JP2009509505A - Ｔｄｏａ遺伝子と変形性関節症の関連 - Google Patents

Abstract

本発明は、TDOA遺伝子と変形性関節症(OA)間の関連の同定から生じる。したがって、本発明は、TDOA遺伝子、その前駆体またはその産物(mRNA、cDNA、ゲノムDNA、またはタンパク質)のすべてまたは部分を検出することにより、OAを発症する患者の感受性を決定するための診断技術に関する。特に、本発明は、TDOA遺伝子のアレル変形を解析するための方法および材料、ならびに個体のOAを発症するリスクの同定におけるTDOA多型の使用に関する。TDOAタンパク質は、それ自身がOAと強い関連を有する過程であるインテグリンシグナル伝達に関与するタンパク質であるα-パキシリンに結合することが分かった。したがって、本発明はまた、OAのモジュレーターを同定するための方法に向けられ、それは、TDOA遺伝子を調節するか、またはTDOA:α-パキシリン結合を妨害する。

Description

技術分野
本願の発明者らは、連鎖および連関解析を用いて、変形性関節症(OA)への感受性と関連する遺伝子を発見した。該遺伝子を、本明細書ではTDOAと呼ぶ。したがって、本発明は、OAにおけるTDOAの役割を同定している。本発明は、したがって、この遺伝子のすべてまたは部分、その前駆体または産物(mRNA、cDNA、ゲノムDNA、またはタンパク質)を検出することによる、OAの検出のための診断技術、およびOAを発症する患者の感受性を決定するための診断技術に関する。本発明はまた、該遺伝子内の多型およびそれらの検出のための方法に関する。特に、本発明は、TDOA遺伝子のアレル変異を解析するための方法および材料、ならびにOAを発症する個体のリスクの同定におけるTDOA多型の使用に関する。

本発明の多型はまた、患者の階層化を可能にする。OAを発症する増加したリスクまたは減少したリスクを有するものとして同定された個体のサブグループは、とりわけ、狙いを定めた臨床試験計画および、また、可能性のある遺伝薬理学的治療のために使用され得る。

本願の発明者らはまた、この遺伝子(TDOA)によりコードされたタンパク質が、インテグリンシグナル伝達(それ自身が、OAとの強い関連を有する過程である)に関与するタンパク質であるα-パキシリンに結合することを発見した。したがって、本発明はまた、OAのモジュレーターを同定するための方法に向けられ、該モジュレーター、例えば、化学化合物、アンチセンス分子および抗体は、TDOA遺伝子を調節するか、またはTDOA:α-パキシリン結合を妨害する。

発明の背景
変形性関節症は、関節軟骨細胞および細胞外マトリックス、ならびに軟骨下骨の分解および合成の正常なカップリングを不安定化する、機械的および生物学的イベントの結果である(Creamer and Hochberg, Lancet, 350: 503-508, 1997; Jones and Doherty, Br. Med. J., 310: 457-460, 1995)。それらは、遺伝学的、発生学的、代謝のような環境因子、および外傷性を含む複数の因子によって開始され得るが、変形性関節症は、可動関節の組織のすべてを含む。最終的には、変形性関節症は、細胞およびマトリックスの両方に、形態学的、生化学的、分子的、および生体力学的な変化が現れ、とりわけ、軟化、繊維化、潰瘍形成、関節軟骨の欠失、硬化および軟骨下骨の象牙質化、骨棘、および軟骨下嚢胞を生じる。軟骨以外の他の組織、例えば、腱、靱帯、筋肉および半月板もまた、疾患の開始および進行に関与し得る。臨床的に顕在化するとき、変形性関節症は、関節痛、圧痛、動きの制限、摩擦、時折の滲出、および主に、明らかな全身的影響のない種々の程度の炎症により特徴づけられる(Kuettner and Goldberg, Osteoarthritic disorders. Rosemont: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1995)。

たいていの疫学的研究は、典型的なX線写真の特徴の存在に基づいて、変形性関節症のケースを定義している。白色北米人および北欧人種の集団では、25-74歳の大人の約3分の1が、少なくとも1つの末梢関節集団が関与するX線写真の変形性関節症の特徴を有し: 最も共通する部位は、手、次いで、足、膝、および股関節であるが(Spector and Hochberg, Ann Rheum Dis 53: 43-46, 1994)、膝およびのOAはより臨床的に重要である。年齢は変形性関節症の最も強い決定要因であり、すべての関節に関する有病率が年齢が上がるにつれて上昇する。罹患率はまた年齢と共に上昇するが、これは、70歳代で横ばい状態に達するとの証拠がいくつかある。年齢が変形性関節症にかかりやすくするメカニズムは、明らかではない。肥満は、横断的およびプロスペクティブ研究で、強く膝の変形性関節症と、より低い程度で股関節の変形性関節症と関連していた(Hochberg MC, Lethbridge-Cejku M. Hamerman D, ed. Osteoarthritis: public health implications for an aging population. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1997:169-86)。

変形性関節症の現在の処置は、まだ、疾患修飾変形性関節症薬剤が存在しないので、純粋に症状を制御することである。処置効果の主要な指標は、伝統的に疼痛である。薬剤の選択は、現在のところ、患者の一部は応答しないが、NSAID(COX-2阻害剤を含む、非ステロイド性抗炎症性薬剤)からの効果を得るように思われるパラセタモールである。NSAIDまたはカプサイシンのどちらかの局所的クリームは、どちらか一方の単剤療法として、または経口鎮痛剤に加えるとき、とりわけ、少数の関節だけが関与しているときに役立ち得る。

関節内ステロイドは、広く、変形性関節症に、特に、膝の変形性関節症に使用される。わずか1-3週間で、鎮痛に対するそれらの効果を支持するいくつかの証拠があり; トリアムシノロンヘキサアセトニドが、最も有効な製剤である。関節内ヒアルロン酸はまた、膝変形性関節症を有する患者での疼痛を調節するのに有効であることが示され;この治療は、3-5週間、毎週の注射を必要とする。遺伝的な要因が、双生児での遺伝率推定および兄弟での相対危険度推定により、変形性関節症に存在することが証明された。手および膝のOAに関して、遺伝的影響は、双子で39-65%の間で計算された。手および椎間板OAの分離研究では、概算は、それぞれ56%と75%であった。人工股関節全置換術(THR)を必要とする重篤な股関節のOAでは、一般の集団と比較した兄弟の相対的危険度は5.6で計算され、これは、一般集団におけるOAの有病率が高いため、過小評価であり得る。女性の双生児ペアの最近の研究は、膝および股関節における変形性関節症のX線写真の特徴に関して、有意な遺伝率を示した(Spector et al, BMJ. 312: 940-944, 1996)。II型コラーゲン(COL2A1)の遺伝子における突然変異は、穏やかな軟骨異形成を有する早期多関節変形性関節症と関連しているが(Knowlton et al New Eng. J. Med. 322: 526-530, 1990)、変形性関節症への遺伝的関与を十分に説明する単一遺伝子は存在しそうにない。しかしながら、OAは、かなりの臨床的不均一性を証明しているので、OAの特定のサブクラスに関する特定の遺伝子(複数もある)が存在し得る(Peach et al. Trends Mol. Med. 11(4):186-191, 2005)。

したがって、OAの発症と重要な関連を有する遺伝子を同定することが望ましい。これは、関連遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を調節するか、または他のタンパク質または分子とそれらの相互作用を調節する、化合物および他の物質、例えば、抗体のスクリーニングにより、OAに関する新規治療剤を開発することを可能にし得る。関連遺伝子の配列に関する知識はまた、関連遺伝子の発現を調節する新規抗遺伝子法の開発を可能にし得て、また、OAを処置する新規遺伝子治療技術の開発を可能にし得る。関連遺伝子の発見はまた、(i)関連する一塩基多型(SNP)の遺伝子型のパターン解析、(ii)影響を受ける組織中の翻訳されるmRNAのレベルを測定すること、そして(iii)影響を受ける組織および生物学的液体中のタンパク質のレベルを測定することにより、OAを診断するための新規方法を開発するのを助け得る。これらの方法によるOAの診断、またはOAに対する素因の予測は、まだ疾患の古典的な症状を表していない患者で達成し得る可能性がある。そのようなOAに対する感受性の決定または疾患発症の早期検出は、現在なし得るよりもより早期の臨床的介入を生じ得て、該疾患のより有効な処置を生じ得る。そのような技術はまた、患者の階層化を可能にし得て、とりわけ臨床試験のための患者を選択するのに有用であり得る。

国際特許公開番号: WO 00/20632は、マイクロサテライトマーカーD11S4046とD11S1320の間の第11染色体上の20cMの領域を同定していて、そこは、可能性のあるOAの感受性遺伝子座を含む。この領域は、2段階ノンパラメトリック連鎖解析を受けて同定された。これは、連鎖の証拠である第11染色体上の3個のマイクロサテライトを明らかにした。これらのマイクロサテライトとその周辺のより精密なマッピングが、連鎖の強化された証拠を提供し、連鎖領域を定義するのを可能にした。連鎖不均衡解析は、無成層データ(p<0.001)において、マーカーD11S937の258bpアレル(GDB (Genome Database)に記載されたとおりのアレル11)の過度の伝達を同定した。このデータは、11q上のOA感受性遺伝子座が、D11S937の近くにあり、258bpアレルが、素因祖先染色体(predisposing ancestral chromosome)上に存在し得ることを示した。しかしながら、いずれの単一遺伝子に対してもOAとの関連の開示はなく、また、そのような遺伝子が、開示した20cM領域内に位置し得ることについての示唆もない。

本発明は、TDOAと呼ばれる単一遺伝子に関するOAとの関連の我々の発見に基づき、TDOAは、11q13.5でD11S937を内蔵した11q13-14内の2.8cM領域にマップされている。

TDOAは、ヒトFisクローン(受託AK027572)および理研からのマウスクローン(受託AK017384)(その両方が、機能未知である)と近い相同性を有している。ドメイン探索は、多くのカリウムチャネルの四量体化ドメインを有する、およびまた、いくつかのジンクフィンガータンパク質で発見されたBTB/POZドメインを有するN末端で相同性を示し、二量体化を仲介する。

TDOAは、WO 01/62923 (Incyte Genomics Inc.)に記載されていて、そこでは、TDOAは、TRICH-6と名付けられ、カリウムチャネルであると主張されているが、そこで開示された核酸は、本願発明者らにより同定されたTDOA配列(配列番号2)と比較して、78個のアミノ酸挿入を有する予測されるポリペプチドをコードする。WO 01/62923のTRICH-6配列に存在する核酸挿入配列は、ヒトゲノム配列(例えば、EnsEMBL 9.30a1)と比較したとき、不正確な複製であるように思われる。さらに、TDOA配列を記載した他の特許出願は、下記のものを含む;cDNA配列をコードしたヒトタンパク質、配列番号:653、HYSEQ INC、WO200153455A2;ヒト生殖器官関連抗原DNA、配列番号:9849、Human Genome Sci Inc、WO200155320-A2;ヒト分泌タンパク質5' EST、配列番号:3553、Genset、EP1033401-A2;ならびに配列タグおよびコードされたヒトタンパク質、GENSET、JP2001269182-A/3546。上記に記載したすべての特許出願は、関連した配列ではあるが、OAとの関連は記載されていない。

TDOAタンパク質の予測されるアミノ酸配列は、配列番号2で示している。TDOAのゲノム配列は、配列番号1として開示している。cDNA配列は、配列番号3で示している。

発明の要約
本願発明者らは、第11染色体上の遺伝子と変形性関節症との関連を同定し、そしてこの遺伝子内の多型を同定した。したがって、本出願は、変形性関節症でのTDOAの役割に関する直接的な証拠を提供する。TDOA遺伝子、mRNAおよびそこに由来するタンパク質配列は、したがって、変形性関節症の診断または予後診断マーカーとして使用し得て、遺伝子もしくはmRNAの多型の存在を検出できるか、または試験サンプル、例えば、体液もしくは細胞サンプル中に、mRNAもしくはコードされたタンパク質のレベルを測定できる特異的なプローブを設計するか、または抗体を作製するために使用し得る。さらに、遺伝子およびそれにコードされたタンパク質は、変形性関節症における治療的介入のための、例えば、mRNAを標的としたアンチセンス核酸の開発での、またはより幅広く、治療剤の同定または開発での潜在的な標的である。本願の発明者らはまた、TDOAが、インテグリンシグナル伝達(それ自身が、OAとの強い関連を有する過程である)に関与するタンパク質であるα-パキシリンに結合することを発見した(参考のために、Peters et al. (Osteoarthsitis ＆ Cartilage. 10:831-835 2002)を参照のこと)。本願の発明者らはまた、初代ヒト軟骨細胞におけるTDOAの過剰発現が、細胞内でのα-パキシリンの異常な分布を生じ(タンパク質の多くが、核に存在する)、この結果、OA患者の影響を受けている関節の細胞で観察されるものと一致した遺伝子発現の変化を生じることを発見した。当業者は、TDOA、そのコードされたタンパク質またはそのα-パキシリンに結合する能力を調節する(例えば、活性化する(アゴナイズする))か、または阻害する(アンタゴナイズする))化合物(化学的または生物学的な)を同定するためのスクリーニングアッセイを考案することが可能であり、化合物は、変形性関節症および一般の関節症を処置するか、または予防する治療剤として有用であることを証明し得る。

発明の詳細な説明
下記の定義を本明細書に適用する。

“アレル”は、その特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列により他の形態と区別される、遺伝子座の特定の形態のことを言う。

“発現”は、相当するmRNAを産生する遺伝子のDNAデンプレートの転写および相当する遺伝子産物(すなわち、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質)を産生するこのmRNAの翻訳のことを言う。“遺伝子発現を活性化する”なる用語は、該誘導または増加を、該処理の不在下での遺伝子発現の量と比較したとき、処理に応答して、遺伝子の転写を誘導するか、または増加させることを言う。同様に、“遺伝子発現を減少させる”または“遺伝子発現をダウンレギュレートさせる”なる用語は、該減少またはダウンレギュレーションが、該処理の不在下での遺伝子発現の量と比較したとき、処理に応答して、遺伝子の転写を阻害するか、または妨害することを言う。

“遺伝子型”は、個体の1組の相同染色体における遺伝子座での1個またはそれ以上の多型サイトで発見された、ヌクレオチド対(複数もある)の相特定できない5'から3'の配列である。

本明細書で言及するとき、“単離された”核酸は、その元の環境(例えば、それが自然に生じる天然環境)から取り除かれた、したがって、ヒトの手によりその天然状態から変えられる物質のことを言う。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部であり得るか、または細胞内に含まれ得るが、該ベクター、組成物、または特定の細胞が、ポリヌクレオチドの元の環境ではないので、なお“単離され”ている。

“遺伝子座”は、遺伝子または身体的もしくは表現型的特徴に相当する染色体またはDNA分子上の位置のことを言う。

“多型サイト”は、少なくとも2個の別の配列が集団内で発見されている、遺伝子座内の位置のことを言う。

“多型”は、個体の多型サイトで観察される配列変異のことを言う。多型は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失およびマイクロサテライトを含み、必ずしもその必要はないが、遺伝子発現またはタンパク質機能において検出可能な差異を生じ得る。

したがって、本発明の第1の局面にしたがって、OAを処置することにおける潜在的な治療的または予防的利点を有する化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、1個またはそれ以上の試験化合物を、TDOAポリペプチドを含むスクリーニングにかけ、化合物の能力を決定するか、または該ポリペプチドに結合するか、妨害するか、もしくは調節する化合物または該ポリペプチドの活性を阻害する化合物を決定することを含む。特定の態様では、TDOAポリペプチドは、配列番号2で示したアミノ酸配列、またはそのホモログ、またはいずれかの断片を含有するか、または含む。

本発明のさらなる局面にしたがって、潜在的な治療的または予防的利点を有する化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、TDOAのα-パキシリンへの結合を妨害するか、または阻害する試験化合物の能力を測定することを含む。TDOAのα-パキシリンへの結合を妨害するか、または阻害することが可能な化合物は、潜在的な治療的または予防的利点を有し得る化合物である。特定の態様において、該化合物は、OAを処置するか、または予防することにおける、潜在的な治療的または予防的利点を有し得る。

本明細書で使用するとき、“断片”なる用語は、配列番号2に記載した連続したアミノ酸配列の少なくとも25個、好ましくは、少なくとも50個、より好ましくは、好くなくとも100個を含む、完全長配列の部分列のことを言い、好ましくは、該断片は、C末端切断およびN末端切断のどちらか、または両方を有するTDOAタンパク質であるポリペプチドである。

本発明で使用するポリペプチドは、TDOAタンパク質の断片およびホモログの両方であり得ると理解される。

好ましい態様では、本発明のスクリーニング法は、配列番号2で記載したアミノ酸配列または増加したオーダーの選択性で、少なくとも、その、80%、85%、90%、95%、97%、98%および99%アミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを用いて行う。そのような変異型は、本明細書では“ホモログ”と呼ぶ。本発明での使用のための適当なホモログは、該核酸が、ホモログがTDOAタンパク質の機能を保持するストリンジェントな条件下で、配列番号2に記載したポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするものを含む。

2個の配列間の配列同一性は、例えば、BestFit, GapまたはFrameAlignのプログラムを用いて、ペアワイズコンピューターアライメント解析により決定し得る。好ましいアライメントツールは、BestFitである。実際に、類似/同一配列を、配列データベース内からクエリー探索で探すとき、一般に、適当なソフトウェア、例えば、Blast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA、Fasta3およびPILEUP、ならびに、Blosum 62のような得点マトリクスを用いて、類似配列の最初の同定を行う必要がある。そのようなソフトウェアパッケージは、Smith-Watermanの“gold-standard”アライメントアルゴリズムにかなり接近しようと試みている。したがって、類似性を評価する、すなわち、2個の一次ポリペプチド配列が並ぶ方法を評価するのに使用するための好ましいソフトウェア/サーチエンジンプログラムは、Smith-Watermanである。同一は、直接の一致のことを言い、類似は、保存的置換を含める。

TDOAタンパク質のアレル変異型または変形は、ヒト集団内、特に、異なる民族集団間に存在し得る。本発明のさらなる局面は、インビボで該TDOA変形の活性を変えることができる化合物を発見するためか、またはそれ自身(すなわち、多量体を形成する)もしくはα−パキシリンに結合するその能力を変えるためのスクリーニング中に含まれるべき、適当なTDOAタンパク質の変形の選択および使用を含む。研究者は、標的に対するさまざまな変形間のすべての異なる薬理学的活性を検出するために、TDOAタンパク質の最も一般的な変形に対して、およびまた、より頻度の少ないTDOAタンパク質の変形に対して、それらの化合物をスクリーニングすることを望み得る。本発明のさらなる局面は、該集団内のTDOA遺伝子における一塩基多型(突然変異)のアレル頻度を測定するための、さまざまな民族に基づく集団のスクリーニングである。この情報は、これらの集団内のTDOAの活性を変えることができる新規化合物の有効性を推定すること、および特に、治療に応答し得ない集団の割合を推定するのに価値があり得る。

候補化合物は、さまざまな起源から、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、ペプチドおよび遺伝子ライブラリー、ならびに天然産物混合物から同定し得る。化学ライブラリーは、コンビナトリアル化学ライブラリー、特に、GPCRと相互作用する化合物を含むコンビナトリアル化学ライブラリーを含む。そこで同定したそのようなアンタゴニストまたは阻害剤は、天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素、抗体(上記に記載したとおりの)などであり得るか、場合によっては、TDOAタンパク質のそれらであり得て;または、その構造的もしくは機能的模倣剤であり得る(Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)を参照のこと)。

クロマトグラフィーまたは電気泳動を含む分析的遠心分離親和性結合実験のような技術を、直接、TDOAと相互作用する分子を検出するために使用し得る。タンパク質-タンパク質相互作用の同定を可能にする他の技術は、免疫沈降および酵母ツー・ハイブリッド実験を含む。

阻害、活性化、または調節活性を有する化合物を、TDOA活性(例えば、α-パキシリンへの結合)および/または発現に関するインビトロおよびインビボアッセイを用いて、同定し得て、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそれらのホモログおよび模倣剤であり得る。

本発明のさらなる局面は、表2で要約したとおり、TDOAにおける多型(たいていは、一塩基変化多型/突然変異)の同定から生じる。

多型は、集団内での、2個またはそれ以上の遺伝学的に決定された別のアレルまたは配列の出現のことを言う。多型マーカーは、相違が生じるサイトである。好ましくは、マーカーは、少なくとも2個のアレルを有し、各々は、選択された集団の1%以上の頻度で生じ、そしてより好ましくは、少なくとも、10%、15%、20%、30%またはそれ以上の頻度で生じる。

一塩基多型(SNP)は、一般に、名前のとおり、種のいくつかのメンバーの核酸配列に存在する、1ヌクレオチド変化または点変化を意味する。種内のそのような多型変化は、一般に、進化を通した自然の突然変異の結果であると考えられている。突然変異した配列および正常な配列は、時々、安定した均衡または見かけ上安定した均衡で種の集団内に共存する。ある時には、突然変異は、種に対していくらかの利点を与え、またある時には、種のすべてのまたは大多数のメンバーのゲノム中に組み込まれ得る。

いくつかのSNPは、タンパク質コード配列を変え、その場合には、多型タンパク質型の1つは、異なるアミノ酸を有し得て、それは、変異型タンパク質の発現および潜在的には、遺伝学的疾患を生じ得る。これらの機能における変化は、非限定的に、タンパク質フォールディングの変化、リガンドおよび基質結合親和性の変化および膜結合親和性の変化を含むいくつかのメカニズムが介在し得て、インビボでのタンパク質に関する、活性/機能の獲得または活性/機能の欠損を生じ得る。そのような、インビボでのタンパク質の活性/機能の変化は、OAの発症において臨床的に重要であり得る。タンパク質のアミノ酸配列の変化は、また、タンパク質と該活性を調節するためにスクリーニングにより選択した化合物間の特異性を変えることにより、OAに対する薬剤治療の効果に影響を与え得る。他のSNPは、3'UTRまたは5'UTRの遺伝子の制御領域、プロモーター、スプライスドナーまたはアクセプターサイトに生じる。そのようなサイトにおける変異型は、非限定的に、タンパク質コード変異型と同様の方法で、遺伝子の機能および/または発現を変え得る。したがって、スクリーニングにより選択された化合物は、異なる個体でのタンパク質の活性を調節することにおいて、それらが有する遺伝子の変化にしたがって異なる効果を有し得る。特に、遺伝子のより一般的ではない変異型に関してホモ接合性である個体は、優性変異型に対する化合物をスクリーニングすることにより開発された治療に対して、十分に応答し得ない。

特定の医薬製剤を用いた治療に最も適した患者を同定するのを助ける、多型に関する知識の使用は、しばしば、“薬理遺伝学”と呼ばれる。薬理遺伝学はまた、薬剤選択工程を援助するための医薬探索において使用し得る。多型は、ヒトゲノムをマッピングし、疾患の遺伝学的要素を明らかにするのに使用される。読み手は、薬理遺伝学および他の多型検出の使用に関する詳細な背景に関して、下記の文献に向けられる: Linder et al. Clinical Chemistry, 43:254, 1997; Marshall Nature Biotechnology. 15:1249, 1997;国際特許出願WO 97/40462, Spectra Biomedical;およびSchafer et al, Nature Biotechnology. 16:33,1998。

ハプロタイプは、単一(父性または母性)染色体上の関連のある多型サイト(例えば、遺伝子の範囲内)で発見された一組のアレルである。遺伝子内の組み換えがランダムであるならば、2ⁿハプロタイプもの数であり得て、そこでは、2は各SNPでのアレルの数であり、nはSNPの数である。臨床応答と相関する突然変異または多型を同定する1つの方法は、興味ある集団内で同定し得るあらゆるハプロタイプを用いて、関連研究を行うことである。各ハプロタイプの頻度は、最も稀なアレルの頻度により限定され、その結果、低頻度のアレルを有するSNPは、特に、低頻度ハプロタイプのマーカーとして有用である。ある臨床特徴と関連する特定の突然変異または多型、例えば、逆のまたは異常なイベントは、低頻度である可能性があるので、低頻度のSNPは、特に、これらの突然変異を同定するのに有用である(例えば、下記を参照のこと: Linkage disequilibrium at the cystathionine beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation at the CBS locus and plasma levels of homocysteine (De Stefano et al., Ann Hum Genet 62:481-90, 1998;およびKeightley et al., Blood 93:4277-83, 1999)。

臨床試験は、医薬を用いた処置に対する患者の応答が、しばしば、不均一であることを示した。したがって、医薬設計および治療、ならびに臨床試験設計(患者選択)の改善された方法に関する必要性が存在する。薬剤に対するそれらの可能性のある応答(例えば、安全性または効果の観点で)に基づいて患者を集団に階層化する能力は、治療価値の適当な薬剤を同定するための探索において、かなり有用である。

点突然変異は、下記のとおり言及される:天然アミノ酸(1または3文字表記を用いる)、位置、新規アミノ酸。例えば(仮想)、“D25K”または“Asp25Lys”は、25位のアスパラギン酸(D)がリジン(K)に変わったことを意味する。1つのポリペプチドにおける複数の突然変異は、カンマにより分離した個々の突然変異と共に、角括弧間で示される。

多型位置での特定の核酸塩基の存在は、多型位置の後の塩基により表されるであろう。例えば(仮想の)、300位でのアデニンの存在は、300Aとして表す。

我々は、潜在的にTDOAタンパク質の配列に影響を与える多型(突然変異)の例を提供する。これらの多型は、表2および表3に示す。

プロモーターおよびUTR領域中の一塩基多型(突然変異)は、また、TDOA遺伝子の転写および発現に影響を与え、インビボでのTDOAタンパク質の増加した発現レベルもしくは減少した発現レベルを生じ得るか、または無秩序な活性を生じ得る。そのようなインビボでのTDOAタンパク質の発現レベルの変化は、臨床的に重要な機能の獲得または機能の欠損として生じ得る。最近、アミノ酸変化を生じない多型でさえ、潜在的に異なる生物学的機能を有するmRNAの異なる構造的折り畳みを生じ得ることが報告された(Shen et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:7871-7876, 1999)。

本発明のある態様では、本明細書に記載したスクリーニング法は、配列番号1または配列番号3で示した核酸配列から転写し、そして本明細書で同定し、表2および表3に記載した1個またはそれ以上の多型を内蔵するTDOAタンパク質変異型を利用する。

多型(突然変異)はまた、疾患に対する素因の診断マーカーとして使用し得る。OAを患っている集団内およびOAを患っていないが、非限定的に、民族祖先、出生国、性別、年齢および体重指標を含む因子が一致するコントロール集団内での、多型(特に、SNP)のジェノタイピングは、研究者が、相当するコントロール集団でのそれらの罹患率と比べてOAを有する集団でより優性である、ある多型ジェノタイプまたはハプロタイプの遺伝にしたがって、OA疾患の発症と関連する増加したリスク因子を同定するのを可能にし得る。これは、非症候個体内のこれらの多型のジェノタイプおよびハプロタイプを測定することにより、OAを発症する増加したリスクのある個体をスクリーニングすることを可能にし得る。我々は、OAを発症する増加したリスクの診断のために有用であり得る、TDOA遺伝子におけるいくつかの多型を発見した。これらの多型は、表2に示す。好ましい多型は、表3に示す多型である。{*** + LD table for GT filing only}。

本発明に記載のスクリーニング法は、慣用的な手段を用いて、例えば、試験化合物またはスクリーニングされる化合物および適当な基質を、ポリペプチドまたはそれを産生することができる細胞、またはその細胞膜調製物と接触させ、標準的な技術にしたがって、該ポリペプチドに対する親和性を決定することにより操作し得る。

この方法で同定されたすべての化合物は、ヒトおよび/または他の動物でのOAの処置において有用であると証明し得る。したがって、本発明は、主に、疾患の処置における使用のために配列番号2で示したアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその断片またはしたがって、コードする遺伝子(例えば、配列番号1で開示したもの)を利用するスクリーニングアッセイで決定したとおりの、インビボでのTDOAタンパク質の活性を制御するその能力を介して選択された化合物まで延長されて、そこでは、該タンパク質の過剰もしくは過少活性/機能または非制御活性/機能が関係している。

本発明のさらなる局面にしたがって、スクリーニングアッセイまたは潜在的な疾患修飾抗OA薬剤(DMOAD)を同定するための方法を提供し、これは、TDOAの発現レベルに対する試験化合物の効果を検出することができるアッセイ系に試験化合物を接触させ、そしてTDOAの発現レベルの変化を評価することを含む。特定の態様では、OA障害を処置するための潜在的な治療化合物は、TDOAの発現レベルを減らすことができる化合物である。

TDOAポリペプチドのDNAまたはRNA発現を調節する化合物は、さまざまなアッセイ系により検出し得る。適当なアッセイ系は、レポーター遺伝子、例えば、ベータ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または当業者に既知である他のものの発現の変化が存在するか否かを決定する、単純な“イエス/ノー”アッセイであり得る(Naylor, Biochem. Pharmacol. 58: 749-57,1999を参照のこと)。アッセイ系は、試験サンプルの発現または機能を、標準的なサンプルの発現または機能のレベルと比較することにより定量し得る。転写因子を、ポジティブアウトプットを刺激するために使用する系、例えば、レポーター遺伝子の転写は、一般に、“1ハイブリッド系”と言われる(Wang and Reed. Nature. 364:121-126, 1993)。ネガティブアウトプットを刺激するための転写因子を用いることは(増殖阻害)、したがって、“逆1ハイブリッド系”と言われ得る(Vidal et al, 1996, 上記を参照のこと)。したがって、本発明の1つの態様において、レポーター遺伝子は、TDOAプロモーターの制御下に置かれている。

本発明のさらなる局面では、我々は、TDOAプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む、細胞または細胞株を提供する。

本発明の他の局面にしたがって、潜在的にOAの処置のために有用な化合物をスクリーニングする方法を提供し、TDOAの活性または量を調節する能力に関して、該化合物をアッセイすることを含む。好ましくは、該アッセイは、
i) TDOAポリペプチドを発現する細胞、細胞株または組織を用いるか、または精製したTDOAポリペプチドを用いたTDOA活性の測定;および
ii) TDOAポリペプチドを発現する細胞、細胞株または組織抽出物でのTDOA転写または翻訳の測定
から選択される。
特定の態様において、OA障害を処置するための潜在的な治療化合物は、TDOAの活性または量を減少させることができる化合物である。

“TDOAポリペプチド”は、TDOAタンパク質、そのホモログ、またはいずれかの断片のことを言う。

したがって、本発明のさらなる局面では、TDOAポリペプチドを発現する細胞培養は、治療剤のためのスクリーニングで使用し得る。試験化合物の効果は、TDOAのmRNAまたはタンパク質の変化によりアッセイし得る。下記に記載したとおり、細胞(すなわち、ほ乳類、細菌など)は、TDOAポリペプチドを発現するように設計し得る。

したがって、本発明のさらなる局面は、OA障害表現型を抑制する能力に関して、潜在的な治療剤を試験する方法を提供し、該方法は、試験化合物を、TDOAポリペプチドを発現するように設計した細胞と接触させ、そして該試験化合物が、TDOAポリペプチドの発現を抑制するか否かを決定することを含む。

我々はまた、TDOAの転写の阻害剤を同定するための方法を提供し、該方法は、潜在的な治療剤を、上記したとおりの細胞または細胞株と接触させ、そしてレポーター遺伝子の発現の欠損または減少を参考にして、潜在的な治療剤によるTDOA転写の阻害を決定することを含む。

本発明のさらなる局面にしたがって、潜在的な治療的または予防的利点を有する化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、TDOAのα-パキシリンまたはそれ自身への結合を妨害するか、または阻害する試験化合物の能力を測定すること含む。TDOAのα-パキシリンまたはそれ自身への結合を妨害するか、または阻害することができる化合物は、潜在的な治療的または予防的利点を有し得る化合物である。特定の態様では、これは、OAを処置するか、または予防する。

TDOAとα-パキシリンの相互作用を妨害する潜在的な治療剤を同定し得る、タンパク質:タンパク質相互作用を測定するための多くの異なる技術が存在する。そのような技術の例は、酵母2ハイブリッド (Fields and Song, Nature. 340(6230):245-6,1989)、ほ乳類2ハイブリッド (Dang, C.V., et al. Mol. Cell Biol. 11: 954-962, 1991)、表面プラズモン共鳴(例えば、L. T. Vassilev et al., Science. 303:844-8, 2004を参照のこと)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET; Matyus L., J Photochem Photobiol B. 12(4):323-37,1992を参照のこと)または共沈(例えば、Adams and Ohh. Nature Methods. 2:475-476, 2005を参照のこと)を含む。そのような技術は、完全長TDOAと完全長α-パキシリン、またはα-パキシリンの切断型および欠失型(それらは、酵母2ハイブリッドスクリーニングでもともと同定した領域を内蔵する)との相互作用を破壊する物質を同定するために使用し得る。α-パキシリン遺伝子配列は、受託番号: HS14588で、EMBLデータベースで開示されている。コードされたタンパク質配列は、配列番号8として開示している。本明細書で同定したα-パキシリンの活性化断片のアミノ酸配列は、配列番号9で示す。さらに、これらの方法はまた、完全長TDOAとそれ自身の相互作用を破壊する物質を同定するのに使用し得る。

あらゆる好適な試験化合物または試験化合物のライブラリーは、試験アッセイとともに使用し得る。特定の試験化合物は、ヒトまたは動物使用のための医薬または獣医薬剤として適当な低分子量化合物(好ましくは、1500ダルトン以下の分子量を有する)、または洗浄剤/滅菌剤のような非投与使用のための化合物、または農業使用のための化合物を含む。試験化合物はまた、もともと生物学的なものであり得て、例えば、抗体であり得る。

本発明のさらなる局面にしたがって、本明細書に定義したスクリーニング法により同定した化合物を提供する。

本発明の他の局面にしたがって、TDOAの活性または量を調節できる化合物のOAの処置のための医薬の製造における使用を提供する。化合物によるTDOAの量の調節は、例えば、変えられた遺伝子発現レベルまたはメッセージ安定性を介してもたらし得る。化合物によるTDOA活性の調節はまた、例えば、TDOAタンパク質に結合する化合物を介してもたらし得る。1つの態様では、TDOAの調節は、TDOAの活性または量を減らすことができる化合物の使用を含む。他の態様では、TDOAの調節は、TDOAの活性または量を増やすことができる化合物の使用を含む。

本願の発明者らは、TDOAが多量体としてそれ自身に結合し得ること、およびTDOAが恐らく多量体としてα-パキシリンに結合することを発見した。このことは、TDOAの多量体化を破壊し、α-パキシリンへの結合の欠損を生じる能力を有する化合物をスクリーニングする機会を開いた。

本発明の他の局面にしたがって、TDOAのα-パキシリンへの結合を阻害するか、またはTDOAの多量体化を阻害することができる化合物のOAの処置のための医薬の製造における使用を提供する。この文脈において、“阻害”なる用語は、完全に結合を阻害することまたは妨害することおよび結合の量を減少させることを含む。

当然のことながら、OAの処置に関する用語、およびその変形は、治療的および予防的(防止的)処置を含む。

本発明の他の局面にしたがって、医薬組成物の製造法を提供し、該方法は、
i) 本明細書に記載したスクリーニング法にしたがって、OAの処置のために有用な化合物を同定し;そして
ii) 該化合物または薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合すること
を含む。

本発明のさらなる局面にしたがって、OAを患っている患者の処置法を提供し、該方法は、該患者に、本発明のスクリーニング法にしたがって同定した有効量の化合物または本明細書に記載した方法により製造した有効量の組成物を投与することを含む。

本発明の組成物は、経口使用のために(例えば、錠剤、トローチ剤、硬もしくは軟カプセル、水性もしくは油状懸濁液、エマルジョン、分散粉体もしくは顆粒、シロップ剤またはエリキシル剤として)、局所使用のために(例えば、クリーム、軟膏、ゲル、または水性もしくは油状溶液または懸濁液として)、吸入による投与のために(例えば、微粉または液体エアロゾルとして)、吹き入れによる投与のために(例えば、微粉として)または非経腸投与のために(例えば、静脈内の、皮下の、関節内の、筋肉内のもしくは筋肉内の投与のために滅菌水性もしくは油性溶液としてまたは直腸投与のための座薬として)、適当な形態であり得る。

本発明の組成物は、当業者に既知の慣用的な医薬賦形剤を用いた、慣用的な手順により取得し得る。したがって、経口使用のために意図する組成物は、例えば、1個またはそれ以上の着色料、甘味料、芳香剤および/または保存剤を含み得る。

錠剤製剤のための適当な薬学的に許容される賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウム、造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸;結合剤、例えば、デンプン;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク;保存剤、例えば、エチルまたはp-ヒドロキシ安息香酸プロピル、ならびに抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸
を含む。錠剤製剤は、それぞれの場合に、当業者に既知の慣用的な被覆剤および手順を用いて、それらの崩壊および次の胃腸管内での有効成分の吸収を修飾するか、またはそれらの安定性および/または出現を改善するために、非被覆であるか、または被覆し得る。

経口使用のための組成物は、有効成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセルの形態であるか、または有効成分が、水または油、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルの形態であり得る。

一般に、水性懸濁液は、1個またはそれ以上の懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム;分散剤または湿潤剤、例えば、レクチンまたは脂肪酸を有する酸化アルキレンの濃縮産物(例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン)、または長鎖脂肪族アルコールを有する酸化エチレンの濃縮産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキセタノール、または脂肪酸由来の部分エステルを有する酸化エチレンの濃縮産物およびヘキシトール、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または長鎖脂肪族アルコールを有する酸化エチレンの濃縮産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキセタノール、または脂肪酸由来の部分エステルを有する酸化エチレンの濃縮産物およびヘキシトール、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または脂肪酸由来の部分エステルを有する酸化エチレンの濃縮産物およびヘキシトール無水物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートと共に、微粉状形態での有効成分を含む。水性懸濁液はまた、1個またはそれ以上の防腐剤(例えば、エチルまたはプロピルp-ヒドロキシ安息香酸、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸)、着色剤、香味剤、および/または甘味剤(例えば、スクロース、サッカリンまたはアスパルテート))を含み得る。

油状懸濁液は、植物油(例えば、ラッカッセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油)中または鉱油(例えば、液体パラフィン)中に、有効成分を懸濁することにより製剤し得る。油状懸濁液はまた、増粘剤、例えば、密ろう、硬パラフィンまたはセチルアルコールを含み得る。例えば、上記に記載したとおりの甘味剤および香味剤は、口当たりの良い経口製剤を提供するために添加し得る。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存し得る。

水の添加による水性懸濁液の製造のために適当な分散粉および顆粒は、一般に、分散もしくは湿潤剤、懸濁剤および1個またはそれ以上の防腐剤と共に、有効成分を含む。適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤は、すでに上記したものが例である。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤および着色剤は、また、存在し得る。

本発明の医薬組成物はまた、油水エマルジョンの形態であり得る。油層は、植物油、例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、例えば、例えば、液体パラフィンまたはこれらのいずれかの混合物であり得る。適当な乳化剤は、例えば、天然に生じるガム、例えば、アカシアガムもしくはトラガカントガム、天然に生じるリン脂質、例えば、大豆、レシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルもしくは部分エステル(例えば、ソルビタンモノオレエート)ならびに酸化エチレンとの該部分エステルの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。エマルジョンはまた、甘味剤、香味剤および防腐剤を含み得る。

シロップ剤およびエリキシル剤を、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースと共に製剤し得て、また、鎮痛薬、防腐剤、香味剤および/または着色剤を含み得る。

医薬組成物はまた、滅菌注射用水性または油性懸濁液の形態であり得て、上記に記載した1個またはそれ以上の適当な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の手順にしたがって製剤し得る。滅菌注射用製剤は、また、非毒性非経腸的に許容される希釈剤または溶媒での滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオールでの溶液であり得る。

座薬製剤は、有効成分を、通常の温度では固体であるが、直腸温度では液体である適当な非刺激性賦形剤と混合することにより製造し得て、したがって、直腸内で溶解し、薬剤を放出する。適当な賦形剤は、例えば、ココアバターおよびポリエチレングリコールを含む。

局所製剤、例えば、クリーム、軟膏、ゲルおよび水性もしくは油性溶液または懸濁液は、一般に、有効成分を、当業者に既知の慣用的な手順を用いて、慣用的な局所的に供されるビヒクルまたは希釈剤と共に製剤することにより取得し得る。

吹き入れによる投与のための組成物は、平均直径が、例えば、30μ程度の粒子を含む微粉の形態で有り得て、粉末自体は、有効成分のみを含むか、または1個またはそれ以上の生理学的に許容される担体、例えば、ラクトースで希釈される。次いで、吸入のための粉末は、便利には、ターボインヘイラー装置を用いた使用のために、例えば、1から50mgの有効成分を含むカプセル中に保持され、例えば、既知の薬剤、クロモグリク酸ナトリウムの吸入のために使用される。

吸入による投与のための組成物は、微粉化固体または液滴を含むエアロゾルとして有効成分を投与するために調製された、慣用的な加圧エアロゾルの形態であり得る。慣用的なエアロゾル噴射剤、例えば、揮発性フッ素化炭化水素または炭化水素を使用し得て、エアロゾル装置は、便利には、計量された量の有効成分を投与するために調製される。

製剤に関するさらなる情報のために、読者は、Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990の第5巻第25.2章を参照のこと。

単一用量型を産生するために、1個またはそれ以上の賦形剤と合わせる有効成分の量は、必要に応じて、処置される宿主および特定の投与経路に依存して変わる。例えば、ヒトへの経口投与を意図する製剤は、例えば、適当なおよび好適な量の賦形剤(重量が、全組成物の約5%から約98%まで変わり得る)と共に調合する5 mgから2 gの有効成分を含む。用量単位型は、一般に、約1 mgから約500 mgの有効成分を含む。投与経路および用量レジメンのさらなる情報に関しては、読者は、Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990の第5巻第25.3章を参照のこと。

治療または予防目的のための化合物の用量サイズは、薬学の既知の原理にしたがい、当然に、状態の性質および重篤度、動物または患者の年齢および性ならびに投与経路にしたがって変わる。

治療的または予防的目的のために化合物を使用するとき、一般には、例えば、0.5 mg/kg体重から75 mg/kg体重の範囲の一日投与量が受けられるように投与する(所望により、分割用量で)。一般に、より低い用量が、非経腸投与を使用するときに投与される。したがって、例えば、静脈内投与のために、0.5 mgから30 mg/kg体重の範囲の用量が、使用される。同様に、吸入による投与のために、例えば、0.5 mgから25 mg/kg体重の範囲の用量が、使用される。しかしながら、経口投与および関節内注射が好まれる。

TDOA遺伝子がOAに関与することを同定したので、本発明は、多くの分子診断的機会を提供する。臨床的に重要な情報は、生物学的サンプル内に生じる核酸、タンパク質または他の分析物のレベルの測定により取得し得ることは、当業者には既知である。核酸、タンパク質または他の分析物が、多型で生じるとき、次いで、また、該多型核酸、タンパク質または他の分析物のさまざまな変形のうちどれがサンプル中に生じるかを同定することにより、診断的利用が存在し得る。

研究者は、サンプル中に存在するTDOAタンパク質のレベルを測定するか、またはTDOA mRNA転写産物のレベルを測定することを望み得る。研究者はまた、サンプル中に存在する変異型ヌクレオチド(例えば、SNP)を検出するために、核酸配列解析を行うことを望み得て、これらの解析は、サンプルのDNAまたはRNAフラクションで行い得て、当業者に既知である。研究者はまた、直接、当業者に既知の分解に基づく技術によるか、または間接的に、免疫アッセイを含む分子認識技術によるか、またはタンパク質の物理的特性の変化を検出することに基づく技術、例えば、機能的もしくは基質特異性アッセイもしくは等電点電気泳動法により、タンパク質配列解析を行うことを望み得る。

本発明のさらなる局面にしたがって、OAを診断するか、予後診断するかまたはモニターするための方法を提供し、異常なTDOAのレベルに関して生物学的サンプルを試験することを含む。

“異常なレベル”なる用語は、正常の範囲外にあるレベルのことを言う。正常な範囲は、多くの正常な組織を試験することにより決定し得るか、または試験サンプルを正常なもしくはコントロールサンプルと並べて比較することから決定し得る。本出願の目的のために、異常な発現は、正常なコントロールと比較した疾患サンプルでの核酸のレベルにおける統計的に有意な差異のことを言う。本明細書で使用するとき、核酸は、RNAおよびDNAの両方のことを言う。“統計的に有意な”は、一般に、90%の信頼レベルで、好ましくは、95%の信頼レベルで、より好ましくは、98%の信頼レベルでおよびとりわけ、99%の信頼レベルでの有意を意味する。

試験サンプルは、好適には、滑液、血液(血清、血漿など)、口腔スクレープ、尿または他の体液または個体から取得した組織のサンプルである。

本発明は、OA疾患罹患率に関連することを本明細書で同定した遺伝子の同定による。したがって、部分的には、本発明は、本明細書で同定したTDOA遺伝子の、単独でまたは一団として、コントロール組織の発現と比較して異なる発現レベルを評価することができる、任意の診断法に向けられる。特に、そのような方法は、mRNA転写レベルおよび/またはタンパク質レベルの評価を含み、そこでは、該遺伝子の異常な発現レベルの存在が、OAの存在を示すか、または該障害を発症する増加した可能性を示す。

上記で記載したとおり、1つの態様では、本発明の診断/検出法は、TDOAの1個またはそれ以上の多型の存在を検出するために使用される。

本発明の他の局面にしたがって、TDOAにおける多型の診断のための方法を提供し、該方法は、少なくとも1個の多型位置でのヒトの配列を決定すること、およびTDOAにおける多型を参考にしてヒトの状態を決定することを含む。好ましい多型位置は、30983、38160、12523...12542および32945(各々、配列番号1に従う)の1個もしくはそれ以上、またはそこでD' 0.9を超えた連鎖不均衡での多型である。

“多型の診断”なる用語は、多型位置での個体の遺伝学的状態を決定することを言う(個体は、各位置で同型であるか、または異型であり得る)。

本発明の他の局面にしたがって、ヒトの変形性関節症または発症する感受性の診断のための方法を提供し、該方法は、30983、38160、12523...12542および32945(各々、配列番号1に従う)の1個もしくはそれ以上でのヒトの核酸配列、またはそこでD' 0.9を超えた連鎖不均衡での多型を決定すること、およびTDOA遺伝子における多型を参考にしてヒトの状態を決定することを含む。特定の態様では、この方法は、ヒトでのOAを発症する素因および/または感受性を評価するために使用される(例えば、将来、OAを発症するリスクを評価すること)。OAとの関連を示す特定のアレルは、表3で同定している。

特定の態様では、30983位におけるアデニンの存在および/または38160位におけるグアニンの存在およびまたは12523 - 12542位(各々、配列番号1の位置に従う)からの配列の欠失は、増加したOA発症のリスク(例えば、OAの素因)を示す。さらに、特定の位置(例えば、配列番号1の30983位)でのヌクレオチドと塩基対を形成する配列番号1の相補鎖におけるヌクレオチドの検出は、当然に、主張した発明の範囲内にあることに注目すべきである。

本発明の他の局面にしたがって、個体のジェノタイプを決定する方法を提供し、該方法は、30983、38160、12523...12542および32945(各々、配列番号1に従う)の1個もしくはそれ以上でのヒトの核酸配列、またはそこでD' 0.9を超えた連鎖不均衡での多型を決定すること、およびTDOA遺伝子における多型を参考にしてヒトのジェノタイプ状態を決定することを含む。個体のジェノタイプ状態は、次いで、OAを発症する個体のリスクを測定するために使用し得る。

特定の態様では、これらの特定の局面は、表2で同定した1個またはそれ以上の多型の検出に適用される。

“状態”なる用語は、ポリヌクレオチドまたは相当するタンパク質の定義された位置での潜在的な配列変形により検出された、ヒトの遺伝学的な状態のことを言う。

個体の状態を決定することは、単に、個体のジェノタイプを決定すること(すなわち、特定の多型でのアレルの同定)であり得て、および/またはその情報を臨床的な意義に翻訳すること(例えば、OAを発症する考えられるリスクを評価すること)であり得る。

本発明の多型は、OAと重要な関連があることを証明している。しかしながら、当業者は、OAが多遺伝子疾患であって、それ故、多型(例えば、SNP)のみからなる診断試験は、本発明の1個またはそれ以上を含むハプロタイプでさえ、任意の特定の個体のための疾患の発症のための診断ではないであろうと認識している。にもかかわらず、将来の発症と一致して、我々は、本発明の多型が、臨床の実践に十分に影響を与える正常な臨床的標準内で、個体に関して疾患または疾患感受性を組み合わせて予測するマーカーの一部を形成し得ることを予測している。

本発明の他の局面にしたがって、個体が、OAへの素因があるか否かを決定する方法を提供し、該方法は、個体のTDOA遺伝子座または隣接遺伝子座での少なくとも1個のOA関連ジェノタイプの同型または異型での存在または不存在を決定することを含み(ここで、該隣接遺伝子座は、該TDOA遺伝子座と連鎖不均衡である)、それにより、個体がOAへの素因があるか否かを決定する。

本発明の他の局面にしたがって、OAに対する個体の素因および/または感受性を評価するための方法を提供し、該方法は、
(i) 個体から除去した核酸サンプルを提供すること;
(ii) 個体のTDOA遺伝子における多型サイトでの1個またはそれ以上のヌクレオチドの同定を決定すること;および
(iii) 該1個またはそれ以上のヌクレオチドを参考にして個体の状態を決定すること
を含む。

本発明の他の局面では、OAの診断またはOAを発症する感受性を決定するための方法を提供し、該方法は、
i) 個体から除去されたサンプルを含むタンパク質または核酸を取得すること;TDOAタンパク質内の多型アミノ酸またはTDOA遺伝子配列内の多型塩基に基づいて、変異型TDOAの存在または不存在を検出すること;および、
ii) TDOAにおける多型の存在または不存在を参考にしてヒトの状態を決定すること
を含む。

本発明の1個またはそれ以上の多型位置での変異型ヌクレオチドの存在または不存在を検出するために使用し得る多くの分析的手順が存在することは、当業者には明らかである。一般に、アレル変異型の検出は、突然変異識別技術、所望により、増幅反応および所望により、シグナル産生系を必要とする。リスト1は、多くの突然変異検出技術を記載していて、いくつかは、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)に基づく。これらは、多くのシグナル産生系と組み合わせて使用し得て、その選択は、リスト2に記載している。さらに、増幅技術は、リスト3に記載している。アレル変異型の検出のための多くの現在の方法は、Nollau et al., Clin. Chem. 43:1114-1120, 1997;および標準的なテキスト、例えば、U. Landegren, Oxford University Press, 1996 による“Laboratory Protocols for Mutation Detection”およびNewton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997による“PCR”第2版に記載されている。

表1:略称

リスト1 - 突然変異検出技術
一般:DNA塩基配列決定、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定。
スキャニング:PTT*、SSCP、DGGE、TGGE、Cleavase、ヘテロ二本鎖解析、CMC、酵素ミスマッチ切断。
* 注釈:プロモーター多型の検出のために有用ではない。
ハイブリダイゼーションに基づく:固層ハイブリダイゼーション:ドットブロット、MASDA、逆ドットブロット、オリゴヌクレオチドアレイ(DNAチップ)
溶液層ハイブリダイゼーション: Taqman(商標)- US-5210015 & US-5487972 (Hoffmann-La Roche)、Molecular Beacons - Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303; WO 95/13399 (Public Health Inst., New York)。
伸張に基づく: ARMS(商標)-アレル特異的増幅(欧州特許第-B-332435号および米国特許第5,595,890号に記載したとおり)、ALEX(商標) - 欧州特許第332435 B1号 (Zeneca Limited)、COPS - Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347。
取り込みに基づく:ミニ-塩基配列決定、APEX。
制限酵素に基づく: RFLP、制限酵素サイト産生PCR。
ライゲーションに基づく:OLA。
他: インベーダーアッセイ、ハイブリダイゼーション保護アッセイ。

リスト2 - シグナル産生または検出系
蛍光:FRET、蛍光クエンチング、蛍光偏光 - 英国特許第2228998号(Zeneca Limited)。
他:化学発光、ラマン、放射能、比色分析、質量分析、SERRS - WO 97/05280 (ストラスクライド大学)。

リスト3 - さらなる増幅法
SSR、NASBA、LCR、SDA、b-DNA

好ましい突然変異検出技術は、ARMS(商標)-アレル特異的増幅、Taqman(商標)、ミニ塩基配列決定、塩基配列決定、RFLP、ALEX(商標)、OLA、制限サイトに基づくPCRおよびFRET技術を含む。

特に好ましい方法は、ARMS(商標)-アレル特異的増幅、OLAおよびRFLPに基づく方法を含む。ARMS(商標)-アレル特異的増幅が、とりわけ好ましい方法である。

ARMS(商標)-アレル特異的増幅(欧州特許第EP-B-332435号、米国特許第5,595,890号およびNewton et al. (Nucleic Acids Research, 17:2503, 1989)に記載されている)は、プライマーの3'末端ヌクレオチドおよびその鋳型の相補性に依存する。プライマーの3'末端ヌクレオチドが、特定の突然変異、アレルまたは多型に相補的であるか、または非相補的であるかが検出される。3'末端ヌクレオチドが、塩基突然変異、アレルまたは多型に相補的であるプライマーからのプ、ライマー伸張に対する選択的な利点が存在する。鋳型配列と3'末端ミスマッチを有するそれらのプライマーは、酵素的プライマー伸張を大幅に阻害するか、または妨害する。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応または非方向性プライマー伸張反応は、3'末端ヌクレオチドが、鋳型のそれに相補的ではないときではなく(少なくとも、増幅効率はよくない)、3'末端ヌクレオチドが、鋳型のそれに相補的であるときに生成物増幅を生じる。

当然のことながら、試験サンプルは、等しく、試験サンプルの配列に相当する核酸配列であり得て、サンプル核酸中の領域の全体または部分は、最初に、解析前に、任意の慣用的な技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅し得る。核酸は、ゲノムDNAまたは分画化もしくは全細胞RNAであり得る。1つの態様では、RNAは全細胞RNAであり、直接、ランダムプライマーまたはポリAプライマーを用いて第1鎖cDNAを標識するための鋳型として使用する。試験サンプル中の核酸またはタンパク質は、標準的な方法論(Sambrook et al. “Molecular Cloning- A Laboratory manual”, second edition. Cold Spring Harbor, NY (1989))にしたがって、サンプルから抽出し得る。

TDOAのために開示した遺伝子配列(配列番号1に記載したとおりの)は、代表的な配列であることは明らかであるだろう。正常な個体では、各遺伝子について2個のコピー(母性および父性コピー)が存在し、それは、いくつかの配列差異を有し、さらには、集団内で、遺伝子配列の多くのアレル変異型(天然のアレル変異型)が存在する。当然のことながら、本発明の診断法および他の局面は、これらの配列変異型のいずれかの検出などにまで延長される。好ましい配列変異型は、配列番号1または2で記載したTDOAと少なくとも90%の配列同一性、および好ましくは、少なくとも95%の配列同一性(核酸またはアミノ酸)を有する変異型である。核酸配列同一性はまた、ハイブリダイゼーション研究により測定し得て、そこでは、ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下で、密接に関連した配列(例えば、>90%の同一性を有する配列)のみが、ハイブリダイゼーション複合体を形成できる。

診断のためのアミノ酸配列法は、好ましくは、免疫学的な方法、例えば、酵素免疫測定法(ELISA)により決定される方法である。

TDOAのレベルは、試験サンプル中に存在するmRNA、cDNA、ゲノムDNAまたはポリペプチド配列の相対的な量から評価し得る。RNAを使用するとき、RNAを相補的cDNAに変換することを望み得て、この過程の間に、適当な検出可能標識をcDNA中に組み込むことを望み得る。

特定の態様では、本発明の方法は、mRNA転写レベルの検出に依存する。これは、サンプル中のTDOAの相対的なmRNA転写レベルの評価、およびサンプルデータのコントロールデータとの比較を含む。遺伝子転写は、個々に検出し得るか、または、好ましくは、他の疾患関連遺伝子TDOA中に検出し得て、そこから、転写プロファイルを産生し得る。試験サンプル中のTDOA mRNAレベルは、当業者に既知の任意の技術により検出し得る。これらは、ノザンブロット解析、逆転写酵素-PCR増幅(RT-PCR)、マイクロアレイ解析およびRNAse保護を含む。

1つの態様では、サンプル中のTDOA RNAのレベルは、ノザンブロットアッセイで測定し得る。ここでは、組織RNAを電気泳動により分画し、固体膜支持体、例えば、ニトロセルロースまたはナイロンに固定し、そして検出されるべきTDOA RNAと選択的にハイブリダイズすることができるプローブ(複数もある)にハイブリダイズさせる。実際のレベルは、1個またはそれ以上のコントロールハウスキーピング遺伝子を参考にして、定量化し得る。プローブは、単独で、または組み合わせて使用し得る。これはまた、プローブにより検出されるmRNAの大きさに関する情報を提供し得る。ハウスキーピング遺伝子は、細胞の一般的な代謝または維持に関与する遺伝子であり、細胞型、生理学的状態または細胞周期の状態に関わらず、一定のレベルで発現すると考えられている。適当なハウスキーピング遺伝子の例は、下記である:ベータアクチン、GAPDH、ヒストン H3.3またはリボソームタンパク質L13(Koehler et al., Quantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction. Springer-Verlag, Germany (1995))。

相対的な発現レベルを測定するために、コントロールサンプルを、試験サンプルと一緒に流し得るか、または試験結果/値を、正常なまたはコントロール組織で予期されるTDOA発現レベルと比較し得る。これらのコントロール値は、試験の前に、正常なコントロール組織を用いた実験から産生し得て、TDOAに関する平均のまたは正常な値を産生し得る。

他の態様では、組織サンプル中のTDOA核酸を増幅し、定量的にアッセイされる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の手順は、変性、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号1で開示した配列にしたがって設計した)のアニーリング、およびDNAポリメラーゼを用いたプライマーの伸張を含む一連の反復工程を介して、特定の核酸配列を増幅するのに使用し得る(例えば、Mullis, et al.,米国特許第4,683,202号; Loh et al., Science 243:217 (1988)を参照のこと)。逆転写酵素-PCR (RT-PCR)では、この手順は、先行して逆転写工程があり、mRNAのコピー数の大量の増幅を可能にする(Koehler et al., 上記を参照のこと)。他の既知の核酸増幅手順は、転写に基づく増幅系(TAS)、例えば、核酸に基づく配列適用(NASBA)および3SR(Kwoh et al., Proc Natl. Acad Sci USA 86:1173 (1989), Gingeras et al., PCT出願WO 88/10315)、リガーゼ連鎖反応(LCR、欧州特許第320308号を参照のこと)、鎖置換増幅法(SDA)、“race”、“一方向PCR”および他のもの(Frohman, PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. Academic Press, NY (1990); Ohara et al., Proc Natl Acad Sci. USA 86:5673-5677,1989)を含む。RT-PCR産物の定量は、反応生成物が指数関数的に増えている間に為し得て、診断的に有用な臨床データを産生し得る。1つの態様では、解析は、また、RT-PCRにより増幅される1個またはそれ以上のハウスキーピング遺伝子を参照して行われる。RT-PCR産物の定量は、例えば、ゲル電気泳動目視検査またはイメージ解析、HPLC(上記、Koehler et al.を参照のこと)によるか、または蛍光検出法、例えば、インターカレーション標識、Taqmanプローブ(Higuchi et al., Biotechnology 10:413-417,1992)、Molecular Beacon (Piatek et al., Nature Biotechnol. 4:359-363,1998)、プライマーまたはScorpionプライマー(Whitcombe et al., Nature Biotech 17:804-807, 1999);または他の蛍光検出法の使用により行い得る(コントロールハウスキーピング遺伝子または上記に記載した遺伝子と比較する)。

TDOA RNA測定はまた、滑液、血液または血清サンプルで行い得る。好ましくは、RNAは、末梢血サンプルから取得される。血液血清中の可溶性RNAの場合には、予期されるmRNAの低い存在度のために、RT-PCR (Kopreski et al., Clin Cancer Res 5:1961-5, 1999)のような感度の高い試験が必要である。全血勾配を、有核細胞を単離するために行い得て、全RNAを、例えば、Rnazole B法(Tel-Test Inc., Friendsworth, Tex.)によるか、またはSambrook et al.(上記を参照のこと)で上記に記載したような当業者に既知の方法の修飾により抽出する。

本発明の特定の態様では、本発明の診断/検出法は、マイクロアレイ解析を用いてTDOA転写レベルを評価することを含む。マイクロアレイ技術により、多くの数千の遺伝子の発現を1回の実験で同時に研究することが可能になる。ヒト組織(例えば、生検または死後の組織)での遺伝子発現の解析は、疾患の診断および予後診断ならびに疾患に関するリスクの評価を助け得る。定義された病理学的疾患状態を有する患者からのさまざまな遺伝子の発現レベルと正常な患者との比較は、疾患に特徴的な発現プロファイルを作製するのを可能にする。

試験サンプル中の標的TDOA遺伝子の配列に選択的にハイブリダイズするプローブを作製する。これらのプローブを、おそらく、他のプローブおよびコントロールプローブと共に、適当な支持媒体上、例えば、ナイロンフィルターまたは顕微鏡用スライド上で、別々の場所に結合させ、転写プロファイリングアレイを形成する。診断法は、臨床サンプル中のTDOAの相対的なmRNA転写レベルを評価することを含む。これは、組織mRNAを放射活性標識するか、または非放射活性標識することにより為し得て、該mRNAは、所望により、当業者に既知の多くの方法のいずれかで全RNAから精製し得る(Sambrook et al., 上記を参照のこと)。プローブは、標的TDOA mRNAの任意の一部、またはそのすべてに向け得る。

本発明の他の態様では、全TDOA RNAまたはDNAを定量し、コントロール組織のレベルまたは先に試験した標準からの予期されるレベルと比較する。DNAおよび/またはRNAは、当業者に既知の技術を用いて定量し得る。メッセンジャーRNAは、しばしば、サンプル中の内部コントロールmRNAレベルを参考にして定量し、しばしば、ハウスキーピング遺伝子と比較して定量する(Koehler et al., 上記を参照のこと)。

好ましい態様では、産生したハイブリダイゼーションシグナルは、ナイロン膜のような固相支持体上のプローブのマイクロアレイにハイブリダイズする放射能標識した組織RNAに曝された、ホスホイメージスクリーン上のイメージのコンピューターソフトウェア解析により測定する。他には、量は、放射線感受性フィルム(例えば、X線フィルム)の濃度測定により測定するか、または視覚的手段により予測する。他の態様では、量は、蛍光標識プローブの使用により測定し、それは、異なるフルオロフォアで標識した異なる生検および正常なRNAの混合物であり得て、正常なレベルに対する比率として表されるTDOA mRNAの定量を可能にする。この型の実験での固相支持体は、一般に、ガラス蛍光顕微鏡スライドであり、検出は、蛍光顕微鏡およびコンピューターイメージングによる。

特異的な相互作用の検出は、標識した標的配列がアレイに結合する位置を検出することにより行い得る。放射性標識プローブは、慣用的なオートラジオグラフィー技術を用いて検出し得る。デジタル化スキャナーおよび結果を解析するための適当なソフトウェアを装備したスキャニングオートラジオグラフィーの使用が好ましい。標識が蛍光標識であるとき、例えば、国際公開番号WO 90/15070;米国特許第5143854号または米国特許第5744305号に記載された装置を、有利に適用し得る。確かに、たいていのアレイフォーマットは、標識した捕捉物/標的二本鎖形成を検出するのに、蛍光読み出しを使用する。レーザー共焦点蛍光顕微鏡は、日常的に使用される他の技術である(Kozal et al., Nature Medicine 2:753-759, 1996)。質量分析はまた、DNAアレイに結合したオリゴヌクレオチドを検出するのに使用し得る(Little et al, Analytical Chemistry 69: 4540-4546, 1997)。使用するレポーター系が何であろうと、高性能の器具およびソフトウェアは、大量の読み出しから意味のあるデータを読み取るのに必要とされ得る(例えば、米国特許第5800992号または国際公開番号WO 90/04652に記載されたように)。

マイクロアレイ試験の好ましい態様では、TDOA RNA測定は、一定であるか、または相対的に一定であることが既知な内部標準(すなわち、ハウスキーピング遺伝子)と比較した値として産生される。ヒストンH3.3およびリボソームタンパク質L19ハウスキーピング遺伝子は、細胞周期から独立しており、構成的にあらゆる組織で発現していることが示された(Koehler et al.,上記を参照のこと)。データの標準化に関して、いくつかの異なるハウスキーピング遺伝子を、平均的なハウスキーピング遺伝子測定を作製するために使用し得る。

OA障害またはその感受性を検出するためのマイクロアレイまたはRT-PCR試験は、mRNAを含んだ組織サンプルが利用できるとき、使用し得る。

RNA抽出のためのサンプルは、RNA分解を避けるために即座に処理しなければならない(Sambrook et al., 上記を参照のこと)。これは、例えば、フェノールに基づく試薬または、例えば、液体窒素での即座の凍結を用いた、素早い抽出を必要とする。RNAを後日抽出し得るまで、サンプルを-70℃またはそれ以下で保存し得る。組織または細胞を、好適に、室温で数日間および4℃で数ヶ月間保存できる専有試薬を利用できる(例えば、RNAlater, Ambion Inc., TX )。抽出より先に、破砕、混合または均質化のような方法を、適当な抽出バッファー中で組織を分散するのに使用する。次いで、典型的なプロトコールは、溶媒抽出および選択的沈殿技術を使用する。

他の態様では、TDOA核酸に選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブ(複数もある)を、TDOA遺伝子発現のレベルを検出するために使用し得る。

本発明のさまざまな局面における使用のための好適なDNA配列は、慣用的な分子生物学的手順を用いて、例えば、ヒトゲノムまたはcDNAライブラリーを、本明細書に記載したヌクレオチド配列を用いて設計した10個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含む、1個またはそれ以上の標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて探索することにより取得し得る。あるいは、DNAの特定の領域に隣接するために、本明細書に記載したヌクレオチド配列を用いて設計した一組のオリゴヌクレオチド(その1つは、センス鎖に相同であり、1つは、アンチセンス鎖に相同である)は、cDNAライブラリーから該DNAを増幅するために使用し得る。

本発明の方法のいずれかにおける使用のためのプライマーまたはプローブは、任意の好適な合成法を用いて製造し得る。そのような方法の例は、標準的なテキスト、例えば、“Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties,” Methods in Molecular Biology Series; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7 (1993); 1^st Editionに見出し得る。必要ならば、プライマー(複数もある)を検出を促進するために標識し得る。

本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、特に、TDOAにおける特定の多型(例えば、SNP)の遺伝子型を検出するために適当である。

本発明のプライマーまたはプローブと組み合わせて使用し得る多くの慣用的な検出可能標識、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光化合物、標識結合タンパク質、磁気ラベル、分光マーカーおよび結合酵素が存在する。当業者に既知の1つの特定の例は、³²Pを用いたエンドラベリングである。蛍光標識は、それらが、放射性標識よりも危険が少なく、それらが、低いバックグラウンドを有する強いシグナルを提供し、異なる波長の光を吸収しおよび/または異なる色シグナルを発することができるさまざまな異なるフルオロフォアが、同じ解析での比較解析を可能にするために存在しているので好ましい。例えば、フルオルセインは緑色を発し、ローダミンは赤色を発し、そして両方一緒の場合は黄色を発する。

増幅のための好ましいプライマーは、長さが15から60 bp、より好ましくは、17から35bpである。プローブ配列は、上限の長さが、約25ヌクレオチドであり得る。標的配列が、2kbのサイズの遺伝子であれば、プローブ配列は、遺伝子配列相補体を完成し得て、したがって、また、2kbのサイズであり得る。好ましくは、プローブ配列は、標的配列のゲノム断片、またはより好ましくは、cDNA断片であり、50から2000 bp、好ましくは、200から750 bpであり得る。当然のことながら、おそらくTDOA遺伝子配列の完全長に渡って、各々TDOA核酸の異なる標的配列に選択的にハイブリダイズすることができる複数のプローブは、製造し、診断試験で一緒に使用し得る。プライマーまたはプローブは、標的配列と完全に相同であり得るか、または正確な鋳型配列に結合する特異性を援助するために、1個またはそれ以上のミスマッチを含み得る。興味のある標的配列に選択的にハイブリダイズすることができる任意の配列は、適当なプライマーまたはプローブ配列として使用し得る。また、当然ながら、プローブまたはプライマー配列は、標的鋳型核酸にハイブリダイズしなければならない。標的核酸が、二本鎖(ゲノムまたはcDNA)であるならば、次いで、プローブまたはプライマー配列は、センスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズし得る。しかしながら、標的がmRNA(一本鎖のセンス鎖)であるならば、プライマー/プローブ配列は、アンチセンス相補体でなければならない。

核酸をナイロン膜に固定するときの適当なハイブリダイゼーション溶液の一例は、6 x SSC (クエン酸ナトリウム生理食塩水)、0.5% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、100μg/mlの変性、超音波処理されたサーモン精子DNAであり、プローブ核酸は、500塩基または塩基対よりも大きい。ハイブリダイゼーションは、68℃で少なくとも1時間行い、次いで、フィルターを1 x SSCにより68℃で洗浄するか、またはより高いストリンジェンシーでは、0.1 x SSC/0.1% SDSで洗浄する。

“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”の他の例は、50% ホルムアミド、5x SSC(750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5x Denhardt's溶液、10% 硫酸デキストラン、および20 pg/ml変性、切断されたサーモン精子DNAを含む溶液による42℃での一晩のインキュベーションを提供し、その後、0.1x SSCにより65℃で少なくとも1時間、フィルターを洗浄する。

核酸をナイロン膜に固定するときの適当なハイブリダイゼーション溶液の一例は、3M トリメチル塩化アンモニウム(TMACl)、0.01M リン酸ナトリウム(pH 6.8)、1mM EDTA(pH 7.6)、0.5% SDS、100μg/ml 変性、超音波処理されたサーモン精子DNAおよび0.1 乾燥スキムミルクであり、プローブは、12から50塩基の間のオリゴヌクレオチドである。最適ハイブリダイゼーション温度(Tm)は、通常、ハイブリッド鎖のTiから5℃低くなるように選択される。Tiは、プローブとその標的間で形成されるハイブリッドの不可逆的な融点である。プローブとその標的間でいずれかのミスマッチが存在するならば、Tmは、より低くなる。一般の手引きとして、3M TMACl中17-merのための推薦されるハイブリダイゼーション温度は、48-50℃であり; 19-merのためには、それは、55-57℃であり;そして、20-merのためには、それは、58-66℃である。

TDOA遺伝子発現のレベルはまた、ポリペプチド(TDOAタンパク質)のレベルをスクリーニングすることにより検出し得る。例えば、TDOAタンパク質との免疫反応性を示すモノクローナル抗体は、試験サンプルをスクリーニングするのに使用し得る。そのような免疫学的アッセイは、当業者に既知の任意の慣用的な様式で為し得る。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織化学的アッセイおよびELISAアッセイを含む。タンパク質結合決定のような機能的アッセイはまた、使用し得る。

本発明のTDOAタンパク質およびホモログまたはその断片は、選択的にそれに結合し、そうすることで該タンパク質の活性を制御する物質を作製するために使用し得る。そのような物質は、例えば、抗体を含み、本発明は、特に、配列番号2で示したタンパク質に結合可能な抗体にまで延長される。特に、抗体は、中和抗体であり得る。

本明細書で使用するとき、抗体なる用語は、抗体全体またはその断片、例えば、F(ab)2、Fab、FV、VHもしくはVK断片、一本鎖抗体、多量体単一特異的抗体もしくはその断片、または二もしくは複数特異的抗体もしくはその断片を意味するものと理解されるべきである。これらの型の抗体誘導体およびそれらの略語の各々は、当業者に既知である。

他の好ましい態様では、TDOAタンパク質に向けられる抗体は、OA疾患の検出、予後診断、診断および段階分けに使用し得る。免疫化学的染色法を含む当業者に既知のさまざまな組織学的染色法を、また、使用し得る。銀染色は、TDOAタンパク質を検出する1つの方法に過ぎない。本発明で使用する他の染色方法に関しては、例えば、A Textbook of Histology, Eds. Bloom and Fawcett, W.B. Saunders Co., Philadelphia (1964)を参照のこと。

本発明のさらなる局面にしたがって、OAを診断するか、予後診断するか、またはモニターするアッセイにおける、TDOAタンパク質に選択的な抗体の使用を提供する。

本発明のこの局面で使用する抗体は、TDOAタンパク質/ポリペプチドを用いて製造し得る。

標識化抗体を作製し検出する方法は、既知である(Campbell; Monoclonal Antibody Technology, in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13. Eds: Burdon R et al. Elsevier, Amsterdam (1984))。抗体なる用語は、実質的に同種の集団であるモノクローナル抗体および異種の集団であるポリクローナル抗体の両方を含む。その用語はまた、とりわけ、ヒト化およびキメラ抗体を含む。特定の抗原に対するモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法により、例えば、ハイブリドーマ細胞、ファージディスプレイライブラリーまたは他の方法から取得し得る。モノクローナル抗体は、とりわけ、ヒト、ラットまたはマウス由来であり得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のために、ハイブリドーマ細胞は、免疫化動物、例えば、マウスからの脾臓細胞を腫瘍細胞と融合させることにより製造し得る。その後、適当な分泌ハイブリドーマ細胞を選択し得る(Koehler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Cole et al., “Monoclonal Antibody and Cancer Therapy”, Alan R Liss Inc, New York N.Y. pp 77-96 (1985))。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそのいずれかのサブクラスを含むいずれかの免疫グロブリンクラスであり得る。

ポリクローナル抗体は、抗原、例えば、本発明で使用するTDOAタンパク質の1つを用いた動物(例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジなど)の免疫化により作製し得る。

TDOAポリペプチド(複数もある)は、当業者に既知のさまざまな技術により製造し得る。RNA転写産物は、既知の方法にしたがって、インビトロ翻訳技術により、本発明のポリペプチドを製造するために使用し得る(上記、Sambrook et al.を参照のこと)。あるいは、TDOAポリペプチド(複数もある)は、化学的に合成し得る。例えば、Merryfield技術(J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1968)による。多くの自動ポリペプチド合成機、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機がまた、現在、存在する。あるいは、TDOAポリペプチド(複数もある)は、組み換え発現技術を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から産生する。さまざまな発現ベクター/宿主系は、TDOAコード配列を発現するために使用し得る。これらは、非限定的に、微生物、例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージを発現する細菌;発現ベクターで形質転換された酵母;バキュロウイルス発現系でトランスフェクトされた昆虫細胞系;植物ウイルス発現系、例えば、カリフラワーモザイクウイルスでトランスフェクトされた植物細胞系;またはほ乳類細胞系(例えば、アデノウイルスベクターでトランスフェクトされたもの)を含み;多くの適当な系の選択は、選択の問題である。好ましくは、TDOAタンパク質は、真核細胞、とりわけ、ほ乳類、昆虫および酵母細胞で発現する。ほ乳類細胞は、組み換えTDOAタンパク質に翻訳後修飾を提供し、それは、折り畳みおよび/またはリン酸化を含む。

発現ベクターは、通常、複製開始点、プロモーター、翻訳開始サイト、所望により、シグナルペプチド、ポリアデニル化サイト、および転写終結サイトを含む。これらのベクターはまた、通常、選択のために1個またはそれ以上の抗生物質耐性マーカー遺伝子(複数もある)を含む。上記したとおり、適当な発現ベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージもしくはレトロウイルスのようなウイルスであり得る。ポリペプチドのコード配列は、適当なプロモーター、制御エレメントおよび転写ターミネーターの制御下におき、その結果、ポリペプチドをコードした核酸配列は、発現ベクターコンストラクトにより形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞中で、RNAに転写される。コード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドまたはリーダー配列を含み得るか、または含み得ない。TDOAポリペプチド(複数もある)の発現および精製は、当業者に既知の方法を用いて容易に行い得る(例えば、上記、Sambrook et al.で記載したとおり)。

α-パキシリンと共にTDOAポリペプチド(複数もある)もまた、TDOA:α-パキシリン結合を阻害することができる化合物を同定するための結合アッセイで使用し得る。

本発明のTDOAポリペプチド(複数もある)はまた、動物に接種するために使用し得て、後に、導入したTDOAタンパク質/ポリペプチドに対する特異的な抗体を含有する血清サンプルを、そこから取得し得る。

齧歯類抗体は、当業者に既知の技術にしたがって、組み換えDNA技術を用いてヒト化し得る。あるいは、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片を、また、当業者に既知の技術を用いて、本発明のポリペプチドに対して開発し得る(Huse et al., Science 256:1275-1281, 1989)。そうして産生した抗体は、多くの使用を有し、それは、当分野の分子生物学者または免疫学者にとって明らかである。そのような使用は、非限定的に、酵素発現をモニタリングすること、酵素活性を測定するためのアッセイの開発および治療剤としての使用を含む。酵素免疫測定法(ELISA)は、当業者に既知であり、特に、試験サンプル中のTDOAタンパク質またはそのポリペプチド断片を検出するのに適当である。

TDOA特異的抗体は、体液中のTDOAタンパク質を検出するためにELISAアッセイで、または免疫組織化学的もしくは他の手段により使用し得る。さらに、抗体は、個々に、または抗体の一団の一部として、尿試験紙または類似の診断装置で共通のタンパク質に反応するコントロール抗体と共に使用し得る。

試験サンプル中のTDOAを検出するために必要とされるあらゆる重要な材料および試薬は、キット中に一緒に集め得る。そのようなキットは、コントロールプローブ/プライマーと共に1個またはそれ以上の診断cDNAプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。キットは、マイクロアレイ基質、例えば、フィルター膜またはシリコン基底基質に固定したプローブを含み得る。キットはまた、さまざまな生理学的状態の組織、例えば、正常な、BPH、限定腫瘍および例えば、コントロールとして使用される転移腫瘍由来の全RNAのサンプルを含み得る。キットはまた、適当な包装および本発明の方法における使用のための指示書を含み得る。

本発明の他の局面にしたがって、OAを診断するか、予後診断するか、またはモニタリングする診断キットを提供し、該キットは、TDOAに選択的にハイブリダイズするか、または結合することができる、1個またはそれ以上の診断用プローブ(複数もある)および/または診断用プライマー(複数もある)および/または抗体を含む。

当然のことながら、“診断用キット”なる用語は、診断使用のみのキットに限定することを意図するものではなく、それはまた、他の使用、例えば、予後診断、段階モニタリングおよび治療効果研究における使用を包含する。

好ましい態様では、診断用(検出)プローブは、マイクロアレイ上で提供する。

そのようなキットは、さらに、適当なバッファー(複数もある)および/またはポリメラーゼ(複数もある)、例えば、熱安定性ポリメラーゼ(例えば、taqポリメラーゼ)を含み得る。それらはまた、コンパニオン/一定プライマーおよび/またはコントロールプライマーまたはプローブを含み得る。コンパニオン/通常プライマーは、PCRを行うために使用するプライマー対の部分である。そのようなプライマーは、通常、正確に鋳型鎖を補完する。キットはまた、フルオロフォア(例えば、Cy5)で標識したコントロール正常OA RNAを含む。使用において、生検または体液または細胞由来の患者RNAは、他のフルオロフォア(例えば、Cy3)で標識し得て、次いで、RNAは、混合され、アレイにハイブリダイズされ得る。蛍光比率、例えば、Cy3:Cy5を検出するための装置が利用可能であり、TDOA過剰発現を検出するために使用し得る。

他の態様では、キットは、インサイチュで組織切片中のmRNAにハイブリダイズするのに適当な1個またはそれ以上の特異的プローブを含む。キットはまた、ハイブリダイゼーションバッファーおよび比色または蛍光顕微鏡検出のための検出試薬を含み得る。

他の態様では、キットは、TDOA mRNAのRT-PCRによる定量のための、一組の特異的オリゴヌクレオチドプライマー、所望により、標識したものを含む。これらは、特異的なPCR産物の正確な定量を可能にするScorpionプライマー(Whitcombe et al., Nature Biotechnol. 17:804-807, 1999)であり得る。あるいは、TaqmanまたはMolecular Beaconプローブを、この目的のためにキット中に提供し得る。キットの1つの形態は、いくつかのウェルに特定の試薬を含むマイクロタイタープレートであり、そこで、抽出RNAのアリコートをピペッティングし得る。マイクロタイタープレートは、適当な機械で熱循環させ得て、また、プレートウェルからの蛍光放出を読み取ることができ得る(例えば、Perkin Elmer 7700)。

他の態様では、キットは、免疫組織化学的解析における使用のために、TDOAタンパク質に対して特異的な1個またはそれ以上の抗体を含む。

他の態様では、キットは、本明細書で同定したTDOAタンパク質に対して特異的な1個またはそれ以上の抗体を含む、ELISAキットである。

本発明の他の局面では、OAを患っている患者を処置するための方法を提供し、該方法は、該患者にTDOAに対して特異的な有効量の抗体を投与することを含む。

本発明の他の局面にしたがって、TDOA遺伝子は、遺伝子治療で、例えば、インビボでの該タンパク質の産生を修飾することが望ましい場合に、使用し得て、本発明は、そのような使用まで拡張される。

本発明にしたがった遺伝子の知識は、また、例えば、アンチセンスDNAまたはRNAの使用により、そのインビボでの発現を制御する能力を提供し得る。特定の遺伝子(例えば、本明細書で同定したTDOA)の発現レベルを阻害するか、または弱める1つの治療的手段は、アンチセンス治療を使用することである。アンチセンス治療は、特定のmRNA配列を反映するように設計されたDNAまたはRNAの合成断片(“オリゴヌクレオチド”)であるアンチセンス核酸分子を利用し、タンパク質産生を妨害する。mRNAは、いったん形成されると、効率的にRNA配列を読み取り、遺伝子により指示された特定のタンパク質分子を産生する細胞のタンパク質産生“工場”であるリボソームに結合する。アンチセンス分子が、細胞に送達されれば(例えば、天然のオリゴヌクレオチドとして、または適当なアンチセンス発現ベクターにより)、その配列が、塩基の標的配列に対して相補的であるように設計されているので、それは、メッセンジャーRNAに結合する。二本の鎖が結合すると、mRNAはもはや、リボソームによるコードされたタンパク質の製造を指示できず、素早く細胞内酵素により破壊され、それにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドは解放され、mRNAの他の同一メッセンジャー鎖を探し、不安定にする。

したがって、本発明の他の局面では、OAを患っている患者を処置するための方法を提供し、該方法は、該患者に、TDOA遺伝子のmRNAに結合し、TDOA遺伝子のタンパク質産物の発現を阻害することができる有効量の抗アンチセンス分子を投与することを含む。

完全なタンパク質産生の阻害は重要ではなく、実際には、有害であり得る。正常な組織の状態に類似した状態までの阻害が、望ましいと考えられる。

アンチセンス治療のこの局面では、特に、OA障害の原因が、問題となっているTDOA遺伝子の過剰発現が直接の原因となっている場合に適用できる(該TDOA遺伝子が、間接的にOA障害の原因となっている場合にも、等しく適用できる)。TDOA遺伝子およびmRNA配列に関する知識で、当業者は、適当なアンチセンス核酸治療分子を設計し、所望により、それらを投与することができる。

治療的潜在性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、十分に確立された技術を用いて、実験的に決定し得る。ほ乳類細胞での本発明のTDOA遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を可能にするために、1つの例は、アンチセンス発現コンストラクトを、例えば、pREP10ベクター(Invitrogen Corporation)を用いて、容易に構築し得る。転写産物は、この型のコンストラクトでトランスフェクトされた細胞において遺伝子の翻訳を阻害することが予期される。アンチセンス転写産物は、天然の遺伝子転写産物の翻訳を阻害するのに有効であり、本明細書に記載した効果(例えば、組織生理の制御)を誘導することができる。TDOA遺伝子mRNAの任意の部分に相補的でありハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、治療的使用に関して検討される。1997年6月17日に公開された、米国特許第5,639,595号、“Identification of Novel Drugs and Reagents”(ここで、インビボ活性を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法が、十分に記載されている)は、引用により本明細書の一部とする。TDOA遺伝子配列由来のランダムオリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、細胞に形質転換する。次いで、細胞を、オリゴヌクレオチドの望む活性から生じる表現型に関してアッセイする。望む表現型を有する細胞を同定した後、望む活性を有するオリゴヌクレオチドの配列を同定し得る。同定は、ベクターを回収するか、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により達成し得て、挿入核酸材料を含む領域の塩基配列を決定し得る。アンチセンス分子は、アンチセンス治療のために合成し得る。これらのアンチセンス分子は、DNA、DNAの安定した誘導体、例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート、RNA、RNAの安定した誘導体、例えば、2'-O-アルキルRNA、または他のオリゴヌクレオチド模倣体であり得る。生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果を記載している、1997年6月29日に公開された米国特許第5,652,355号、“Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates”および1997年6月29日に公開された米国特許第5,652,356号、“Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides”は、引用により本明細書の一部とする。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル封入またはアンチセンス配列を含むベクターからの発現により細胞内に導入し得る。

上記で言及したとおり、アンチセンス核酸分子はまた、ベクターを使用せずに直接投与される長い半減期を有するいくつかの安定した形態のRNAが、現在、当業者に既知であるので、RNAとして提供し得る。さらに、DNAコンストラクトは、リポソーム、受容体仲介トランスフェクションおよび当業者に既知の他の手段により、細胞に送達し得る。

配列番号1の遺伝子と共操作するためのアンチセンスDNAまたはRNAは、慣用的な手段を用いて、上記に記載したとおりの標準的な分子生物学および/または化学合成により製造し得る。所望により、アンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAは、インビボで分解されないようするか、または細胞膜を介した通過を促進するために、化学的に修飾し得て、および/または、mRNAを不活性化することができる基質、例えば、リボザイムをそれに結合し得て、本発明は、そのようなコンストラクトにまで拡大される。

アンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAは、TDOA遺伝子産物の過剰制御産生または過少制御産生が関与したヒトでの疾患または障害の処置において、使用し得る。

あるいは、リボザイム分子は、インビボでTDOA mRNAを切断し、破壊するように設計し得る。リボザイムは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するRNA分子である。ハンマーヘッドリボザイムは、ヌクレオチド配列が、標的RNAの少なくとも一部に相補的なハイブリダイズ領域および標的RNAを認識し切断するように適合する触媒領域を含む。ハイブリダイズする領域は、好ましくは、少なくとも9ヌクレオチドを含む。そのようなリボザイムの設計、構築および使用は、当業者に既知であり、Haselhoff and Gerlach, (Nature. 334:585-591, 1988)により十分に記載されている。その他には、三重らせん構造を形成するためにTDOA遺伝子の5'-領域にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドは、TDOA遺伝子の転写を妨害するか、または減らすために使用し得る。その他には、プラスミドベクター中にクローン化したRNA干渉(RNAi)オリゴヌクレオチドまたは短(18-25bp)RNAi TDOA配列を、二本鎖RNAをほ乳類細胞の中に導入し、TDOAメッセンジャーRNAを阻害するおよび/またはTDOAメッセンジャーRNAの分解を生じるために設計する。TDOA RNAi分子は、アデニン/アデニン(AA)または少なくとも(任意の塩基-A、U、CまたはＧ)A・・・で開始し得て、18または19または20または21または22または23、または24または25塩基対二本鎖RNA分子を含み得て、好ましい長さは21塩基対であり、2個のヌクレオチド3'オーバーハングまたはヘアピンが、45-50mer RNA分子を形成し、個々のTDOA配列に特異的である。そのような小分子阻害性RNA分子の設計、構築および使用は、当業者に既知であり、下記においてより十分に記載している: Elbashir et al., (Nature. 411(6836):494-498, 2001); Elbashir et al., (Genes & Dev. 15:188-200, 2001); Harborth, J. et al. (J. Cell Science 114:4557-4565, 2001); Masters et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8012-8017, 2001);および、Tuschl et al., (Genes & Dev. 13:3191-3197, 1999)。

経路マッピングは、TDOAタンパク質が相互作用する細胞内の各タンパク質を決定し、順に、これらのタンパク質の各々がまた相互作用するタンパク質を決定するために使用し得る。このようにして、細胞応答に刺激を与える疾患と関連がある特定の重要なシグナル伝達経路を同定することが可能であり、それにより、治療介入のための新規潜在的標的の同定を可能にする。実施例、特に、実施例5および7で説明したとおり、本願の発明者らは、TDOAがα-パキシリンと相互作用することを同定した。

本発明のさらなる局面にしたがって、OAに関与するさらなる遺伝子標的を同定するための探索におけるTDOA遺伝子またはその断片の使用を提供する。

本発明のさらなる局面にしたがって、処置を必要とするヒトを、TDOAタンパク質に作用する小分子薬剤またはTDOA mRNAに作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置する方法を提供し、該方法は、
i) ヒトにおけるTDOA遺伝子の多型の検出(該診断は、好ましくは、TDOA遺伝子の30983、38160、12523...12542および32945(配列番号1における位置により定義したとおり)からなる集団から選択される1個またはそれ以上の位置での配列またはそこでのD' 0.9を超える連鎖不均衡の多型を決定することを含む);
ii) TDOA遺伝子の多型を参考にしてヒトの状態を決定し;そして、
iii) 有効量の薬剤を投与すること
を含む。

他の態様では、この局面は、検出または表2で同定した1個またはそれ以上の多型に適用される。

本発明のさらなる局面にしたがって、処置を必要とするヒトを、TDOAタンパク質に作用する小分子薬剤またはTDOA mRNAに作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置する方法を提供し、該方法は、
i) ヒトから取得した組織サンプル中のTDOA mRNAのレベルを測定し、そして
ii) TDOA mRNAの正常なレベルを参考にしてヒトの状態を決定し;そして、
iii) 有効量の薬剤を投与すること
を含む。

本発明のさらなる局面にしたがって、処置を必要とするヒトを、TDOAタンパク質に作用する小分子薬剤またはTDOA mRNAに作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置する方法を提供し、該方法は、
i) ヒトから取得した組織サンプル中のTDOAタンパク質のレベルを測定し、そして
ii) TDOAタンパク質の正常なレベルを参考にしてヒトの状態を決定し;そして、
iii) 有効量の薬剤を投与すること
を含む。

TDOAとα-パキシリンまたはTDOAとそれ自身(すなわち、多量体を形成する)の間の相互作用を破壊するか、または阻害し得るものは、TDOAタンパク質に作用する化合物の集団に含まれる。

本発明の他の局面にしたがって、OA障害を患っている患者の処置の方法を提供し、該方法は、該患者にTDOAの転写または発現を減少させることができる化合物を投与することを含む。

本発明の他の局面にしたがって、OA障害を患っている患者の処置の方法を提供し、該方法は、該患者にTDOAのα-パキシリンへのまたはそれ自身への結合を阻害することができる化合物を投与することを含む。

本発明の他の局面にしたがって、OA障害を患っている患者の処置の方法を提供し、該方法は、該患者にTDOAのmRNAを標的とするアンチセンス核酸分子を投与することを含む。

本発明の他の局面にしたがって、アンチセンス核酸分子またはTDOAに向けられた抗体の、OA障害を処置するための医薬の製造における使用を提供する。

本発明の各局面は、一次的OAおよび二次的OAを含むOAに適用できるだけではなく、他の関節症、例えば、椎間板変性および顎関節疾患;代謝性関節症、例えば、CPPDおよびヒドロキシアパタイトを含む慢性結晶沈着疾患ならびに炎症性疾患、例えば、リウマチ性関節炎に貢献できるように適用できる。

他に定義がなければ、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション化学および生化学で)。標準的な技術を、分子的、遺伝学的および生化学的方法のために使用する。一般には、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.; as well as Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.)、およびGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)を参照のこと。これらの文献は、引用により本明細書の一部とする。

本発明をさらに、下記の非限定的な実施例および図により記載する。

図1は、TDOAの発現が、ほ乳類2ハイブリッドにおいて、TDOAとα-パキシリンの結合のシグナルを増やしたことを証明する棒グラフであり;そして

図2は、正常な剖検サンプル(PM)およびOA患者(OA)からの軟骨細胞におけるTDOA mRNAの発現レベルを示した棒グラフである。サンプルは、内側および側面の大腿顆ならびに脛骨プラトー由来のRNAを含む。TDOA発現は、18S RNAで標準化した。

TDOAはまた、OATDとして本明細書に記載している。

実施例1
OAと関連する遺伝子としてのTDOAの同定
我々は、SNPジェノタイピングに基づき、連鎖に基づく方法を用いて、興味のある11q領域調べた。

1.方法
WO 00/20632に記載された20cM 11q領域を、マイクロサテライトマーカーD11S4046とD11S1320により区切る。連鎖不均衡解析は、コントロール(例えば、患者の無症状配偶者)と比較した場合に、症例(すなわち、関節置換術を受けたOAを有すると診断された患者)におけるマーカーD11S937の258bpアレルの過度の伝達を同定した。

この領域を精密にマッピングするために、我々は、SNP発見およびジェノタイピングを行い、マーカー間距離を減少させた。ジェノタイピングは、膝または股関節のOAを患っており、関節置換術を受けた対象からの600個のDNAで行った。無症状配偶者の症例からの500個のコントロールDNAのジェノタイピングもまた行われた。

A. SNP発見
マーカーD11S4046とD11S1320の間に生じるSNPを、下記の方法により同定した。

(i) BAC(バクテリア人工染色体)ショットガンライブラリースクリーニング
deJong RCPI-11 BACライブラリー(Osoegawa et al. Genome Research. 11(3):483-496, 2001)に対するハイブリダイゼーションを、興味のある領域で、STS(配列タグ化サイト)由来の³²P末端標識オリゴのプールを用いて行った。次いで、BACを、PCRにより個々にチェックし、137個の個々のBACを単離した。

BAC DNAは、抽出キット(Nucleon/Tepnel, Manchester UK)を用いて、一晩培養した500mlの培養液から調製した。ライブラリーを構築するために、2つの方法を使用した。最初の方法では、BAC DNAを、Sau3aで部分的に消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した。0.5-4kbサイズ範囲の断片を、ゲルから切り出し、精製した。断片を、pZEROプラスミドベクター(Invitrogen)中にショットガンクローン化し、シングルコロニーを取り上げ、挿入を、慣用的なT7およびSP6プライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物を、ダイターミネータ化学を用いて塩基配列決定した。第2の方法では、BAC DNAを、Hydroshear (GeneMachines, San Carlos, CA)を用いて1Kbのサイズに切断し、pZEROプラスミドベクター中にサブクローン化した。シングルコロニーを取り上げ、挿入を、慣用的なM13フォアードおよびリバープライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物を、M13 F&Rプライマーを用いて、MegaBace (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK)で塩基配列決定した。

あらゆるライブラリーのPCR産物から産生した配列を、SeqMan package (DNAStar, Madison WI)を用いて、コンティグ中に集めた。サイズが500bpを超える配列を解析し、ベクターおよび品質について調整し、反復のためにマスクした/E.coli DNAおよび新規BAC配列を同定した。プライマーを、多型スクリーニングプロトコールでの使用のために、400-600bp PCR産物を産生するように、この配列に対して設計した。全837個のSTSを、スクリーニングのために作製した。すべてのプライマー対を、3つの別々の増幅条件で試験し、ワーキングプライマーを、1プール(17個体)での多型スクリーニングを通して使用し、3個体を、フォアードおよびリバース方向で塩基配列を決定した。配列の解析は、Phred/Phrap/Consedを用いて行った。

ショットガンライブラリーの解析は、全132個のSNPを産生した。平均的な1個のSNPは、解析した1.6kb配列ごとに発見された。

(ii) ゲノムクローンの解析
我々は、興味のある領域にマップする330個のゲノムクローン(Research Genetics)を同定し、多型スクリーニングの配列を提供するために、直接、配列を使用することが可能であった。ゲノムクローン配列を、各クローンのために少なくとも6個の塩基対を設計するために使用し、次のスクリーニングは、WAVE (Transgenomic Inc. Crewe, UK)および配列解析の組合せにより行った。141個のSNPを、この方法により発見した

(iii) SNPコンソーシアムSNP
ヒト単一ヌクレオチド多型のThe SNP Consortium's databaseの4回目の公開は、102,719個のSNPを含んでおり、そのすべては、ゲノム配列作業ドラフトに対する放射線ハイブリッドマッピングおよび/または“インシリコ”マッピングにより、ヒトゲノムに固定された。

全168個の独自に表されたSNPは、興味のある20Mbの領域から取り出された。

B. SNPジェノタイピング
工程Aで発見したSNPを、膝または股関節部のOAを患っていて、関節置換術を受けた対象からの600個のDNAおよび無症状配偶者の症例からの500個のコントロールDNAで遺伝子型を決定した。ジェノタイピングは、アレル特異的増幅(ARMS)および単一ヌクレオチドプライマー伸張法を用いて行った。

C. マイクロサテライトジェノタイピング
10個のマイクロサテライトマーカー、D11S916、D11S1321、D11S4081、D11S4128、D11S4179、D11S911、D11S4079、D11S906、D11S937、D11S4166の遺伝子型を、症例コントロールコホートで決定した。

実施例2.連鎖解析
A. マイクロサテライト
マイクロサテライトの解析は、プログラムCLUMP(author D. Curtis, Human Genome Mapping Project)で行った。このプログラムは、単一p値を産生する症例およびコントロールに沿ってアレルの分布を比較し、したがって、各アレル(各マーカーではなく)に関して、複数の試験の補正の必要性がない。プログラムはまた、データに関して正確なp値を産生するモンテカルロシュミレーションで行う。
関連は、D11S937(p=0.04)に関して確認され、さらなる関連が、D11S4081(p 0.02)で見られた(D11S937からおよそ0.7cMでマップされる)。

B. SNPs
アレル頻度を、症例とコントロール間で、各SNPのために比較し、ODD比を、95%信頼区間で計算した(Jurg Ott, Analysis of Human Genetic Linkage 3^rd Ed, John Hopkins Univ. Press, 1999)。>5%のアレル頻度を有するSNPの解析(ハーディ・ワインベルグ平衡)は、疾患と有意な関連を示した(p.<0.05)3個(配列番号3-5 & 表3)を表した。これらは、複数の試験のために訂正されていなかった。3個すべてのSNPは、同じ3cM放射線ハイブリッド区間(区間Dと呼ばれる)内に存在し、また、11q13.5に位置するマイクロサテライトマーカーD11S937の近くにマップされることを発見した。

実施例3.遺伝子発見
35個のバクテリア人工染色体(BACs)を、区間Dをマッピングするために見出した。下記の解析は、Seqmanを用いて行った。BACを、2.8Mbを覆う連続138個にまとめた。TDOAと呼ばれる遺伝子が、この区間内に見出された。

実施例4.SNP発見
この領域のアンサンブル配列の公開後、TDOAに関するcDNAを、エクソン/イントロン境界、UTRおよび潜在的プロモーター領域を同定するためにゲノム配列にマッピングした。
PCRプライマーは、エクソン、UTR、潜在的プロモーター領域および隣接イントロン配列に渡って設計した。塩基配列決定は、29人の非関連白人個体で行い、配列をPolyphred/Phrap/Consedで並べ、多型を同定した。

発見した多型を、表2で示している。
表2. TDOA遺伝子および隣接ゲノム配列の特徴
位置は、ヌクレオチド番号によるものであり、配列番号1に記載している。

表3. OAとのポジティブな関連を示す多型(p値<0.05を有するODD比)

配列番号4、5および6は、隣接した配列との関連する多型を示しており、他の変異型TDOA配列での多型の位置を決定するのを促進する。

表4. TDOA遺伝子のアミノ酸コード領域内で生じるSNP
位置は、アミノ酸残基数によるものであり、配列番号2のことを言う。SNP IDは、表2に記載したもののことを言う。

実施例5.α-パキシリンとの関連
TDOAは、OAとの機能的関連を知られていなかったし、学問的文献内で生物学的な機能を報告されていなかった。TDOAは、GeneSeqP特許データベースで見出されたTRICH-6(受託番号:ABG61536)と同一である。インシリコ相同性アライメント解析に基づいて、TDOAは、T1ドメインとの相同性のために、カリウムイオンチャネルと弱い類似性を有するが、TDOAは、明白なイオントランスポートドメインを有さないことが分かった。

TDOAの考えられる機能を理解するために、我々は、TDOAと結合するタンパク質を探すため、酵母2ハイブリッドを用いたパスウェイ解析実験を行った。

Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 (Clontech)を、TDOAのタンパク質相互作用パートナーをスクリーニングするために使用した。Matchmaker 3 Systemでは、TDOAを、転写因子Gal4のDNA結合ドメインと融合させた“ベイト”として発現させ、TDOAのための潜在的な相互作用パートナー(“プレイ”)を、Gal4の転写活性化ドメインとの融合として、酵母内で共発現させた。

TDOA“ベイト”と結合パートナー“プレイ”間の相互作用は、Gal4の転写活性を再構成し、Gla4プロモーターの制御下のレポーター遺伝子の発現を生じる。この遺伝子の発現は、“プレイ”を発現する酵母の検出および選択のために使用し得る。“プレイ”を含有するコンストラクトは、酵母から単離し得て、“プレイ”の配列を決定し、そして同定し得る。

TDOA“ベイト”は、TDOA cDNA(配列番号3)のベクターpGBKT7への挿入により構築した。cDNAライブラリー(“プレイ”)は、オリゴdTプライミングによりヒト脊髄から製造し、pACT2-AD (Clontech)の5'EcoRI-XhoIへ、一方向にクローン化した。ライブラリーの力価は、6.8 x 10⁴コロニー/mlであった。最初の組み換えは、全4.1 x 10⁶ クローンであると見積もられた。挿入サイズは、0.9-3.7 kbであり、平均サイズ(10クローン)は、1.82 kbであった。1.2 x 10⁶ クローンを、高ストリンジェンシー条件下でスクリーニングし、それにより形質転換体は、SD(合成脱落培地)-Trp、-Leu、-His、-Ade上で増殖することが必要とされ、lacZに対してポジティブである、すなわち、X-α-gal基質の存在で青色になる。

スクリーニングにより同定した2個のcDNAヒットの塩基配列を決定し、ヒトα-パキシリンの541塩基対断片(クローンB2;配列番号10)および664塩基対断片(クローンB1;配列番号11)を含むことを示した。2つのクローンはオーバーラップし、α-パキシリンの中央領域と100%の同一性を示した。パキシリンの他の既知のスプライスバリエント(β-パキシリンおよびγ-パキシリン)の両方が、この領域内の挿入を含むので、これらのクローンが、α-パキシリンであることは明らかであった。

酵母2ハイブリッドにより同定したTDOAとα-パキシリン間の相互作用を、免疫沈降/ウエスタンブロット解析で確認した。

TDOAの機能を理解するために、我々は、2Dディファレンスゲル電気泳動を用いて、他の細胞内タンパク質に対するTDOA過剰発現の影響を調べた。

HEK 293T細胞を、レトロウイルスを用いて下記のとおり安定的にトランスフェクトした:TDOA(配列番号3)またはC-末端FLAGタグ(配列番号7)を含有するTDOAをコードするcDNAを、標準的なGateway(登録商標)クローニング方法論を用いて、Gateway(登録商標)(Invitrogen)適合ベクターpFUNC-GW中にクローン化した。これにより、2つのレトロウイルス発現ベクター; pFUNC1-GW非タグ化TDOAとpFUNC1-GW 5'FLAG TDOAを産生した。目的ベクターは、Not I (New England Biolabs)を用いて線状化し、そして非タグ化し、5'flagタグ化TDOA(配列番号7)は、LR Clonase kit (Invitrogen)を用いてLR組み換え反応を行うことによりクローン化した。16℃で16時間後、組み換え反応をproteinase K (Invitrogen)を用いて、37℃で10分間処理し、次いで、1mlをDH5a 最大効率(Max Efficiency)コンピテントセル(Invitrogen)を用いて形質転換し、L+アンピシリンアガープレートにプレーティングした。

レトロウイルス産生
非タグ化またはC-末端FLAGタグ化TDOAを発現できる複製欠損レトロウイルス粒子を、HEK 293T細胞の一過的トランスフェクションにより、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質(VSV-G)被覆タンパク質を偽感染させた。感染の24時間前、HEK 293T細胞(3 x 10⁶)を、10-cm組織培養ディッシュにプレーティングした。リン酸カルシウム仲介ProFection(登録商標)Mammalian Transfection System (Promega)を用いて、細胞を3つのベクターに共トランスフェクトした: gag-pol発現ベクターpVPack-GP (Stratagene)、VSV-Gエンベロープ発現ベクターpVPack-VSV-G (Stratagene)、および興味のあるcDNAを含有する適当なレトロウイルス発現ベクター(pFUNC1-GW非タグ化TDOAまたはpFUNC1-GW 5'FLAG TDOA)。16マイクログラムの適当なレトロウイルス発現ベクター、16μgのpVPack-GPおよび8μgのpVPack-VSV-Gを、500μlの量で62.5μlの2 M塩化カルシウムと合わせた。次いで、この溶液に、500 μlの2' HEPES緩衝生理食塩水を、機械的ピペッターを介した一定の通気と共に、滴下により加えた。室温で15分間のインキュベーション後、DNA沈殿物は、細胞上に一様に分布した。次いで、細胞を、37℃で一晩、インキュベートした。次の日、培地を、トランスフェクトされたベクター(18)からの転写を高めるために、10 mM 酪酸ナトリウムを補充した新鮮な増殖培地と取り替えた。37℃で6時間のインキュベーション後、酪酸ナトリウムなしの培地に再び取り替え、レトロウイルス上清の産生のために、細胞を、37℃で一晩、インキュベートした。上清を、トランスフェクションの48時間後に収穫し、0.45-μmフィルターを介してろ過し、感染のためにすぐに使用するか、またはドライアイスで凍結させ、-80℃で貯蔵し、後の感染に使用した。

HEK 293形質導入
感染の24時間前に、HEK 293T細胞(1.5 x 10⁵)を、60-mm組織培養ディッシュにプレーティングした。細胞を、5 μg/ml ポリブレンを補充したレトロウイルス上清で感染させ、次いで、37℃で一晩、インキュベートした。翌日、培地およびレトロウイルス上清を除去し、そして細胞を新鮮な増殖培地に移した。感染の48時間後、細胞を、60-mm組織培養ディッシュから75-cm2フラスコに分け、そして、細胞が接着した後、培地を0.5 μg/mlピューロマイシンで補充し、プロウイルスで形質導入された細胞を選択した。一般に、ピューロマイシン選択は、クローンコロニーが確立されるまで2週間続け、その後、細胞を増殖させ、他の細胞株についても維持した。

レトロウイルス上清の感染効率を解析するために、感染は、6-ウェルプレートでHEK 293Tを用い、ピューロマイシン選択を行わないことを除いて上記したとおり行った。

非タグ化TDOA(HEK-非タグ-TDOA)またはC-末端FLAGタグ化TDOA(HEK-C-FLAG-TDOA)を発現する2個の細胞株を作製した。

次いで、細胞ライセートを、非タグ化TDOA(HEK-非タグ-TDOA)またはFLAGタグ化TDOA(HEK-C-FLAG_TDOA)を発現するHEK 293T細胞から下記のとおり調製した:細胞を、溶解バッファー(トリス緩衝食塩水(TBS)/1% IGEPAL CA-630 + プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤: 150 mM NaCl、50 mM Tris、pH 8、1% IGEPAL CA-630、10 mM NaF、2 mM Na₃VO₄、10 mM β- グリセロホスフェート、50 mlバッファーにつき1x EDTA-free Complete(商標)プロテアーゼ阻害剤錠剤(Roche Applied-Science)、1 mM DTT)中、5x10⁷細胞/mlで再懸濁し、サンプルをボルテックスにかけた。細胞を、時々混合しながら、氷上で30分間インキュベートすることにより溶解させた。ライセートを、100000gで30分間、4℃で遠心分離した。上清を除去し、免疫沈降のために使用した。

抗FLAG免疫沈降(IP)を、抗FLAG M2 モノクローナル抗体(Sigma)を結合したUltralink-ヒドラジドビーズ(Pierce)を用いて、HEK-非タグ-TDOAおよびHEK-C-FLAG-TDOA細胞ライセートから行った。抗体結合は、基本的に、製造者により記載されたとおりに行った。

およそ25μlの抗FLAG結合Ultralink-ヒドラジドビーズを、およそ10⁷細胞に相当するHEK 293細胞ライセートから、下記のとおりFLAGタグ化TDOAを免疫沈降するために使用した:サンプル/ビーズスラリーを確保するために十分に混合し、500μlをHandeeスピンカップ(Pierce)に移し、微小遠心の14000 rpmで2分間、遠心した。フロースルーを、無菌管の中に静置した。残りのサンプル/ビーズスラリーを十分に混合し、同じスピンカップに移し、すべてのビーズが、同じスピンカップに集められるまで、2分間、遠心した。

ビーズを、回転式ミキサー上、4℃で、500μlのTBS/ 1% IGEPAL中で再懸濁することにより、5分間洗浄した。サンプルを、無菌のHandee微小遠心管(Pierce)から各洗浄液を除去するために、2分間遠心した。これを、さらに3回、繰り返した。最後に、vibromat上、4℃で、50μlのTBS/ 1% IGEPALにより、5分間洗浄した。サンプルを、最後の洗浄液を除去するために、2分間遠心した。タンパク質を、vibromat上、4℃で30分間、TBS/ 1% IGEPALで希釈した50μlの0.4 mg/ml FLAGペプチドを添加することにより、ビーズから溶出した。サンプルを、各溶出物を収集するために、2分間遠心した。

細胞ライセート、IPフロースルー溶出液サンプルを、製造者の指示にしたがって、Novexトリス-グリシン8-16%アクリルアミドゲル(Invitrogen)で分離した。次いで、タンパク質を、製造者の指示にしたがって、Novexブロッティングユニット(Invitrogen)を用いてPVDF膜にトランスファーした。ゲルを、200 mAで1.5 hr間、ブロットした。次いで、ブロットを、4℃で一晩、ブロッキングバッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS; 0.01M リン酸バッファー、0.0027M 塩化カリウム、pH7.4)、0.1% (v/v) Tween 20および5% (w/v)無脂肪乾燥粉ミルク)でブロックした。

ブロットを、洗浄バッファー(PBS、0.1% (v/v) Tween 20および0.5% (w/v) 非脂肪乾燥粉ミルク)で、2 x 5分間洗浄し、次いで、供給者が推薦する洗浄バッファーで希釈した抗パキシリン抗体(抗パキシリンマウスモノクローナルIgG1, Upstate, code: 05-417)を用いて、室温で2.5時間、インキュベートした。

次いで、ブロットを、洗浄バッファーで、3 x 5分間洗浄し、供給者が推薦する洗浄バッファーで希釈した二次抗体検出抗体(ヤギ抗マウスIgG (H+L)、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート- Invitrogen)で、2.5時間インキュベートした。次いで、ブロットを、洗浄バッファーで、2 x 10分間洗浄し、その後、PBSで、2 x 10分間洗浄した。抗体シグナルは、製造者の指示にしたがって、SuperSignal West Picoにより高められる化学発光基質を用いて検出した。次いで、ブロットを乾燥させ、2つのアセテート間に置き、そしてHyperfilmに曝した。

α-パキシリンに相当するタンパク質バンドを、TDOAを用いた免疫沈降により検出した。これは、Y2Hにより検出されたTDOAとα-パキシリンの相互作用を確認した。

実施例6
細胞内タンパク質に関するTDOA過剰発現の影響を解析するために、非トランスフェクトHEK EBNA細胞およびレトロウイルスを用いて(上記したとおり)、安定的に非タグ化TDOAをトランスフェクトしたHEK EBNAを225cm² フラスコに播種し、5日間、単層として増殖させ、穏やかなトリプシン処理を用いて収集した。Cy5-標識非トランスフェクトまたはCy5-標識TDOA-発現HEK EBNA細胞の50μg負荷量を、50μgのCy3-標識プール非トランスフェクトおよびTDOA-発現HEK EBNAライセート(内部標準)と合わせた。pH 4-7およびpH6-11で1次元目の分離を行い、その後、12.5% アクリルアミドにより2次元目の分離を行った。ゲルを、Cy3およびCy5のための波長で撮像した(2イメージ/ゲル)。イメージ解析を、Progenesis Discoveryを用いて行った。スポットフィルターを、コントロールとTDOA-発現サンプル間で2倍以上の変化を示すスポットを選択するのに適用した(t-検定の閾値<0.05)。1mg負荷量の銀およびコロイドクマシーゲルを、スポット切り取りおよびMS解析(MALDI)のために行った。

TDOA過剰発現後に有意に変化した全10個のタンパク質スポットを同定し、このうち5個はポジティブに同定された(表5)。

表5 MALDI-MS解析結果。ポジティブ倍率変化は、TDOA-発現細胞での増加した発現を有するタンパク質を示し、ネガティブ倍率変化は、TDOA-発現細胞での減少した発現を有するタンパク質を示す。

TDOA相互作用体の文献解析
表6:タンパク質は、2Dゲルから変化する:

表7: 院内OA患者と死後死体(PM)関節軟骨Affymetrix実験からのデータは、OAドナーからの関節軟骨における、PP1BおよびEEF2に関する下記の遺伝子発現変化を証明した:

要約すると、3個のタンパク質(PP1CB、hnRPKおよびEEF2)の発現は、TDOAの過剰発現により変化した。PP1CBおよびEEF2は、同様に、ゲノムレベルで、OA軟骨で変化した。これらのタンパク質の機能の再検討は、OAでのそれらの考えられる役割を示した。

実施例7
TDOAとα-パキシリンの相互作用を、さらに、CheckMate(商標)系(Promega)を用いたほ乳類2ハイブリッド実験で確認した。プロトコールは、基本的に、製造者により記載されたとおりであった。簡潔には、TDOAおよびα-パキシリン(配列番号12で開示したcDNA配列)を、DNA結合ドメインコンストラクト(pBind)または転写活性化ドメイン(pAct)コンストラクトにクローン化した。増殖培地(10%ウシ胎児血清(FCS) (Hyclone, Cramlington, UK)および1% ペニシリン/ストレプトマイシン (Invitrogen)を補充した、DMEMプラスglutamax (Invitrogen, Paisley, UK))100μl中、5x10⁴ HEK293T細胞を、96ウェルプレート(poly-D-リジン処理された黒/透明ウェル、cat# 356640 Becton Dickinson, Oxford, UK)の各ウェルに添加した。これらの細胞を、一晩、85-95%コンフルエンスまで増殖させ、次の日にトランスフェクトした。

トランスフェクトする細胞の培地を、さらに処理する前に、無抗生物質培地(10% FCSを含むDMEM+glutamax)に換えた。1μlのlipofectamine 2000 (Invitrogen)を、25μlのOptimem組織培養培地(Invitrogen)に加え、5分間インキュベートした。トランスフェクトされるおよそ100ng(モル比で)の各プラスミドを、別々の25μlのOptimemのアリコートに添加した。これら2つのOptimemのアリコートを混合し、室温で20分間インキュベートし、その後、細胞に加え、一晩インキュベートした。

トランスフェクション後、培地を細胞から除去し、25μlの受動的溶解バッファー(Promega, Southampton, UK)を加えた。細胞を、Titramax 100シェイカー(Heidolph Instruments, Schwabach, Germany)、900rpmで40分間溶解し、次いで、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Dual luciferase kit (cat#E1960, Promega)およびTropix Luminometer (Applied Biosystems, Warrington, UK)を用いてアッセイした。ウミシイタケルシフェラーゼは、構成的プロモーターから発現し、データを標準化するのに使用した。ホタルルシフェラーゼ発現は、GAL4プロモーターから駆動し、タンパク質:タンパク質相互作用の結果としての転写因子活性の再構築に依存している。シグナルは、ホタルルシフェラーゼシグナルとウミシイタケルシフェラーゼシグナルの比率を計算することにより、相対光単位(RLU)として計算した。

TDOAおよびα-パキシリンは、ほ乳類2ハイブリッドで相互作用し、再び、酵母2ハイブリッドにより見出された2つのタンパク質間の直接の物理的結合を確認した。相互作用は、ほ乳類2ハイブリッドの両“方向”で、すなわち、TDOAがDNA結合ドメインと融合しているか、または活性化ドメインと結合しているかを問わず(α-パキシリンに関して、逆もまたしかりである)、生じた。しかしながら、我々は、α-パキシリンが、GAL4のDNA結合ドメインとの融合(pBindコンストラクト中)としてほ乳類2ハイブリッド系で発現するとき、それが転写アクチベーターとして作用することを観察した。これは、α-パキシリン/VP16融合が、コントロールと比較して任意のさらなるレポーター遺伝子活性を示さなかったので、遺伝子転写におけるα-パキシリン過剰発現の一般的な効果によるものではなかった。

パキシリンは、通常、接着班を介したインテグリンシグナル伝達と関連している(例えば、Panetti. Frontiers in Bioscience 7:143-150, 2002を参照のこと)。しかしながら、アフリカツメガエルA6細胞では、細胞をある細胞外マトリックス上で増殖させると、パキシリンが核へ移行することが明らかである(Ogawa et al., Biochemical & Biophysical Research Communications. 304: 676-683, 2003)。さらに、パキシリンは、アンドロゲン受容体を介した遺伝子転写を促進するのに作用し得て(Kasai. et al., Cancer Research. 63: 4927-4935, 2003)、したがって、α-パキシリンが、ほ乳類2ハイブリッドにおいて転写アクチベーターとして作用するという我々の観察は、おそらく、作為的結果ではなかった。

ほ乳類2ハイブリッドを用いて、我々はまた、TDOAが物理的にそれ自身と相互作用することを証明することができ、したがって、細胞内で多量体を形成し得る。このことは、機能的T1ドメインを有するTDOAと一致するであろう。

実施例8
我々は、次に、野生型TDOAの過剰発現が、ほ乳類2ハイブリッド系に与える影響に関して検討した。TDOAを、ほ乳類発現ベクターpCEP4 (Invitrogen)にクローン化し、これを、TDOAとα-パキシリンで行われるほ乳類2ハイブリッド実験に導入した。余剰TDOAのこの系への添加は、ほ乳類2ハイブリッドからのシグナルの増加を生じた（図1を参照のこと）。ほ乳類2ハイブリッドシグナルの増加を生じた原因は、TDOA自身によるものではなく、したがって、TDOAは、おそらくα-パキシリンに多量体として結合していることを示した。

TDOA cDNA(配列番号3)を、pAct活性化ドメインプラスミドにクローン化し、α-パキシリンcDNA(配列番号12)を、pBind DNA結合ドメインプラスミドにクローン化した。両ベクターを、示された量のpCEP4 TDOA(CMVプロモーターの制御下で野生型TDOAを発現するプラスミド)と一緒に、HEK 293T細胞にトランスフェクトした。

第11染色体のこの領域に関連するすべてのSNPは、TDOAの非コード領域内(イントロンまたはプロモーター/エンハンサー領域)に見出され、我々は、これらのSNPがTDOAの発現レベルまたはTDOA mRNAの安定性に影響し得ると推論した。

実施例9
OA患者および正常な剖検サンプルからの軟骨におけるTDOAのmRNAレベル
RNA単離
変形性関節症軟骨は、同意を得た全膝関節置換サンプルまたは同意を得た死後取り出した膝関節軟骨から取得した。軟骨細胞を急速冷凍し、Glen Creston Spexミルを用いて、液体窒素下で破砕した。RNAを、製造者のプロトコールにしたがって、標準的TRIzol抽出法(Invitrogen)を用いて破砕軟骨細胞から抽出した。RNAを、Qiagen RNeasy minicolumn (Qiagen)を用いて精製し、DNaseで処理した。RNAは、RNA Nano6000チップと共にAgilent Bioanalyser 2100を用いて定量した。

定量的PCR
TaqManリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを、製造者(Applied Biosystems)のプロトコールにしたがって、ABI Prism 7700 Sequence Detection Systemで行った。使用したTaqMan RT-PCRアッセイプライマーの配列は、配列番号13および14として同定しており、使用したプローブは、配列番号15で開示した配列を有した。

25ngのRNAを、関連のあるフォアード/リバースプライマー、蛍光プローブおよびTaqman Quantitect Probe Master-Mix and RT enzyme mix (Qiagen)と共に混合した。サンプルを、最初の逆転写反応のために、50℃で30分間、次いで、95℃で15分間インキュベートし、その後、95℃で15秒、60℃で1分間を40サイクル、インキュベートした。相対的な標的RNAの定量は、SDS v1.9ソフトウェアを用いて、Taqmanにより行った。

結果
TDOAの発現は、変形性関節軟骨でアップレギュレートされる
9症例の変形性関節軟骨サンプル(人工膝関節置換術を受けた患者から取得した)および死後に取得した標準軟骨におけるTDOA mRNAの発現レベルを確立するために行った定量的RT-PCRは、変形性関節軟骨での高められたTDOAの発現を示した(図2)。したがって、TDOA発現レベルは、OAの表現型に関与することに重要であり得る。本願発明者らは、次に、TDOAの過剰発現が、初代ヒト軟骨細胞におけるα-パキシリンの分布に与える影響に関して検討した。

実施例10
TDOAアデノウイルス(Adv-TDOA)および緑色蛍光タンパク質を発現するコントロールウイルス(Adv-GFP)を、遺伝子送達のために使用した。完全長TDOAおよびGFP(コントロール)をコードする複製欠損アデノウイルス(Ad5 c20)を、Galapagos Genomics (2301 CA Leiden, The Netherlands)により産生した。単離後、2代継代の初代軟骨細胞を、200:1および500:1の感染の多重度で6時間、アデノウイルスで形質導入した。細胞を一晩で回収し、次いで、フィブロネクチン被覆チャンバースライドにプレーティングする前に、無血清DMEMで24時間培養した。

細胞を、軟骨細胞の接着を可能にするように、37℃で1時間30分インキュベートし、次いで、10%中性緩衝ホルマリンで、室温で15分間固定した。PBSで2回洗浄し、0.1% Triton/PBSで5分間伝達した。

スライドを、3% BSA/PBSで、一晩4℃でブロックした。抗パキシリン抗体 (BD Transduction Cat# 610052)を、3% BSA中1:10,000で添加し、1時間インキュベートした。二次抗体としてAlexa-488 抗マウス(Molecular probes A-11001)を、1:500で、暗所で40分間適用した。染色された細胞をVectaShield antifade (Cat # H-1000)に載せ、蛍光顕微鏡で、495nmで観察した。

細胞を、RNA単離のために、感染後24時間から72時間の間で収集した。
TDOA過剰発現は、α-パキシリンの、初代ヒト軟骨細胞の核での増加した染色を生じた。したがって、OA患者における増加したTDOAの発現は、軟骨細胞でのα-パキシリンの異常な分布を生じ得る。α-パキシリンが、転写のレギュレーターとして作用する潜在性を有するという我々の観察に基づき、これは、順に、下流の遺伝子の変化を生じ得る。

要約および結論
我々は、TDOAが、インテグリンシグナル伝達(それ自身が、OAに強く関連する過程である)に関与するタンパク質であるα-パキシリンに結合することを示した(Peters et al. (Osteoarthritis & Cartilage. 10:831-835 2002)を参照のこと)。

我々は、酵母2ハイブリッドを用いてTDOA:α-パキシリン相互作用を同定し、次いで、それを、IP/ウエスタンブロットおよびほ乳類2ハイブリッドにより確認した。TDOAのα-パキシリンへの結合は、多量体として存在し得る。我々はまた、α-パキシリンが、GAL4転写因子のDNA結合ドメインと融合したとき、転写のアクチベーターとして作用し得ることを証明した。TDOA mRNAは、正常な剖検材料と比較して、OA患者からの軟骨において高レベルで発現している。初代ヒト軟骨細胞で過剰発現したとき、TDOAは、α-パキシリンの細胞内での異常な分布を生じた(タンパク質の多くが、核内に存在する)。

このデータは、TDOAの機能の1つは、α-パキシリンを制御することであり、OA患者においては、この正常な制御が、増加したTDOAの発現のために破壊されているという見解を支持している。これが、α-パキシリンの核への増加を生じ、次いで、疾患状態に関与する遺伝子転写の変化を生じる。したがって、OA患者におけるTDOA:α-パキシリン相互作用の破壊は、OAの処置において有益であることが証明され得る。

TDOAの発現が、ほ乳類2ハイブリッドにおいて、TDOAとα-パキシリンの結合のシグナルを増やしたことを証明する棒グラフである。 正常な剖検サンプル(PM)およびOA患者(OA)からの軟骨細胞におけるTDOA mRNAの発現レベルを示した棒グラフである。サンプルは、内側および側面の大腿顆ならびに脛骨プラトー由来のRNAを含む。TDOA発現は、18S RNAで標準化した。

Claims (20)

1. TDOAにおける多型の診断のための方法であって、1個またはそれ以上の多型位置でのヒトの配列を決定し、そしてTDOA中の多型を参考にしてヒトの状態を決定することを含む、方法。
2. 多型が、30983、38160、12523...12542および32945(各々、配列番号1に従う)の位置での多型からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
3. ヒトでの変形性関節症(OA)を発症する素因および/または感受性を評価するための方法であって、
   i) 30983、38160、12523...12542および32945(各々、配列番号1に従う)の1個またはそれ以上の位置でのヒトの核酸配列またはそこでのD' 0.9を超える連鎖不均衡の多型を決定し;そして、
   ii) 存在する多型(複数もある)を参考にしてヒトの状態を決定すること
   を含む、方法。
4. 30983位でのアデニンの存在および/または38160位でのグアニンの存在およびまたは12523-12542位(各々、配列番号1の位置に従う)からの配列の欠失が、ヒトがOAを発症する素因および/または感受性を有することを示す、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
5. OAを診断するか、または予後診断するか、またはモニターするための診断キットであって、TDOAに選択的にハイブリダイズするか、または結合することが可能である、1個またはそれ以上の診断プローブおよび/または診断プライマーおよび/または抗体を含む、キット。
6. プライマーおよびプローブが、30983、38160、12523...12542および32945(各々、配列番号1に従う)からなる群から選択される位置での多型を検出することができる、請求項5に記載のキット。
7. 潜在的な治療的または予防的利点を有する化合物を同定するための方法であって、1個またはそれ以上の試験化合物を、TDOAポリペプチドを含むスクリーニングにかけて、そして試験化合物の、該ポリペプチドに結合するか、妨害するか、もしくは調節するか、または該ポリペプチドの活性を阻害する能力を決定することを含む、方法。
8. TDOAポリペプチドが、配列番号2で示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、またはそのホモログであるか、またはいずれかの断片である、請求項7に記載の方法。
9. 表2で同定した1個またはそれ以上の多型を含むTDOAポリペプチドを利用する、請求項7に記載の方法。
10. 該ポリペプチドの活性が、TDOA多量体を形成する能力およびα-パキシリンに結合する能力から選択される、請求項7に記載の方法。
11. 潜在的な治療的または予防的利点が、OAの処置に関する、請求項7に記載の方法。
12. 潜在的な疾患修飾抗OA化合物を同定するための方法であって、
    i) TDOAの発現レベルに対する試験化合物の効果を検出できるアッセイ系に試験化合物を接触させ;そして、
    ii) TDOAの発現レベルの変化を評価すること;
    (ここで、試験化合物が不在のときと比較して、試験化合物の存在下での発現レベルの変化が、該化合物がOAの処置における治療的潜在能力を有する化合物であることを示す)
    を含む、方法。
13. OAの処置において潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、直接的または間接的にTDOAの活性または量を調節する能力に関して該化合物をアッセイすることを含む、方法。
14. アッセイが、TDOAポリペプチドを発現できる細胞を含むか、またはTDOAポリペプチドを含んだ細胞膜調製物を含む、請求項13に記載の方法。
15. 細胞が、TDOAポリペプチドを発現するように改変されている、請求項13または14に記載の方法。
16. TDOAの活性または量を、
    (i) TDOAポリペプチドを発現する細胞、細胞株または組織を用いるか、または精製したTDOAポリペプチドを用いたTDOA活性の測定;および
    (ii) TDOAポリペプチドを発現する細胞、細胞株または組織抽出物でのTDOA転写または翻訳の測定
    から選択される方法により決定する、請求項13に記載の方法。
17. 潜在的な治療的または予防的利点を有する化合物を同定するための方法であって、TDOAのα-パキシリンへのまたはそれ自身への結合を妨害するか、または阻害する試験化合物の能力を測定することを含む、方法。
18. TDOAのα-パキシリンへの結合を妨害するか、もしくは阻害する、またはTDOAのそれ自身への結合を妨害するか、もしくは阻害する化合物の、OAの処置のための医薬の製造における使用。
19. 処置を必要とする対象に有効量のTDOAタンパク質に作用する小分子薬剤またはTDOA mRNAに対して作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、OAを患っている患者を処置する方法。
20. 小分子薬剤が、TDOAとα-パキシリンの相互作用もしくは結合を阻害するか、またはTDOAとそれ自身の相互作用もしくは結合を阻害することができる、請求項19に記載の方法。

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