中で複数回継代してウイルスを培養した後、インフルエンザウイルスを回収し、場合により、例えばホルムアルデヒド及び/又はβ-プロピオラクトンを使用して不活性化する。しかしこの方法によるインフルエンザワクチンの製造はいくつかの大きな欠点がある。鶏卵からの残存汚染物質は非常に抗原性、発熱原性であり、投与するとしばしばかなりの副作用を引き起こす。さらに重要なことは、典型的にはインフルエンザウイルスの製造及び不活性化のための時間を考慮するために、次のインフルエンザシーズンの何ヶ月も前に、製造のために指定される株を選択し、配分する必要がある。細胞培養で組換えワクチン及び再集合ワクチンを製造する試みは、ワクチン製造のために認可された株のいずれもが標準的細胞培養条件下で効率的に増殖することができないことによって制限されている。
ある態様において、本発明は、好適なマスタードナーのウイルス株においてts表現型の基礎をなす突然変異の決定を基礎とする。MDV株ゲノムにおける単一ヌクレオチド変化の機能的重要性を判定するために、A/AA/6/60系統内の高度に関連する株に由来する再集合ウイルスを温度感受性について評価した。2つの親株の同種同系性が、ts表現型に対する単一ヌクレオチド変化の評価を可能にする。従って、MDV-Aのts表現型の遺伝子的根拠が、PB1、PB2、及びNP内の特定のアミノ酸残基に対してヌクレオチドレベルでマッピングされる。
本発明はまた、発育鶏卵及び/又は宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製能力を上昇させるために、HA及びNA中に少なくとも1つのアミノ酸残基置換を導入する方法を提供する。本発明はさらに、HA及び/又はNA非置換インフルエンザウイルスと比較して、発育鶏卵及び/又は宿主細胞中での複製能力が増強したインフルエンザウイルス変異体(以後「複製増強変異体」と呼ぶ)を提供する。特に、本発明の方法が宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの複製を増強するのに使用できること、及び複製増強変異体は鶏卵及び/又は宿主細胞で複製が増強されることが意図される。インフルエンザウイルスの複製に適した宿主細胞には、例えばVero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、及びCOS細胞(293T細胞、COS7細胞を含む)がある。
典型的には、ウイルスの増殖は、宿主細胞が通常培養される培地組成物中で行われる。インフルエンザウイルスの複製のための適当な宿主細胞には、例えばVero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、及びCOS細胞(293T細胞、COS7細胞を含む)などがある。複製効率を改善するために、通常、上記細胞株の2つを含む共培養物(例えば、MDCK細胞と293TもしくはCOS細胞)が例えば1:1の比で使用される。典型的には、細胞は、標準的な市販の培養培地、例えば血清(例えば10%ウシ胎児血清)を補充したダルベッコ改変イーグル培地、又は血清無含培地中、中性緩衝化pH(例えば、PH7.0〜7.2)を維持するのに適したCO2濃度及び制御された湿度下で培養される。場合により、培地は、細菌増殖を防ぐための抗生物質(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど)、及び/又は追加の栄養物質(例えば、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸など)、好適な増殖特性を促進するための追加の補助物質(例えばトリプシン、β−メルカプトエタノール)などを含有する。
真核細胞に異種核酸を導入するための当該分野で周知の方法(例えばリン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を使用するトランスフェクション)に従って、インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターが宿主細胞に導入(例えばトランスフェクト)される。例えば、ベクター(例えばプラスミド)は、ポリアミントランスフェクション試薬TransIT-LT1(Mitrus)を製造業者の説明書に従って用いて、宿主細胞(例えばCOS細胞、293T細胞、又はCOS細胞又は293T細胞及びMDCK細胞との組合せ)にトランスフェクトすることができる。160μl培地、好ましくは血清無含培地、に希釈した約2μlのTransIT-LT1により、宿主細胞集団に約1μgの各ベクターが総量200μlで導入される。このDNA:トランスフェクション試薬混合物は室温で45分間インキュベートされた後、さらに800μlの培地を加える。トランスフェクション混合物を宿主細胞に加え、該細胞を上記したように培養する。組換え又は再集合ウイルスを細胞培養で製造するために、8つの各ゲノムセグメント(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA、及びNA)を組み込んだベクターを約20μlのTransIT-LT1と混合し、宿主細胞にトランスフェクトする。場合により、トランスフェクション前に血清含有培地を血清無含培地(例えばOpti-MEM I)で取換え、4〜6時間インキュベートする。
ウイルスは、典型的には、感染(トランスフェクト)した細胞が増殖した培養培地から回収される。典型的には、インフルエンザウイルスの濃縮前に粗培地は浄化される。一般的方法には、ろ過、限外ろ過、硫酸バリウムへの吸着及び溶出、並びに遠心分離がある。例えば、感染培養物からの粗培地は、まず細胞残屑や他の大きな粒状物質を除去するのに充分な時間(例えば10〜30分)で遠心分離(例えば1000〜2000xg)することにより浄化することができる。あるいは、培地を0.8μmの酢酸セルロースフィルターでろ過して、無傷の細胞や大きな粒状物質を除去する。場合により、浄化した培地上清は、次に、例えば15,000xgで約3〜5時間遠心分離してインフルエンザウイルスをペレット化する。適切な緩衝液、例えばSTE(0.01M Tris-HCl;0.15M NaCl;0.0001M EDTA)又はpH7.4のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でウイルスペレットを再懸濁した後、ショ糖(60%〜12%)又は酒石酸カリウム(50%〜10%)による密度勾配遠心分離によりウイルスを濃縮する。連続勾配又は段階的勾配(例えば、12%〜60%のショ糖勾配を4段階の12%で)が適している。勾配は、ウイルスを回収のための視覚可能なバンドまで濃縮するのに十分な速度と時間で遠心分離される。あるいは、大部分の大規模商業的用途のために、連続的な様式で稼動するゾーン遠心分離ローターを使用して、密度勾配からウイルスが溶出される。
本発明の組換え及び再集合ウイルスは、インフルエンザウイルスの1つまたはそれ以上の株に特異的な免疫応答を刺激するために、適切な担体又は賦形剤中で予防的に投与することができる。典型的には、担体又は賦形剤は、薬剤学的に許容される担体もしくは賦形剤、例えば無菌水、食塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、非感染鶏卵からの尿膜腔液(すなわち、正常な尿膜腔液「NAF」)、又はこれらの組合せである。無菌性、pH、等張性、及び安定性を確保するかかる溶液の調製は、当該分野で確立されたプロトコールに従う。一般に、担体又は賦形剤は、アレルギー及び他の好ましくない作用を最小化し、特定の投与経路(例えば、皮下、筋肉内、鼻内など)に適合するように選択される。
本発明のベクター及びベクター系の使用を容易にするために、任意のベクター(例えば、コンセンサスインフルエンザウイルスプラスミド、変異体インフルエンザポリペプチドプラスミド、インフルエンザポリペプチドライブラリープラスミドなど)、及び実験目的又は治療目的でインフルエンザウイルスのパッケージングや感染に有用な追加の成分(例えば、緩衝剤、細胞、培養培地)をキットの形でパッケージングすることができる。典型的には、キットは、上記成分に加えて、追加の物質(例えば本発明の方法を実施するための説明書、パッケージング材料、及び容器などを含むことができる)を含む。
本発明において、インフルエンザウイルス核酸及び/又はタンパク質は、周知の分子生物学的技術に従って操作される。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などを含む非常に多くのそのような方法についての詳細なプロトコールは、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2000) John Wiley & Sons, New York (「Ausubel」); Sambrook et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)、及びBerger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (「Berger」)に記載されている。
プラスミドpHW2000(Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113)を改変して、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルをシミアンウイルス40(SV40)由来のポリアデニル化シグナル配列で置換した。
polyA.1: AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT (配列番号1)
polyA.2: TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA (配列番号2))。
低温順応性A型インフルエンザウイルス/AA/6/60変異株は、一般的に、鼻内投与用のA型インフルエンザワクチンを製造するためのマスタードナーウイルスとして使用されている。この株は本発明におけるマスタードナーウイルス(MDV)の例である。簡潔にするために、このA/AA/6/60変異株をここではMDV-Aと呼ぶ。MDV-AウイルスRNAをRNeasyミニキット(Qiagen)を使用して抽出し、8つの対応するcDNA断片を表1に列挙したプライマーを用いてRT-PCRにより増幅した。
Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞とヒトCOS7細胞とを、10%ウシ胎児血清(FBS)を含有する改変イーグル培地(MEM)で維持した。ヒト胚腎細胞(293T)を5%FBSを含有するOpti-MEM I(Life Technologies)で維持した。MDCKとCOS7又は293T細胞を6ウェルプレート中で1:1の比率で共培養し、細胞を約80%コンフルエンスでトランスフェクションのために使用した。293T細胞とCOS7細胞は高トランスフェクション効率を有するが、インフルエンザウイルスの複製には許容されない。MDCK細胞との共培養により、組換えウイルスの効率的複製が確保される。トランスフェクションの前に、血清含有培地を血清無含培地(Opti-MEM I)で取換え、4〜6時間インキュベートした。TransIT-LT1(Mirus)を使用して、8つの各プラスミドDNA(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA、及びNA)1μgを、160μlのOpti-MEM Iで希釈した20μlのTransIT-LT1を総量200μlで混合することにより、プラスミドDNAトランスフェクションを行った。DNA:トランスフェクション試薬混合物を室温で45分間インキュベートした後、800μlのOpti-MEM Iを加えた。次に、トランスフェクション混合物を共培養したMDCK/293T又はMDCK/COS7細胞に加えた。トランスフェクトした細胞を35℃又は33℃で6時間〜24時間、例えば一晩、インキュベートし、トランスフェクション混合物を各ウェルにおいて1mlのOpti-MEM Iで置換した。35℃又は33℃で24時間インキュベーション後、1μg/mlのTPCK-トリプシンを含有する1mlのOpti-MEM Iを各ウェルに加え、さらに12時間インキュベートした。次に回収したウイルスをコンフルエントMDCK細胞で増幅したか又は発育鶏卵で直接増幅した。12ウェルプレート中のMDCK細胞に0.2mlのトランスフェクション混合物を室温で1時間感染させ、その後、混合物を取り出し、1μg/mlのTPCK-トリプシンを含有する2mlのOpti-MEM Iで置換した。細胞を35℃又は33℃で3〜4日間インキュベートした。増幅したウイルスを-80℃、SPG安定化剤の存在下で保存するか、又はプラーク精製し、MDCK細胞もしくは発育鶏卵で増幅した。
4つのMDV-Aポリメラーゼタンパク質PB2、PB1、PA、及びNPの機能活性を、EGFPレポーター遺伝子をコードするインフルエンザウイルスミニゲノムを複製するそれらの能力により分析した。A/PR/8/34株(H1N1)のcDNAを含有する8つの発現プラスミドのセット(例えば表4を参照)(Hoffmann et al. (2001) Eight plasmid rescue system for influenza A virus; Options for the control of influenza International Congress Series 1219:1007-1013)と、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP、pHW72-EGFP)をコードするレポーター遺伝子を含有するインフルエンザウイルスミニゲノム。
pAD3000にクローニングされた8つの各MDV-Aゲノムセグメントは、再集合実験で、MDA-Aからの単一の遺伝子セグメントを、対照A/PR/8/34株からの相補的な7つのセグメントと共に共トランスフェクトすることにより、機能的に発現されることが示された。8つすべての単一のゲノムセグメントプラスミドを相補的制御セグメントと組合せると、感染したMDCK細胞で細胞変性効果を引き起こす感染性再集合ウイルスが生成し、これは8つすべてのプラスミドが機能的MDV-Aタンパク質をコードすることを示している。
上記方法に従って、8つのMDV-Aプラスミド(組換え)、又は6つのMDV-A内部遺伝子とA/PR/8/34由来のHA及びNAとを組み込んだプラスミド(6:2再集合体)でトランスフェクトした3日後、トランスフェクトした培養物上清を使用して新鮮なMDCK細胞を感染させ、感染した細胞を1μg/ml TPCK−トリプシンの存在下、33℃で3日間インキュベートした。感染MDCK細胞に対する組換えウイルスの細胞質効果を顕微鏡を用いて観察した。ウイルスヘマグルチニンの発現を標準的な赤血球凝集アッセイ(HA)を使用してモニターした。HAアッセイは、連続2倍希釈した培養物上清50μlと1%雛赤血球50μlとを96ウェルプレートで混合することにより行った。トランスフェクトした8つのMDV-Aプラスミド又は6:2再集合ウイルスに由来する増幅ウイルスについて、約1:254〜1:1024のHA力価が検出された。E. Hoffman博士から得た8つのA/PR/8/34プラスミドを使用するトランスフェクション反応物を陽性対照として使用した。表5に示すように、これらの3つのトランスフェクション反応から感染性インフルエンザウイルスが製造された。
MDV-Aインフルエンザウイルスワクチン株は、ワクチン(例えば弱毒化生ワクチン)の製造に関連するいくつかの表現型を有する:低温順応性(ca)、温度感受性(ts)、及び弱毒化(att)。MDV-A株と非ts毒性wt A/AA/6/60株との配列比較は、これらの2つの株の間の少なくとも17ntの差を明らかにした(表6)。GeneBankデータベースで入手可能な全てのA型インフルエンザウイルスと比較した際、MDV-A配列における変化のいくつかはこの株に固有であり、これは、これらのアミノ酸置換の1つまたはそれ以上がatt、ca、及びts表現型に機能的に関連していることを示唆する。PB2821における単一アミノ酸変化は、MDV-Aのts表現型の決定因子としてすでに報告された唯一のヌクレオチド位置であった(Subbarao et al. (1995) Addition of Temperature-Sensitive Missense Mutations into the PB2 Gene of Influenza A Transfectant Viruses Can Effect an Increase in Temperature Sensitivity and Attenuation and Permits the Rational Design of a Genetically Engineered Live Influenza A Virus Vaccine J. Virol. 69:5969-5977)。
MDV-A ts表現型に対する各wt遺伝子セグメントの効果を、組換え単一遺伝子再集合体(表7)を作製することによって評価した。rMDV-AにwtPB2を導入すると、38℃でのみ非tsであるウイルスが得られた;しかし、これは39℃でtsのままであった。38℃及び39℃での(33℃と比較した)ウイルス力価の低下は、MDCK細胞におけるプラークアッセイにより測定すると、それぞれ0.6 log10と2.7 log10であった。wtPB1遺伝子セグメントを含有する再集合体は、38℃と39℃の両方でプラークを形成する能力について非tsであった。しかしこの組換え体のプラークサイズは、温度の上昇により影響を受け、rWtと比較して39℃で有意に低下した。wt NP遺伝子セグメントをrMDV-Aに導入すると、38℃で非tsであるウイルスが得られたが、wt PB2組み換え体と比較して、wt NP遺伝子セグメントを含有するウイルスは39℃でプラークを形成しなかった。wt PA、M、又はNS遺伝子セグメントを独立にrMDV-Aに導入してもts表現型は変化せず、これはこれらの遺伝子セグメントがこの表現型の維持において最小の役割を有することを示している。
ts表現型に重要な役割を果たす変化を特定するために、rWt及びrMDV-AのPB1、PB2、及びNP遺伝子セグメントの間の特定の差異を体系的に調べた。rMDV-AのNP遺伝子はrWtNPとはnt146でのみ異なった(G34D、表6)。rMDV-AのPB2遺伝子は3つの部位でrWtと異なったが、nt821のみがアミノ酸変化を生じ(N265S、表6)、これはおそらくPB2遺伝子セグメントに位置するts遺伝子座を示す。MDV-AのPB1遺伝子はwtPB1とは6nt位置で異なり、そのうち4つはコーディング変化であった(表6)。各wtアミノ酸残基置換をrMDV-AのPB1遺伝子セグメントに個々に置換して、ts表現型におけるその役割を評価した。1395G(Glu-457)と2005G(Ala)はMDV-A ts表現型に影響を与えなかった。1195A(Lys-391)と1766A(Glu-581)はそれぞれ38℃でts表現型をわずかに低下させたが、39℃では影響はなかった(表8)。これらのデータは、1195Aと1766AがPB1遺伝子セグメント中の有望なts遺伝子座であったことを示す。しかし、1195Aと1766Aの組合せは、wtPB1に似たts表現型を生じなかった(表6)。2005G(1395Aではなく)をPB1-1195A/1766Aに加えると、39℃でのウイルスts表現型がさらに低下し、これは2005AがMDV-AのPB1セグメントにより特定されるts表現型の発現における役割も有することを示している。
MDV-Aウイルス及び上記の1つまたはそれ以上のMDV-A由来セグメントを含む再集合ウイルスにより示される温度感受性及び弱毒化表現型に加えて、MDV-Aウイルスは、MDCK細胞における増殖と比較してPer.C6細胞において増殖が低下していることにより示されるように宿主細胞制限を示した。MDV-A及びMDV-A由来PB1及びPB2セグメントを含む再集合ウイルスは、図20AとBに示されるように、MDCK細胞における増殖と比較してPer.C6細胞において有意に低下した増殖を示した。
MDV-AのPB1、PB2、及びNP遺伝子セグメント中で同定された5つのアミノ酸がMDV-Aのts及びatt表現型を再現できるかどうかを判定するために、PB1-391E、581G、661T、PB2-265S、NP-34Gを分岐した野生型ウイルス株(A/PR/8/34;「PR8」)に導入すると、得られたウイルスは38℃でウイルス力価が1.9 log10低下し、39℃で4.6 log10低下し、これはrMDV-Aのものと非常によく似ていた(図11)。
B型インフルエンザ/Ann Arbor/1/66(ca/Master Ann Arbor/1/66 P1 Aviron 10/2/97)の低温順応性変異体(これはB型インフルエンザマスタードナー株(MDV-B)の一例である)からのウイルスRNAを、RNeasyキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して感染発育卵からの尿膜腔液100μlから抽出し、RNAを40μlの水に溶出させた。One Step RT-PCRキット(Qiagen, Valencia, CA)を提供されたプロトコールに従って用い、各反応について1μlの抽出RNAを使用して、ゲノムセグメントのRT-PCRを行った。RT反応は、50℃で50分、次に94℃で15分行った。PCRは、94℃で1分、54℃で1分、及び72℃で3分を25サイクル行った。P遺伝子はBsmBI部位を有するセグメント特異的プライマーを使用して増幅し、2つの断片を生成した(表12)。
PCR断片を単離し、BsmBI(又はNP用のBsaI)で消化し、上記したようにBsmBI部位でpAD3000(マイナス鎖vRNA及びプラス鎖mRNAの転写を可能にするpHW2000の誘導体)に挿入した。生じた各2〜4のプラスミドを配列決定し、RT-PCR断片の直接的な配列決定に基づいてMDV-Bのコンセンサス配列と比較した。コンセンサス配列とは異なるアミノ酸変化を生じるヌクレオチド置換を有するプラスミドは、プラスミドをクローニングすることにより、又はQuikchangeキット(Stratagene, La Jolla, CA)を使用することにより「修復」した。生じたB/Ann Arbor/1/66プラスミドを、pAB121-PB1、pAB122-PB2、pAB123-PA、pAB124-HA、pAB125-NP、pAB126-NA、pAB127-M、及びpAB128-NSと名付けた。この2方向性転写系を使用してすべてのウイルスRNAとタンパク質を細胞内で製造して、感染性B型インフルエンザウイルスを生成した(図4)。
ヘルパーウイルス無含細胞培養系でB型インフルエンザを増殖させる場合に直面する障害を克服するために、本発明は組換え及び再集合B型インフルエンザウイルス株の製造のための新規ベクター及びプロトコールを提供する。B型インフルエンザウイルスのレスキューに使用されるベクター系は、A型インフルエンザウイルスの生成のために開発されたものに基づく(Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113; Hoffmann & Webster (2000) Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids J Gen Virol 81:2843-7)。293T細胞又はCOS-7細胞(高トランスフェクション効率とpolI活性とを有する霊長類細胞)をMDCK細胞(インフルエンザウイルスについて許容性)と共培養し、293T細胞を5% FBS細胞を含有するOptiMEM I-AB培地で維持し、COS-7細胞を10%FBSを含有するDMEM I-AB培地で維持した。MDCK細胞を1xMEM、10%FBS中で抗生物質と抗真菌薬とを添加して維持した。ウイルスゲノムベクターでトランスフェクトする前に、細胞を5mlのPBS又はFBSを含まない培地で1回洗浄した。75cm2のフラスコ中のコンフルエント細胞に10mlのトリプシン−EDTAを加えた(MDCK細胞を20〜45分インキュベートし、293T細胞を1分インキュベートした)。細胞を遠心分離し、10mlのOptiMEM I-ABに再懸濁した。次に1mlの各懸濁細胞株を18mlのOptiMEM I-AB中に希釈し、混合した。次に細胞を3ml/ウェルで6ウェルプレートに分注した。6〜24時間後、1μgの各プラスミドを、1.5mlのエッペンドルフチューブ中で、OptiMEM I-ABとともにプラスミドに混合した(xμlプラスミド+xμl OptiMEM I-AB+xμl TransIT-LT1=200μl);1μgプラスミドDNA当たり2μl TransIT−LT1。混合物を室温で45分インキュベートした。次に800μlのOptiMEM I-ABを加えた。細胞から培地を除去し、トランスフェクション混合物を細胞に(t=0)33℃で6〜15時間加えた。トランスフェクション混合物をゆっくり細胞から除去し、1mlのOptiMEM I-ABを加え、細胞を33℃で24時間インキュベートした。トランスフェクションの48時間後、1μg/ml TPCK-トリプシンを含有する1mlのOptiMEM I-ABを細胞に加えた。トランスフェクションの96時間後、1μg/ml TPCK-トリプシンを含有する1mlのOptiMEM I-ABを細胞に加えた。
MDCK細胞でのその後の継代後、感染細胞の上清のRT-PCRを使用して、生成したウイルスの確実性を確認した。8つのセグメント全てについてセグメント特異的プライマーを使用したRT-PCRを行った(表12)。図5Aに示すように、すべてのセグメントについてPCR産物を生じた。PB1、HA、及びNSセグメントのPCR産物の直接配列決定は、分析した4つのヌクレオチドがプラスミドpAB121-PB1、pAB124-HA、及びpAB128-NS中で見出されるものと同じであることを明らかにした。これらの結果は、生成したウイルスが設計したプラスミドから生じたものであること、及び親ウイルスによる実験室での汚染の可能性を(陰性対照に加えて)排除することを証明した(図5B)。
MDV-Bウイルスは2つの特徴的表現型を示す:温度感受性(ts)と低温順応性(ca)。定義によれば、33℃と比較して37℃でのウイルス力価の2 log(またはそれ以上)の差はtsを規定し、caは33℃と比較して25℃でのウイルス増殖の2 log未満の差により規定される。初代ニワトリ腎(PCK)細胞を、親ウイルスMDV-Bとプラスミド由来のトランスフェクトウイルスとで感染させて、3つの温度でのウイルス増殖を調べた。
B型インフルエンザの主要な系統であるいくつかの異なる株のHA及びNAセグメントを、実質的に上記したように、増幅し、pAD3000にクローニングした。プライマーは、HA及びNAセグメントの同時RT-PCR増幅のために最適化した。セグメント4(HA)及びセグメント6(NB/NA)の非コード領域であるvRNAの末端領域の比較は、5'末端の20個の末端ヌクレオチドと3'末端の15個のヌクレオチドが、B型インフルエンザウイルスのHAとNA遺伝子との間で同一であることを明らかにした。RT-PCR用のプライマー対(下線の配列はB型インフルエンザウイルスに特異的である)Bm-NAb-1: TAT TCG TCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA (配列番号87); Bm-NAb-1557R: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGT AAC AAG AGC ATT TT (配列番号88)を合成し、種々のB型インフルエンザ株からのHA及びNA遺伝子を同時に増幅するために使用した(図8)。B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001、及びB/Hong Kong/330/2001のHA及びNA PCR断片を単離し、BsmBIで消化し、pAD3000に挿入した。これらの結果は、B型インフルエンザの主要な系統であるいくつかの異なる野生型ウイルスからのB型インフルエンザHA遺伝子とNA遺伝子とを含有するプラスミドの効率的生成のための、これらのプライマーの適応性を証明した。RT-PCR産物は、配列決定及び/又は発現プラスミドへのクローニングのために使用することができる。
MDV-Bウイルス(ca B/Ann Arbor/1/66)はヒトで弱毒化しており、フェレットで弱毒化表現型を示し、細胞培養物で低温順応性及び温度感受性表現型を示す。MDV-Bの内部遺伝子の推定アミノ酸配列を、BLAST検索アルゴリズムを使用してLos Alamosインフルエンザデータベース(flu.lanl.govのworld wide web)中の配列と比較した。MDV-Bに固有であり、他の株には存在しない8つのアミノ酸を同定した(表17)。PB1、BM2、NS1、及びNS2をコードするゲノムセグメントは、固有の置換残基を示さない。PA及びM1タンパク質はそれぞれ2つの固有の置換アミノ酸を有し、NPタンパク質は4つの固有の置換アミノ酸を有する(表17)。PB2中の630位に1つの置換アミノ酸が存在する(追加の株B/Harbin/7/94(AF170572)はまた630位にアルギニン残基を有する)。
すでに、組換えA型インフルエンザがVero細胞からレスキューできることが示唆されている(Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA J. Virol. 73:9679-82; Hoffmann et al. (2002) Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccine Vaccine 20:3165-3170)。報告された方法は脂質試薬を必要とし、A型インフルエンザの高複製能実験室株の単一株(A/WSN/33とA/PR/8/34)についてのみ記載されており、ワクチン製造に適した弱毒化生ウイルスの製造における用途は限定される。本発明は、エレクトロポレーションを使用してVero細胞から組換えインフルエンザウイルスを回収する新規方法を提供する。これらの方法は、A型インフルエンザ及びB型インフルエンザウイルス株の両方の製造に適しており、血清無含条件下で増殖させたVero細胞からの例えば低温順応性、温度感受性、弱毒化ウイルスの回収を可能にし、これは、例えば鼻内ワクチン製剤で投与するのに適した弱毒化生ワクチンの調製を容易にする。ウイルス株にわたるその広い応用性に加えて、エレクトロポレーションは細胞基質のための増殖培地以外に追加の試薬を必要とせず、従って好ましくない汚染物質についての可能性が小さい。特にこの方法は、血清無含条件下での増殖に適応させたVero細胞(例えば、病原体を含まず、ワクチン製造に適したVero細胞分離株)を使用して組換え及び再集合ウイルスを生成するのに有効である。この特徴は、細胞基質へのDNAの商業的導入のための適切な方法として、エレクトロポレーションの選択を支持する。
本発明のベクターはまた、遺伝子送達系として、及び遺伝子治療のために使用することもできる。かかる用途のために、組換えインフルエンザウイルス、例えば外来タンパク質を発現する組換えA型又はB型インフルエンザウイルスを生成することが望ましい。例えば、B型インフルエンザウイルスのセグメント7はスプライシングされないため、これは異種核酸配列の挿入のための便利な遺伝子要素を提供する。このmRNAは、M1とBM2タンパク質とをコードする2つのオープンリーディングフレームを有する2つのシストロンを含む。BM2又はM1のオープンリーディングフレームは、目的の異種配列(例えば、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードする遺伝子)により置換される。本発明のプラスミドベースのベクター系を使用して、M1-EGFP及びBM2のオープンリーディングフレームをコードするcDNAが2つの異なるプラスミドにクローニングされる。このオープンリーディングフレームはセグメント7の非コード領域に挟まれ、該領域は複製と転写に必要なシグナルを含有する。あるいは、2つのプラスミドが構築される(1つはM1 ORFを含有し、もう一方はEGFP-BM2を含有する)。生じた9つのプラスミドの共トランスフェクションにより、異種遺伝子配列を含有する組換えB型インフルエンザウイルスが生成される。同様に、EGFPをA型インフルエンザのNS1セグメントから発現させることができる。
典型的な好ましい実施形態において、弱毒化低温順応性A型生インフルエンザ/AA/6/60株は、A型インフルエンザ FluMist(商標)ワクチンのためのマスタードナーウイルス(MDV-A)である。MDV-Aの6つの内部遺伝子は、各ワクチン株に低温順応性(ca)、温度感受性(ts)、及び弱毒化(att)表現型を付与する。逆遺伝学を使用して、複数のアミノ酸が3つの遺伝子セグメントに分かれることが証明される(MDV-Aのts及びatt表現型の発現を制御する、PB1-K391E、E581G、A661T、PB2-N265S、及びNP-D34G)。6:2ワクチン株のプラスミドレスキューは、古典的な再集合技術より効率的なインフルエンザワクチンの生成を可能にする。
ウイルス株、細胞、及び抗体:野生型(wt)A型インフルエンザウイルス株、A/Fujian/411/02(A/Fujian)、A/Sendai-H/F4962/02(A/Sendai)、及びA/Wyoming/03/03(A/Wyoming)を疾病管理センター(Center for Disease Control (Atlanta, GA))から得て、MDCK細胞又は発育鶏卵(卵)で増幅した。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ(MVA-T7)を発現する改変型ワクシニアウイルスAnkara株をCEK細胞中で増殖させた。HEp-2、COS-7、及びMDCK細胞(American Type Culture Collection、ATCCから得た)を5%ウシ胎児血清(FBS)を含有する最小必須培地(MEM)で維持した。A/Ann Arbor/6/60、A/Sendai-H/F4962/02、及びA/Wyoming/03/03に対するポリクローナル抗血清をニワトリで産生させた。A型インフルエンザのNPタンパク質に対するモノクローナル抗体をBioDesign(Saco, MI)から得た。
野生型(wt)A型インフルエンザウイルス株、A/Fujian/411/02、A/Sendai-H/F4962/02、およびA/Wyoming/03/03は疾病管理センター(Atlanta, GA))から得て、MDCK細胞又は発育鶏卵中で1回増幅した。表20に示すように、A/Fujianは細胞培養で3回だけ継代し、A/SendaiとA/Wyomingは卵で11回継代した。これらの3つの株のHA及びNA配列を、これらのウイルスから抽出したvRNAを使用したRT-PCR産物の配列決定により決定した。これらの3つのH3N2株のHA及びNA配列の差を表1に列記する。A/SendaiはそのHA1アミノ酸配列がA/Fujianと同じであったが、NA配列は119、146、および347位の3つのアミノ酸で異なっていた。A/WyomingはA/Fujianと同じNA配列を有したが、HA1では4つのアミノ酸でA/FujianとA/Sendaiとは異なっていた。さらにA/Sendai及びA/Wyomingも、HA2においてGly-150の代わりにGlu-150を有した。MDCK細胞で1回増幅後、wtA/FujianのHA1中の183残基はHis-183からLeu-183に突然変異し、His-183を有するwtA/Fujianウイルスを単離することは困難であった。これはHis-183を有するウイルスがin vitroでの増殖の利点を有することを示す。
A/FujianはA/SendaiとNA中の3つのアミノ酸で異なり(E119Q、Q136K、及びH347Y)(表20)、これらの変化の1つまたはそれ以上が、A/Sendaiを発育鶏卵中でA/Fujianより高力価まで複製することを可能にしたと仮定する。E119のG、D、A、又はV残基による置換は、ノイラミニダーゼ活性を低下させたいくつかの抗ノイラミニダーゼ薬剤耐性株で報告されいる。E119Q、又はNA中の他の2つの変化のいずれかが、A/FujianのNA活性及び発育鶏卵中で複製する能力に影響を与えるかどうかを調べるために、A/Fujian NA発現プラスミドに単一のおよび2重の置換突然変異を導入し、トランスフェクトHEp-2細胞中のNA活性を測定した。さらに、A/Fujian NA中に突然変異を有する組換え6:2再集合ウイルスも回収し、MDCK細胞及び卵におけるその増殖を比較した(表21)。A/Fujian(E119Q136H147)はA/Sendai(Q119K136Y147)と比較して約80%高いNA活性を有した。単一のQ119突然変異は66%のNA活性を有し、Y347変化はNA活性に最小の影響を有したが、K136はわずかに25%の活性を有した。2重突然変異K136Y347、Q119Y347、及びQ119K136はNA活性をA/Fujianのそれぞれ29%、52%、及び25%のレベルで低下させた。これらのデータは、これらの3つのNA残基がK136>Q119>Y347の順序でNA活性に影響を与えたことを示す。
A/Fujianとは異なるA/Wyoming/03/03中の4つのHA1残基の変化を、ウイルス複製におけるその役割について調べた。単一および複数の置換突然変異をA/Fujian HA cDNAに導入し、改変型HAプラスミドをいずれかのA/Fujian NAとともにMDV-Aに導入した。すべての6:2再集合ウイルス突然変異体はMDCK細胞中でよく複製したが、発育鶏卵中での増殖は異なっていた(表33)。A/Fujian HAを有する6:2再集合体(T128G186S219V226)は卵中で複製できなかった。単一のT128A変化は卵中のウイルス増殖を改善しなかった。しかし単一のG186V又はV226I変化は卵中でのウイルス複製を増加させた。HA中の2重G186V及びV226I変化は卵中で効率的に複製した。残基128及び/又は219での追加の置換はウイルス複製を有意に上昇させなかった。すなわち最小の2つのG186V及びV226I変化が6:2 A/Fujianを発育鶏卵中で効率的に増殖することを可能にした。
6:2 A/Fujian株が発育鶏卵中で増殖できるように適応できるかどうかを調べるために、ウイルスをMDCK細胞中で増幅し、次に卵で継代した(表23)。3.0 log10PFUのウイルスを卵に接種すると、採取した尿膜腔液中に2.0 log10PFU/ml未満のウイルスが検出された。この物質の継代後、感染性ウイルスは回収できなかった。第2の継代実験中に、発育鶏卵に接種されたウイルスの量は5.9 log10PFUに増加した。採取した尿膜腔液(FJ-EP1)中に3.9 log10PFU/mlの力価が検出され、卵でさらに継代を行うと6.2 log10PFU/mlまでウイルス力価を上昇させた(FJ-EP2)。卵でさらに継代すると(FJ-EP3)ウイルス力価は8.2 log10PFU/mlまで上昇した。FJ-EP2ウイルスの配列分析は、HA RNAセグメント中のnt625でのAからUへの突然変異を明らかにし、これはHAタンパク質のH183L変化を引き起こした。さらに分析すると、この変化がまた、MDCK細胞中でのウイルス増幅中にも起きることが示された。H183L突然変異はまた、上記したように、wtA/Fujian HAにおいてMDCK及び卵中でのその複製中にも見られた。V226A置換を引き起こすHAのnt754でのUからCへのさらなる突然変異が、FJ-EP3増幅ウイルス中で見られた(表23)。NAセグメントでは変化は検出されなかった。
上記研究から、A/FujianのNA活性を低下させたNA変化が、このウイルスが卵で増殖するのに十分であることが示された。一方、HA変化(G186VとV226I又はH183LとV226A)がA/Fujianのより高いNA活性を補うために受容体結合活性を上昇させたのかもしれない。A/FujianのHAタンパク質における変化がその受容体結合活性を上昇させたかどうかを調べるために、HA-V186I226変化を有する6:2 A/Fujian及びHA-L183A226変化を有する卵適応性6:2 A/Fujianの吸着を、6:2 A/Fujian、A/Sendai、及びA/Wyomingと比較した。各ウイルスをmoi 1.0でMDCK細胞に4℃又は33℃で30分吸着させ、接種物を取り出し、感染細胞を3回洗浄したか又は洗浄をしなかった。33℃で6時間インキュベート後、感染細胞%を抗NP抗体を使用した免疫蛍光分析により測定した。図36に示すように、4℃で吸着を行った時、6:2 A/Fujian及びA/Sendaiは26〜27%の細胞を感染させたが、ウイルスの大部分は洗浄工程により容易に除去された。33℃では、洗浄により6:2 A/Fujianウイルスの感染は大幅に低下した(37.8%に対して6.2%)が、6:2 A/Sendaiの感染には有意な影響は無かった(51.7%に対して42.8%)。これに対して、HA-V186I226又はHA-L183A226を有する6:2 A/Fujian、6:2 A/Wyomingは、細胞が4℃又は33℃で吸着されても及び洗浄工程有りでも無しでも、同様の感染率を有した。これらのデータは、A/Fujian及びA/Sendai HAが、4℃で結合したウイルスが細胞から容易に洗い流され得る程度の、低い結合親和性を有したことを示した。結合とウイルス侵入速度は33℃でより速く、すなわち洗浄工程は6:2 A/Sendaiウイルス感染に対してごくわずかな影響しかなかった。しかし、結合した6:2 A/Fujianの大部分は、そのより高いNA活性が33℃での効率的なウイルス結合を妨害したため、同様の条件下で洗い流された(データは示していない)。
改変型HA及びNA残基を有するウイルスがウイルス抗原性に影響を与えるかどうかを調べるために、フェレット抗A/Wyoming血清および抗A/Sendai血清を使用して血球凝集阻害アッセイ(HAI)を行った(表24)。抗A/Wyoming又は抗A/Sendaiフェレット血清は、6:2 A/Fujian又はA/Sendaiウイルスで測定した時、同様のHAI力価を有した。6:2 A/Wyomingウイルスでわずかに高いHAI力価が検出され、これはおそらく赤血球上の細胞受容体へのA/Wyoming HAのより強い結合によると思われる。2つの改変型ウイルス(A/Fujian HA-V186I226及びA/Fujian HA-L183A226)は、いずれかの血清で測定するとA/Wyomingと同様のHAI力価を有した。これらの結果は、A/SendaiとA/Wyoming及びこの研究で作製した改変型HAウイルスとの間のアミノ酸の差がウイルス抗原性を変化させなかったことを示した。
上記したように、発育鶏卵中でのA/Fujian/411/02(A/Fujian)の弱い複製は、HA分子の受容体結合領域中のアミノ酸残基を置換することにより改善することができる。このアプローチが最近のH3N2株に適用できるかどうかを試験するために、本発明者らはA/Singaore/21/04(A/Singaore、CDC, Atlanta, GAから得られた)(これは、抗原性がワクチン株A/California/7/04(A/California)に関連している)の卵中で増殖する能力を試験した。A/Wyoming/03/03(A/Wyoming、卵適応A/Fujian様株)、A/California、およびA/SingaoreのHA及びNAをRT-PCR増幅し、pAD3000発現プラスミドにクローニングした。低温順応性A/Ann Arbor/6/60(FluMist(登録商標)ワクチンのA型インフルエンザワクチン成分のマスタードナーウイルス(MDV-A))の6つの内部遺伝子により6:2再集合ウイルスを作製した。これらの株のHA受容体結合領域のアミノ酸残基を比較し、ウイルス複製と抗原性に対するこれらの影響を評価した。
これらのH3N2株のHA受容体結合部位中のアミノ酸残基の差を表25に要約する。卵中でのウイルス複製に決定的に重要であることが示された残基I266は、これらのすべての株で同じである。しかし、A/Singaoreは2つの位置(186と196)でA/CaliforniaやA/Wyomingと異なる。
A/Singaore、A/Wyoming、及びA/Californiaとで異なるHA-186とHA-196残基とを、ウイルス複製におけるその役割について調べた。これらの2つの部位の1つにおける置換突然変異をA/Singaore HA cDNAに導入し、改変型HAプラスミドをA/Singaore NAプラスミドとともにMDV-Aに導入した。いずれかの部位に置換突然変異を有する回収した6:2再集合ウイルスは発育鶏卵中で効率的に複製して、それぞれ8.0及び8.5 log10PFU/mlの力価に達した(表25)。すなわち、186又は196部位における単一のアミノ酸変化は、6:2 A/Singaoreを卵中で効率的に増殖させるのに十分であった。
186及び196残基の両方ともHA受容体結合領域中に存在する(Weis et al., Nature 1988;333:426-31を参照)ため、G186V又はA196Tを含有する6:2再集合ウイルスのMDCK細胞への結合をwtウイルスと比較した。6ウェルプレート中のMDCK細胞をwtウイルス又は2つの改変型組換え体によりmoi 1.0、4℃で30分感染させ、PBSで3回洗浄し、2mlのOptiMEMIを重層し、33℃で6時間インキュベートした。次いで、細胞単層を1%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中0.2% TritonX-100で透過性にし、抗NPモノクローナル抗体で免疫染色した。感染細胞%を計算し、結合効率として表した。A/Wyoming(56%)又はA/California(60%)と比較して、A/Singaoreは5%の非常に弱い結合効率を有した。A/Singaoreと比較して、2つの改変型ウイルス(A/Sing-G186V又はA/Sing-A196T)は有意に高い結合効率(55〜60%)を有した。
改変型HA及びNA残基を有するウイルスがウイルス抗原性に影響を与えたかどうかを調べるために、フェレット抗A/Wyoming血清および抗A/California血清を使用して血球凝集阻害アッセイ(HAI)を行った(表26)。連続2倍希釈したフェレット抗血清の25μlのアリコートを、25μl(4HAU)の6:2再集合ウイルスと共に37℃で1時間インキュベートし、次に50μlの0.5%七面鳥赤血球と共に25℃で45分インキュベートした。HAI力価は、血球凝集を阻害した最も高い血清希釈率として定義した。HAIアッセイに基づいて、A/SingaoreはA/Californiaに密接に関連することが示されたが、A/Wyomingとは2倍異なっていた。2つの改変型ウイルス(A/Sing-G186V及びA/Sing-A196T)は、いずれかの血清を使用するとA/Singaore又はA/Californiaと同じHAI力価を有した。これらの結果は、この試験で作製したHA改変型ウイルスがウイルス抗原性を変化させなかったことを示した。
低温順応性(ca)B/Ann Arbor/1/66は、弱毒化生B型インフルエンザFlumist(登録商標)ワクチンのマスタードナーウイルス(MDV)である。ca B/Ann Arbor/1/66由来の6つの内部遺伝子と、流行している野生型株からのHA及びNA表面糖タンパク質とを有する6:2 B型インフルエンザワクチンは、低温順応性(ca)、温度感受性(ts)、及び弱毒化(att)表現型により特徴付けられる。配列分析は、MDV-Bが野生型B型インフルエンザ株には見られないPB2、PA、NP、及びM1タンパク質中の9つのアミノ酸を含有することを明らかにした。本発明者らは、PA(M431V)とNP(A114V、H410P)中の3つのアミノ酸がts表現型を確定し、これらの3つのts遺伝子座に加えて、M1中の2つのアミノ酸(Q159H、V183M)がatt表現型を付与することを確定した。
Claims (18)
- 再集合インフルエンザウイルスの複製を少なくとも10%上昇させる方法であって、
a) 再集合インフルエンザウイルスのアミノ酸配列と、発育卵中で高力価まで複製する異なるインフルエンザウイルスのアミノ酸配列とを比較する工程;
b) 再集合ウイルスの前記配列の1つまたはそれ以上のアミノ酸を改変させて、前記異なるインフルエンザウイルスの配列に一致させることにより、1つまたはそれ以上の改変再集合ウイルスを作製する工程、及び
c) 卵中で1つまたはそれ以上の改変再集合ウイルスを増殖させる工程
を含んでなる、前記方法。 - 工程(b)は以下よりなる群から選択されるメンバーの工程を含んでなる、請求項1に記載の方法:
i) 183位がロイシンであり、226位がアラニンであるように、HAアミノ酸残基を必要に応じて置換する工程;
ii) 186位がバリンであり、226位がイソロイシンであるように、HAアミノ酸残基を必要に応じて置換する工程;
iii) 119位がグルタミン酸であり、136位がグルタミンであるように、NAアミノ酸残基を必要に応じて置換する工程;
iv) 186位がバリンであり、226位がイソロイシンであるように、HAアミノ酸残基を必要に応じて置換し、かつ119位がグルタミン酸であり、136位がグルタミンであるように、NAアミノ酸残基を必要に応じて置換する工程;
v) 196位がスレオニンであるように、HAアミノ酸残基を必要に応じて置換する工程;及び
vi) 186位がバリンであり、226位がイソロイシンであり、196位がスレオニンであるように、HAアミノ酸残基を必要に応じて置換する工程。 - 請求項1に記載の方法により製造される複製増強再集合インフルエンザウイルス。
- 請求項1に記載の複製増強再集合インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
- 発育卵における再集合インフルエンザウイルスの増殖を上昇させる方法であって、再集合ウイルスをMDCK細胞及び発育卵で複数回継代することを含み、その際、増殖は少なくとも1logPFU/mL上昇するものである、前記方法。
- 以下よりなる群から選択されるメンバーを含む複製増強再集合インフルエンザウイルス:
i) 183位にロイシンを含み、226位にアラニンを含むHAタンパク質;
ii) 186位にバリンを含み、226位にイソロイシンを含むHAタンパク質;
iii) 119位にグルタミン酸を含み、136位にグルタミンを含むNAタンパク質;
iv) 186位にバリンを含み、226位にイソロイシンを含むHAタンパク質、及び119位にグルタミン酸を含み、位にグルタミンを含むNAタンパク質;
v) 186位にバリンを含み、226位にイソロイシンを含み、196位にスレオニンを含むHAタンパク質;
vi) 196位にスレオニンを含むHAタンパク質;及び
vi) HAタンパク質における186位と196位での置換。 - 請求項6に記載の複製増強再集合インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
- インフルエンザウイルスの複製を少なくとも10%上昇させる方法であって、
a) アミノ酸置換がなされた場合に、183位にロイシン残基を、186位にバリン残基を、196位にスレオニン残基を、そして226位にアラニン残基を生じるように、HAの183位、186位、196位又は226位の1つ以上で、必要に応じてアミノ酸置換を行う工程:及び
b) 前記HA置換を含むインフルエンザウイルスを卵で増殖させる工程、
を含んでなる、前記方法。 - 183位、186位、196位、又は226位の1つ以上で置換を含む再集合インフルエンザウイルスであって、発育卵中で少なくとも8.0 log10PFU/mlの力価まで増殖する、前記インフルエンザウイルス。
- 183位、186位、196位、又は226位の1つ以上で置換を含む再集合インフルエンザウイルスであって、発育卵中で少なくとも9.0 log10PFU/mlの力価まで増殖する、前記インフルエンザウイルス。
- 183位、186位、196位、又は226位の1つ以上で置換を含む再集合インフルエンザウイルスであって、前記置換を有しない同じ再集合ウイルスより少なくとも50%高い力価まで増殖する、前記インフルエンザウイルス。
- 少なくとも1つの置換は、196位にスレオニン、又は186位にバリンを生じる、請求項9、10、又は11に記載の再集合ウイルス。
- 少なくとも1つの置換は、196位に非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、又は186位に非極性側鎖を有するかつアラニンではないアミノ酸を生じる、請求項9、10、又は11に記載の再集合ウイルス。
- インフルエンザウイルスは低温順応性であり、温度感受性であり、かつ弱毒化されている、請求項9、10、11、12、又は13に記載のインフルエンザウイルス。
- インフルエンザウイルスはMDV-A株又はPR8株の骨格をさらに含む、請求項9、10、11、12、又は13に記載のインフルエンザウイルス。
- 請求項9、10、11、12、又は13に記載のインフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物。
- 請求項9、10、11、12、又は13に記載のインフルエンザウイルスを含むインフルエンザワクチン。
- 請求項9、10、11、12、又は13に記載のインフルエンザウイルスを含む、低温順応性弱毒化温度感受性生インフルエンザワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US72666005P | 2005-10-17 | 2005-10-17 | |
US60/726,660 | 2005-10-17 | ||
PCT/US2006/060031 WO2007048089A2 (en) | 2005-10-17 | 2006-10-17 | Multi-plasmid system for the production of influenza virus |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013138529A Division JP2013236638A (ja) | 2005-10-17 | 2013-07-02 | インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009511073A true JP2009511073A (ja) | 2009-03-19 |
JP2009511073A6 JP2009511073A6 (ja) | 2009-08-27 |
JP5349049B2 JP5349049B2 (ja) | 2013-11-20 |
Family
ID=37963400
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008535808A Expired - Fee Related JP5349049B2 (ja) | 2005-10-17 | 2006-10-17 | インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 |
JP2013138529A Pending JP2013236638A (ja) | 2005-10-17 | 2013-07-02 | インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013138529A Pending JP2013236638A (ja) | 2005-10-17 | 2013-07-02 | インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8354114B2 (ja) |
EP (2) | EP2614836A3 (ja) |
JP (2) | JP5349049B2 (ja) |
AU (1) | AU2006304898B2 (ja) |
CA (2) | CA2626266C (ja) |
ES (1) | ES2402061T3 (ja) |
WO (1) | WO2007048089A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012531205A (ja) * | 2009-06-25 | 2012-12-10 | メディミューン,エルエルシー | ブタインフルエンザヘマグルチニン変異体 |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2626266C (en) | 2005-10-17 | 2015-09-08 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
WO2007126810A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
US7682619B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine influenza virus |
US9474798B2 (en) | 2007-06-18 | 2016-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
SG172220A1 (en) | 2008-12-16 | 2011-07-28 | Baxter Int | Production of influenza vaccines |
US9109013B2 (en) | 2009-10-26 | 2015-08-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells |
US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
HUE037227T2 (hu) | 2010-05-14 | 2018-08-28 | Univ Oregon Health & Science | Rekombináns HCMV és RHCMV vektorok és alkalmazásuk |
ES2524894T3 (es) * | 2010-08-16 | 2014-12-15 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Línea celular de amniocitos humanos permanentes para la producción de virus de la gripe |
AU2014290203B2 (en) | 2013-07-15 | 2020-12-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in MDCK or vero cells or eggs |
EP3022298B1 (en) | 2013-07-19 | 2019-06-19 | University Of Rochester | Attenuated influenza vaccines and uses thereof |
US10053671B2 (en) | 2014-06-20 | 2018-08-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
US10323231B2 (en) | 2015-04-24 | 2019-06-18 | University Of Rochester | Attenuated influenza vaccines and uses thereof |
US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
WO2017007839A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Improved influenza virus replication for vaccine development |
GB201602535D0 (en) * | 2016-02-12 | 2016-03-30 | Univ Edinburgh | Improved flu vaccine yield |
AU2017221444B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-07-29 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Improved influenza B virus replication for vaccine development |
CN105861555B (zh) * | 2016-05-11 | 2019-05-14 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 一种双向转录/表达质粒及其在流感病毒反向遗传学中的应用 |
JP2022527235A (ja) | 2019-01-23 | 2022-06-01 | 義裕 河岡 | インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異 |
CN113874496A (zh) | 2019-02-08 | 2021-12-31 | 威斯康星校友研究基金会(Warf) | 人源化细胞系 |
US11390649B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-07-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
US11807872B2 (en) | 2019-08-27 | 2023-11-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005062820A2 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Medimmune Vaccines, Inc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US6001634A (en) | 1989-08-28 | 1999-12-14 | Palese; Peter | Recombinant negative strand RNA viruses |
US20060019350A1 (en) | 1989-08-28 | 2006-01-26 | Peter Palese | Recombinant negative strand RNA virus expression system and vacccines |
ATE302277T1 (de) | 1992-04-14 | 2005-09-15 | Sinai School Medicine | Gentechnologisch abgeschwächte virus |
US5426039A (en) | 1993-09-08 | 1995-06-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol |
US5690937A (en) | 1995-06-05 | 1997-11-25 | Aviron | Temperature sensitive clustered changed-to-alanine mutants of influenza virus PB2 gene |
US6951754B2 (en) | 2000-04-28 | 2005-10-04 | St. Jude Children's Research Hospital | DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus |
WO2003091401A2 (en) | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Medimmune Vaccines, Inc. | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
US7465456B2 (en) * | 2002-04-26 | 2008-12-16 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
US7037707B2 (en) | 2003-09-04 | 2006-05-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Method for generating influenza viruses and vaccines |
EP1748790B1 (en) * | 2004-05-24 | 2015-07-15 | MedImmune, LLC | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
CA2626266C (en) | 2005-10-17 | 2015-09-08 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
-
2006
- 2006-10-17 CA CA2626266A patent/CA2626266C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-17 CA CA2891994A patent/CA2891994A1/en not_active Abandoned
- 2006-10-17 AU AU2006304898A patent/AU2006304898B2/en not_active Ceased
- 2006-10-17 US US12/090,435 patent/US8354114B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-17 ES ES06846105T patent/ES2402061T3/es active Active
- 2006-10-17 EP EP20120199040 patent/EP2614836A3/en not_active Withdrawn
- 2006-10-17 EP EP20060846105 patent/EP1945778B1/en active Active
- 2006-10-17 WO PCT/US2006/060031 patent/WO2007048089A2/en active Application Filing
- 2006-10-17 JP JP2008535808A patent/JP5349049B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-12-14 US US13/715,509 patent/US20130102053A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-07-02 JP JP2013138529A patent/JP2013236638A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005062820A2 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Medimmune Vaccines, Inc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6011063935; J. Virol. Vol. 79, No. 11, 200506, p. 6763-6771 * |
JPN6011063936; J. Clin. Microbiol. Vol. 43, No. 6, 200506, p. 3027-3029 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012531205A (ja) * | 2009-06-25 | 2012-12-10 | メディミューン,エルエルシー | ブタインフルエンザヘマグルチニン変異体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8354114B2 (en) | 2013-01-15 |
AU2006304898B2 (en) | 2011-11-10 |
ES2402061T3 (es) | 2013-04-26 |
JP5349049B2 (ja) | 2013-11-20 |
EP1945778B1 (en) | 2012-12-26 |
AU2006304898A1 (en) | 2007-04-26 |
EP2614836A2 (en) | 2013-07-17 |
EP1945778A4 (en) | 2011-07-27 |
WO2007048089A3 (en) | 2010-07-29 |
JP2013236638A (ja) | 2013-11-28 |
EP2614836A3 (en) | 2013-10-23 |
US20090297554A1 (en) | 2009-12-03 |
US20130102053A1 (en) | 2013-04-25 |
WO2007048089A2 (en) | 2007-04-26 |
CA2891994A1 (en) | 2007-04-26 |
CA2626266A1 (en) | 2007-04-26 |
CA2626266C (en) | 2015-09-08 |
EP1945778A2 (en) | 2008-07-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5349049B2 (ja) | インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 | |
US9255253B2 (en) | Multi plasmid system for the production of influenza virus | |
US9238825B2 (en) | Multi plasmid system for the production of influenza virus | |
US8722059B2 (en) | Multi plasmid system for the production of influenza virus | |
JP2009511073A6 (ja) | インフルエンザウイルス製造用マルチプラスミド系 | |
EP1748790B1 (en) | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090602 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111206 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120229 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120307 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120531 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130115 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130409 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130416 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130702 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130730 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130820 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |