JP2009505039A - アポリポタンパク質a−ivレベルを測定することにより腫瘍を診断する方法 - Google Patents
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Abstract
個体における腫瘍の診断方法であって、以下の工程:− 個体の体液サンプル又は組織サンプル中のアポリポタンパク質A−IV(アポA−IV)量を測定し;− サンプル中のアポA−IVの測定量を基準値と比較し(ここで、基準値は、腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量である);そして、− サンプル中のアポA−IV含量が基準値と比較して減少している場合に腫瘍を診断する、ことを含む方法。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、個体における腫瘍の診断方法に関するものである。
ヒトアポリポタンパク質A−IV(アポA−IV;スイスプロット番号P06727)は、小腸及び非常に少量ではあるが肝臓によって合成される46kDの血漿糖タンパク質である。ヒトにおけるアポA−IVの平均血漿濃度は約15mg/dl(10〜18mg/dlの範囲)である。ラットにおける研究により、アポA−IVが小腸によって腸間膜リンパ液へ放出され、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、高密度リポタンパク質(HDL)の構造タンパク質として、又はリポタンパク質に結合しないで血漿区画へ入ることが示された。大部分の糖タンパク質は比較的血漿半減期が長いが、ヒトアポA−IVは、最もターンオーバー速度が速いアポリポタンパク質に含まれる。ヒト血漿中のアポA−IV分布に関する報告は相反するものである。使用した技術によって、アポA−IVの分布は、アポA−IVはほとんど完全にHDLに結合しているというものから、ほとんど主要リポタンパク質画分に結合していないというものまで記載されている。
このアポリポタンパク質に関してさまざまな生理機能が提唱されている。非常に多くのin vitro研究は、胆汁酸又はホルモンへの最終変換のためにコレステロールを末梢細胞から除去し、肝臓又はステロイド産生臓器へ輸送する逆コレステロール輸送経路のいくつかの工程に関与することを示唆している。アポA−IVは、酵素のレシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)を活性化することによって小さなHDL粒子の形成を促進させる。in vitro研究では、リポタンパク質リパーゼの活性化、及びHDLからLDLへのコレステリルエステルのコレステリルエステル輸送タンパク質(CETP)介在輸送も調節する。これらのin vitroデータと一致して、トランスジェニックマウスにおけるアポA−IVの過剰発現は、大動脈病変の減少とアテローム性動脈硬化症に対する予防をもたらした。これらの結果は、3つの独立したヒト集団における症例対照研究によって近年確認された:冠動脈疾患患者の血漿アポA−IV濃度は対照群と比較して優位に低いことがわかった(KRONENBERG Fら、J Am Coll Cardiol 36:751−757、2000);腎不全患者では血漿アポA−IV濃度とアテローム性動脈硬化症との相関も観察された(KRONENBERG Fら、J Am Soc Nephrol 13:461−469、2002)。
US2002/068319A号は、アポA−IVと相同性が高いいくつかのヒト分泌タンパク質の同定について開示している。
US2005/0059013A1号には、サンプル中のアポA−I量を測定することによる卵巣癌の診断方法が記載されている。
US2005/0059013A1号には、サンプル中のアポA−I量を測定することによる卵巣癌の診断方法が記載されている。
JP2004−333274A号は、癌に罹患する個体の血清サンプル中のアポリポタンパク質A2の測定方法に関するものである。
WO97/10503号は、アポリポタンパク質Dの量を測定することによる前立腺癌の診断方法を開示する。
WO97/10503号は、アポリポタンパク質Dの量を測定することによる前立腺癌の診断方法を開示する。
EP 1 560 024 Al号は、個体の血清又は血漿中のアポA−IV量を測定することによる消化管疾患の診断方法に関するものである。
DE 103 43 815Al号には、アポリポタンパク質D1の腫瘍マーカーとしての使用が開示されている。
DE 103 43 815Al号には、アポリポタンパク質D1の腫瘍マーカーとしての使用が開示されている。
いくつかの研究は、アポA−IV代謝における腎臓の役割について示唆している。慢性腎疾患患者は、顕著に上昇したアポA−IV濃度を示す(KRONENBERG Fら、Kidney Int(Suppl):S113−S116、2003)。アポA−IVは、腎不全の初期において既に増加し始めるため、アポA−IVを腎機能障害の初期マーカーとして同定されている(KRONENBERG Fら、J Am Soc Nephrol 13:461−469、2002)。肝臓は主要な分解部位であることがわかっているが、腎臓はアポA−IVの異化に大いに寄与している。
腎疾患に罹患する個体のアポA−IVレベルはすでに集中的に研究されているが、このレベルが個体の腫瘍、特に固形腫瘍のような他の疾患の存在によってどのように影響されるかに関して利用可能なデータはない。個体における腫瘍の検出を、特に発症の初期段階において、迅速で正確な様式で可能にすることができる腫瘍マーカーを有することが医療診断では非常に重要であるため、本発明の目的は、個体において腫瘍を診断するため、並びに腫瘍治療効率(例えば固形腫瘍切除術後)のモニタリング、特に腫瘍の再発をモニタリングするための方法及び手段を提供することである。
KRONENBERG Fら、J AmColl Cardiol 36:751−757、2000
KRONENBERG Fら、J Am Soc Nephrol 13:461−469、2002
KRONENBERG Fら、Kidney Int(Suppl):S113−S116、2003
DIEPLINGER Hら、Eur J Clin Invest 22:166−174、1992
KRONENBERG Fら、J AmSoc Nephrol 6:110−120、1995
KRONENBERG Fら、J Lipid Res 35:1318−1328、1994
STEINMETZ Aら、J Chromatogr 487:154−160、1989
EZEH Bら、J Lipid Res 44:1523−1529、2003
したがって、本発明は、個体における腫瘍の診断方法を提供するものであり、以下の工程:
− 個体の体液サンプル又は組織サンプル中のアポリポタンパク質A−IV(アポA−IV)の量を測定し;
− サンプル中のアポA−IVの測定量を基準値と比較し(ここで、基準値は、腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量である);そして
− サンプル中のアポA−IV含量が基準値と比較して減少している場合に腫瘍を診断する、
ことを含む。
− 個体の体液サンプル又は組織サンプル中のアポリポタンパク質A−IV(アポA−IV)の量を測定し;
− サンプル中のアポA−IVの測定量を基準値と比較し(ここで、基準値は、腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量である);そして
− サンプル中のアポA−IV含量が基準値と比較して減少している場合に腫瘍を診断する、
ことを含む。
驚くべきことに、個体のサンプル中のアポA−IV量を測定することにより、個体における固形腫瘍の存在の診断を可能にすることが示されるであろう。例えば、個体の血清中のアポ−IVレベルが腫瘍のない個体の平均アポA−IV量よりも低い場合、腫瘍の存在を診断することができる。
「基準値」は、腫瘍に罹患していない健常個体における平均アポA−IV量を表す。基準値は、好ましくはさまざまな個体の、少なくとも1サンプル、好ましくは少なくとも5サンプル、より好ましくは少なくとも10サンプル、更により好ましくは少なくとも50サンプルから計算することが好ましい。血清アポA−IVレベルは、腎機能障害(腎機能障害に罹患していない健常個体と比較してアポA−IVレベルが上昇)、冠動脈疾患及びアテローム性動脈硬化の合併症(冠動脈疾患及びアテローム性動脈硬化の合併症に罹患していない健常個体と比較してアポA−IVレベルが低下)のような他の疾患の存在にも依存することに注目されたい(EP 1 410 039A号を参照されたい)。したがって、基準値は、腫瘍、腎機能障害、冠動脈疾患、及びアテローム性動脈硬化の合併症に罹患していない個体から計算することが好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、個体はヒトである。
当然、本発明による方法は、哺乳動物、特にペット(例えばイヌ、ネコ)及び家畜(例えばウマ、ウシ、ヒツジ)に適用することもできる。アポA−IVレベルをヒト以外の他の哺乳動物で測定する場合、本発明による方法を用いて腫瘍を診断する前に、健常哺乳動物のアポA−IVレベルを測定する必要がある。
当然、本発明による方法は、哺乳動物、特にペット(例えばイヌ、ネコ)及び家畜(例えばウマ、ウシ、ヒツジ)に適用することもできる。アポA−IVレベルをヒト以外の他の哺乳動物で測定する場合、本発明による方法を用いて腫瘍を診断する前に、健常哺乳動物のアポA−IVレベルを測定する必要がある。
診断すべき腫瘍は、腎腫瘍、並びに生殖器官(即ち生殖系)の腫瘍、特に卵巣癌、子宮頚癌、及び精巣癌から成る群より選択されることが好ましい。
結局、特に腎腫瘍及び生殖器腫瘍(例えば卵巣癌、子宮頚癌、及び精巣癌)(又は1種より多い腫瘍)に罹患する患者において、血清アポA−IVレベルは、それらの疾患に罹患していない個体の血清レベルと比較して低下していることがわかり、臨床診療において信頼できる診断マーカーとしてすでに証明されている。しかしながら、本発明は、腫瘍、特に固形腫瘍、例えば上皮細胞に関与する腫瘍に適用することもできる。
結局、特に腎腫瘍及び生殖器腫瘍(例えば卵巣癌、子宮頚癌、及び精巣癌)(又は1種より多い腫瘍)に罹患する患者において、血清アポA−IVレベルは、それらの疾患に罹患していない個体の血清レベルと比較して低下していることがわかり、臨床診療において信頼できる診断マーカーとしてすでに証明されている。しかしながら、本発明は、腫瘍、特に固形腫瘍、例えば上皮細胞に関与する腫瘍に適用することもできる。
生殖器腫瘍、特に卵巣腫瘍及び精巣腫瘍は、特に若い人々(30〜50歳の人々の大きな群も同様)を侵す。これらの腫瘍の多くは、初期診断が生存に最も重要である。生殖系には、性腺、即ち男性の精巣及び女性の卵巣、並びに他の付随する管及び腺が含まれる(gonos=種子)。これらは、生殖手段、種の存続、及び次世代への遺伝物質の伝達を提供する。
本発明による方法は、子宮頚癌、特に既にこの種の癌の初期にあるもの(例えば前第0期、第0期、第I期、第IA期、又は第IB期)の診断に有効であることも証明されている。
子宮頚癌の病期分類が癌の増殖の程度を記述するために開発されている。子宮頚癌の病期は、腫瘍の大きさ、頚部浸潤の深さ、並びに頚部内及びそれを越えた広がりについて記述している。子宮頚癌の病期分類は、通常、国際産科婦人科連合によって開発された病期分類案であるFIGOシステムで記載されている。FIGO分類は、第0期〜第IV期(0〜4)と表示される基本的な病期にグループ分けされる:
* 第0期又は上皮内癌は非常に初期の癌である。異常細胞は頚部裏打ち層細胞の第1層に見られるのみであり、頚部の更に深い組織へは浸潤していない。
* 第I期癌は頚部を侵すが近隣には広がっていない。
* 第IA期は、顕微鏡下でのみ目に見え、頚部組織の更に深部に見られる、非常に少量の癌を示す。
* 第IB期は、頚部組織に見られる更に多量の癌を示す。
* 第II期癌は近隣領域まで広がっているが、依然として骨盤領域内である。
* 第IIA期癌は頚部を越えて膣の上部2/3まで広がっている。
* 第IIB期癌は頚部周辺組織まで広がっている。
* 第III期癌は骨盤領域全体に広がっている。癌細胞は膣の下部まで広がり得る。細胞は更に広がって腎臓と膀胱をつなぐ管をブロックし得る。
* 第IV期癌は身体の他の部分まで広がっている。
* 第IVA期癌は膀胱又は直腸(頚部に近接した臓器)まで広がっている。
* 第IVB期癌は肺などの他の臓器まで広がっている。
* 第0期又は上皮内癌は非常に初期の癌である。異常細胞は頚部裏打ち層細胞の第1層に見られるのみであり、頚部の更に深い組織へは浸潤していない。
* 第I期癌は頚部を侵すが近隣には広がっていない。
* 第IA期は、顕微鏡下でのみ目に見え、頚部組織の更に深部に見られる、非常に少量の癌を示す。
* 第IB期は、頚部組織に見られる更に多量の癌を示す。
* 第II期癌は近隣領域まで広がっているが、依然として骨盤領域内である。
* 第IIA期癌は頚部を越えて膣の上部2/3まで広がっている。
* 第IIB期癌は頚部周辺組織まで広がっている。
* 第III期癌は骨盤領域全体に広がっている。癌細胞は膣の下部まで広がり得る。細胞は更に広がって腎臓と膀胱をつなぐ管をブロックし得る。
* 第IV期癌は身体の他の部分まで広がっている。
* 第IVA期癌は膀胱又は直腸(頚部に近接した臓器)まで広がっている。
* 第IVB期癌は肺などの他の臓器まで広がっている。
初期検出(特に第0期の前(前第0期))によって子宮頚癌の発生率を顕著に低下させる能力があるにもかかわらず、この疾患のスクリーニング法には現在のところ依然として限界がある。最も優勢なのは、多くの患者が近年利用可能なスクリーニング方法を知らないという事実である。日常的に実施されている血清解析において血清サンプルで子宮頚癌を検出することによりこの問題は解決されるであろう。現在のスクリーニング法は血清サンプルでCIN及び/又は子宮頚癌を検出することができず、頚部細胞の解析用にデザインされたものである。これまでに確立されたスクリーニング法には全て特定の限界があり、これらの方法で、頚部形質転換領域由来のもの以外のサンプルにおいてCIN又は子宮頚癌の検出を可能にするものはない。更に、これらのスクリーニングプログラムはいずれも、特に発展途上国において、集団検診に用いられる可能性をはるかに越えている。この状況は正確で迅速で安価なCIN及び/又は子宮頚癌の診断ツールの開発により劇的に変化するであろう。
言うまでもなく、本発明による方法は、当該技術分野に熟練した者が、個体において1種の腫瘍だけでなく複数の腫瘍の存在を診断することを可能にする。したがって、1種より多い腫瘍に罹患する個体において腫瘍を診断することも可能であるが、この場合、最終診断はこれらの状況を注意深く考慮する必要があり、全ての最終的な診断の決定に関しては信頼できる医者によってのみなされ得る。
アポA−IV量は、いくつかの体液サンプル及び組織サンプルにおいて測定することができるが、体液は、血液、血清、又はそれらの画分であることが好ましい。
腫瘍診断方法は、例えば外科的介入(例えば生検)ほど侵襲的でない、比較的簡便で迅速な方法で得ることができるサンプルを使用することが有益である。したがって、腫瘍マーカーは、血液、血清、又はそれらの画分中で検出できることが好ましい。又、本発明の方法を用いて腫瘍処置の進展をモニターする場合、例えば侵襲的な方法は処置の進展をモニターするために必要な十分量の組織サンプルを得ることができないため、好ましくは侵襲的でない方法によって得たサンプルを得る必要がある。
腫瘍診断方法は、例えば外科的介入(例えば生検)ほど侵襲的でない、比較的簡便で迅速な方法で得ることができるサンプルを使用することが有益である。したがって、腫瘍マーカーは、血液、血清、又はそれらの画分中で検出できることが好ましい。又、本発明の方法を用いて腫瘍処置の進展をモニターする場合、例えば侵襲的な方法は処置の進展をモニターするために必要な十分量の組織サンプルを得ることができないため、好ましくは侵襲的でない方法によって得たサンプルを得る必要がある。
本発明の好ましい態様によれば、基準値は10〜18mgアポA−IV/dL血清、好ましくは13〜15mgアポA−IV/dL血清である。
本発明を用いて診断した個体における測定値と基準値との比較は、値を採取若しくは測定した体液又は組織にも依存する。言うまでもなく、血清を試験することが好ましく、アポA−IV ELISAで試験した場合、(健常)基準値は通常10〜18mgアポA−IV/dL血清である。しかしながら、上記のように、これらの絶対値は、非常に特異的なアポA−IV量測定方法、及びアポA−IV量を測定する体液/組織に常に依存する。本発明による試験材料の体液に由来する血液以外の他の好ましい供給源には、腫瘍組織、特に腫瘍組織に由来する生検材料が含まれる。
本発明を用いて診断した個体における測定値と基準値との比較は、値を採取若しくは測定した体液又は組織にも依存する。言うまでもなく、血清を試験することが好ましく、アポA−IV ELISAで試験した場合、(健常)基準値は通常10〜18mgアポA−IV/dL血清である。しかしながら、上記のように、これらの絶対値は、非常に特異的なアポA−IV量測定方法、及びアポA−IV量を測定する体液/組織に常に依存する。本発明による試験材料の体液に由来する血液以外の他の好ましい供給源には、腫瘍組織、特に腫瘍組織に由来する生検材料が含まれる。
腫瘍は、アポA−IVレベルが10mgアポA−IV/dL血清、好ましくは8mgアポA−IV/dL血清よりも低い場合に診断される。
本発明の好ましい態様によれば、サンプル中のアポA−IV含量は、腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量よりも少なくとも10%、好ましくは少なくとも30%、特に少なくとも50%少ない場合に減少していると判断される。
本発明の好ましい態様によれば、サンプル中のアポA−IV含量は、腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量よりも少なくとも10%、好ましくは少なくとも30%、特に少なくとも50%少ない場合に減少していると判断される。
低下したアポA−IVレベルは、腫瘍のない健常対照個体よりも低いレベルであるとみなされる。
サンプル中のアポA−IV量は、アポA−IVに対する抗体を用いた免疫化学的方法で検出することが好ましい。
サンプル中のアポA−IV量は、アポA−IVに対する抗体を用いた免疫化学的方法で検出することが好ましい。
サンプル中のタンパク質量の測定は、例えば免疫化学的方法によって行うことができる。この方法は、測定すべきタンパク質又はその断片に対する抗体を使用する。
抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明の方法に使用できる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。しかしながら、この方法にモノクローナル抗体を使用することが好ましい。アポA−IV抗原に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野に公知の方法によって得ることができる(例えばKohler G及びMilstein C.、Nature(1975)256:495−457)。当該技術分野に熟練した者にはポリクローナル抗体の産生方法も周知である。そのような抗体は、抗原を、場合により少なくとも1種のアジュバントと組み合わせて、哺乳動物、好ましくはウサギ、マウス、又はヒツジへ投与し、得られた血清から抗体を含む画分を単離することによって得ることができる。
アポA−IV又はその断片に対する抗体は、検出マーカー、好ましくは発色マーカー、蛍光マーカー、又は放射性マーカーを含むことが好ましい。
アッセイで抗体を検出するには、例えば検出手段(例えば光電子増倍管)によって容易に検出できる適当なマーカーを有するアポA−IV抗体のように標識が必要である。言うまでもなく、アポA−IV抗体は直接標識しないことも可能である。そのような抗体を包含するアッセイでは、アポA特異的抗体に対する抗体を標識する必要がある。どの抗体を標識すべきかは、血清中のアポA−IVを測定するために用いるアッセイに主に依存する。
アッセイで抗体を検出するには、例えば検出手段(例えば光電子増倍管)によって容易に検出できる適当なマーカーを有するアポA−IV抗体のように標識が必要である。言うまでもなく、アポA−IV抗体は直接標識しないことも可能である。そのような抗体を包含するアッセイでは、アポA特異的抗体に対する抗体を標識する必要がある。どの抗体を標識すべきかは、血清中のアポA−IVを測定するために用いるアッセイに主に依存する。
本発明の好ましい態様によれば、免疫化学的方法は、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、及び放射性免疫測定法(RIA)から成る群より選択される。使用した、抗原アポリポタンパク質A−IVに対するモノクローナル抗体及び/又はポリクローナル抗体の特異性をモニターするために、ウエスタンブロットが用いられる。
当該技術分野において公知の免疫化学的方法の中で、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、又は放射性免疫測定法(RIA)を用いることが好ましい。ELISA及びRIAは競合アッセイに、ELISAはサンドイッチアッセイにも用いることができる(例えばRosseneu Mら、Clin Chem(1988)34:739−743)。
本発明の他の側面は、腫瘍治療効率をモニターするための、本発明による方法の使用に関するものである。
腫瘍に罹患する個体、特に個体の血清におけるアポA−IV量の減少は、腫瘍処置中のアポA−IVレベルのモニタリングを可能にする。血清アポA−IVレベルは個体における腫瘍の存在に顕著に依存するため、血清アポA−IVレベルが基準値まで増加することは、癌患者の処置が成功したことを示す。処置のあいだ血清アポA−IVレベルの変化をモニターするには、個体のサンプルを、処置前(例えば腫瘍切除前)、及び処置(例えば化学療法)中の規定の期間に採取する。言うまでもなく、この方法を長期試験に用いて、個体における腫瘍再発をモニターすることもできる。
腫瘍に罹患する個体、特に個体の血清におけるアポA−IV量の減少は、腫瘍処置中のアポA−IVレベルのモニタリングを可能にする。血清アポA−IVレベルは個体における腫瘍の存在に顕著に依存するため、血清アポA−IVレベルが基準値まで増加することは、癌患者の処置が成功したことを示す。処置のあいだ血清アポA−IVレベルの変化をモニターするには、個体のサンプルを、処置前(例えば腫瘍切除前)、及び処置(例えば化学療法)中の規定の期間に採取する。言うまでもなく、この方法を長期試験に用いて、個体における腫瘍再発をモニターすることもできる。
腫瘍は、腎腫瘍及び生殖器腫瘍、特に卵巣癌、子宮頚癌、及び精巣癌から成る群より選択されることが好ましい。
本発明の他の側面は、患者の腫瘍を診断するため及び腫瘍治療効率をモニターするためのキットに関するものであり、1以上の以下の成分を含む:
− 腫瘍に罹患する個体に由来する正の対照;
− 体液サンプル又は組織サンプル中のアポA−IV量の測定手段;及び
− 基準値手段として、腫瘍に罹患していない個体に由来するサンプル。
本発明の他の側面は、患者の腫瘍を診断するため及び腫瘍治療効率をモニターするためのキットに関するものであり、1以上の以下の成分を含む:
− 腫瘍に罹患する個体に由来する正の対照;
− 体液サンプル又は組織サンプル中のアポA−IV量の測定手段;及び
− 基準値手段として、腫瘍に罹患していない個体に由来するサンプル。
腫瘍に罹患する個体に由来する正の対照、及び腫瘍に罹患していない個体に由来するサンプルは安定化させることが好ましく、凍結乾燥によって安定化させることが好ましい。
生体物質を含むサンプルは不安定な傾向にある。したがって、そのようなサンプル及び正の対照をキットに提供する場合、キットを6℃以下又は室温で長期間保存させるには、サンプル及び正の対照を安定化させる必要がある。キットを室温保存することを意図する場合、キットに含まれる生体物質は例えば凍結乾燥される必要がある。凍結乾燥は、広く普及しているタンパク質サンプルの保存方法である。キットを6℃以下、好ましくは0℃以下で保存することを意図する場合、生体物質を、生体物質中に含有されるタンパク質の劣化を妨げる溶液中で提供する必要がある。溶液は、例えばグリセロール、メルカプトエタノール、及び防腐剤を含むことができる。
生体物質を含むサンプルは不安定な傾向にある。したがって、そのようなサンプル及び正の対照をキットに提供する場合、キットを6℃以下又は室温で長期間保存させるには、サンプル及び正の対照を安定化させる必要がある。キットを室温保存することを意図する場合、キットに含まれる生体物質は例えば凍結乾燥される必要がある。凍結乾燥は、広く普及しているタンパク質サンプルの保存方法である。キットを6℃以下、好ましくは0℃以下で保存することを意図する場合、生体物質を、生体物質中に含有されるタンパク質の劣化を妨げる溶液中で提供する必要がある。溶液は、例えばグリセロール、メルカプトエタノール、及び防腐剤を含むことができる。
アポA−IV量の測定手段は、抗アポA−IV抗体、特にポリクローナル抗体、2次抗体、特に酵素的に若しくは化学的に標識された2次抗体、アポA−IV−RNA特異的核酸、アポA−IV特異的酵素試験、アポA−IV特異的ELISA、又はそれらの組み合わせから選択されることが好ましい。
サンプル中のアポA−IV量はいくつかの方法で測定することができ、量を測定する手段として抗体を使用する方法を用いることが好ましい。
本発明を以下の図面及び実施例によって更に説明するが、それらに限定されるものではない。
本発明を以下の図面及び実施例によって更に説明するが、それらに限定されるものではない。
腎腫瘍マーカーとしてのアポA−IV
方法:
被験者
この実施例には、30人の患者(男性18人、女性12人)から採取したヒト血液サンプルが含まれた。全ての患者は腎癌のため片側腎全摘出術を受けている。重篤なタンパク尿の患者はいなかった(タンパク尿に関する尿検査は最高でも1+であった)。
方法:
被験者
この実施例には、30人の患者(男性18人、女性12人)から採取したヒト血液サンプルが含まれた。全ての患者は腎癌のため片側腎全摘出術を受けている。重篤なタンパク尿の患者はいなかった(タンパク尿に関する尿検査は最高でも1+であった)。
一晩絶食後、術前に血液サンプルを採取した。4℃で低速遠心分離後、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)血漿を得、使用前、−80℃で凍結させた。患者は、献血前1週間以内に、腎機能に影響を及ぼし得る造影剤を用いた試験を受けていないことを確かめた。
血漿アポA−IV濃度の測定
親和性精製したポリクローナル抗ヒトアポA−IV抗体をコーティングに用い、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた同一抗体を検出に用いる2重抗体酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)にて血漿アポA−IV濃度を測定した。既知含量のアポA−IVを有する血漿を較正基準とした。この測定法の検出下限は0.002mg/dlである(KRONENBERG Fら、J Lipid Res 35:1318−1328、1994)。各サンプルは2重に解析した。CNBrで活性化したセファロースQ2 4B (アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン)に結合させた精製血漿アポA−IVを用いて、ウサギ抗ヒトアポA−IV抗血清の免疫吸着クロマトグラフィによって親和性精製した抗体を調製した。ウサギを精製血漿アポA−IVで免疫することによって抗アポA−IV血清を得た(DIEPLINGER Hら、Eur J Clin Invest 22:166−174、1992)。
親和性精製したポリクローナル抗ヒトアポA−IV抗体をコーティングに用い、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた同一抗体を検出に用いる2重抗体酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)にて血漿アポA−IV濃度を測定した。既知含量のアポA−IVを有する血漿を較正基準とした。この測定法の検出下限は0.002mg/dlである(KRONENBERG Fら、J Lipid Res 35:1318−1328、1994)。各サンプルは2重に解析した。CNBrで活性化したセファロースQ2 4B (アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン)に結合させた精製血漿アポA−IVを用いて、ウサギ抗ヒトアポA−IV抗血清の免疫吸着クロマトグラフィによって親和性精製した抗体を調製した。ウサギを精製血漿アポA−IVで免疫することによって抗アポA−IV血清を得た(DIEPLINGER Hら、Eur J Clin Invest 22:166−174、1992)。
イムノブロット解析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)で分離し、ニトロセルロース膜に転写したサンプルについてアポA−IVのイムノブロット解析を行った。精製アポA−IVを標準として用いた。アポA−IVは、リポタンパク質を枯渇させた後、トリグリセリド−リン脂質エマルジョンとともにインキュベーションし、脂質に結合した疎水性タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィで分離することによってヒト血漿から単離した(STEINMETZ Aら、J Chromatogr 487:154−160、1989)。同様に親和性精製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポA−IVもELISAプロトコールに含まれており、イムノブロットに使用した。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)で分離し、ニトロセルロース膜に転写したサンプルについてアポA−IVのイムノブロット解析を行った。精製アポA−IVを標準として用いた。アポA−IVは、リポタンパク質を枯渇させた後、トリグリセリド−リン脂質エマルジョンとともにインキュベーションし、脂質に結合した疎水性タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィで分離することによってヒト血漿から単離した(STEINMETZ Aら、J Chromatogr 487:154−160、1989)。同様に親和性精製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポA−IVもELISAプロトコールに含まれており、イムノブロットに使用した。
統計的評価
試験群間の平均アポA−IV濃度をマンホイットニーU検定で比較した。対応のあるサンプルはウイルコクソン検定で比較した。
試験群間の平均アポA−IV濃度をマンホイットニーU検定で比較した。対応のあるサンプルはウイルコクソン検定で比較した。
結果:
アポA−IV抗体の特異性
免疫組織化学に用いるポリクローナルウサギ抗ヒトアポA−IV抗体の特異性を検証するために、2人の異なる患者に由来する組織から単離したヒト腎タンパク質及び対応の血漿サンプルのイムノブロット解析によって抗体を解析した。アポA−IV抗体は組織サンプル及び血漿サンプルにおいてタンパク質のバンドを1本だけ検出できたが、標準として用いたアポA−IV調製物では2本のバンドを検出した。ペプチドの配列決定により、標準のタンパク質バンドはいずれもアポA−IVを表すことを確認した。したがって、2本目の小さなアポA−IVアイソフォームは、脱グリコシル化又はタンパク質分解により生じたのであろう。
アポA−IV抗体の特異性
免疫組織化学に用いるポリクローナルウサギ抗ヒトアポA−IV抗体の特異性を検証するために、2人の異なる患者に由来する組織から単離したヒト腎タンパク質及び対応の血漿サンプルのイムノブロット解析によって抗体を解析した。アポA−IV抗体は組織サンプル及び血漿サンプルにおいてタンパク質のバンドを1本だけ検出できたが、標準として用いたアポA−IV調製物では2本のバンドを検出した。ペプチドの配列決定により、標準のタンパク質バンドはいずれもアポA−IVを表すことを確認した。したがって、2本目の小さなアポA−IVアイソフォームは、脱グリコシル化又はタンパク質分解により生じたのであろう。
血清アポA−IVレベル
血漿サンプルの解析により、血漿アポA−IV濃度は、通常、健常個体(11.9±2.8mg/dl、n=52)と比較して、腎腫瘍患者(6.8±4.4mg/dl)で低いことが示された(EZEH Bら、J Lipid Res 44:1523−1529、2003;KRONENBERG Fら、J Am Coll Cardiol 36:751−757、2000)。
血漿サンプルの解析により、血漿アポA−IV濃度は、通常、健常個体(11.9±2.8mg/dl、n=52)と比較して、腎腫瘍患者(6.8±4.4mg/dl)で低いことが示された(EZEH Bら、J Lipid Res 44:1523−1529、2003;KRONENBERG Fら、J Am Coll Cardiol 36:751−757、2000)。
卵巣癌マーカーとしてのアポA−IV
a) 第1の患者群は19人の卵巣癌患者で構成した。卵巣癌の再発は、患者における血漿アポA−IVレベルの定量によって決定した。初期血漿アポA−IVレベルは外科的介入後およそ30日に測定し、患者の血漿アポA−IVレベルは健常個体の基準値に近いことを示した。卵巣癌の再発後、血漿アポA−IVレベルは初期値と比較して顕著に低下した(図1)。
a) 第1の患者群は19人の卵巣癌患者で構成した。卵巣癌の再発は、患者における血漿アポA−IVレベルの定量によって決定した。初期血漿アポA−IVレベルは外科的介入後およそ30日に測定し、患者の血漿アポA−IVレベルは健常個体の基準値に近いことを示した。卵巣癌の再発後、血漿アポA−IVレベルは初期値と比較して顕著に低下した(図1)。
b) 第2の臨床試験では、外科的介入前後に10人の癌患者の血漿アポA−IVレベルを長期間にわたって測定し、周知の腫瘍マーカーであるCA125の血漿レベルと比較した。卵巣癌患者において術前(時点0)及び術後少なくとも30週間、CA125及びアポA−IVの血漿レベルを測定した。図2Aに、2つの腫瘍マーカー間の相関を示す。卵巣癌の存在を示す高CA125量は、低血清アポA−IVレベルと相関する。卵巣癌の再発は術後50〜55週に認められる。これらの結果は、組織学的試験によって確認した。しかしながら、CA125レベルは卵巣癌の再発を示さなかったが、血清アポA−IVレベルは術後65〜70週に2人の他の患者において卵巣癌の存在を明らかに示している(図2B、図2Cを参照されたい)。これらの結果も組織学的試験によって確認した。したがって、血漿アポA−IVレベルは、この症例の非検出が偽陰性診断をもたらすCA125よりも、腫瘍、特に卵巣癌の確実に良好なマーカーであることを明らかに証明する。図2Dでは、卵巣癌患者の成功した治療におけるCA125及びアポA−IVの測定結果を示す。図2E及び図2Fでは、卵巣癌患者におけるCA125レベルとアポA−IVレベルとの相関が確認されるであろう。
精巣癌マーカーとしてのアポA−IV
18人の精巣癌患者群を試験した。血漿アポA−IVレベルの結果を以下の表に表す。
18人の精巣癌患者群を試験した。血漿アポA−IVレベルの結果を以下の表に表す。
子宮頚癌マーカーとしてのアポA−IV
最後に、他の生殖器腫瘍である子宮頚癌(女性では2番目に頻度の高いがん)の患者群についても調査した。この頻度の高い癌を同定するための特異的血清腫瘍マーカーは全く存在しない。慣用的に使用される血漿マーカーSCC(扁平上皮癌抗原)も、子宮頚癌に対して十分に特異的ではない。
最後に、他の生殖器腫瘍である子宮頚癌(女性では2番目に頻度の高いがん)の患者群についても調査した。この頻度の高い癌を同定するための特異的血清腫瘍マーカーは全く存在しない。慣用的に使用される血漿マーカーSCC(扁平上皮癌抗原)も、子宮頚癌に対して十分に特異的ではない。
本発明によって、16人の子宮頚癌患者において血漿アポA−IV濃度が顕著に低下したことを示した(図4)だけでなく、縦断的研究(n=16)においてアポA−IVのモニタリング腫瘍マーカーとしての好適性を再度立証することができた。調査した全てのがんのFIGO病期においてアポA−IVは減少し、腫瘍除去後に健常対照の正常値まで増加し、腫瘍再発時に再度減少した(図5及び図6)。
Claims (16)
- 個体における腫瘍の診断方法であって、以下の工程:
− 個体の体液サンプル又は組織サンプル中のアポリポタンパク質A−IV(アポA−IV)の量を測定し;
− サンプル中のアポA−IVの測定量を基準値と比較し(ここで、基準値は、腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量である);そして
− サンプル中のアポA−IV含量が基準値と比較して減少している場合に腫瘍を診断する、
ことを含む、前記方法。 - 個体がヒトであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍が、腎腫瘍、並びに生殖器腫瘍、特に卵巣癌、子宮頚癌、及び精巣癌から成る群より選択されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 体液サンプルが、血液サンプル、血漿サンプル、又は血漿画分のサンプルであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 基準値が10〜18mg、好ましくは13〜15mgアポA−IV/dL血清であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- アポA−IVレベルが10mgアポA−IV/dL血清より低い場合、好ましくは8mgアポA−IV/dL血清より低い場合に腫瘍が診断されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 腫瘍のない個体に由来するサンプル中のアポA−IV含量よりも少なくとも10%、好ましくは少なくとも30%、特に少なくとも50%低い場合に、サンプル中のアポA−IV含量が減少していることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- サンプル中のアポA−IV量が、アポA−IVに対する抗体を用いた免疫化学的方法によって測定されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 抗体が、検出マーカー、好ましくは発色マーカー、蛍光マーカー、又は放射性マーカーを含むことを特徴とする、請求項8又は9に記載の方法。
- 免疫化学的方法が、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、及び放射性免疫測定法(RIA)から成る群より選択されることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 腫瘍治療効率をモニターするための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 腫瘍が、腎腫瘍、並びに生殖器腫瘍、特に卵巣癌、子宮頚癌、及び精巣癌から成る群より選択されることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
- 患者の腫瘍を診断するため又は腫瘍治療効率をモニターするためのキットであって、1以上の以下の成分:
− 腫瘍に罹患する個体に由来する正の対照;
− 体液サンプル又は組織サンプル中のアポA−IV量の測定手段;及び
− 基準値手段として、腫瘍に罹患していない個体に由来するサンプル、
を含む、前記キット。 - 正の対照及び腫瘍に罹患していない個体に由来するサンプルが安定化されている、好ましくは凍結乾燥によって安定化されていることを特徴とする、請求項14に記載のキット。
- アポA−IV量測定手段が、抗アポA−IV抗体、特にポリクローナル抗体、2次抗体、特に酵素的に又は化学的に標識された2次抗体、アポA−IV−RNA特異的核酸、アポA−IV特異的酵素試験、アポA−IV特異的ELISA、又はこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
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