JP2009504141A - ヒト可溶性アデニル酸シクラーゼの結晶構造 - Google Patents

Abstract

本発明はｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶構造を提供する。この構造を表１から５に示す。この構造は、このタンパク質とリガンド（例えば医薬化合物）との相互作用のモデル化、及び、関連アデニル酸シクラーゼ分子の構造の決定に使用できる。

Description

本発明は、ヒト可溶性アデニル酸シクラーゼ（soluble adenylate cyclase：ｓｏｌＡＣ）の触媒ドメイン、その結晶化のための方法、ｓｏｌＡＣの結晶及びその３次元構造、リガンド存在下でのｓｏｌＡＣの結晶、並びにそれらの使用に関する。

アデニル酸シクラーゼ
環状アデノシン３’，５’一リン酸（cyclic adenosine 3',5'-monophosphate：ｃＡＭＰ）は、遺伝子発現、細胞増殖、心機能、染色体分裂及び細胞代謝等、数々の重要な生理学的プロセスを調節する、偏在性の二次メッセンジャーである（Robison, G．A． Butcher, R．W． and Sutherland, E．W． (1968) Annu． Rev． Biochem．,37, 149-174; Rodbell, M． (1980) Nature, 284, 17-22）。ｃＡＭＰはＡＴＰから６種の異なるファミリーの酵素により合成されるが、その１つはアデニレート又はアデニリルシクラーゼ（adenylyl cyclases：ＡＣ）である。これらのファミリーは、ＡＴＰからｃＡＭＰを生成する能力については共通しているものの、互いの配列に類似性は見られない。クラスＩは腸内細菌に存在し、異化抑制を調節するのに対し、クラスIIは炭疽菌（Bacillus anthracis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及び百日咳菌（Bordetella pertusis）等の病原体に存在する。クラスIV、Ｖ及びVIは、それぞれアエロモナス細菌（Aeromonas hydrohila）、プレボテラ・ルミニコラ（Prevotella ruminicola）及びインゲン根粒菌（Rhizobium etli）に存在する。普遍クラス（Universal Class）としても知られるクラスIIIシクラーゼは、真核生物に見出された唯一のクラスであり、細菌や古細菌にも存在している。哺乳類細胞が発現するこれらの酵素は、二つの異なる種類に分けられる。即ち、その特性が既によく知られている膜貫通アデニル酸シクラーゼ（transmembrane adenylate cyclases：ｔｍＡＣ）と、近年発見された可溶性アデニル酸シクラーゼ（soluble adenylate cyclase：ｓｏｌＡＣ）である（Shenoy, A.V. and Visweswariah, S.S (2004) FEBS Lett. 561, 11-21）。

ｔｍＡＣは細胞膜結合タンパク質である。ｔｍＡＣには９種のイソフォーム（Ｉ〜IX）が同定されているが、何れもホルモン及び神経伝達物質によって刺激されるとともに、Ｇ_sタンパク質のα−サブユニットによって活性化され、また、タイプIXを除いて、ジテルペンホルスコリンによっても刺激される。これらは、Ｇ_i、Ｇ_o及びＧ_zα−サブユニット、並びにＧ_β,γサブユニット、ＰＫＣ及びＣａ²⁺／カルモジュリンに対する応答性の違いによって、識別することができる。この調節多様性によって、これらの様々なｔｍＡＣ’が、神経伝達物質やホルモンからの細胞内シグナルに対し、正しい細胞環境で応答することが可能となる。何れのｔｍＡＣも、短い細胞質ゾルＮ末端と、それに続く疎水性領域のタンデム反復（６膜貫通ヘリックスとしてモデリングされる場合が多い）と、細胞質領域とからなる、共通の構造を有している。それぞれＣ₁及びＣ₂と名付けられた二つの細胞質ドメインは、互いに高い相同性（~５０％の同一性）を示すと共に、ｔｍＡＣファミリーの９種の異なるメンバーの間でも、高い相同性を有している（~５０〜９０％の同一性）。酵素が活性となるためには、Ｃ₁とＣ₂とが会合して、相補的なヘテロ二量体を形成する必要がある。活性タンパク質の精製が困難であることから、これらの酵素の機序及び調節の生化学的な特性解析は、長らく停滞してきた。大きな突破口となったのは、可溶性ｔｍＡＣシステムの開発である。これは細胞質ドメインの各セクションを個別に、可溶性組み換えタンパク質として発現させたものである。Ｃ₁及びＣ₂は何れも、インビトロでは頭尾接触により（in a head to tail interface）自己会合して、不活性（Ｃ₁）及び貧活性（Ｃ₂）のホモ二量体を生じてしまう傾向があるが、混合した場合にはそれらの調節特性が保持された完全に活性なヘテロ二量体が得られる。即ち、Ｃ₂ホモ二量体及びＣ₁Ｃ₂ヘテロ二量体はホルスコリン刺激に反応するのに対して、Ｃ₁ホモ二量体は活性を示さないままである。

可溶性ｔｍＡＣシステムによって酵素のＸ線結晶解析が可能となった結果、ラット タイプII Ｃ₂ホモ二量体、及びイヌ タイプＶ Ｃ₁／ラット タイプII Ｃ₂ ヘテロ二量体とウシＧ_sαとの複合体について、構造解が得られている（Zhang, G., Liu, Y., Ruoho, A.E. and Hurley, J.H. (1997) Nature, 386, 247-253; Tesmer, J.J.G, Sunahara, R.K., Gilman, A.G. and Sprang, S.R. (1997) Science 278, 1907-1916; Tesmer, J.J.G, Sunahara, R.K., Johnson, R.A., Gosselin, G., Gilman, A.G. and Sprang, S.R (1999) Science, 285, 756-760）。

かかるシステムの構築は依然として困難である。大きな課題の１つは、Ｃ₁及びＣ₂コンストラクトの出発点を定めることである。ファミリー間には高い配列相同性があるため、配列相同性のみに基づくコンストラクトの設計は実用的な出発点となるが、タンパク分解に対して安定な、可溶性且つ機能性のタンパク質を得ることは容易なことではない（Beeler, J.A. and Tang, W-J. (2004) Methods in Mol. Biol, 237, 39-53）。

可溶性アデニル酸シクラーゼ：機能、特性解析及び精製
新たな可溶形のアデニル酸シクラーゼ（“ｓｏｌＡＣ”）の存在が始めて報告されたのは１９７５年、ラット睾丸由来の細胞質ゾル画分においてであった。ｔｍＡＣとは異なり、ｓｏｌＡＣはＭｎ²⁺イオンに対する特異的な要求性を示し、その活性は黄体ホルモン（luteinizing hormone：ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（follicle-stimulating hormone：ＦＳＨ）の何れによる刺激も受けなかった（Braun, T. and Dods, R.F. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1097-1101）。Ｍｎ²⁺イオンがこの酵素を活性化する能力を有することや、Ｇタンパク質調節に対してこの酵素が非感受性であることから、Buck及び共同研究者等は１９９９年に、生化学的手法及びクロマトグラフィーにより、この酵素の特性解析に成功した。彼らは分子量４８ｋＤａの可溶性タンパク質を同定したが、ＰＣＲにより単離されたｓｏｌＡＣの全長遺伝子は、１８７ＫＤａという遥かに大きな酵素をコード化するオープン・リーディング・フレームの存在を示していた。４８ｋＤａの酵素活性種は、全長タンパク質のＮ末端部分に存在することが明らかとなり、このタンパク質の分解断片に相当することが示された。これらの短酵素及び全長酵素が、げっ歯類生殖細胞系において、２種の選択的スプライス転写物によって生成されていることを示す証拠が、ＰＣＲ及びリボヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイによって明らかになった（Jaiswal, B.S. and Conti, M. (2001) J. Biol. Chem., 276, 31698-31708）。ｓｏｌＡＣのオープン・リーディング・フレームと他の配列との比較から、４８ＫＤａ種が有する２つの領域が、様々なアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインに対して高いアミノ酸相同性を示すことが明らかになった。最も密接な関連を有する配列は、シアノバクテリア（Anabaena spirulensisのcyaB1、cyaB2及びcyaA、並びにSpirulina platensisのcyaC）及び粘液細菌（Stigmatella aurantiaca、cyaA及びcyaA）に由来するものであった（Buck, J., Sinclair, M.L. Schapal, L., Cann, M.J. and Levin, L.R. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 79-84）。更なる分析によって、ｓｏｌＡＣの触媒ドメインとｔｍＡＣの触媒ドメインＣ₁及びＣ₂との間の共通性は、僅か１５から２５％の配列同一性に過ぎないことが示された。

逆転写ＰＣＲにより検査した組織の多くで、例えば眼毛様体突起、角膜内皮、脈絡叢、腎臓及び精巣上体等で、ｓｏｌＡＣの発現が確認された（Mittag, T.W., Guo, W-B and Kobayashi (1993) Am. J. Physiol 264, F1060-F1064; Zippin, J.H Levin, L.R. and Buck (2001) Trends Endocrinol Metab, 12 366-370）。しかし、ノーザンブロット分析及びインサイチュハイブリダイゼーションによれば、高度の発現が見られたのは雄生殖細胞のみであった（Sinclair, M.L., Wang, X-Y, Matia, M., Conti, M. Buck, J., Wolgemuth, D.J. and Levin, L.R. (2000) Mol. Reprod. Dev. 56, 6-11）。ｓｏｌＡＣは可溶性酵素であるばかりでなく、ミトコンドリア、中心子、紡錘体、中心体及び核等の細胞内小器官に対して特異的に標的化されることによって、ｃＡＭＰ情報伝達の効果器に近接して存在することが明らかになった（Zippin, J.H., Chen, Y. Nahirney, P., Kamenetsky, M., Wuttke, M.S., Fishman, D.A., Levin, L.R and Buck,J. (2003) Faseb Journal, 17, 82-84; Litvin, T.N., Kamenetsky,M, Zarifyan,A., Buck,J. and Levin L.R. (2003) J. Biol. Chem. 278, 15922-15926）。

可溶性ＡＣはＣａ²⁺及びＨＣＯ₃ ^-による調節を受けることから、ｓｏｌＡＣはこれらの細胞内情報伝達分子の調節の下、固有の細胞事象に対するｃＡＭＰ依存性応答を媒介しているものと思われる。ｓｏｌＡＣは、今までのところ哺乳類における重炭酸／二酸化炭素化学センサー（bicarbonate/carbon dioxide chemosensor）として同定されている唯一の酵素であることから、受精能獲得 過剰活性化運動能及びアクロソーム反応のみならず、腎臓における体液再吸収、毛様体及び脈絡叢における体液分泌、更には栄養信号に応じた代謝調節においても、重要な役割を果たしているものと考えられている（Litvin, T．N．, Kamenetsky,M, Zarifyan,A．, Buck,J． and Levin L．R．（２００３）J． Biol． Chem． ２７８, １５９２２−１５９２６）。

タンパク質の構造を解明するためには、結晶を生成させるために、十分な量の精製タンパク質を調達する必要がある。多くのタンパク質は、組み換え産生系で発現させた場合でも、可溶性、活性、且つ非凝集の形態のままで精製することは困難であった。

数々の異なる細菌性アデニル酸シクラーゼが、大腸菌（E. Coli）において可溶型として発現されてきた。特に、細菌性アデニル酸シクラーゼである Anabaena cyaB、Mycobacterium Rv1264 及び Stigmatella cyaB が、大腸菌（E. Coli）において可溶型として発現されている（Cann et al. (2003), J. Biol. Chem, 278, 35033-35038; Kanacher et. Al. (2002) EMBO J. 21,-3672-3680; Linder et al. (2002) J. Biol. Chem, 277, 15271-15276）。

また、大腸菌（E. Coli）を用いて、トリパノソーマ・ブルーセイ（Trypanosoma brucei）アデニル酸シクラーゼを封入体の形態で発現させた報告もある（Bieger, B. and Essen, L-O. (2000) Acta Cryst. D56, 359-362）。

また、大腸菌（E. Coli）を用いて、Ｎ末端にＨｉｓタグを付したラット膜貫通アデニル酸シクラーゼのＣ２ドメインの発現も行なわれている。本タンパク質は可溶型として発現された（Yan, S-Z et al. (1996) J. Biol. Chem, 271, 10941-10945）。

また、Sunahara, R．K等によって、イヌアデニル酸シクラーゼのタイプＶ Ｃ１ドメインが、Ｎ末端にＨｉｓタグを付した融合物として発現されている（(1997) J. Biol. Chem., 272, 22265-22271）。

十分な純度の材料を十分な量取得することが困難であるという点が、ｓｏｌＡＣの機序及び生化学の解明の妨げとなってきた。上述した他形態のアデニル酸シクラーゼの発現及び回収の条件は何れも様々であることから、相当量のタンパク質産生を実現するには、アデニル酸シクラーゼの形態の違いに応じて、異なる厳密な条件が求められるものと考えられる。

組み換え発現に先立つｓｏｌＡＣの精製アプローチの１つによれば、本酵素の特性を調べるのに十分なタンパク質（~３μｇ）を得るために、数百ものラット睾丸（９５０）を処理する必要があった（Buck, J., Sinclair, M.L. and Levin, L.R. (2003) Methods in Enzymol. 345, 95-105）。本精製手順は複数の工程からなり、まず２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ及びプロテアーゼ阻害剤を含んでなる細胞溶解液を用いる。６つの異なるカラムで精製した後、濃縮された酵素の画分をＨＰＬＣカラムに導入し、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１ｍＭ ＤＴＴで溶出し、更に０〜０．１Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出した。ここでｐＨを降下させたことが（これは本段で初めて行なわれたものである）、活性の大幅な強化（約６０倍）に繋がっているものと考えられる。回収されたｓｏｌＡＣタンパク質の最終収率は約３μｇであったが、その中には６２ＫＤａの無関係な不純物タンパク質が含まれていたことから、より大きなスケールで実施するにしても、本調製法が結晶の作製に適しているとは言い難いと考えられる。

また、ＨＥＫ２９３細胞を用いたラットの組み換えｓｏｌＡＣの全長及び触媒ドメインの発現も行なわれている。これらのコンストラクトを用いて、これら二つの選択的転写物によりコード化される酵素の特性や、これら相互間の相対活性、更には組織由来の等価物に対する相対活性が決定された。組み換え細胞溶解液を遠心分離で清明化した後、Sephacryl S-200カラムに導入した。収率は報告されていないが、これらの組み換え種が活性、サイズ、及び免疫反応の面で、睾丸で発現されている２つのｓｏｌＡＣ種と対応していることを確認するには十分であった（Jaiswal, B.S. and Conti, M. (2001) J. Biol. Chem., 276, 31698-31708）。

発現に組み換えアプローチを用いることで、発現されるタンパク質をタグ化して容易に回収することが可能となった。Litvin等（(2003) J. Biol. Chem. 278, 15922-15926）は、ＧＳＴタグを付した組み換えヒトｓｏｌＡＣ触媒ドメインのバキュロウイルスＨｉ５（Baculovirus Hi5）細胞での産生について報告している。本タンパク質を産生する細胞を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及びプロテアーゼ阻害剤のカクテルで溶解させた。溶解物をグルタチオンセファロース４Ｂカラムに導入し、５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ 還元グルタチオン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１０μｇ／ｍｌロイペプチン（leupeptin）で溶出した。溶出液をSuperdex 200 HR 10/30 カラムに通し、サンプルを５０％グリセロール中で保存した。最終サンプルは別のＧＳＴバンドを有しており、目的のタンパク質はタグと分離していなかった。本著者等は収率を記していないが、酵素学的研究には十分だったにせよ、非常に低い値であったと思われる。

別のタグとして、Chen等（(2000) Science 289, 625-628）がｓｏｌＡＣ触媒ドメイン（アミノ酸１から４６９）の発現に用いたヘキサヒスチジンタグが挙げられる。このタグをＣ末端に融着したタンパク質を、Bac-to-Bac^{（登録商標）}バキュロウイルス発現システム（Life Technologies）を用いて昆虫HiFive細胞で異種発現させ、Ｎｉ²⁺−ＮＴＡセファロース樹脂（Qiagen）を用いたクロマトグラフィーでタンパク質を精製した。タンパク質の条件及び収率は開示されていないが、重炭酸塩が組み換え酵素の活性に及ぼす効果が、ｐＨ効果によるものではないことを確認するのに十分な量であった。更に、本著者等の報告によれば、亜硫酸水素イオン（bisulphite ions）を用いて重炭酸ｓｏｌＡＣの刺激を模倣することが可能であったが、塩素、硫酸又はリン酸イオンでは不可能であった。

これらの過去のｓｏｌＡＣに関する研究にもかかわらず、純粋な組み換え哺乳類タンパク質の最終収率は依然として低く、構造研究に着手する際の妨げとなってきた。

ｓｏｌＡＣ相同体構造
ＨＣＯ₃ ^-の存在下又は不在下において、ＡＴＰ類似物、Ｍｇ²⁺又はＣａ²⁺と複合体を形成したスピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）から得られたｓｏｌＡＣ相同体ＣｙａＣの一連の構造が報告されている。これらの報告によれば、カルシウムイオンは第１の金属結合部位を占有していることから、活性部位の開放立体構造におけるヌクレオチドの結合を媒介しているものと思われる。重炭酸イオンの存在によって活性部位が閉鎖されるとともに、第２の金属イオンが動員される。基質類似体のリン酸基が、おそらくは生成物の形成及び放出を容易にするために、活性部位内におけるその立体構造を再構成する。酵素のアポ型は溶解しないことから、更なる酵素の立体構造が存在し、観察されたものは反応経路に沿って捕捉された種に相当する可能性がある（Steegborn, C., Litvin, T., Levin, L.R. Buck, J. and Wu,H. (2005) Nat. Struc. And Mol. Biol.,12, 32-37, Tesmer, J.J.G. (2005) Nat. Struc. And Mol. Biol.,12, 7-8）。

ｓｏｌＡＣと雄避妊
細胞ｃＡＭＰ濃度の変化は、精子による受精過程（特に成熟、受精能獲得、運動能獲得、及び配偶子との融合）の調節と関連付けられてきた。これらの事象の関連性にもかかわらず、その基礎となる機序は殆ど分かっていない。それぞれのアデニル酸シクラーゼがこれらの過程の調節に果たす具体的な役割を決定するべく行なわれた精子の研究から、ｓｏｌＡＣが中心的な役割とはいかなくても、主要な役割を担っていることを示している（de Lamirande, E., LeClerc,P. and Gagnon, C. (1997) Mol. Hum. Reprod., 3, 175-194; Jaiswal, B.J. and Conti,M. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100,10676-10681; Xie, F. and Conti, M. (2004) Developmental Biol. 265, 196-206; Chen, Y., Cann, M.J., Litvin, T.N., Iourgenko, V., Sinclair, M.L., Levin, L.R. and Buck, J. (2000) Science 289, 625-628）。ｓｏｌＡＣが受精において果たしている役割を示す決定的な証拠となったのは、マウスのｓｏｌＡＣ遺伝子を破壊したところ、精子の運動能に重度の障害が生じ、繁殖不能になるという知見である。ｓｏｌＡＣ欠損雄に生じた睾丸及び精巣上体は正常であり、ｓｏｌＡＣを発現することが知られている他の器官にも、目立った異常は認められなかった。ｓｏｌＡＣ欠損雌マウスには何の表現型も見られず、野生型又はヘテロ接合型マウスとの間で正常な大きさの子を産んだ。ｓｏｌＡＣ欠損雄は正常に交尾したものの、精子の前進運動の欠失のため、繁殖には至らなかった。突然変異精子を用いたインビトロでの研究によれば、突然変異精子にｃＡＭＰを添加することによって、正常な運動能を回復することはできたものの、やはり卵母細胞を繁殖させることはできなかった（Esposito, G., Jaiswal, B.S., Xie, F., Krajnc-Franken, M.A.M., Robben, T.J.A.A, Strik, A.M., Kuil, C, Philipsen, R.L.A., van Duin, M., Conti, M. and Gossen, J.A. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2993-2998）。

ｓｏｌＡＣが受精に重要な役割を果たしているにもかかわらず、ｔｍＡＣの一部はこの過程に組み込まれていることを示す証拠もある。無傷マウス精子の免疫学的局在決定によれば、ｔｍＡＣ II、III及びVIII は先体及び鞭毛領域に豊富に存在するのに対して、ｔｍＡＣ Ｉ及びIV は中辺（midpiece）及び先体帽に、より少量存在していた。ＩＶＦ培地の成分の一部はＧ−タンパク質結合受容体を通じて作用することが知られていることから、これらの効果はｔｍＡＣを介して調節されている可能性が高い（Baxendale, R.W. and Fraser,L (2003) Mol. Reprod. and Dev. 66, 181-189）。

ｓｏｌＡＣ、腫瘍学、炎症及びその他のプロセス
ｃＡＭＰは、細胞増殖、細胞分化及びアポトーシスに影響を及ぼす信号伝導経路に関与している。これらの経路における異常は、ガン等の病態を招くことが知られている。例示される様々なガンとしては、本明細書の第Ｇ（vii）節において後述するものが挙げられる。即ち、ｓｏｌＡＣの活性の上昇又は降下によるｃＡＭＰ濃度の調節は、治療又は予防のためのレバーと見なすことができる。

近年の研究は、ｓｏｌＡＣ ＴＮＦ誘導性の好中球活性化及びＮＧＦ媒介性の神経突起生成が、グアノシントリホスファターゼＲａｐ−１のｃＡＭＰ依存性調節を介していることを示している（Han, H., Stessin, A.M., Roberts, J., Hess, K.C., Gautam, N., Kamenetsky, M., Lou, O., Hyde, E., Nathan, N., Muller, W.A., Buck, J., Levin, L.R., and Nathan, C. (2005) J. Exp. Med., 202, 353-361; Stessin, A.M., Zippin, J.H., Kamenetsky, M., Hess, K.C., Buck, J., and Levin, L.R. (2006). J. Biol. Chem., 10, 1074）。従って、ｓｏｌＡＣの活性化又は抑制による、これらの過程の下流調節は、治療に有用である可能性がある。

ＴＮＦの過剰産生又は未制御産生が、数々の炎症性の疾患及び症状を媒介し、又は増悪させることが指摘されてきた。例としては、リウマチ様関節炎（Maini et al., APMIS, 105(4): 257-263）、リウマチ様脊椎炎、変形性関節炎、痛風性関節炎、及びその他の関節炎症状；敗血症、敗血症ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、毒素性ショック症候群、成人呼吸窮迫症候群、脳マラリア、慢性肺炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease：ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（acute respiratory distress syndrome：ＡＲＤＳ）、喘息、肺線維症及び細菌性肺炎、珪肺症、肺サルコイドーシス、骨吸収病、再灌流傷害、移植片対宿主反応、同種移植片拒絶、感染による発熱及び筋肉痛、例えばインフルエンザ、単純ヘルペスウイルス１型（herpes simplex virus type-1：ＨＳＶ−１）、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水疱瘡ウイルス（varicella−zoster virus：ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（Epstein−Barr virus：ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス−６（human herpes virus-6：ＨＨＶ−６）、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８、仮性狂犬病、感染又は悪性病変に続発する鼻気管炎及び悪液質、後天性免疫不全症候群（acquired immune deficiency syndrome：ＡＩＤＳ）に続発する悪液質、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）、ケロイド形成、瘢痕組織形成、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は胸焼け（pyresis）が挙げられる。ｓｏｌＡＣ阻害剤はＴＮＦ産生によって生じる効果を抑制することから、上に列記した疾病の治療に有用であると予想される。

更にｃＡＭＰは、眼房水形成（緑内障）及び膵臓の島細胞（糖尿病）からのインシュリン分泌を刺激することが知られている。何れの過程も重炭酸塩濃度によって調節されることから、ｓｏｌＡＣとの直接的な関連が示唆される。

タンパク質結晶化
タンパク質化学の分野ではよく知られているように、タンパク質の結晶化は、不確実且つ困難なプロセスであり、明確な成功への期待はない。今のところ、タンパク質構造を決定する上で、タンパク質の結晶化が最大のハードルであるのは明らかである。こうした理由から、タンパク質の結晶化は研究課題を伴い、或いはそれ自体が研究課題となってきており、タンパク質結晶学者の実験室の延長には留まらない。タンパク質結晶を成長させる作業に伴う困難性を記した参考文献は多数存在する（Kierzek AM. and Zielenkiewicz P. (2001) Biophysical Chemistry, 91, 1-20 Models of protein crystal growth; Wiencek JM (1999) Annu Rev Biomed Eng., 1, 505-534 New Strategies for crystal growth; Service, R., Science (2002) Nov 1;298, 948-50 Structural genomics. Tapping DNA for structures produces a trickle; Chayen N., J Struct Funct Genomics (2003) 4 (2-3) 115-20 Protein crystallization for genomics: throughput versus output）。

Wiencekは、タンパク質構造決定に適した上質のタンパク質単結晶を作製するための、合理的な方法論及びプロトコルの必要性を強調するとともに、タンパク質結晶化のための基礎的なアプローチの不在が、通常は構造決定における律速段階となっていることを指摘している。合理的なアプローチの必要性に関連して、タンパク質の溶解性、核生成、及び結晶成長に影響を及ぼす変数についての議論がなされている。こうした変数としては、例えば温度、圧力、ｐＨ、電解質、反溶媒（antisolvents）、及び可溶性合成ポリマーが、タンパク質の溶解性に及ぼす影響などが挙げられる。様々な物理化学的手法（例えばレーザー光散乱、Ｘ線散乱、Ｘ線回折、及び原子間力顕微鏡法等）と、結晶成長及び核生成速度の研究におけるそれらの使用が報告されるとともに、様々な結晶成長法、例えば蒸気拡散、自由界面拡散、透析、回分成長、及びシーディングの手法が記載されている。タンパク質結晶の質と、それに影響を及ぼす変数の測定についても記載されている。Wiencekは以下のように結論付けている。タンパク質結晶化については未だに多くが不明のままであるが、構造生物学の大部分はタンパク質分子を結晶化する能力に掛かっている以上、タンパク質結晶化の理解に根本的な進歩が生じれば、それはタンパク質結晶学そのものを超えた分野に様々な影響を及ぼすであろう。

同様に、Kierzek等は、タンパク質結晶化の物理化学的側面が分かっていない以上、規則性の高い大きなタンパク質結晶を成長させることは、依然としてＸ線結晶学によるタンパク質構造決定の最大の障害となっている、との認識を示している。タンパク質結晶成長についてこれまで採取された実験データを解釈するためのモデルを作製する努力について概説した上で、それでもなお、課題があまりにも複雑になってしまうため、満足のいくタンパク質結晶化のモデルは存在しないと述べている。即ち、結晶化プロセスは、時間及び空間の何れの尺度においても桁数の範囲が広く、殆どのコンピュータシミュレーションのアプローチでは扱うことができないからである。Kierzek等は結論として、結晶成長の分野で現在検討されている多種多様なアプローチをある程度統一するためには、実験的な方法及び理論的な方法の両面において更なる進展が必要であろう、と述べている。

Service（同）は、タンパク質の結晶化及び構造決定に伴う課題について論じている。一例として挙げられているのは、米国で開始された、タンパク質の結晶化に伴う数多くの工程を自動化することにより、構造決定プロセスの迅速化を図ろうとするパイロット・プロジェクトである。このプロジェクトは、プロセスの各段階において困難に遭遇している。構造決定の目標として挙げられた１８７０種のタンパク質のうち、タンパク質構造の作製が完了したのは僅か２３種に過ぎない。Serviceによれば、他のプロジェクトの結果も似たようなものであり、世界中の様々な構造ゲノム学プロジェクトで目標とされた約１８，０００種のタンパク質のうち、構造が解明されたタンパク質は約２００種ほどに留まっている。更に本論説は、構造決定プロセスにおける異なる幾つかの点に着目し、それらが何れも課題を孕んでいることを指摘している。プロセスの出発点、即ち大腸菌（E. Coli）や他の宿主細胞に適切なタンパク質を発現させ、それを可溶型にすることが、最大の課題の１つであると述べている。次に、タンパク質がＸ線研究に適した結晶を形成するようにする作業に伴う課題について論じている。結晶化とそれに続く結晶の最適化も、本プロセスの大きな課題であると述べている。実のところ、本論説が述べるところによれば、核工程において大幅な減耗が生じる。たとえ結晶が得られたとしても、その結晶の構造を解析しなければならない。それは定型的な作業ではなく、また、成功が期待又は予測できるものでもない。ＮＩＳＧＣコンソーシアム（NISGC consortium）による論説で例証されている。結晶化及び構造決定の対象となったタンパク質の数に比して、実際にクローン化され、更に可溶性タンパク質として発現されたタンパク質の数は少ない。その後の更なる精製は必ずしも可能ではなく、精製できた場合でも、精製タンパク質の僅かな画分が結晶化されたに過ぎない。その場合でも、Ｘ線結晶学によるタンパク質構造決定に適した上質なタンパク質単結晶を結晶化により生成したのは、これらのタンパク質のうちのごく僅かな量に過ぎなかった。５１８７種の標的タンパク質のうち、コンソーシアムのメンバーがクローン化したものは１６７５種、タンパク質として発現させたものは１２９５種であったが、その中で可溶性であったものは７７３種に過ぎなかった。そのうち７１９種のタンパク質について、コンソーシアムのメンバーが自ら精製を行なったが、結晶化できたのは僅か９４であった。現在までのところコンソーシアムのメンバーが構造を決定したのは５０種であるが、そのうちＸ線分析で決定されたものは２２種に過ぎない。

同様の図が、Chayen（同）にFigure 1 として掲載されている。Chayenは、構造ゲノム学に関わる多数の工程のうち結晶化工程に焦点を当て、Ｘ線結晶学による構造決定に適した上質なタンパク質結晶を作製することの困難性を論じている。この困難性こそが、作製されたタンパク質のうちほんの僅かのタンパク質しか、これまで構造決定されていないという事実の、主な原因である。

溶液からのタンパク質分子の結晶化が、タンパク質構造の決定プロセスにおける障害になっていると一般的に信じられている理由は多数存在する。タンパク質は複合体分子であり、他のタンパク質分子及び小分子との特異的及び非特異的な相互作用を伴う、溶液中での微妙な均衡を予測することは困難である。

タンパク質は各々、独自の条件の組合せの下で結晶化し、その条件の組合せを前もって予測することはできない。単にタンパク質を過飽和させて溶液から沈殿させるだけでは、結果として非晶質沈殿となってしまい、うまくいかない場合が多い。多数の沈殿化剤が使用されており、一般的なものとしては異なる塩や、ポリエチレングリコールが挙げられるが、他のものも知られている。更には、金属や界面活性剤（detergents）等の添加剤を加えて、溶液中のタンパク質の挙動を調節することもできる。多数のキットが入手可能であり（例えばHampton Research社製）、それらは結晶化空間内のパラメーターを可能な限り多数カバーしようとするものではあるが、それらは多くの場合、回折分析に適さない結晶性沈殿や結晶を最適化するための出発点となるに過ぎない。溶解性の点からみたタンパク質挙動、適切な折り畳み構造や活性を得るための金属イオンへの依存度、他の分子との相互作用、更には、入手可能な他の情報に関する知識があれば、結晶化を首尾よく実施するための。それでもタンパク質の結晶化は、時間のかかるプロセスと見なされる場合が多く、それゆえ、過去の試みの観察の上に、その後の実験が構築されている。

タンパク質結晶が得られた場合でも、それらは必ずしも回折分析に適したものではない。分解能に限界があるかも知れず、その後の改良によって、分析に必要な分解能で回折可能な結晶とすることは困難である。結晶の分解能の限界は、幾つかの因子によってもたらされる。例えば、結晶内におけるタンパク質の固有移動度が挙げられる。これは、他の結晶型を用いても、解消するのは困難である。また、結晶内の溶媒含量が高いことも挙げられる。これは結果として散乱の弱化を招く。或いは、結晶格子の欠陥も挙げられる。こうした欠陥があると、回折されるＸ線が格子内の単位相互間で完全には一致しないことになる。これらの因子の何れか１つ、又は複数の組合せがあると、その結晶は構造決定に適さないものとなる。

タンパク質の中には、決して結晶化しないものもある。妥当な試行の後、タンパク質自体を調べ、ドメインの分離、Ｎ又はＣ末端の切断の変更、又は点突然変異が可能か否かを検討する必要がある。タンパク質をどのように設計し直せば、結晶化能力を向上させることができるのか、予測が困難な場合が多い。適切な結晶を作製するためには、リガンドを結晶化混合物中に含有させることが重要な場合もある。結晶化機序に関する我々の理解は未だ不完全であり、結晶化に関与するタンパク質構造の因子についてはよく分かっていない。

本発明は、ヒト可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの結晶構造に関する。本結晶構造によれば、本酵素における基質及び補因子の結合部位を検討及び決定することが可能になる。

即ち、一態様によれば、本発明は表１に挙げる可溶性アデニル酸シクラーゼの三次元アポ（即ちリガンドを含まない）構造、及びその使用を提供する。

第二の態様によれば、本発明は表２に挙げる、更には表３、４及び５に挙げる、リガンド存在下における可溶性アデニル酸シクラーゼの３次元構造を提供する。

一般的な態様によれば、本発明はｓｏｌＡＣ構造と、リガンドの相互作用のモデリングにおけるその利用の提供に関する。リガンドの相互作用の例としては、潜在及び既存の医薬化合物又は他の分子構造、プロドラッグ、ｓｏｌＡＣ調節因子若しくは基質、又は、こうした化合物、調節因子若しくは基質の断片と、このｓｏｌＡＣ構造との相互作用が挙げられる。

上述の態様を含めた本発明の態様、及び本発明の実施形態について、以下で説明する。

上述した本発明の態様の各々、並びにそれら複数の組合せは、何れも本発明の有利な特徴に寄与するものである。

表の簡単な説明

表１は、ｓｏｌＡＣの構造の座標データを表わす表である。

表２は、ＡＭＰＣＰＰとの複合体における、ｓｏｌＡＣの構造の座標データを表わす表である。

表３は、重炭酸イオンとの複合体における、ｓｏｌＡＣの構造の座標データを表わす表である。

表４は、５−フェニル−２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−チオール（化合物１）との複合体における、ｓｏｌＡＣの構造の座標データを表わす表である。

表５は、Ｎ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸との複合体における、ｓｏｌＡＣの構造の座標データを表わす表である。

表６：ｓｏｌＡＣの活性部位残基。

表７：アデノシン部分と相互作用するｓｏｌＡＣの活性部位残基。

表８：ｓｏｌＡＣの重炭酸イオン塩結合部位。

表９：ｓｏｌＡＣのチャネル結合部位。

表１０：ｓｏｌＡＣの基質ポケット（Sub-pocket）結合部位。

表１１：ｓｏｌＡＣの代替結合部位残基。

表１２：哺乳類の可溶性アデニル酸シクラーゼの全長配列間のパーセンテージ同一性。

表１３：哺乳類の可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメイン間のパーセンテージ同一性。

表１４：ｓｏｌＡＣ発現コンストラクト。

表１５：ｓｏｌＡＣ溶解バッファー（lysis buffers）。

表１６：ｓｏｌＡＣ構造の解明に使用した重原子誘導体。

定義
選択座標
本明細書に記載される本発明の様々な態様（例えばリガンドの適合（fitting）、相同性モデリング及び構造解、データ記憶手段、コンピュータを用いた座標の操作等）は、表１、表２、表３、表４又は表５に記載されたｓｏｌＡＣ構造の座標、又は表１、表２、表３、表４又は表５から導かれる座標、又は表１、表２、表３、表４又は表５の座標を基準として得られる座標を利用する。本発明のかかる態様の何れにおいても、当業者には明らかなように、本発明の多くの適用分野では、表１、表２、表３、表４又は表５の座標の全てを使用する必要はなく、その中の一部、例えば、特定の用途に関連して特に関心のある原子を表わす座標群を用いればよい。かかる一部の座標を、本明細書では「選択座標（selected coordinates）」という。

本発明において選択座標に触れる場合、それはｓｏｌＡＣ構造のうち、例えば少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０、より一層好ましくは少なくとも１００、例えば少なくとも５００、又は少なくとも１０００のタンパク質原子を指す。中でも、選択座標は、少なくとも３０の異なるアミノ酸残基に属する（即ち、３０の異なる残基に由来する原子が少なくとも１つずつ存在する）ことが好ましく、より好ましくは少なくとも６０の残基、より一層好ましくは少なくとも１００又は１５０の残基に属することが好ましい。選択座標は任意により、表１、表２、表３、表４又は表５に記載された１又は２以上のリガンド又は水分子の原子を含んでいてもよい。

アデニル酸シクラーゼは通常、２ドメイン構造を有し、これら２つのドメインは相互に高い構造相同性を示し、偽二量体（pseudo-dimer）に類似した構造を有する。可溶性アデニル酸シクラーゼと最も近似しているのはシアノバクテリアのクラスIII アデニル酸シクラーゼであるが、これは対称性のホモ二量体として機能する。ホモ二量体の二つの単量体、或いは偽二量体の２つのドメインは、その活性部位の内容に応じて、互いに異なる向きに配向する場合がある。従って、選択座標はＮ末端ドメイン（残基１〜２４６）の座標のみであってもよく、Ｃ末端ドメイン（残基２４７〜４６８）の座標のみであってもよい。

別の態様によれば、選択座標は、以下に記載するｓｏｌＡＣの活性部位に寄与する主鎖又は側鎖原子として発明者等が同定したアミノ酸残基、特に表６のアミノ酸残基（とりわけ表７のアミノ酸残基の何れか）のうち、１又は２以上の残基の原子からなるか、或いはこれらの原子を含んでいてもよい。

好ましい実施形態によれば、選択座標が表６に規定される残基からなる群、より好ましくは表７に規定される残基からなる群から選択される原子を少なくとも１つ含有する場合、この選択座標は、これらの好ましい群のアミノ酸のうち、少なくとも２種のアミノ酸、例えば少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種、より一層好ましくは少なくとも５種、最も好ましくは全てのアミノ酸に由来する原子を、少なくとも１つ含有する。中でも、選択座標はこれらの残基群由来の原子を少なくとも１０、より好ましくは２５、より好ましくは５０含んでなると共に、その群の各要素に由来する原子を少なくとも１つずつ含有することがより好ましい。

別の態様によれば、選択座標は、表８、９、１０又は１１のうち何れかのアミノ酸残基のうち、１又は２以上のアミノ酸残基原子からなるか、或いはこれらの原子を含んでいてもよい。別の実施形態によれば、選択座標が表８、９、１０又は１１のうち何れかに規定される残基の群に由来する原子を少なくとも１つ含有する場合、この選択座標は各表のアミノ酸のうち、少なくとも２種のアミノ酸、例えば少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種、より一層好ましくは少なくとも５種、最も好ましくは全てのアミノ酸から、少なくとも１つの原子を含有する。中でも、選択座標はこれらの残基群から、少なくとも１０、より好ましくは２５、より好ましくは５０の原子を含有すると共に、これらの表の何れかに記載された群の各要素から少なくとも１つの原子を有することがより好ましい。

或いは、選択座標は表６から１１のうち何れか、又は全てから、少なくとも１０、より好ましくは２５、より好ましくは５０の原子、例えば少なくとも１００の原子を含んでいてもよい。

一態様によれば、選択座標は、表６から選択されるアミノ酸残基（例えば表７の残基）の１又は２以上の座標とともに、表８、９、１０又は１１の何れかから選択されるアミノ酸残基の１又は２以上の座標を含有していてもよい。一態様によれば、選択座標は少なくとも表６（好ましくは表７）からのものと、表８からのものとの組合せである。かかる選択座標群は、ＡＴＰ及び重炭酸イオンの結合部位を占有するリガンドの設計、開発及び分析において、とりわけ有利な場合がある。

別の態様によれば、表８の残基の好ましい下位集合としては、Ｌｙｓ９５、Ｖａｌ１６７及びＡｒｇ１７６が挙げられる。本明細書記載の本発明の態様のうち、表８のアミノ酸残基の座標の使用と関連する態様においては、これらの下位集合残基からの座標を使用することも考えられる。更に、特異的なリガンド相互作用を有することが特定されている原子の座標（表１の１５２５、２５８５、２６００、２７２９；表２の１５２５、２５８８、２６０３及び２７３２；表３の９３７、１５０５、１５０８及び１５７８；表４の１５１６、２６７８、２６９２及び２８２１；表５の１５１６、２６７０、２６８４及び２８１３の原子）を使用することも考えられる。

別の態様によれば、表９の残基の好ましい下位集合としては、Ｈｉｓ１６４, Ｐｈｅ１６５及びＶａｌ３３５が挙げられる。本明細書記載の本発明の態様のうち、表９のアミノ酸残基の座標の使用と関連する態様においては、これらの下位集合残基からの座標を使用することも考えられる。更に、特異的なリガンド相互作用を有することが特定されている原子の座標（表１の２５３６、２５４６、２５６５及び５２９５；表２の２５３９、２５４９、２５６８及び５２９８の原子；表３の１４８２、１４８６、１４８９、及び２８６６の原子；表４の２６２８、２６３９、２６５７、及び５４１３の原子；表５の２６２０、２６３１、２６４９、及び５３９２の原子）を使用することも考えられる。

更なる態様によれば、選択座標は、ｓｏｌＡＣが有するもう１つの、部分的にヘリカルなドメインのアミノ酸残基のうち、１又は２以上のアミノ酸残基の原子からなるか、或いはこれらの原子を含んでいてもよい。このドメインは、ｔｍＡＣと比較した場合に、このｓｏｌＡＣに特有であると思われる。即ち、選択座標は、Ｍｅｔ１からＴｙｒ２６、又は、Ｌｙｓ２１９からＧｌｙ２８４の残基の原子を、少なくとも１つ含有していてもよい。中でも、選択座標は、Ｉｌｅ１３からＨｉｓ１９、Ｐｈｅ２２６からＰｈｅ２３６、Ａｓｐ２５８からＴｙｒ２６８、又はＧｌｕ２７１からＩｌｅ２７７の残基の原子を、少なくとも１つ有することが好ましい。かかる場合、選択座標は、これらの好ましい座標のうち、少なくとも２種のアミノ酸、例えば少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種、より一層好ましくは少なくとも５種、例えば少なくとも１０種、最も好ましくは全てのアミノ酸から、少なくとも１つの原子を含有することがより好ましい。更に、選択座標は、この残基群から少なくとも１０、より好ましくは２５、より好ましくは５０の原子を含んでなると共に、当該原子が前述の好ましい番号の異なるアミノ酸に由来することがより好ましい。

選択座標は、少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％のＣ−α原子を含有することが好ましい。この代わりに、或いはこれに加えて、選択座標は少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、より一層好ましくは少なくとも約３０％の、窒素、Ｃ−α、Ｃ末端、及びカルボニル酸素原子の任意の組合せから選択される骨格原子を含有する。

即ち、本明細書において以下に言及される「選択座標」とは、別途明示した場合を除き、何れも上述の定義に沿って解すべきである。

二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）
タンパク質の構造類似性は通例、二乗平均平方根偏差（root mean square deviation：ｒｍｓｄ）により表記及び測定される。これは二つの原子群の間における、空間的な配置の違いを測るものである。ｒｍｓｄは、最適重畳後における等価原子間の距離を表わす。ｒｍｓｄの計算は、全原子について、残基骨格原子（即ち、タンパク質アミノ酸残基の窒素−炭素−炭素骨格原子）について、主鎖原子のみ（即ち、タンパク質アミノ酸残基の窒素−炭素−酸素−炭素骨格原子）について、側鎖原子のみについて、或いはより一般的には、Ｃ−α原子のみについて行なうことができる。

タンパク質構造を比較する方法については、Methods of Enzymology, vol 115, pg 397-420に記載されている。ｒｍｓｄを計算するために必要な最小二乗代数については、Rossman及びArgosによって与えられたが（J. Biol. Chem., vol 250, pp7525 (1975)）、より高速な方法が、Kabsch（Acta Crystallogr., Section A, A92, 922 (1976); Acta Cryst. A34, 827-828 (1978)）、Hendrickson（Acta Crystallogr., Section A, A35, 158 (1979)）、McLachan（J. Mol. Biol., vol 128, pp49 (1979)）及びKearsley（Acta Crystallogr., Section A, A45, 208 (1989)）によって開示されている。アルゴリズムによっては逐次法を使用するものもある。これは一の分子を他の分子に対して相対的に移動させるものであり、例えばFerro及びHermansによって説明されている（Ferro and Hermans, Acta Crystallographic, A33, 345-347 (1977)）。他の方法として、例えばKabschのアルゴリズムは、適合度（best fit）を直接探索するものである。

ｒｍｓｄを決定するプログラムとしては、MNYFIT（プログラム集COMPOSERの一部、M.J., Haneef, I., Carney, D. and Blundell, T.L. (1987) Protein Engineering, 1, 377-384）、MAPS（Lu, G. An Approach for Multiple Alignment of Protein Structures (1998, in manuscript and on http://bioinfo1.mbfys.lu.se/TOP/maps.html)）が挙げられる。

顕著に異なる座標群を比較する場合には、Ｃ−α原子のみについてｒｍｓｄ値を計算するのがより一般的である。しかしながら、側鎖の運動を分析する場合には、全原子についてのｒｍｓｄを算出してもよい。

ｒｍｓｄ値の算出には、例えばLSQKAB（Collaborative Computational Project 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, Acta Crystallographica, D50, (1994), 760-763）、QUANTA（Jones et al., Acta Crystallography A47 (1991), 110-119、Accelrys, San Diego, CAより市販）、Insight（Accelrys, San Diego, CAより市販）、Sybyl（登録商標）（Tripos, Inc., St Louis より市販）、O（Jones et al., Acta Crystallographica, A47, (1991), 110-119）、及び他の座標フィッティングプログラム等のプログラムを使用することができる。

例えばLSQKABやO等のプログラムによれば、計算のために対合させる２つのタンパク質の残基を、ユーザーが定義することができる。或いは、残基の対合は、２つのタンパク質の配列アラインメントを生成することにより行なうこともできる。配列アラインメント用プログラムについては、セクションＤでより詳細に論じる。その後、このアラインメントに従って原子座標を重畳し、ｒｍｓｄ値を算出することができる。Sequoia（C.M. Bruns, I. Hubatsch, M. Ridderstrom, B. Mannervik, and J.A. Tainer (1999) Human Glutathione Transferase A4-4 Crystal Structures and Mutagenesis Reveal the Basis of High Catalytic Efficiency with Toxic Lipid Peroxidation Products, Journal of Molecular Biology 288(3): 427-439）は、相同タンパク質配列のアラインメントと、相同タンパク質の重畳とを行なう原子座標プログラムである。アラインメントの後、上述したプログラムを使用して、ｒｍｓｄを算出することができる。配列が同一、或いは同一性が高い場合、タンパク質の構造アラインメントは手作業で行なってもよく、上記概略のように自動で行なってもよい。もう１つのアプローチとしては、配列を考慮することなく、タンパク質原子座標の重畳を生成することも考えられる。

本明細書に記載した本発明の様々な態様では、表１、表２、表３、表４又は表５の全座標又は選択座標の使用が示される。同様に、表１、表２、表３、表４又は表５の全座標又は選択座標の使用によって得られる、或いは表１、表２、表３、表４又は表５の全座標又は選択座標から誘導される、構造及びそれらの使用についても示される。かかる態様において、表の座標は、ｒｍｓｄが１．５Å以下、好ましくは１．４Å以下、より好ましくは１．２Å以下、より好ましくは１．０Å以下、例えば好ましくは０．７Å以下、より好ましくは０．５Å以下、より好ましくは０．２Å以下、より一層好ましくは０．１Å以下の範囲内で異なっていてもよい。

従って、本明細書における表１、表２、表３、表４又は表５の座標に関する言及は、異なる旨の明示がない限り、何れも１．５Å以下のｒｍｓｄ変分（好ましくは上記段落に記載された変分）を含むものとして解釈される。同様に、１．５Å以下未満のｒｍｓｄ変分の値に関する言及も、上記段落に記載された好ましい（より狭い）範囲を含むものとして解釈される。誤解を避けるために言えば、本明細書において当該１．５Å以下よりも小さい具体的な数値未満のｒｍｓｄ値に言及する場合、その具体的な数値以下の、上述した好ましい（より狭い）範囲を含むものとして解釈されるべきである。

ｒｍｓｄは、Ｃ−α原子を基準として計算することが好ましい。但し、選択座標を使用する場合には、かかる原子を少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％含んでなることを条件とする。選択座標がかかる原子を少なくとも約５％含んでいない場合には、ｒｍｓｄは４種の骨格原子全てを基準として計算してもよい。但し、これらは選択座標を少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％含んでなることを条件とする。選択座標が側鎖原子を９０％以上含んでなる場合には、全選択座標を基準としてｒｍｓｄを計算してもよい。

リガンド
本明細書で使用する限り、リガンドとは、本発明のｓｏｌＡＣ構造に結合し、或いは当該ｓｏｌＡＣ構造と相互作用する可能性を有する１又は２以上の原子を含んでなる、仮想又は現実の構造を指す。かかる原子としては、有機分子内に存在する原子、例えば炭素、酸素、水素、窒素、リン、及び硫黄、更には生物系に一般に存在する金属イオン、例えば鉄、カルシウム、マグネシウム、マンガン、セレン等が挙げられる。

本発明で使用されるリガンドは、本技術分野において３次元構造が入手可能な（例えば２５０，０００を超える分子構造を格納するCambridge Structural Database（www.ccdc.cam.ac.uk）から入手される）小化学分子でもよく、或いは具体的な構造又はその他の基準に基づいてその構造が設計又は選択されたリガンドでもよい。これらの構造や他の構造を用いれば、例えば、ｓｏｌＡＣと相互作用してその機能を調節（例えば活性化又は阻害）する新規化合物の開発におけるリガンドのスクリーニングを目的として、本発明を実施することができる。当業者には明らかなように、仮想分子の形態のリガンドを、１又は２以上のタンパク質原子における本発明のｓｏｌＡＣ構造と相互作用するように作成したとしても、現実の化合物とｓｏｌＡＣとの間にかかる相互作用が生じるとは限らない。

ｓｏｌＡＣの触媒ドメインの１又は２以上の原子に結合し、或いは当該原子と相互作用するリガンドは、特に興味深い。リガンドは酵素の調節因子（例えば活性剤又は阻害剤）であってもよく、酵素の基質であってもよい。かかる基質の一例として、アデニル酸シクラーゼの作用により活性薬剤に変換されるプロドラッグが挙げられる。リガンド結合は通常（常にという訳ではないが）、非共有結合的な相互作用（水素結合等）により生じる。

当業者には明らかなように、コンピュータを用いた分析方法等の説明においてリガンドに言及する場合、リガンドとは仮想的な分子構造を指すが、他の文脈（例えばｓｏｌＡＣの結晶の浸漬等）においては、リガンドは化合物を指す。本発明の一部の態様によれば、リガンドをコンピュータモデリング法によって同定し、その後に化合物の形態として、更なる分析に供する。化合物の分析によれば、例えば浸漬又は共結晶化実験のように、更なるリガンドが生成する場合が多いが、これをその後に、本発明のコンピュータを用いた方法によって分析してもよい。

浸漬又は共結晶化に使用可能な候補リガンドは、様々な原料から得ることが可能である。例えば、アデニル酸シクラーゼ阻害剤の候補として開発されている化合物を用いてそのｓｏｌＡＣとの相互作用を確認し、その活性を強化するか、或いは調節するようにリガンドを修飾してもよい。かかるリガンドとしては、更に以下で説明するアデニンヌクレオチド類似体が挙げられる。

或いは、数々の合成化合物ライブラリが、Maybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, N.J.）、Brandon Associates（Merrimack, N.H.）、及びMicrosource（New Milford, Conn.）等の各社から市場で利用可能とされている。また、レアケミカルライブラリ（rare chemical library）がAldrich（Milwaukee, Wis.）から利用できる。組合せライブラリも利用可能であり、また、作製することもできる。或いは、細菌、真菌、植物及び動物性の抽出物の形態における天然化合物のライブラリも、例えばPan Laboratories（Bothell, Wash.）やMycoSearch（N.C.）が利用可能であり、更には本技術分野で周知の方法により容易に作成することが可能である。例えば動物、細菌、真菌、植物源（葉や樹皮）、及び海洋資料等の天然源から単離された化合物を候補として、有用な可能性がある医薬品の存在についてアッセイを行なうことも提案される。当然のことながら、スクリーニングの対象となる医薬品は、化学組成物や人工の化合物から誘導又は合成したものでもよい。

特に興味深いリガンドとしては、医薬用途で開発中の化合物であろう。通常、かかるリガンドは有機分子であり、その分子量は一般的に約１００から２０００Ｄａ、より好ましくは約１００から１０００Ｄａである。かかるリガンドの例としては、ペプチド及びその誘導体、ステロイド、抗炎症剤、抗ガン剤、抗細菌又は抗ウイルス剤、神経学的薬剤（neurological agents）等が挙げられる。基本的には、製薬分野において開発中の任意の化合物を本発明に使用することにより、その開発の容易化が可能となり、或いはその特性を改善するための更なる合理的薬物設計が可能となる。

興味深い他のリガンドとしては、アデニンヌクレオチド及びその類似体が挙げられる。アデニンヌクレオチドは、アデノシンのリン酸エステルの何れか、即ち、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）、ＡＤＰ、及びＡＴＰの何れかである。

アデニンヌクレオチドの類似体とは、アデニンヌクレオチドの特徴的な構造を保持する任意の化合物、例えば当該ヌクレオチドの断片や当該ヌクレオチドの分子変異体であって、ｓｏｌＡＣのＡＴＰ結合ポケットに結合可能なものをいう。特徴的な構造（characteristic structure）とは、前記類似体が、プリン塩基構造、糖残基、及び一、二又は三リン酸エステル構造、又はそれらの類似構造のうち、１又は２以上を含んでなることを表わす。

アデニンヌクレオチドの断片としては、アデノシンのリン酸エステルのうち何れかの分子断片であって、ｓｏｌＡＣのＡＴＰ結合ポケットに結合する能力を有する断片が挙げられる。即ち、アデニンヌクレオチドの断片の例としては、アデニン（塩基）、アデノシン（ヌクレオシド）、リボース（糖）、及び、リボースのリン酸エステルの何れか（例えばリボース５’一リン酸、リボース５’二リン酸、及びリボース５’三リン酸の何れか）が挙げられる。

アデニンヌクレオチドの分子変異体は、プリン塩基構造がアデニン誘導体、例えば８位置換アデニン（例えば、ハロゲン原子により得られる８−ブロモＡＴＰや８−ブロモＡＭＰ、又はアルキル基による置換体等）であってもよく、或いは環がヘテロ原子を含んでいてもよく、或いは塩基がＺＭＰ（ＡＩＣＡリボシド一リン酸）等の開環類似体であってもよい。これらに加えて、或いはこれらの代わりに、糖残基構造が、例えば２’又は３’ヒドロキシル基の修飾（例えば他の基による置換又はこれらの基の環化）を受けたものであってもよい。更には、リン酸エステル部分の修飾によって形成された非加水分解性基を、例えばγ及びβリン酸の間（例えばアデノシン−５'−［（β,γ）−イミド］三リン酸、ＡＭＰＰＮＰ）、或いはβ及びαリン酸の間（例えばアデノシン−５'−［（α,β）−メチレノ］三リン酸、ＡＭＰＣＰＰ）に有する類似体であってもよい。極めて多様な類似体が様々な製造業者から市販されている（例えばJena Bioscience GmbH（Jena, Germany））。加えて、様々なアデニンヌクレオシド類似体が臨床上も（特に抗ウイルス分野で）使用されている。例えばビダラビン（別名アデニンアラビノシド又はara−Ａ）は、ウイルス性ポリメラーゼを標的としてヘルペスウイルスの治療に使用されるアデニンヌクレオシド類似体であり、９−（３−Hydroxy−２−phosphonyl−methoxypropyl）−アデニン（別名ＨＰＭＰＡ）は抗ＨＩＶ活性を有するアデニン誘導体である（Pauwels, R.; Balzarini, J.; Schols, D.; Baba, M.; Desmyter, J.; Rosenberg, I.; Holy, A.; De Clercq, E., Phosphonylmethoxyethyl Purine Derivatives, A New Class Of Anti-Human Immunodeficiency Virus Agents. Antimicrob Agents Chemother 32(7):1025-1030 (1988)）。これらの一部はインビボでリン酸化されて三リン酸になる。

アデニンヌクレオチド及びその類似体をリガンドとして、更に修飾を加えてそのｓｏｌＡＣとの相互作用を増加又は低減することにより、例えば新規の医薬化合物の開発に使用してもよい。

リガンドは、重炭酸又は二硫化物に類似する部分を有する化合物であってもよい。このような部分は、ｓｏｌＡＣ原子のうち重炭酸結合に関与する１又は２以上の原子に配位する能力を有する。

Ａ．タンパク質結晶
本発明は、ヒト可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの結晶を提供する。

更なる態様によれば、本発明は、配列番号３の残基１から４６８を含んでなる可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの結晶、或いは１から１０のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を伴うその変異体の結晶を提供する。かかる結晶が有する配列番号３の配列は、Ｈｉｓ６タグを除く配列であってもよく（即ち配列番号３の１から４６９）、Ｈｉｓ６タグが４から２０のアミノ酸を有するタグで置換されていてもよい。かかるタグが有するヒスチジン残基の数はより少数でも、或いはより多数でもよく、例えばＨｉｓ４、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ７又はＨｉｓ８タグでもよい。本結晶は、配列番号３の残基１〜４６８のアレル又は変異体であって、本明細書に示す条件の下で結晶を形成する能力を保持するものを含んでいてもよい。かかる変異体としては、複数のアミノ酸置換を有するもの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸が、同数又はより少数のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。更なる変異体の例については、突然変異体も含め、本明細書の以下の記載で更に論じる。

一実施形態によれば、上述した本発明の結晶は、単位格子次元ａ＝ｂ＝９９．５Å、ｃ＝９７．４Å、及びα＝β＝９０．０°、γ＝１２０．０°の空間群Ｐ６₃を有する。単位格子次元は５％の変動を有していてもよい。即ち、具体例としては、ａ＝ｂ＝９９．５１Å、ｃ＝９７．１３Å；ａ＝ｂ＝９９．４２４Å、ｃ＝９７．３９０Å（表１に示す）；ａ＝ｂ＝９９．６５１Å、ｃ＝９６．５２２（表２に示す）；ａ＝ｂ＝９９．６７３Å、ｃ＝９６．８２４（表３に示す）；ａ＝ｂ＝９９．５６９Å、ｃ＝９８．４７０（表４に示す）；ａ＝ｂ＝９９．２９１Å、ｃ＝９７．７５３（表５に示す）が挙げられる。

より一般的には、単位格子結晶次元は、１０４．４７５Å＞ａ＝ｂ＞９４．５２５Å、１０２．２７Å＞ｃ＞９２．５３Åの範囲である。

かかる結晶は、後述の実施例に記載の方法を用いて得ることができる。

本発明は、活性部位結合リガンドの不在下で成長させたｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶を提供する。従って、本発明は更に、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインのアポ結晶を包含する。

本明細書に示すｓｏｌＡＣ結晶又は共結晶を提供するのに使用される方法論としては、約３．５Å又はより優れた分解能で分解可能なｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶又は共結晶を得るのに一般に使用される方法論が挙げられる。

即ち、本発明は更に、３．５Å又はより優れた分解能を有する、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶又は共結晶を提供する。

更なる態様によれば、本発明はｓｏｌＡＣ触媒ドメインのタンパク質結晶、特にｓｏｌＡＣの触媒ドメインの配列を含んでなるｓｏｌＡＣタンパク質又はその変異体の結晶を作製する方法であって、懸滴蒸気拡散により結晶を生長させる工程を含んでなる方法を提供する。

本発明の更なる態様によれば、リガンドが浸漬されたｓｏｌＡＣ触媒ドメインが提供される。

更に、本発明は、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインとリガンドとの複合体の結晶を作製する方法であって、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶を取得する工程と、その中にリガンドを浸漬する工程を含んでなる方法を提供する。

（ｉ）突然変異体
突然変異体は、野生型ｓｏｌＡＣの少なくとも１のアミノ酸が置換（replacement）、挿入又は欠失してなることを特徴とする、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインタンパク質をいう。かかる突然変異体は、例えば、部位特異的な突然変異誘発、或いは天然又は非天然アミノ酸の導入等によって調製することができる。

本発明で「突然変異体（mutants）」を考慮する場合、「突然変異体」とは、天然又は合成ｓｏｌＡＣの少なくとも１のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することにより、及び／又は、天然ポリペプチド中のアミノ酸残基、又はｓｏｌＡＣに相当するポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、付加及び／又は欠失を加えることにより得られたポリペプチドであって、その元となったｓｏｌＡＣと実質的に同じ３次元構造を有するポリペプチドを指すものとする。実質的に同じ３次元構造を有するとは、表１、表２、表３、表４又は表５の座標からの二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）が約１．５Å未満の原子構造座標群を有することを指す。

突然変異体は、酵素又は触媒活性を有していてもよいが、必ずしも有する必要はない。

相同体又は突然変異体を作製するために、当該タンパク質に存在するアミノ酸を、同様の特性（例えば疎水性、疎水性モーメント、抗原性、α−ヘリックス構造又はβシート構造を形成又は中断する性向等）を有する別のアミノ酸と置換してもよい。タンパク質の置換変異体とは、タンパク質配列内の少なくとも１のアミノ酸が除去されて、異なる残基が代わりに挿入されたものである。アミノ酸置換は通常は１の残基であるが、例えば結晶接点等の機能的な制約がある場合は、クラスター化していてもよい。アミノ酸の置換は、保存アミノ酸の置換を含んでなることが好ましい。挿入アミノ酸変異体は、１又は２以上のアミノ酸が導入されたものである。これはアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合でも、配列内導入でもよい。アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合の例としては、親和性タグ（例えばＭＢＰ又はＧＳＴタグ）、又はエピトープタグが挙げられる。

アミノ酸の置換、欠失及び付加がｓｏｌＡＣの３次元構造を顕著に妨害しないか否かは、その置換、付加又は欠失が生じるｓｏｌＡＣの領域に応じてある程度異なる。分子の高頻度可変領域においては、保存置換に加えて非保存置換も、分子の３次元構造を顕著に乱すことなく、許容される可能性がある。高保存領域、又は顕著な二次構造を含む領域では、保存アミノ酸置換が好ましい。

保存アミノ酸置換は本技術分野では周知であり、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は、両親媒性の類似性に基づいてなされる。例えば、負帯電アミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。正帯電アミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられる。非帯電極性頭部基を有するアミノ酸のうち、近似の親水価を有するものとしては：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。他の保存アミノ酸置換も本技術分野では周知である。

場合によっては、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加によって、ポリペプチドをコード化するｃＤＮＡ内に扱いに優れたクローニング部位を形成し、ポリペプチド等の精製を補助することが、特に有利であり、又は都合がよい場合がある。このような、ｓｏｌＡＣの三次元構造を実質的変更しない置換、欠失及び／又は付加については、当業者には明らかである。

上述したように、本明細書において考慮される突然変異体は、酵素活性を示す必要はない。実際に、ｓｏｌＡＣの触媒活性に影響を与えるものの、触媒領域の３次元構造を実質的には変更しないアミノ酸の置換、付加又は欠失については、本発明による具体的な考慮の対象となる。かかる結晶性ポリペプチド、又はそれから得られる原子構造座標を用いて、タンパク質に結合するリガンドを同定することが可能である。

突然変異のための残基は当業者であれば容易に特定可能であり、これらの突然変異は部位特異的突然変異誘発により導入することができる。例としては、Stratagene QuikChange^{（登録商標）}部位特異的突然変異誘発キット又はカセットによる突然変異誘発法の使用が挙げられる（例えばAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, and Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)参照）。

（ii）アレル
本発明で「アレル（alleles）」を考慮する場合、「アレル」とは、Bateson及びSaundersによって１９０２年に作成された、メンデル性遺伝において互いに代替的な関係にある形質を指す造語をいう。現在ではアレルという語は、異なる遺伝子産物を生じ、ひいては異なる表現型を生じる、１の遺伝子の２以上の代替形を指すために使用される。アレルは、転写、スプライシング、翻訳、転写後若しくは翻訳後修飾に影響を与え、又は少なくとも１のアミノ酸の変化を招くことが示されている、ヌクレオチドの変化を有する。通常、ｓｏｌＡＣのアレル変異体は、それに対応する、具体的に例示されたｓｏｌＡＣタンパク質との間に、少なくとも７５％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性）を有する。ここで、配列同一性は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、重複及び同一性が最大となるとともに、配列間隙が最小となるようにアライメントして、比較することによって決定される。より一般的には、アレル体は、野生型タンパク質と比較して１〜１０のアミノ酸の変化、特に１又は２のアミノ酸の変化、或いはＤＮＡ配列において１〜３０のヌクレオチドの変化を含んでなる。

本発明がｓｏｌＡＣ−リガンド複合体及び突然変異体、相同体、類似体、アレル体、ｓｏｌＡＣの種変異タンパク質に関する範囲において、かかるタンパク質の結晶を形成してもよい。かかる結晶の形成に、本明細書に示されるｓｏｌＡＣの結晶化のための条件を使用することができることは、当業者であれば認識し得るであろう。或いは、当業者であればこれらの条件を基礎として用い、かかる結晶を形成するべく修正を加えた条件を特定することができるであろう。

即ち、ｓｏｌＡＣの結晶に関する本発明の態様を、相同体、アレル体、及び種変異体を生じるｓｏｌＡＣの突然変異体結晶及び突然変異体に延長することも可能である。

（iii）ｓｏｌＡＣの精製
結晶化に十分な量のタンパク質を得るためには、ｓｏｌＡＣを高いレベルで発現及び回収するためのプロトコルを開発する必要があった。一実施形態によれば、本発明は、Ｃ末端又はＮ末端タグと融合されていてもよい、ｓｏｌＡＣ（例えば、配列番号３の残基１〜４６９を含んでなるｓｏｌＡＣ、又はその突然変異体若しくは変異体）を作製するための方法であって、
ｓｏｌＡＣを真核細胞培養物内で発現させる工程；
前記培養物の細胞を、１０〜１００ｍＭ トリス ｐＨ７．４〜８．０（４℃）、０．３〜０．５Ｍ ＮａＣｌ、０〜２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、及び２〜５ｍＭ ベータ−メルカプトエタノールを含んでなるバッファーで溶解させる工程；及び
前記培養物からｓｏｌＡＣを回収する工程を含んでなる方法を提供する。

より好ましくは、本方法は：
前記培養物の細胞を、４０〜６０ｍＭ トリス ｐＨ７．４〜７．６（４℃）、０．３〜０．４Ｍ ＮａＣｌ、５〜１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、及び２〜５ｍＭ ベータ−メルカプトエタノールを含んでなるバッファーで溶解させる工程；及び
前記培養物からｓｏｌＡＣを回収する工程を含んでなる。

より一層好ましくは、本方法は、当該細胞培養中での発現の後に：
前記培養物の細胞を、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５（４℃）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２〜５ｍＭ ベータ−メルカプトエタノールを含んでなるバッファーで溶解させる工程；及び
前記培養物からｓｏｌＡＣを回収する工程を含んでなる。

これら上述の方法において、前記真核細胞培養物としては、哺乳類又は昆虫の細胞培養が挙げられるが、特に昆虫の細胞培養物である。

一実施形態によれば、ｓｏｌＡＣがヒスチジンタグ（例えば約４から１０、例えば約６のヒスチジンを含んでなるタグ）残基を含んでなるとともに、ｓｏｌＡＣの回収が、タグがキレートカラムに結合する条件下でｓｏｌＡＣをキレートカラムに結合させた後、タンパク質をカラムから溶出させる工程を含有する。別の実施形態によれば、ｓｏｌＡＣはＧＳＴタグを有していてもよい。

また、本発明は、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５（４℃）、３３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、及び１ｍＭ ベータ−メルカプトエタノールを含んでなるバッファー中に、ｓｏｌＡＣ（特に配列番号３のｓｏｌＡＣ、又はその突然変異体又は変異体）を含んでなる組成物も提供する。好ましい実施形態によれば、ｓｏｌＡＣの濃度は１０から４０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０から４０ｍｇ／ｍｌである。これらの好ましい濃度において、ｓｏｌＡＣは単量体のまま維持されることが好ましい。

（iv）ｓｏｌＡＣの結晶化
ｓｏｌＡＣ触媒ドメインタンパク質の結晶を作製するために、バッファー（例えば５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、３３０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ベータ−メルカプトエタノール、及び１０％グリセロールを含んでなるバッファー）中の最終タンパク質は、市販の濃縮機器を用いて~８〜１５ｍｇ／ｍｌに濃縮される。

タンパク質の結晶化は懸滴又は静滴法により行なわれ、タンパク質は様々な蒸気拡散バッファー組成物に対して、４℃で蒸気拡散により結晶化される。微細種晶（Microseeding）を用いてもよい。慣例的には、懸滴又は静滴中、タンパク質溶液及び蒸気拡散バッファーは１：１の比率で使用される。本明細書では別途記載しない限り、この比率を使用した。懸滴又は静滴の体積は、通常約０．５から２μｌ、例えば約１から２μｌ、好ましくは１μｌである。また、結晶化はマイクロバッチ（microbatch）法で行なってもよい。

一般に、蒸気拡散バッファーは、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４．８、２００ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１４〜１７％ＰＥＧ４０００、１０％グリセロール、及び３ｍＭ ベータ−メルカプトエタノールを含んでなる。

結晶化の試行条件（trial conditions）は、Hampton Research スクリーニングキット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／イオンスクリーン、ＰＥＧグリッド、硫酸アンモニウムグリッド、ＰＥＧ／硫酸アンモニウムグリッド等を用いて調製することができる。

結晶化に影響を与えることが特定されている添加剤を結晶化条件に加えてもよい。予備結晶化条件の最適化の際には、添加剤スクリーン（Additive Screens）を使用してもよい。添加剤の存在によってサンプルの結晶化が促進されるとともに、添加剤によって結晶の質が向上する可能性があるからである。例としてはHampton Research Additive screensが挙げられる。これらは、グリセロール、ポリオール、及び、タンパク質結晶化におけるその他のタンパク質安定剤（R. Sousa. Acta. Cryst. (1995) D51, 271-277）、又は二価陽イオン（Trakhanov, S. and Quiocho, F.A. Protein Science (1995) 4,9, 1914-1919）を用いたものである。

更に、結晶化挙動を向上させるべく、界面活性剤を結晶化条件に加えてもよい。例としては、Hampton Research detergent screensにみられる、イオン性、非イオン性、及び両性イオン性の界面活性剤が挙げられる（McPherson, A., et al., The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins, J. Crystal Growth (1986) 76, 547-553）。

更に、種晶（seeding）法を用いることにより、結晶の質を向上させることもできる。例としては、マイクロシーディング（microseeding）、ストリークシーディング（streak seeding）、及びマクロシーディング（macroseeding）が挙げられる。市販の種晶調製キットを使用することができる。例としては、Hampton Researchから販売されているものが挙げられる。

Ｂ．結晶座標
更なる態様によれば、本発明は、表１の三次元原子座標を有する、可溶性アデニル酸シクラーゼ触媒ドメインの結晶を提供する。

表１は、非対称ユニット中に存在する可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの原子座標データである。これは原子１から７２７３を包含する分子Ａとして特定される。表の列中、２番目のカラムは原子番号を表わし、３番目のカラムは原子を表わし、４番目は残基の種類を表わし、５番目は鎖の特定（Ａ又はＢ）、６番目は残基番号、７番目、８番目及び９番目のカラムはそれぞれ、問題となる原子のＸ、Ｙ、Ｚ座標、１０番目は原子の占有率、１１番目は原子の温度因子、１２番目は原子の種類を表わす。

表における残りの原子（７２７４−８７２６）は水であり、その原子を上記と同様の書式で表わしている。

表１の原子座標により定義される構造の有利な特徴として、約１．７Åの分解能を有している点が挙げられる。表２の原子座標により定義される構造の有利な特徴として、約１．９Åの分解能を有している点が挙げられる。表３及び表４の原子座標により定義される構造の有利な特徴として、約２．０Åの分解能を有している点が挙げられる。表５の原子座標により定義される構造の有利な特徴として、約２．０５Åの分解能を有している点が挙げられる。

表１の原子座標により定義される構造の特別な利点としては、リガンドによって占有されていない活性部位を有する構造を画定している点が挙げられる。

更なる態様によれば、本発明は、表２に示す３次元構造を有する、ＡＭＰＣＰＰ分子との複合体の形態における可溶性アデニル酸シクラーゼ触媒ドメインの結晶を提供する。

表２は、ｓｏｌＡＣとＡＭＰＣＰＰとの複合体の原子座標である。ここで本タンパク質は番号１〜７２８９の原子を含んでなる分子Ａとして特定され、ＡＭＰＣＰＰ分子は番号７２９１〜７３３９の原子を含んでなり、カルシウムイオンは番号７３４０であり、残る番号７３４１〜８３０７の原子は水分子を表わす。表の列中、２番目のカラムは原子番号を表わし、３番目のカラムは原子を表わし、４番目は残基の種類を表わし、５番目は鎖の特定（Ａ又はＢ）、６番目は残基番号、７番目、８番目及び９番目のカラムはそれぞれ、問題となる原子のＸ、Ｙ、Ｚ座標、１０番目は原子の占有率、１１番目は原子の温度因子、１２番目は原子の種類を表わす。

表３はｓｏｌＡＣと重炭酸イオンとの複合体の原子座標データを表わす。分子Ａとして特定されるタンパク質は、番号１７１から３９０９の原子を含んでなる。表ではこれらの原子の前に、水分子（１〜８７及び９２〜１７０）及び重炭酸イオンの原子（８８〜９１）が示されている。

表４は、ｓｏｌＡＣと、５−フェニル−２Ｈ−［１，２，４］−トリアゾール−３−チオール（化合物１）との複合体の原子座標データである。ここで、分子Ａとして特定されるタンパク質は、番号１〜７４９９の原子を含んでなり、化合物１の分子は７５１６〜７５３４の原子であり、これに続く分子は水である。また、本構造中にはグリセロール分子が、７５０２から７５１４の原子として存在している。

表５は、ｓｏｌＡＣと、Ｎ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸（化合物２）との複合体の原子座標データである。ここで、分子Ａとして特定されるタンパク質は、番号１〜７４７８の原子を含んでなり、化合物２の分子は７４９５〜７５２３ の原子であり、これに続く分子は水である。また、本構造中にはグリセロール分子が、７４８１から７４９３の原子として存在している。

表３〜５におけるカラムの順序は、ｓｏｌＡＣタンパク質構造については、表２と同様である。

表１、表２、表３、表４、及び表５は何れも、内部整合の取れた形式（internally consistent formats）で示されている。例えば、表１、２、４、及び５において、各アミノ酸残基の原子座標の列記順としては、まず骨格窒素原子を示し、次にＣ−α骨格炭素原子をＣＡとして示し、続いて側鎖残基原子（標準的な一慣行（one standard convention）に従って示す）、そして最後にタンパク質骨格の炭素及び酸素を示している。表３では、タンパク質骨格の炭素及び酸素を側鎖残基より先に示している。また、表３には、ｓｏｌＡＣ構造の原子に連続番号を付与しているのに対し、他の表の番号は、タンパク質分子の水素原子を計数する慣習的な方法により付与している。当業者の中には、これらの原子の順序が異なる、或いは側鎖残基やリガンド分子の原子の記載が異なる、別のファイル形式を使用し、或いは好む者もいるであろう。但し、異なるファイル形式を用いて表の座標を表記又は操作することも、当然ながら本発明の範囲内である。

表１、表２、表３、表４又は表５の座標は、原子位置の単位としてオングストロームを用い、少数第３位まで記したものである。これらの座標は、三次元形状を規定する相対位置の集合であるが、当業者であれば分かるように、異なる原点及び／又は軸を基準とした全く異なる座標群によって、同一又は類似の形状を表わすこともできる。更には、上述の「定義」の欄で述べたことではあるが、当業者であれば分かるように、構造を表わす原子の相対原子位置が異なる場合でも、二乗平均平方根偏差が１．５Å未満の範囲内であれば、その構造特性の点でも、また、リガンドとのｓｏｌＡＣ相互作用力を構造に基づき分析する際の有用性の点でも、表１、表２、表３、表４又は表５の構造と実質的に同じ構造が規定されることになる。

同様に、当業者であれば分かるように、表の水分子及び／又はリガンド分子の番号及び／又は位置を変更しても、通常は、ｓｏｌＡＣ相互作用リガンドの構造基準分析におけるその構造の有用性に影響を与えることはない。即ち、表１、表２、表３、表４又は表５の座標を異なる原点及び／又は軸に転置した場合；構造を表わす原子の相対原子位置、或いはその選択座標を変更した場合であって、変更後の構造を表１、表２、表３、表４又は表５に示す座標に重畳した場合の二乗平均平方根偏差が、１．５Å未満の範囲内にある場合；及び／又は、水分子及び／又はリガンド分子の番号及び／又は位置を変更した場合：の何れも、本発明の態様として本明細書に記載された目的によれば、本発明の範囲内に属する。

上述したように、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ構造の好ましい選択座標としては、本明細書において後述されるｓｏｌＡＣの活性部位に寄与する主鎖又は側鎖原子として本発明者等が特定した、１又は２以上のアミノ酸残基の原子が挙げられる。かかる原子としては、表６、７、８、９、１０又は１１のうち何れか（例えば表６、７又は１１）に記載のアミノ酸に存在する１又は２以上の原子が挙げられる。各表における好ましい選択座標、或いは２以上の表からの座標の組合せについては、本明細書の別の箇所に記載する。

可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの構造は、表１又は表２の座標により規定される。電子密度において観察可能な最初の残基がＭｅｔ１残基であり、最後がＬｙｓ４６８である。Ｍｅｔ１の主鎖窒素に近接する電子密度ピークは、アセチル化によるものと思われるが、モデル化されていない。表１において解釈可能な主鎖密度を有さない残基は、Ｔｒｐ１３５、Ｇｌｕ１３６、Ｇｌｕ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｌｅｕ１３９、Ａｓｐ１４０、Ｐｈｅ３５０、Ｐｒｏ３５１、Ｇｌｙ３５２、Ｇｌｕ３５３、Ｌｙｓ３５４、Ｖａｌ３５５、及びＰｒｏ３５６である。Ｖａｌ４６９残基及びＣ末端Ｈｉｓタグは、電子密度では視認できない。１３４における最初の切断部に近接した主鎖は殆ど特定できず、１３２〜１３４の残基は斑状の主鎖電子密度を有する。３０４〜３０６及び４５１〜４５５の残基は、電子密度では殆ど特定できない。更に、本モデルの周辺に存在する幾つかの残基は、それらについて解釈可能な密度がなかったことから、その側鎖が任意に配置されているものと思われる。Ｐｈｅ３５０は表２では視認できない。

可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインについて、更に別の構造を分解したところ、それらの構造の幾つかは、表１の非分解残基について解釈可能な密度を有していたことから、より完全な表３、表４又は表５の座標データを得ることも可能である。

分解された哺乳類可溶性アデニル酸シクラーゼ構造を、公開済みの細菌性可溶性アデニル酸シクラーゼの構造と比較するために、可溶性アデニル酸シクラーゼ及びスピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）アデニル酸シクラーゼ（PDB code １wc１）（Steegborn, C., Litvin, T., Levin, L.R. Buck, J. and Wu,H. (2005) Nat. Struc. And Mol. Biol.,12, 32-37）の構造間のｒｍｓｄを算出した。計算の際には、Comparer（Sali and Blundell (1990) J Mol Biol. 212, 403-428）を用いて構造の重畳を行ない、MNYFIT（Sutcliffe et al. 1987）を用いて重畳の精緻化及びｒｍｓｄの計算を行なった。ｒｍｓｄの算出はＣα原子のみの位置を用いて行なった。重畳を実行するために、各構造をその構成ドメインに分断した。これによって、構造間のｒｍｓｄに大きな差異が生じる原因となる、ドメインの運動の問題が解消される。即ち、可溶性アデニル酸シクラーゼの第１のドメイン（残基３６〜２１６）を、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）構造のＢ鎖に重畳し、第２のドメイン（残基２８７〜４６５）をＣ鎖に重畳した。２．５Åのカットオフを用いて等価性を定義した（一方の構造のＣα原子が、重畳した構造のＣα原子の２．５Å内にあれば等価とした）。可溶性アデニル酸シクラーゼの第１ドメインにおいては、１８１残基のうち１１６が、Ｓ．プラテンシス構造の残基と等価であると定義され、ｒｍｓｄは１．２Åであった。第２のドメインについては、１７９残基のうち１２７が、Ｓ．プラテンシス構造の残基と等価であると定義され、ｒｍｓｄは１．４Åであった。これらのｒｍｓｄ値や、２．５Åのカットオフをもって特定された等価残基数の少なさは、二次構造要素を結合する複数の配列領域の長さ及び向きが異なる結果であろう。また、この重畳を検討した結果、ヘリックスα３の長さに違いがあり、哺乳類シクラーゼの方が数残基短いこと、また、分子の中心となるβ−シート部分は重畳率が高いのに対し、ヘリックスα２及びα３の重畳率はそれに比べて低いことが明らかになった。従って、Ｓ．プラテンシス構造１ｗｃ１に対する、本発明のｓｏｌＡＣ構造の２つのドメイン全体についての総Ｃα原子のｒｍｓｄ値は、１．５Åよりもかなり高い値であった。

これらの酵素の間には、二次構造に幾つかの違いがある。例えば、ヒト可溶性アデニル酸シクラーゼは、ｔｍＡＣ又はＳ．プラテンシス酵素と比べて、ベータ１鎖がより短く、アルファ１ヘリックスがより長い。

ｓｏｌＡＣと、ｔｍＡＣ及びＳ．プラテンシスｓｏｌＡＣとの主な違いは、偽二量体のＮ末端ドメインを背景とした、部分付加ヘリックスドメインの存在である。これはＮ末端の残基１〜２６からなり、残基１〜１２は伸張した立体構造を有し、１３〜１９はヘリカルな立体構造を有し、残る残基２０〜２６は伸張して、２５〜２７がヘリックスのターンを形成している。本ドメインの残りを形成するのは残基２１９〜２８４である。ここにはＮ末端ドメインのベータ８、Ｃ末端ドメインのベータ１、及びＣ末端ドメインのアルファ１を形成する残基が含まれる。残基２１９〜２８４のうち、残基２２６〜２３６、２５８〜２６８及び２７１〜２７７は、３つのヘリックスを形成している。

本発明者等は、リガンドに結合するｓｏｌＡＣ内の幾つかの領域を同定した。また、本発明者等はこれらの領域が、これらの領域のうち２つ以上に結合するリガンドに対し、拡張された結合部位を形成する可能性があることを見出した。

本発明者等が同定した領域は（ａ）ＡＴＰ結合部位、（ｂ）重炭酸イオン結合部位、（ｃ）チャネル結合部位、及び（ｄ）基質ポケット（Sub-pocket）結合部位である。更に本発明者等は（ｅ）代替部位（潜在的なアロステリック部位）も同定した。これらの部位のより詳しい説明は、後述の実施例に記す。

（Ａ）ＡＴＰ結合部位
この部位は、より一般的にはｓｏｌＡＣの活性部位ということができ、主に活性部位残基によって裏打ちされている。本発明によるｓｏｌＡＣの活性部位残基を、以下に掲げる表６及び７に１文字表記で示す。

（Ｂ）重炭酸イオン結合部位
本発明者等はｓｏｌＡＣの構造を分析し、重炭酸イオン結合領域を解明した。重炭酸イオンと相互作用するのは、ｓｏｌＡＣの３つの残基、即ちＬｙｓ９５、Ｖａｌ１６７及びＡｒｇ１７６である。ＨＣＯ₃ ^-イオンと殆ど同一の位置に負帯電硫黄原子が存在する化合物（５−フェニル−２Ｈ−［１，２，４］−トリアゾール−３−チオール；「化合物１」）を用いることにより、本発明者等は、ＡＴＰ結合部位と隣接する位置に、大きなポケットを形成する、拡張された重炭酸イオン結合部位を同定した。

この拡張ＨＣＯ₃ ^-結合部位は、ｓｏｌＡＣ阻害剤又は活性剤の設計に利用可能なｓｏｌＡＣ構造の領域に光を当てるものである。

この拡張部位の残基は表８に示す通りである。

これらの残基において、本発明者等は以下の点を見出した。
１）Ｌｙｓ９５のＮＺはＨＣＯ₃ ^-のＯ１と塩橋を形成する。
２）Ｖａｌ１６７の骨格ＮＨはＨＣＯ₃のＯ１と荷電水素結合を形成する。
３）Ｖａｌ１６７の骨格カルボニルはＨＣＯ₃ ^-のＯＨと水素結合を形成する。
４）Ａｒｇ１７６の側鎖ＮＨ２はＨＣＯ₃ ^-のＯ３と塩橋を形成する。
５）Ａｒｇ１７６の側鎖ＮＨ２はＨＣＯ₃ ^-のＯＨと荷電水素結合を形成する。

この拡張重炭酸イオン部位において、５−フェニル−２Ｈ−［１，２，４］−トリアゾール−３−チオールの硫黄原子は、ポケットの底部に位置し、Ｌｙｓ９５のＮＺとの間に塩橋を、Ｖａｌ１６７の骨格ＮＨ及びＰｈｅ３３６の骨格ＮＨとの間に荷電水素結合を形成する。また、トリアゾールのＮ６は、ポケットの底部のＭｅｔ３３７の骨格カルボニルとの間に水素結合を形成する。更に、トリアゾールのＮ５は、Ａｒｇ１７６のＮＨ２との間に荷電水素結合を形成する。化合物１のフェニル基は、Ｐｈｅ４５、Ｌｙｓ９５、Ａｌａ９７、Ａｌａ１００、Ｌｅｕ１０２及びＰｈｅ３３６の側鎖により形成される化合物ポケットの概ね親油性の領域に入り込んでいる。この化合物のフェニル基の先では、ポケットは若干狭まった後、ＡＴＰ結合部位に開口している。この拡張ＨＣＯ₃ ^-結合部位の形状と、化合物：ｓｏｌＡＣ複合体において見られる相互作用の性質は、この部位が種々のリガンドを受容し得ることを示唆している。

（C）チャネル結合部位
ｓｏｌＡＣに結合したＮ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸（「化合物２」）の結晶構造は、ｓｏｌＡＣ構造には薬剤設計に利用し得る更なる領域があることを示すものである。化合物２の結合部位は、化合物１について説明した拡張ＨＣＯ₃ ^-ポケットと重複しており、化合物２のフェノキシ基が占有する位置は、化合物１のフェニル基と極めて類似している。しかしながら、化合物２は、ＨＣＯ₃ ^-結合部位の底部に存在するＬｙｓ９５の側鎖を、大きく移動させる。このＬｙｓ９５の移動によってＨＣＯ₃ ^-結合ポケットが開放され、これによって形成されたチャネルが、水で満たされた大きな空孔と融合した後、ＡＴＰ結合部位とは反対側の位置でタンパク質表面に開口する。以下の残基（表９）が、この新たに露出されるチャネルを裏打ちしている。

化合物２のオキサルアミド酸基の突出部先端はこのチャネルに侵入し、タンパク質との間に幾つかの相互作用を形成している。
１）化合物２のＯ３はＨｉｓ１６４のＮＤとの間に荷電水素結合を形成している。
２）化合物２のＯ１はＰｈｅ１６５の骨格ＮＨとの間に荷電水素結合を形成している。
３）化合物２のＯ５はＶａｌ３３５の骨格ＮＨに水素結合している。
４）化合物２のアミドＮ６はＰｈｅ１６５の骨格カルボニルに水素結合している。

Ｌｙｓ９５、Ｐｈｅ１６５、Ｌｅｕ１６６、Ｖａｌ１６７及びＰｈｅ３３６の側鎖は、化合物２中心のアニリノ芳香環の周囲に親油性環境を形成している。化合物２の末端フェノキシ基は、化合物１について説明したのと同様の親油性ポケット内に結合しているが、このポケットの環境は、Ｍｅｔ３３７、Ｐｈｅ３３８、Ａｓｐ３３９、Ｌｙｓ３４０及びＧｌｙ３４１を含んでなるループが化合物２によって移動することにより、僅かに異なっている。このループの移動によってＰｈｅ３３８がＡＴＰ部位から、化合物２の末端フェノキシ基のファン・デル・ワールス距離内に引っ張られている。このＰｈｅ３３８の移動はアポ、ＡＭＰ−ＰＮＰ、及びｓｏｌＡＣに結合した化合物１の構造には観察されない。

（Ｄ）基質ポケット（Sub-Pocket）結合部位
ＡＭＰ−ＰＮＰ複合体の構造の更なる分析によって、Ｐｈｅ３３８が、ＡＭＰ−ＰＮＰリボースのヒドロキシル基に近接して存在するＡＴＰ部位の一端を形成していることが明らかになった。Ｐｈｅ３３８の再配置によって、ＡＴＰ結合部位に隣接する位置に、新たな基質ポケット（Sub-Pocket）が形成される。この新たな基質ポケット（Sub-Pocket）は以下の残基によって裏打ちされている（表１０）。

（Ｅ）ｓｏｌＡＣの代替結合部位
ｓｏｌＡＣ分子表面の疎水性裂隙は、対称関連分子（symmetry related molecule）のＮ末端との結合部位を形成する。Ｎ末端メチオニンの側鎖は、Ｐｈｅ８９、Ｐｈｅ２３０及びＰｈｅ２２６の側鎖により形成される疎水ポケット内に入り込んでいる。残基１〜４の主鎖は更に、片面がヘリックス２の末端の残基により形成され、他方の面が番号Ｌｙｓ２４６、Ａｓｎ２４７、Ｌｅｕ２４８及びＬｅｕ２４９の残基を含むループ由来の残基によって形成された、溝内に嵌まり込んでいる。これらの残基は、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）のアデニル酸シクラーゼと比べて、ｓｏｌＡＣが余分に有するドメイン内に存在する。特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、表１１に挙げるこれらの残基は、アロステリック部位を形成することにより、ｓｏｌＡＣに対するリガンドの更なる標的となっている可能性がある。

複合体構造
ＡＭＰＣＰＰを浸漬した可溶性アデニル酸シクラーゼの構造から、このタンパク質のヌクレオチド結合ポケットの構造、特にヌクレオチドのアデノシン部分の結合ポケットの構造に関する情報を得ることができる。更に、この構造を使用すれば、より強力な調節因子、例えば阻害剤又は活性剤を設計する目的で、ｓｏｌＡＣに類似する構造の相互作用をモデル化することができる。より一般的には、他のリガンドを浸漬した可溶性アデニル酸シクラーゼの構造から、このタンパク質の他の結合ポケットの構造に関する情報を得ることができる。

ｓｏｌＡＣ残基の同定及び使用
ｓｏｌＡＣの結晶構造によって、ＡＴＰ結合ポケット領域内において、酵素の結合部位を裏打ちする全ての残基（表６）を、正確に同定することが可能となった。

従って、本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法において選択座標の使用を考慮する場合、かかる選択座標は表６から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１の座標、好ましくは少なくとも１の側鎖座標を含んでなる。より好ましくは、これらの選択座標は、表７から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１の座標、好ましくは少なくとも１の側鎖座標を含んでなる。表６に規定される残基は、特に小分子リガンドの設計に有効である。

また、ある特定のアミノ酸の原子の全てを選択するか、その一部の原子のみを選択するかによらず、選択座標のうち少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０が、異なるアミノ酸残基の対応する番号の側鎖残基のものであることが好ましい。これらは表６、７又は１１のみから選択してもよい。

他の実施形態によれば、本発明の方法において選択座標を考慮する場合、かかる選択座標は、表６、７又は１１のうち何れかから選択されたアミノ酸残基に由来する、少なくとも１の座標、好ましくは少なくとも１の側鎖座標を含んでなる。

Ｃ．キメラ
所望の特性を得るためにキメラタンパク質を使用するのは、今や科学文献では一般的である。従って、ｓｏｌＡＣの変異体はキメラであってもよい。

特に関係があるのは、活性部位を修飾することにより、構造に関する情報を得るための代替システムを構築する場合である。例えば、Ikuta等（J Biol Chem (2001) 276, 27548-27554）は、構造データが得られていたｃｄｋ２の活性部位を修飾し、Ｘ線構造が入手不能であったｃｄｋ４の活性部位を模倣した。この著者等は本手法により、ｃｄｋ４阻害剤の設計に有用なキメラタンパク質由来のタンパク質／リガンド構造を得ることに成功している。同様の手法によって、関連するｓｏｌＡＣイソフォームの一次配列の比較に基づき、本発明のｓｏｌＡＣの結合部位を修飾してこれらのイソフォームを模倣することが可能である。キメラタンパク質のタンパク質構造又はタンパク質／リガンド構造を用いて、前記の関連ｓｏｌＡＣイソフォームのリガンドとなる化合物を、構造に基づいて選定することが可能となる。

本明細書に記載のｓｏｌＡＣと他のイソフォームとのアミノ酸配列同一性のパーセンテージが２０から８０％までの範囲に及ぶ場合でも、構造要素の空間分布は同様であり、ｓｏｌＡＣタンパク質の全体的な折り畳み構造は極めて類似するものと推測される。

Ｄ．相同性モデリング
また、本発明は、他のタンパク質（以下では標的アデニル酸シクラーゼタンパク質という。）の相同性モデリングを行なう手段も提供する。「相同性モデリング（homology modeling）」という語は、表１、表２、表３、表４又は表５から誘導される座標データ、或いはその選択座標の操作に基づき、コンピュータ支援による構造の新たな（de novo）予測法を用いて、関連アデニル酸シクラーゼ構造を予測することを意味する。

「相同性モデリング」という語は、後出の実施例により構造が決定されたｓｏｌＡＣタンパク質の類似体又は相同体となる標的アデニル酸シクラーゼタンパク質にも及ぶ。また、ｓｏｌＡＣタンパク質自体の突然変異タンパク質にも及ぶ。

「相同領域（homologous regions）」という語は、同一の二つの配列、或いは類似した（例えば脂肪族、芳香族、極性、負帯電、又は正帯電）側鎖化学基を有する二つの配列におけるアミノ酸残基を指す。相同領域における同一又は類似の残基は、当業者によってそれぞれ「不変異体（invariant）」及び「保存（conserved）」と呼ばれる場合もある。

本方法は通常、ｓｏｌＡＣタンパク質のアミノ酸配列を標的タンパク質のアミノ酸配列とアラインメントすることにより、これらのアミノ酸配列を比較する工程を含んでなる。続いてこれらの配列中のアミノ酸を比較し、互いに相同なアミノ酸群（便宜上「対応領域（corresponding region）」という）をグループ化する。この方法によって、ポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸の挿入又は欠失を説明することができる。

アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを用いて決定することが可能である。本技術分野でこの目的に広く用いられているプログラムである、BLAST、gapped BLAST、BLASTN、PSI−BLAST、BLAST2、及びWU−BLAST（National Center for Biotechnology Information より提供）を用いて、２つのアミノ酸配列（又は３つ以上のアミノ酸配列）の相同領域のアラインメントを行なうことができる。これらのプログラムによれば、初期設定パラメーターを用いて、ｓｏｌＡＣとモデル化対象となる他の標的タンパク質との間のアミノ酸配列の相同率を決定することができる。

本発明に係る使用に好適なプログラムとして、WU-BLAST（Washington University BLAST）バージョン２．０ソフトウェアが挙げられる。複数のＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォームで実行可能なWU-BLASTバージョン２．０プログラムを、ftp://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロードすることができる。このプログラムはWU-BLASTバージョン１．４に基づいており、これは更にパブリック・ドメインのNCBI-BLASTバージョン１．４に基づいている（Altschul and Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al., 1990, Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215: 403-410; Gish and States, 1993, Identification of protein coding regions by database similarity search, Nature Genetics 3: 266-272; Karlin and Altschul, 1993, Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877。これらは何れも援用により本明細書に組み込まれる。）。

これら一連の検索プログラムの何れにも、ギャップド・アラインメント・ルーチン（gapped alignment routins）が、データベース検索自体に組み込まれている。ギャッピング（Gapping）は所望により停止することができる。長さ１のギャップに対するペナルティー（Ｑ）の初期設定値は、タンパク質及びBLASTPについてはＱ＝９、BLASTNについてはＱ＝１０であるが、任意の整数に変更することができる。ギャップ拡張時の残基当たりペナルティー（Ｒ）の初期設定値は、タンパク質及びBLASTPについてはＲ＝２であり、BLASTNについてはＲ＝１０であるが、任意の整数に変更することができる。Ｑ及びＲの値としてどのような組合せを用いても、重複及び同一性が最大になるとともに配列ギャップが最小となるように、これらの配列をアラインメントすることが可能である。アミノ酸比較マトリックスは、初期設定状態ではBLOSUM62であるが、他のアミノ酸比較マトリックス（例えばPAM等）を利用することもできる。

類似体とは、類似の３次元構造及び／又は機能を有する複数のタンパク質であって、配列レベルにおいて共通祖先（common ancestor）を示す証拠が殆どないものとして定義される。

相同体とは、共通祖先を示す証拠を有する複数のタンパク質、即ち、進化的分岐の結果により生じ、配列同一性の程度（通常はパーセンテージで表わされる）に基づいて、遠縁、中縁及び近縁の下位区分に分かれたと思しき複数のタンパク質である。

本明細書において相同体とは、ヒトｓｏｌＡＣに対して、少なくとも約２０％、例えば少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の配列、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をいう。この中には、ｓｏｌＡＣの多型体や、下記の表１２及び１３に示す種等の種特異体（species forms）も含まれる。

表１２及び１３は、哺乳類間の可溶性アデニル酸シクラーゼのパーセンテージ同一性を示している。

相同体にはオルソログ（orthologues）とパラログ（paralogues）という、２つの種類が存在する。オルソログは、異なる生物に存在する相同遺伝子、即ち、それらの種が形成された種分化に一致する共通祖先を有する遺伝子として定義される。パラログは、遺伝子／染色体／ゲノムの複製に由来する同一生物内の相同遺伝子、即ち、最後の種分化の後に共通祖先が生じた遺伝子として定義される。

また、相同体は、ｓｏｌＡＣの多型体、例えば、（Ａ）の欄で述べたアレルや突然変異体、又は、（Ｄ）の欄で述べたキメラであってもよい。

既知の構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列と、未知の構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列とのアラインメントを行なったら、既知の構造を有するポリペプチドのコンピュータ表現における保存アミノ酸の構造を、構造が未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移動させる。例えば、既知の構造のアミノ酸配列内のチロシンを、未知の構造のアミノ酸配列における対応する相同アミノ酸である、フェニルアラニンに置き換える。

非保存領域に存在するアミノ酸の構造を、標準的なペプチドのジオメトリーを用いて、或いは分子動力学等の分子シミュレーション法を用いて、手動で割り当ててもよい。本プロセスの最終工程は、分子動力学及び／又はエネルギー最小化法を用いて、全体構造を精緻化することにより達成される。

相同性モデリングはそれ自体、当業者によく知られた手法である（例えば Greer（Science, Vol. 228, (1985), 1055）及びBlundell等（Eur. J. Biochem, Vol. 172, (1988), 513）を参照）。これらの文献に記載された手法や、本技術分野で一般に利用可能なその他の相同性モデリング法を、本発明の実施に用いることができる。

即ち、本発明は、相同性モデリングの方法であって：
（ａ）未知の３次元構造の標的ｓｏｌＡＣタンパク質のアミノ酸配列の表現を、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣのアミノ酸配列、或いはその選択座標とアラインメントし、前記アミノ酸配列の相同領域同士をマッチングさせる工程；
（ｂ）前記未知の構造を有する当該標的ｓｏｌＡＣの、前記マッチングさせた相同領域の構造を、前記の二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５に規定されるｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標の、対応する領域上にモデリングする工程；及び
（ｃ）当該マッチングさせた相同領域の構造が実質的に保存された、未知の構造を有する当該標的ｓｏｌＡＣの立体構造を決定する工程を含んでなる方法を提供する。

未知の構造を有する当該標的ｓｏｌＡＣの立体構造としては、例えば、未知の構造の標的アデニル酸シクラーゼ内で好ましい相互作用が形成される構造、及び／又は、低エネルギーの立体構造が形成されるような構造が挙げられる。

工程（ａ）から（ｃ）の何れか、或いは全てを、コンピュータモデリングによって実行することが好ましい。

表１、表２、表３、表４又は表５の座標データ、或いはその選択座標は、他のアデニル酸シクラーゼを相同性モデリングする際に特に有利である。

本明細書に記載された、コンピュータ内（in silico）ｓｏｌＡＣ構造を利用する本発明の態様は、本発明の上記態様によって得られるアデニル酸シクラーゼの相同体モデルにも等しく応用することができる。この応用は、本発明の更なる態様を構成する。こうしてアデニル酸シクラーゼの立体構造を上述の方法で決定することにより、かかる立体構造を上述のコンピュータを用いた合理的薬物設計法に利用することができる。

Ｅ．構造解
ｓｏｌＡＣの原子座標データは、ｓｏｌＡＣの他の結晶形、突然変異体、ｓｏｌＡＣの共複合体（co-complex）を含む、他の標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の結晶構造を解析するために使用することも可能である。この場合、これらの標的アデニル酸シクラーゼタンパク質のＸ線回折データ又はＮＭＲ分光分析データが得られた後、構造を取得するためには解釈が必要となる。

ｓｏｌＡＣの場合、このタンパク質が結晶化する際の結晶形は複数存在し得る。本発明で提供される、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標は、ｓｏｌＡＣの他の結晶形の構造を解析するのに特に有用である。また、ｓｏｌＡＣの構造突然変異体、ｓｏｌＡＣ共複合体、或いはｓｏｌＡＣの何れかの機能ドメインと顕著なアミノ酸配列相同性を有する他の任意のタンパク質の結晶形を解析するために使用することもできる。

他の標的アデニル酸シクラーゼタンパク質、特に（例えば表１２及び１３に示す種に由来する）哺乳類の相同可溶性アデニル酸シクラーゼの場合、生のＸ線回折データさえ得られれば、本発明によって、かかる標的の構造をより容易に得ることが可能となる。

即ち、標的タンパク質アデニル酸シクラーゼや未知の３次元構造のｓｏｌＡＣについて、Ｘ線結晶学データ又はＮＭＲ分光分析データが用意できれば、表１、表２、表３、表４又は表５に由来する原子座標データを用いてそのデータを解釈することにより、本技術分野で周知の手法によって（例えば、Ｘ線結晶学の場合はフェージング（phasing）、ＮＭＲスペクトルの場合はピーク割り当て支援）、当該他のアデニル酸シクラーゼについて可能性の高い構造を得ることが可能となる。

これらの目的に使用可能な方法の１つとしては、分子置換法が挙げられる。この方法では、当該未知の結晶構造（ｓｏｌＡＣの他の結晶形、ｓｏｌＡＣ突然変異体、ｓｏｌＡＣキメラ若しくはｓｏｌＡＣ共複合体、又は、ｓｏｌＡＣの何れかの機能ドメインとアミノ酸配列相同性を有する標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の結晶のうち、何れであるかを問わない）を、本発明の表１、表２、表３、表４又は表５の一部又は全部のｓｏｌＡＣ構造座標を用いて決定することができる。この方法によれば、未知の結晶の構造形に関する情報を最初から（ab initio）決定しようとする場合と比べて、より高速且つ効率的に正確な構造形を得ることが可能となる。

分子置換を実施するためのコンピュータプログラムとして本技術分野で公知のものの例としては、CNX（Brunger A.T.; Adams P.D.; Rice L.M., Current Opinion in Structural Biology, Volume 8, Issue 5, October 1998, Pages 606-611、またはAccelrys San Diego, CAから市販）、MOLREP（A.Vagin, A.Teplyakov, MOLREP: an automated program for molecular replacement, J. Appl. Cryst. (1997) 30, 1022-1025, part of the CCP4 suite）、又はAMoRe（Navaza, J. (1994). AMoRe: an automated package for molecular replacement. Acta Cryst. A50, 157-163）が挙げられる。

即ち、本発明の更なる態様によれば、タンパク質の構造を決定する方法であって：
ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の座標、或いはその選択座標を用意する工程；及び
either（ａ）当該座標を、当該タンパク質の結晶単位格子内に配置することにより、当該タンパク質の構造を得るか、又は（ｂ）当該座標を操作して、当該タンパク質のＮＭＲスペクトルピークを割り当てる工程を含んでなる方法が提供される。

表１、表２、表３、表４又は表５の座標、或いはその選択座標は、表６から１１の何れか、例えば表６、７又は１１に記載のアミノ酸残基の原子座標を含有することが好ましい。好ましい各表の選択座標、或いは２つ以上の表からの座標の組合せについては、本明細書に別記する通りである。

また、本発明を利用して、表１、表２、表３、表４又は表５のデータを操作することにより、かかるタンパク質のＮＭＲスペクトルのピークを割り当てることもできる。

本発明の好ましい態様によれば、これらの座標を用いることにより、標的アデニル酸シクラーゼ、特にｓｏｌＡＣの相同体、例えば他のアデニル酸シクラーゼ、特に異なる種由来のｓｏｌＡＣのイソフォームについて、その構造を解析することができる。

Ｆ．コンピュータシステム
別の態様によれば、本発明は、ｓｏｌＡＣ、ｓｏｌＡＣ相同体又は類似体、ｓｏｌＡＣとリガンドとの複合体、又はｓｏｌＡＣ相同体又は類似体とリガンドとの複合体と、相互作用するリガンドの構造を生成し、及び／又は、最適化を行なうためのコンピュータシステムであって、前記システムがコンピュータ読取可能なデータとして：
（ａ）表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ座標データであって、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造を規定するデータ、或いはその選択座標；
（ｂ）表１、表２、表３、表４又は表５の座標データに基づく前記標的の相同性モデリングにより生成された、標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の分子座標データ；
（ｃ）表１、表２、表３、表４又は表５の座標データを基準として、Ｘ線結晶学的データ又はＮＭＲデータを解釈することにより生成された、標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の分子座標データ；
（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）の原子座標データから誘導される構造因子データ；及び、
（ｅ）ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の分子座標データ、或いはその選択座標
のうち１又は２以上を有する、コンピュータシステムを提供する。

例えば、このコンピュータシステムは：（ｉ）当該コンピュータ読取可能なデータがコード化されたデータ記憶物質を含んでなる、コンピュータ読取可能なデータ記憶媒体；（ii）当該コンピュータ読取可能なデータを処理するための命令を記憶するための作業メモリ；及び（iii）当該作業メモリ及び当該コンピュータ読取可能なデータ記憶媒体に連結され、当該コンピュータ読取可能なデータを処理することにより、構造を生成し、及び／又は、合理的薬物設計を行なうための中央処理装置（central-processing unit）を含んでなる。このコンピュータシステムは更に、当該中央処理装置に連結された、当該構造を表示するためのディスプレイを含んでいてもよい。

また、本発明は、標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の原子座標データを含有する、かかるシステムであって、かかるデータが、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標を出発データとして、本明細書に記載の本発明の方法によって得られたものである、システムを提供する。

かかるデータは数々の用途に有用である。例としては、アデニル酸シクラーゼタンパク質の作用機序を分析するため、及び／又は、ｓｏｌＡＣと相互作用するリガンド（例えばアデニル酸シクラーゼにより代謝される化合物等）の合理的薬物設計を行なうための構造の生成が挙げられる。

別の態様によれば、本発明は、コンピュータ読取可能なデータがコード化されたデータ記憶物質を含んでなるコンピュータ読取可能な記憶媒体であって、前記データが表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣタンパク質の構造座標、或いはその選択座標で定義されるか、或いはｓｏｌＡＣの相同体であって、その骨格原子の（当該表１、表２、表３、表４又は表５の骨格原子、或いはその選択座標からの）二乗平均平方根偏差が１．５Å未満である相同体によって定義される、記憶媒体を提供する。

更なる態様によれば、ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の構造、或いはその選択座標により定義されるｓｏｌＡＣタンパク質の構造的座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含んでなる、コンピュータ読取可能な第１のデータ群がコード化されたデータ記憶物質を含んでなる、コンピュータ読取可能な記憶媒体であって；
前記データを、未知の構造の分子又は分子複合体のＸ線回折パターンを含んでなる、機械読取可能な第２のデータ群と組み合わせることにより、当該第１のデータ群及び当該第２のデータ群を用いるための命令をプログラムされた機械を用いて、前記の機械読取可能な第２のデータ群に対応する、少なくとも一部の構造座標を決定することが可能な、記憶媒体が提供される。

本明細書で使用される「コンピュータ読取可能な媒体（computer readable media）」とは、コンピュータによって直接に読取及びアクセスが可能な、１又は２以上の任意の媒体を指す。かかる媒体としては、これらに限定されるものではないが：磁気記憶媒体、例えばフロッピーディスク（登録商標）、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープ；光学記憶媒体、例えば光ディスク又はＣＤ−ＲＯＭ；電子的記憶媒体、例えばＲＡＭ及びＲＯＭ；並びにこれらの分類を組み合わせたもの、例えば磁気／光学記憶媒体等が挙げられる。

かかるコンピュータ読取可能な媒体を提供することにより、アデニル酸シクラーゼをモデル化するために、本発明の原子座標データ又はその選択座標に普段から容易にアクセスすることが可能となる。例えば、公に利用可能なコンピュータソフトウェアパッケージであるRASMOL（Sayle et al., TIBS, Vol. 20, (1995), 374）を用いれば、構造決定及び／又は合理的薬物設計のために、原子座標データにアクセスし、これを分析することができる。

「コンピュータシステム（computer system）」とは、本発明の原子座標データを分析するのに使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段及びデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータを用いたシステムにおける最小限のハードウェア手段は、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段及びデータ記憶手段を備えてなるものである。また、構造データを可視化するために、モニターを備えることが望ましい。データ記憶手段はＲＡＭであってもよく、本発明のコンピュータ読取可能な媒体にアクセスするための手段であってもよい。かかるシステムの例としては、Silicon Graphics Incorporated社及びSun Microsystems社より入手可能な、ＵＮＩＸ（登録商標）ベース、ウィンドウズ（登録商標）ＸＰ（Windows（登録商標） XP）、又はＩＢＭ社のＯＳ／２オペレーティングシステムで稼動するマイクロコンピュータワークステーションが挙げられる。

また、本発明は、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ座標、或いはその選択座標を含んでなるコンピュータ読取可能な第１のデータ群がコード化されたデータ記憶物質を含んでなる、コンピュータ読取可能なデータ記憶媒体であって；
当該第１のデータ群を、未知の構造の分子又は分子複合体のＸ線回折パターンを含んでなる機械読取可能な第２のデータ群と組み合わせることにより、当該第１のデータ群及び当該第２のデータ群を使用するための命令をプログラムされた機械を用いて、前記の機械読取可能な第２のデータ群に対応する電子密度の少なくとも一部を決定することが可能な、記憶媒体を提供する。

本発明の更なる態様によれば、ｓｏｌＡＣ、ｓｏｌＡＣ相同体又は類似体、ｓｏｌＡＣとリガンドとの複合体、又はｓｏｌＡＣ相同体又は類似体とリガンドとの複合体と相互作用するリガンドの構造を生成し、及び／又は、最適化を行なうためのデータを提供するための方法であって：
（ｉ）（ａ）ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の原子座標、或いはその選択座標のデータであって、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造、或いはその選択座標を規定するデータを含んでなる、コンピュータ読取可能なデータ；
（ｂ）（ａ）のデータに基づく前記標的の相同性モデリングにより生成された、標的アデニル酸シクラーゼ相同体又は類似体の分子座標データ；
（ｃ）表１、表２、表３、表４又は表５のデータを基準として、Ｘ線結晶学的データ又はＮＭＲデータを解釈することにより生成された、タンパク質の分子座標データ；及び
（ｄ）（ａ）又は（ｃ）の原子座標データから誘導される構造因子データ
を有する遠隔装置と、通信を確立する工程；並びに、
（ii）当該遠隔装置から、当該コンピュータ読取可能なデータを受信する工程を含んでなる方法が提供される。

更なる態様によれば、本発明は、ｓｏｌＡＣ構造又はｓｏｌＡＣ−リガンド複合体の３次元表現を作成するためのコンピュータの使用であって、前記ｓｏｌＡＣ構造が、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の構造、或いはその選択座標であるとともに、当該コンピュータが：
（ｉ）二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の構造、或いはその選択座標を含んでなる、機械読取可能なデータがコード化されたデータ記憶物質を含んでなる、機械読取可能なデータ記憶媒体；及び
（ii）当該機械読取可能なデータを当該３次元表現に加工するための命令を含んでなる、使用を提供する。

このコンピュータは更に、当該３次元表現を表示するためのディスプレイを含んでいてもよい。

当該遠隔装置から受信されるコンピュータ読取可能なデータは（特に、ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の原子座標データ、或いはその選択座標の形態の場合には）、本明細書に記載の本発明の方法において、例えばｓｏｌＡＣ構造を用いたリガンド構造の分析のために使用することができる。

即ち、この遠隔装置が例えば、本発明の上述する態様の何れかに該当する、コンピュータシステム又はコンピュータ読取可能な媒体を含んでいてもよい。この装置は、コンピュータ読取可能なデータが受信される国又は区域とは異なる国又は区域に存在していてもよい。

この通信は、インターネット、イントラネット、ｅメール等の何れを通じたものであってもよく、或いは有線手段を通じたものでも、無線手段（例えば地上波や衛星波）を通じたものでもよい。この通信は通常、電子的に行なわれるが、通信経路の一部又は全部が光学的に、例えば光ファイバーを通じて行なわれてもよい。

Ｇ．本発明の構造の使用
本発明に従って得られる結晶構造、並びに本明細書記載の方法に従って得られる標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の構造は、幾つかの手法で薬剤設計に利用できる。例えば、ｓｏｌＡＣ（例えばｓｏｌＡＣのヌクレオチド結合領域）に対して選択的なリガンドの設計は、表１、表２、表３、表４又は表５の座標データ、或いはその選択座標に基づいて行なうことができる。一態様によれば、非環化性（non-cyclizable）ヌクレオチド類似体であるＡＭＰＣＰＰは、多数の異なるアデニル酸シクラーゼのヌクレオチド結合ポケットに結合することが可能である。現在のｓｏｌＡＣ触媒ドメインの構造を使用することによって、他のアデニル酸シクラーゼと比べて、遥かに高いｓｏｌＡＣ特異性を有する構造の設計が可能となる。

より一般的には、本発明の構造は、ｓｏｌＡＣの調節因子の用意、設計、修飾又は分析に使用することができる。本明細書で使用される限り、ｓｏｌＡＣの「調節因子（modulator）」という語は、ｓｏｌＡＣタンパク質の生物活性レベルに変化（即ち調節）を生じさせるリガンドの意味で使用される。即ち調節とは、ｓｏｌＡＣ活性に上昇又は下降をもたらす生理学的変化を包含する。前者の場合、調節は活性化と言い換かえられ、後者の場合は阻害と言い換えられる。この調節は、リガンドがｓｏｌＡＣのＡＴＰ結合部位に結合する直接の結果として生じてもよく、或いは間接的に（例えばリガンドがｓｏｌＡＣの何れかの部位に結合し、これによってｓｏｌＡＣの活性や、ｓｏｌＡＣと他のタンパク質との相互作用に影響が生じることにより）生じてもよい。かかる相互作用としては、ｓｏｌＡＣ酵素を特定の細胞小器官（例えばミトコンドリア、中心子、紡錘体、核）に局在化させる、他の遺伝子産物又はタンパク質との相互作用や、ｓｏｌＡＣと効果器分子（例えばＰＫＡ）又は酵素活性のレベルとの間に相互作用（例えばアロステリック機構、競合阻害、活性部位の不活性化、フィードバック阻害経路の摂動等により）を生じさせる、他の遺伝子産物又はタンパク質との相互作用が挙げられる。即ち、調節という語は、かかる機序によって引き起こされるｓｏｌＡＣの過大又は過小発現（over- or under-expression）、並びに、リガンドがＡＴＰ結合部位に、或いは重炭酸イオン結合部位に、或いは本明細書で特定する他の何れかの部位に結合することによる活性亢進（又は活性低下）を含意していてもよい。「調節因子（modulator）」、「調節（moudlation）」及び「調節する（modulate）」という語は、ｓｏｌＡＣとの関連で使用される場合、以上に従って解釈すべきである。

例えば、結合ポケット内におけるリガンドの結合の向きに関する情報は、共結晶化、浸漬、又は計算によりリガンドをドッキングさせることにより決定することができる。これに基づいて、リガンドとタンパク質との相互作用を媒介又は制御するべく、化学構造に加える修飾を具体的に設計することが可能となる。かかる修飾の設計は、リガンドとｓｏｌＡＣとの相互作用を修飾し、これにより治療作用を改善することを目的として行なうことができる。

即ち、ｓｏｌＡＣの３次元構造の決定によって、ｓｏｌＡＣと相互作用する新規のリガンド（例えば化合物）を設計するための基礎が提供される。例えば、ｓｏｌＡＣの３次元構造が分かれば、コンピュータモデリングプログラムを用いて、予測又は確認された活性部位（例えば結合部位等）との相互作用や、ｓｏｌＡＣのその他の構造的又は機能的な特徴との相互作用が期待される、異なる分子を設計することが可能となる。

（ｉ）結晶複合体の取得及び分析
１つのアプローチによれば、ｓｏｌＡＣに結合するリガンドの構造は、実験により決定することができる。これによって、ｓｏｌＡＣに結合するリガンドの分析における出発点を提供することができ、ひいては、この特定のリガンドがどのようにｓｏｌＡＣと相互作用するか、また、例えばそれがどのような機序により、結合ポケットを巡ってＡＴＰと競合するのかについて、当業者に具体的な洞察を与えることが可能となる。

上述した構造に基づく薬剤設計に適用される手法及びアプローチの多くは、リガンド−タンパク質複合体内におけるリガンドの結合位置を特定するために、何らかの段階でＸ線分析に依存していた。このための方法としては、複合体をＸ線結晶分析し、差フーリエ電子密度マップ（difference Fourier electron density map）を作成し、特定の電子密度パターンをリガンドと関連付けるという方法が一般的であった。しかしながら、このマップを作成するためには（例えばBlundell等が、Protein Crystallography, Academic Press, New York, London and San Francisco, (1976)において説明するように）、タンパク質の３Ｄ構造（或いは少なくともタンパク質結晶の構造因子群）が既知である必要がある。従って、ｓｏｌＡＣ構造を決定することによって、ｓｏｌＡＣ−リガンド複合体の差フーリエ電子密度マップの作成、及び薬剤の結合位置の決定が可能となり、ひいては合理的薬物設計のプロセスに大いに寄与すると考えられる。

従って、本発明は、ｓｏｌＡＣに結合するリガンドの構造を決定する方法であって：
ｓｏｌＡＣタンパク質の結晶を用意する工程；
前記結晶を前記リガンドに浸漬させて複合体を形成させる工程；及び、
二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標を用いて、前記複合体の構造を決定する工程を含んでなる方法を提供する。

或いは、前記ｓｏｌＡＣ及び触媒ドメインと、リガンドとが共結晶化していてもよい。タンパク質の精製サンプルをある期間に亘って（通常＞１時間）、リガンド候補とインキュベートする。続いて、タンパク質リガンド複合体を、結晶化条件に基づいてスクリーニングすればよい。或いは、あるリガンドを含有するタンパク質結晶を、リガンドが存在しない安定化溶液中に入れ、逆浸漬（back-soaked）によってこのリガンドを除去することもできる。続いてこの得られた結晶を、異なるリガンドを含有する第２の溶液に映してもよい。

即ち、本発明は、ｓｏｌＡＣに結合するリガンドの構造を決定する方法であって：
ｓｏｌＡＣタンパク質を前記リガンドと混合する工程；
ｓｏｌＡＣタンパク質−リガンド複合体を結晶化させる工程；及び、
ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標を用いて、前記複合体の構造決定する工程を含んでなる方法を提供する。

複数の化合物の混合物を結晶に浸漬させ、又は結晶と共結晶化させてもよく、この場合、ｓｏｌＡＣと結合すると予測される化合物は、前記複数の化合物のうちの１種又は一部のみであってもよい。この化合物の混合物は、ｓｏｌＡＣに結合することが知られているリガンドを含んでいてもよい。前記複合体の構造に加えて、複合化している１種又は２種以上の化合物の同一性を決定してもよい。

この方法は更に：（ａ）当該候補リガンドを取得又は合成する工程；（ｂ）ｓｏｌＡＣと当該候補リガンドとの複合体を形成する工程；及び（ｃ）当該複合体をＸ線結晶学又はＮＭＲ分光分析によって分析し、当該候補リガンドがｓｏｌＡＣと相互作用する能力を決定する工程を、更に含んでいてもよい。

かかる構造の分析には、（ｉ）前記複合体のＸ線結晶学的回折データ、（ii）前記複合体の差フーリエ電子密度マップを作成するための、ｓｏｌＡＣの３次元構造（この３次元構造は、表１、表２、表３、表４又は表５の原子座標データ、或いはその選択座標により定義される）、或いは少なくともその選択座標を使用することができる。続いて、この差フーリエ電子密度マップを分析すればよい。

従って、かかる複合体の結晶化及び分析は、Ｘ線回折法により、例えばGreer等が開示するアプローチ（J. of Medicinal Chemistry, Vol. 37, (1994), 1035-1054）によって行なうことができる。また、差フーリエ電子密度マップの算出は、浸漬又は共結晶化したｓｏｌＡＣのＸ線回折パターンと、非複合化ｓｏｌＡＣの解明済みの構造のｓｏｌＡＣのＸ線回折パターンに基づいて行なうことができる。続いて、これらのマップを分析することにより、例えば、特定のリガンドがｓｏｌＡＣに結合し、及び／又は、ｓｏｌＡＣの立体構造を変化させるか否かと、その位置とを決定することが可能となる。

電子密度マップの算出は、例えばCCP4 computing package（Collaborative Computational Project 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, Acta Crystallographica, D50, (1994), 760-763.）に含まれるプログラム等を用いて行なうことができる。マップの可視化及びモデル構築には、例えば「Ｏ」（Jones et al., Acta Crystallographica, A47, (1991), 110-119）等のプログラムを使用することができる。

更に、本発明によれば、ｓｏｌＡＣの突然変異体を、既知のｓｏｌＡＣリガンド又は新規のリガンドとともに、共複合体として結晶化させてもよい。かかる一連の複合体の結晶構造を分子置換によって分析し、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標と比較すればよい。これにより、酵素の様々な結合部位内における修飾候補となる部位を特定することができる。この情報は、ｓｏｌＡＣとリガンドとの間の最も効率的な結合相互作用（例えば疎水性相互作用の上昇）を決定する、補助的なツールとなる。

上述した複合体は何れも、周知のＸ線回折法を用いて分析することができ、また、１．５から３．５Åの分解能のＸ線データに対するＲ値が約０．３０以下となるまで精緻化することができる。この精緻化には、コンピュータソフトウェア、例えばCNX（Brunger et al., Current Opinion in Structural Biology, Vol. 8, Issue 5, October 1998, 606-611 参照。また、Accelrys, San Diego, CAより市販）等の使用や、Blundell等（1976）の記載、Methods in Enzymology, vol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press (1985) 等に従い、行なうことができる。

この情報を使用することによって、既知のクラスのｓｏｌＡＣリガンドを最適化することが可能になるとともに、より重要な点として、新規のクラスのｓｏｌＡＣリガンド（特に阻害剤又は活性剤）を設計及び合成し、更にはｓｏｌＡＣ相互作用が改善された薬剤を設計することが可能になる。

（ii）コンピュータ内での（In silico）分析及び設計
本発明は、ｓｏｌＡＣの触媒ドメインと、前記ｓｏｌＡＣ触媒ドメインと相互作用するリガンドとを含んでなる、実際の結晶構造の決定を容易にするものではあるが、現在のコンピュータを用いた手法は、かかる結晶の生成や回折データの作成及び分析に必要となる、強力な代替手段となり得る。即ち、本発明の特に好ましい態様は、本発明のｓｏｌＡＣ構造と相互作用するリガンドの分析及び開発を目的とした、コンピュータによる（「コンピュータ内での（In silico）」）方法に関する。

ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造の決定は、特に類似の酵素と比較を行なう場合に、ｓｏｌＡＣの結合部位に関する重要な情報を提供する。続いてこの情報を、ｓｏｌＡＣリガンドの合理設計及び修飾に使用することができる。この手法としては、結合部位に対する結合リガンド候補のコンピュータを用いた手法による特定や、薬剤設計に対する結合断片アプローチ（linked-fragment approarches）の可能化、並びに、Ｘ線結晶学的分析を用いた結合リガンドの同定及び位置特定の可能化が挙げられる。これらの手法について、以下でより詳細に論じる。

即ち、ｓｏｌＡＣ３次元構造の決定の結果として、より純粋にコンピュータ的な合理的薬物設計の手法を用いて、ｓｏｌＡＣとの相互作用がより理解された構造を設計することができる（これらの手法の概要については、例えばWalters et al (Drug Discovery Today, Vol.3, No.4, (1998), 160-178; Abagyan, R.; Totrov, M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 375-382を参照）。例えば、標的受容体の原子座標に関する正確な情報が必要な、自動リガンド受容体ドッキングプログラム（automated ligand-receptor docking programs：例えば、Jones等によるCurrent Opinion in Biotechnology, Vol.6, (1995), 652-656 での議論や、Halperin, I.; Ma, B.; Wolfson, H.; Nussinov, R. Proteins 2002, 47, 409-443を参照）を使用することができる。

本明細書に記載された、コンピュータ内の（in silico）ｓｏｌＡＣ構造を利用する本発明の態様は、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標と、本発明の他の態様で得られる標的アデニル酸シクラーゼタンパク質のモデルとの双方に、等しく適用することができる。従って、上述した方法でｓｏｌＡＣの立体構造を決定することにより、かかる立体構造を、本明細書に記載のコンピュータを用いた合理的薬物設計の方法に使用することができる。加えて、ｓｏｌＡＣの構造が利用できれば、仮想ライブラリースクリーニング又はリガンド設計において、予測性に優れたファーマコフォアモデルを作成することが可能となる。

従って、本発明は、リガンドとｓｏｌＡＣ構造との相互作用を分析する方法であって：
二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標を用意する工程；
当該ｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標に、適合させるべきリガンドを用意する工程；及び
前記リガンドを当該ｓｏｌＡＣ構造に適合させる工程を含んでなる方法を提供する。

この本発明の方法は通常、ｓｏｌＡＣの既知のリガンドの分析、ｓｏｌＡＣのリガンドの開発又は探索、例えばｓｏｌＡＣのリガンドの１又は２以上の特性を改善又は修飾するための、ｓｏｌＡＣのリガンドの修飾等に、適用することができる。

この本発明の方法を実施する場合、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標は、本技術分野でそれ自体公知の標準的な手法に従って、コンピュータモデルとして表現することができる。当業者であればかかる方法のために、タンパク質の３次元表現を用意する手段を熟知しているであろう。好適なモデルとしては：（ａ）ワイヤー・フレーム（wire-frame）モデル；（ｂ）チキン・ワイヤー（chicken-wire）モデル；（ｃ）ボール・アンド・スティック（ball-and-stick）モデル；（ｄ）スペース・フィリング（space-filling）モデル；（ｅ）スティック（stick）モデル；（ｆ）リボン（ribbon）モデル；（ｇ）スネーク（snake）モデル；（ｈ）アロー・アンド・シリンダー（arrow and cylinder）モデル；（ｉ）電子密度マップ（electron density map）；又は（ｊ）分子表面モデル（molecular surface model）が挙げられる。

選択座標としては、表６から１１の何れか（例えば表６、７又は１１）に挙げられているアミノ酸の一部又は全部に由来する、１又は２以上の側鎖又は主鎖の原子が挙げられる。その好ましい要素や、かかる座標の好ましい組合せについては、本明細書に別途記載する通りである。

これに代わる態様によれば、本発明の方法は、推定のリガンド構造の構造が結合するポケットをモデル化するために、推定のリガンド構造の近傍（例えば触媒領域の１０〜２５Å以内や結合リガンドの５〜１０Å以内）に存在する、ｓｏｌＡＣリガンド結合領域内の着目される原子の座標を利用してもよい。これらの座標を用いて定義された空間を、続いて上述に従い、コンピュータ内で（in silico）分析することができる。

実際には、結合ポケットを表わす表１、表２、表３、表４又は表５の座標、或いはその選択座標によって定義されるｓｏｌＡＣについて、十分な数の原子を（例えば、表６から１１の何れか（例えば表６、７又は１１）に規定される残基の原子を）モデル化することが望ましい。各表の好ましい選択座標、或いは２以上の表からの座標の好ましい組合せについては、本明細書で別途説明する通りである。ｓｏｌＡＣとリガンドとの相互作用の結合ポケット及び他の特徴については、添付の実施例で説明する。

ｓｏｌＡＣにより結合される種々のリガンドは何れも、タンパク質の結合ポケットの異なる部分と相互作用している可能性があるが、このｓｏｌＡＣの構造によって、ｓｏｌＡＣと薬剤候補との相互作用の多くに関与している可能性が高い特定の部位を、多数同定することが可能となる。こうした残基は表６から１１に、例えば表６、７、又は１１に挙げられている。従って、本発明のこの態様によれば、選択座標はこれらの残基の一部又は全部の座標を含んでしてもよい。各表の好ましい選択座標、或いは２以上の表からの座標の好ましい組合せについては、本明細書で別途説明する通りである。

本発明のｓｏｌＡＣ構造に適合させるべきリガンドの３次元構造を用意するために、この目的のための市販のソフトウェアを用いて、リガンド構造を三次元にモデル化してもよく、その結晶構造が利用できる場合には、その構造の座標を用いて、本発明のｓｏｌＡＣ構造に適合させるためのリガンドの表現を用意してもよい。

新たに設計したリガンド構造を合成して、ｓｏｌＡＣとの相互作用を決定してもよく、この新たに設計した構造が当該ｓｏｌＡＣ構造によってどのように結合されるかを予測してもよい。このプロセスを繰り返すことにより、前記リガンドと前記ｓｏｌＡＣとの相互作用を更に変更してもよい。

「適合させる（fitting）」という語は、自動的又は半自動的な手段で、候補分子の１又は２以上の原子と、本発明のｓｏｌＡＣ構造の少なくとも１つの原子との間の相互作用を決定し、かかる相互作用がどの程度安定であるかを計算することを意味する。相互作用としては、電荷、立体性、親油性、考慮（considerations）等によって生じる誘引及び反発が挙げられる。この種の電荷及び立体的な相互作用は、コンピュータを用いてモデル化することができる。かかる計算の例としては、力場を介したもの、例えばAmber（Cornell et al. A Second Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules, Journal of the American Chemical Society, (1995), 117(19), 5179-97）が挙げられる。これは、タンパク質及びリガンドの原子を部分的に荷電させ、タンパク質とリガンド原子との静電相互作用エネルギーをクーロンポテンシャル（Coulomb potential）を用いて評価するものである。Amber力場では、ファン・デル・ワールスエネルギー項を割り当てることにより、二つの原子間における誘引及び反発の立体相互作用を評価することもできる。親油性相互作用のモデル化には各種の手段を用いることができる。例えば、ChemScore 関数（Eldridge M D; Murray C W; Auton T R; Paolini G V; Mee R P Empirical scoring functions: I. The development of a fast empirical scoring function to estimate the binding affinity of ligands in receptor complexes, Journal of computer-aided molecular design (1997 Sep), 11(5), 425-45）は、タンパク質及びリガンド原子に疎水性又は極性を割り当て、２つの疎水原子間の相互作用について望ましいエネルギー項を特定するものである。リガンド結合への疎水性の寄与を評価する他の方法を利用することもでき、これらは当業者に公知である。相互作用を評価する他の方法を利用することもでき、これらは分子設計分野の当業者に公知である。コンピュータを用いた適合のための様々な方法について、本明細書において更に説明する。

より具体的に、リガンドと本発明のｓｏｌＡＣ構造との相互作用は、ドッキングプログラムを用いたコンピュータモデリングにより調べることが可能である。かかるプログラムとしては、GOLD（Jones et al., J. Mol. Biol., 245, 43-53 (1995), Jones et al., J. Mol. Biol., 267, 727-748 (1997)）、GRAMM（Vakser, I.A., Proteins , Suppl., 1:226-230 (1997)）、DOCK（Kuntz et al, (1982) J.Mol.Biol., 161, 269-288; Makino et al, (1997) J.Comput.Chem., 18, 1812-1825）、AUTODOCK（Goodsell et al, (1990) Proteins, 8, 195-202, Morris et al, (1998) J.Comput.Chem., 19, 1639-1662.）、FlexX（Rarey et al, (1996) J.Mol.Biol., 261, 470-489）、又はICM（Abagyan et al, (1994) J.Comput.Chem., 15, 488-506）等が挙げられる。この手順は、リガンドの形状及び化学構造ｓｏｌＡＣにどの程度良好に結合するかを確認するべく、コンピュータによってリガンドをｓｏｌＡＣに適合させることを含んでいてもよい。

また、ｓｏｌＡＣの活性部位構造の試験を、コンピュータの支援の下、手動で実施してもよい。例えば、様々な官能基を有する分子と酵素表面との間の可能な相互作用部位を決定するプログラムであるGRID（Goodford, (1985) J. Med. Chem., 28, 849-857）を用いて活性部位を分析し、リガンドの代謝速度を変更する修飾の種類を予測してもよい。

コンピュータプログラムを用いて、２つの結合パートナー（即ち、ｓｏｌＡＣ構造及びリガンド）の誘引、反発、及び立体障害を予測してもよい。

２以上のｓｏｌＡＣ活性部位ポケットを特定し、それらに対応する複数の、より小型のリガンドを設計又は選択する場合には、これらの小型のリガンドの各々をより大型のリガンドに結合させたリガンドを形成し、各リガンドの活性部位における相対的な位置及び向きが維持されるようにしてもよい。大型のリガンドは、現実の分子として形成してもよく、コンピュータモデリングにより形成してもよい。

こうして、リガンドのｓｏｌＡＣに対する結合について、詳細な構造に関する情報を得ることができ、この情報を考慮して、リガンドの構造や官能基に調製を加えることにより、例えばそのｓｏｌＡＣとの相互作用を変更することができる。必要に応じ、上述の工程を２度、３度と繰り返してもよい。

別の態様によれば、本発明は、ｓｏｌＡＣの活性を調節するためのリガンドを特定する方法であって：（ａ）二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５に係る３次元原子座標データ、或いはその選択座標を使用して、少なくとも１のｓｏｌＡＣ結合部位、好ましくは複数のｓｏｌＡＣ結合部位を特定する工程；（ｂ）候補リガンドの構造を用意する工程；（ｃ）前記候補リガンドを前記１又は複数の結合部位に適合させる工程；並びに（ｄ）前記１又は複数の結合部位に適合する候補リガンドを選択する工程を有する方法を提供する。

一実施形態によれば、複数の候補リガンドについて、結合部位との相互作用に関する選定又は照合を行なう。一例によれば、工程（ｂ）が、候補リガンドの構造を用意する公邸を含んでなるとともに、その各々を工程（ｃ）において適合させることにより、コンピュータにより化合物のデータベース（例えば the Cambridge Structural Database）から結合部位との相互作用に関する選定を行なう。即ち、コンピュータによりリガンドのデータベースから、結合部位との相互作用に関するスクリーニングを行なうことにより、候補リガンドを選択してもよい（Martin, J. Med. Chem., vol 35, 2145-2154 (1992) 参照）。別の例によれば、リガンドの３−Ｄ記述子が取得される。この記述子は、例えば、１又は２以上の結合空隙の構成及び化学的性質から誘導される、幾何学的及び機能的制約を含む。この記述子を用いて化合物データベースを照合することにより、特定されたリガンドが記述子の特徴に合致する化合物となる。実際には、この記述子は仮想ファーマコフォアの一種である。

上述したように、本発明のｓｏｌＡＣ構造に適合されるリガンドとしては、医薬品候補として開発中の化合物が含まれる。かかる薬剤を適合させることにより、ｓｏｌＡＣの作用がどのようにかかる薬剤を修飾するかを決定することができ、例えばＡＴＰと競合的にｓｏｌＡＣに結合する、候補リガンドをモデリングする基礎を提供することができる。

本発明に係るリガンド化合物を取得し、特性決定を行なった後、本発明は更に、ｓｏｌＡＣの活性を調節する方法であって：（ａ）ｓｏｌＡＣがリガンドの不在下でＡＴＰと結合し得るような条件の下、ｓｏｌＡＣを用意する工程；（ｂ）リガンド化合物を用意する工程；及び（ｃ）ｓｏｌＡＣがＡＴＰと結合する能力が、当該化合物の存在によってどの程度（例えば競合的に）変化するかを決定する工程を含んでなる方法を提供する。

（iii）リガンドの分析及び修飾
あるリガンドが、ｓｏｌＡＣの作用を調節することが知られている場合、或いは調節するとの可能性がある場合、リガンドと相互作用するｓｏｌＡＣの残基をより良好に決定するために、前記リガンドの構造をモデル化してもよい。また、本発明は、ｓｏｌＡＣリガンドとして機能する更なるリガンドを予測するプロセスであって：
当該リガンドをｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造（この３次元構造は、ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の座標、或いはその選択座標により定義される）、或いはその選択座標に適合させる工程；
当該リガンドがどのように当該触媒ドメインに結合するかを決定又は予測する工程；及び
リガンド構造の触媒ドメインとの相互作用を増加又は提言させるように、リガンド構造を修飾する工程を含んでなる方法を提供する。

通常、リガンドの修飾は、出発リガンドに比べてより有効なリガンド、或いは、より医薬的に許容し得るリガンドを作製する目的で行なわれる。

当業者には当然であるが、構造の修飾は通常コンピュータ内で（in silico）行なわれ、これによって、修飾した構造がｓｏｌＡＣとどのように相互作用するかを予測することが可能となる。

Greer等（Greer et al. (1994), J. of Medicinal Chemistry, 37, 1035-1054）は、コンピュータモデリングの繰り返し配列、タンパク質リガンド複合体形成、Ｘ線結晶学又はＮＭＲ分光分析に基づく、リガンド設計のための反復的アプローチについて記載している。即ち、新規のチミジル酸生成酵素阻害剤群がGreer等によって新たに（de novo）設計されており、ｓｏｌＡＣリガンドについてもこの手法で設計又は修飾することができる。より具体的には、例えばｓｏｌＡＣの解析された構造に対するGRIDを用いて、ｓｏｌＡＣ結合部位の官能性を補完するようなｓｏｌＡＣのリガンドを設計することができる。或いは、ｓｏｌＡＣ結合部位の官能性をより良好に、或いは不十分に補完するように、ｓｏｌＡＣのリガンドを修飾してもよい。続いて、このリガンドを合成し、ｓｏｌＡＣとの複合体を形成させた後、この複合体をＸ線結晶学で分析し、結合したリガンドの実際の位置を同定する。続いて必要であれば、Ｘ線分析の結果を考慮して、リガンドの構造及び／又は官能基を調節し、最適化されたリガンドが得られるまで、配列の合成及び分析を繰り返す。構造に基づく薬剤設計に対する関連アプローチは、Bohacek等 (1996) Medicinal Research Reviews, 16, 3-50 にも論じられている。構造に基づく薬剤設計を用いて、別のｓｏｌＡＣ特性に対するリガンドを設計する場合には、第２の標的タンパク質に対する高親和性の必要性を考慮してもよい。Gschwend等（Gschwend et al. (1999),.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9, 307-312）及びBayley等（Bayley et al. (1997) Proteins: Structure, Function and Genetics, 29, 29-67）は、構造に基づく薬剤設計を用いて、標的タンパク質に対する親和性を維持しつつ、あるタンパク質に対する親和性を低減するアプローチについて記載している。

修飾は本技術分野では従来から、薬化学者には知られており、例えば、本発明のｓｏｌＡＣ構造のアミノ酸側鎖基と相互作用する残基を含む基の置換又は除去が挙げられる。例えば、置換としては、試験化合物における基の電荷を減少又は増加させるための基の付加又は除去、試験化合物における基のサイズを増加又は減少させるための基の置換、反対の電荷を有する基による荷電基の置換、又は、疎水性基の親水性基による置換、若しくはその逆の置換が挙げられる。当然のことながらこれらは、新規の医薬化合物の開発に携わる薬化学者が考慮する置換の種類を例示したに過ぎず、出発化合物の性質及びその活性に基づいて、他の修飾を加えることも可能である。

出発リガンドを本発明のｓｏｌＡＣ構造に適合させ、この修飾リガンドから予測を行なうことにより、修飾リガンドの候補を開発した場合、本発明は更に、修飾リガンドを合成する工程、及び、そのｓｏｌＡＣのリガンドとしての活性及び／又は有効性を決定するべく、それをインビボ又はインビトロの生物系で試験する工程を含んでなる。

修飾リガンド自体を更なるリガンド設計の基礎として、上述の本発明のプロセスを反復して行なうこともできる。また、上述の本発明のプロセスを用いて、ｓｏｌＡＣ結合ポケット内においてと相互作用する第２のリガンドを修飾することもできる。

（iv）結合ポケット領域内のリガンドの分析
一実施形態によれば、本発明は、リガンドの構造を修飾するための方法であって：
当該リガンドをｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造（この３次元構造は、ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の座標、或いはその選択座標によって定義される）、或いはその選択座標に適合させる工程；及び
前記リガンド構造の前記触媒ドメインとの相互作用を増加又は低減させるよう、前記リガンド構造を修飾する工程を含んでなり、
当該適合が、表６から１１の何れか、例えば表６、７、又は１１に記載のアミノ酸残基の少なくとも１の座標を含むものとして定義される、リガンド結合領域に対して行なわれる、方法を提供する。各表の好ましい選択座標、又は２以上の表からの好ましい組み合わせについては、本明細書に別途記載する通りである。通常、リガンドの修飾は、その阻害効力やその医薬としての許容性を向上させる目的で行なわれる。

誤解を避けるために言えば、「修飾する（modifying）」という語は、先の各節で定義した意味で使用される。一旦かかるリガンドが開発された後は、それを上述のように合成及び試験してもよい。

（vi）断片連結及び成長（Fragment linking and growing）
また、本発明の結晶構造の供給によれば、断片連結（fragment linking）又は断片成長（fragment growing）アプローチに基づく、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結合ポケット領域と相互作用するリガンド（例えば、特にｓｏｌＡＣの阻害剤又は活性剤として機能するリガンド）の開発も可能となる。

例えば、タンパク質結合ポケットにおける、１又は２以上のリガンド断片の結合を、Ｘ線結晶学により決定することができる。リガンド断片は通常、分子量が１００から２００Ｄａの範囲内の化合物である（Carr et al, (2002) Drug Discov Today. May 1;7(9):522-7）。これらは続いて、医薬品化学における、構造に基づくアプローチを用いて相互作用を最適化するための出発点となる。これらの断片は、テンプレートに結合させてもよく、或いは、タンパク質の他のポケット内にリガンドを「成長（growing out）」させるための出発点として使用することができる（Blundell et al; Nat Rev Drug Discov. (2002) Jan;1(1):45-54）。これらの断片をｓｏｌＡＣの結合ポケット内に配置してから「成長（grown）」させ、利用可能な空間を満たすことにより、分子認識に関与する静電、ファン・デル・ワールス又は水素結合による相互作用を探索することもできる。従って、結合力が弱い元の断片の効力を、構造に基づく反復化学合成を用いて、速やかに改善することが可能となる。

断片成長アプローチにおける１又は２以上の段階において、そのリガンドを合成し、その活性について生物系で試験してもよい。その結果を用いることで、更なる断片の成長の指針とすることができる。

２つの断片結合領域が同定された場合は、結合断片アプローチ（linked fragment approach）は、所望の特性を有し得るより大きな結合構造を得るべく、２つの断片を直接結合させるか、或いは上述した手法によって、断片の一方又は双方を成長させる試みに基づいて行なってもよい。

結合断片アプローチを用いて、例えば、ＡＴＰ結合部位及び重炭酸イオン結合部位を占有するリガンドの設計を行なってもよい。両部位を少なくとも部分的に占有するこのようなリガンドは、ＡＴＰ結合部位のみを占有するリガンドと比べて、ｓｏｌＡＣの選択性により優れている可能性がある。

２以上のリガンドが結合する部位が決定された場合には、それらを結合させてリード化合物の候補を作成し、例えばGreer等の反復法を用いてそれを更に精緻化することも可能である。仮想結合断片アプローチについては、Verlinde等（Verlinde et al. (1992) J. of Computer-Aided Molecular Design, 6, 131-147）を参照のこと。また、ＮＭＲ及びＸ線アプローチについては、Shuker等（Shuker et al. (1996) Science, 274, 1531-1534）及びStout等（Stout et al. (1998) Structure, 6, 839-848）を参照のこと。ｓｏｌＡＣ構造の決定によって、これらのアプローチを用いたｓｏｌＡＣリガンドの設計が可能となる。

（vii）本発明の化合物
本発明の方法に従って、本発明のｓｏｌＡＣ触媒ドメイン構造のリガンド候補が同定されたら、本発明は更に、同定されたリガンドを合成する工程と、その活性及び／又はその有効性を決定するべく、インビボ又はインビトロの生物系で試験する工程とを更に含んでなる。

本発明のこの態様は：
リガンドを合成又は取得する工程；及び
この候補リガンドをｓｏｌＡＣと接触させ、候補リガンドがｓｏｌＡＣと相互作用する能力を決定する工程を更に含んでなることが好ましい。

例えば、上述の接触工程において、基質（通常はＡＴＰ）の存在下、及び一般的にはバッファーの存在下で、候補リガンドをｓｏｌＡＣと接触させ、当該候補リガンドがｓｏｌＡＣと結合する（例えばこれを阻害する）能力を決定する。かかる方法の１つとしては、ＨＴＲＦを用いた免疫アッセイが挙げられる。これは、ｓｏｌＡＣによって産生されたｃＡＭＰと、ＸＬ−６６５−標識ｃＡＭＰとを、Ｅｕクリプテートで標識した抗ｃＡＭＰ抗体に競合的に結合させるものである（http://www.htrf-assays.com; Gabriel D, Vernier M, Pfeifer MJ, Dasen B, Tenaillon L, Bouhelal R. (2003) Assay & Drug Dev. Technol.; 2: 291-303）。即ち、例えば、候補リガンド、基質及びバッファーを含んでなる、ｓｏｌＡＣ用アッセイ混合物を作製すればよい。

特に後者の工程では、候補リガンドの機能が決定される条件下で、候補リガンドをｓｏｌＡＣと接触させることがより好ましい。

以上の代わりに、又は以上に加えて、この方法は：
リガンドを取得又は合成する工程；
ｓｏｌＡＣタンパク質又はその触媒ドメインと当該リガンドとの複合体を形成する工程；及び
当該複合体をＸ線結晶学で分析し、当該リガンドがｓｏｌＡＣ又はその触媒ドメインと相互作用する能力を決定する工程を更に含んでいてもよい。

これらの工程を使用して、本発明の構造に適合可能なリガンドを反復プロセスにより同定すれば、更なるリガンドを設計することが可能となる。

例えば、上述の接触工程において、基質（通常はＡＴＰ）の存在下、及び一般的にはバッファーの存在下で、候補リガンドをｓｏｌＡＣと接触させ、当該候補リガンドがｓｏｌＡＣと結合する（例えばこれを阻害する）能力を決定する。即ち、例えば、候補リガンド、基質及びバッファーを含んでなる、ｓｏｌＡＣ用アッセイ混合物を作製すればよい。

別の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の本発明の方法により同定されたｓｏｌＡＣリガンドである、化合物を包含する。

かかる化合物を同定したら、その化合物を製造し、及び／又は、例えば医薬品、医薬組成物又は薬物等の組成物の調製（即ち製造又は製剤）に使用することができる。これらを個体に投与してもよい。

即ち、本発明の種々の態様は、本発明により提供される化合物のみならず、かかる化合物を含んでなる医薬組成物、医薬品、薬剤、又は他の組成物にも及ぶものとする。これらの組成物は、例えばガン、炎症、骨粗鬆症、糖尿病、緑内障、又は不妊等の疾病の処置（予防的処置を含んでいてもよい）に使用することができる。これらの組成物はまた、例えば精子運動能又は受精を阻害することにより、避妊法に用いてもよい。

本明細書において、疾病や病状の処置の文脈で使用される「処置（treatment）」という語は通常、ヒトか動物か（例えば獣医学用途）を問わず、何らかの所望の治療効果が達成されるような処置及び治療に関する。かかる治療効果としては例えば病状の進行の抑制等が挙げられ、進行速度の低減や、進行速度の停止、病状の寛解、疾病や病状の治癒等も含まれる。また、予防的手段としての処置（即ち予防法（prophylaxis））も含まれる。

本明細書で使用される「治療的に有効な量（therapeutically-effective amount）」という語は、活性化合物の量、或いは活性化合物を含有する物質、組成物又は投与製剤の量であって、所望の処置計画に従って投与された場合に、妥当なリスク対効果比（benefit/risk ratio）に見合った、何らかの所望の治療効果を生じさせるのに有効な量を指す。

「処置（treatment）」という語は、複数の処置及び治療の組合せを含む。この場合、これら２以上の処置又は治療は、例えば連続的に、或いは同時に行なわれる。

本発明の化合物、或いは本発明に従って得られた化合物には、ｓｏｌＡＣ活性の阻害剤である化合物が含まれる。よってこれらは、精子運動能及び運動過剰、受精能獲得及びアクロソーム反応を予防し、及び／又は、可能にする手段を提供する上で、有用であると期待される。従って、男性におけるある形態の不妊又は生殖不能を処置し、及び／又は、卵母細胞の受精とそれに続く妊娠を予防する上で、これらの化合物は有用であると期待される。

処置の対象となり得るガンの例としては、これらに限定されるものではないが、癌腫、例えば膀胱、乳、結腸（例えば結腸直腸癌、例えば結腸直腸腺癌及び結腸腺癌）、腎臓、表皮、肝臓、肺、例えば腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、例えば外分泌膵臓癌、胃、子宮頚、甲状腺、前立腺、又は皮膚、例えば扁平細胞癌；リンパ性造血系腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキン（Hodgkin）リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、又はバーケット（Burkett）リンパ腫；骨髄細胞系列の造血系腫瘍、例えば急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、又は前骨髄球性白血病；多発性骨髄腫；濾胞性甲状腺癌；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫又は横紋筋肉腫；中枢又は末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫又は神経鞘腫；黒色腫；精上皮腫；奇形癌；骨肉腫；色素性乾皮症；角結膜種（keratoctanthoma）；又はカポジ肉腫が挙げられる。

ｓｏｌＡＣの阻害によって寛解され得る炎症性疾患又は病状の例としては、これらに限定されるものではないが、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎、外傷性関節炎、風疹性関節炎、乾癬性関節炎、及び他の関節炎症状；アルツハイマー病；毒素性ショック症候群、内毒素により誘発される炎症反応、又は炎症性腸疾患； 結核、粥状硬化、筋変性、ライター症候群、痛風、急性滑膜炎、敗血症、敗血症ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、成人呼吸窮迫症候群、脳マラリア、慢性肺炎症性疾患、珪肺症、肺サルコイドーシス、骨吸収病、再灌流傷害、移植片対宿主反応、同種移植片拒絶、感染による発熱及び筋肉痛、例えばインフルエンザ、悪液質、特に感染又は悪性病変に続発する悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に続発する悪液質、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）、ケロイド形成、瘢痕組織形成、クローン病、潰瘍性大腸炎、胸焼け、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、肺線維症、及び細菌性肺炎が挙げられる。

特に興味深いのは、炎症性疾患及び病状、リウマチ様関節炎及び変形性関節炎の処置又は予防に使用できる化合物である。

即ち、本発明は、上述した病状の処置を提供する。ここで、当該処置は、本発明に従って得られた化合物を含んでなる組成物を、例えば疾病の処置のために患者へ投与すること；例えば疾病の処置用に投与される組成物の製造における化合物（例えばｓｏｌＡＣ阻害剤）の使用；並びに、医薬組成物を製造する方法であって、かかる化合物を、医薬的に許容し得る賦形剤、ビヒクル又は担体、及び、任意により他の成分と混和する工程を含む方法を含んでいてもよい。

即ち、本発明の更なる態様は、医薬品、医薬組成物又は薬物を調製する方法であって：（ａ）本明細書に記載された本発明の別の態様のうち何れかの方法により、化合物を特定又は修飾する工程；（ｂ）化合物の構造を最適化する工程；及び（ｃ）前記最適化された化合物を含有する医薬品、医薬組成物又は薬物を調製する工程を含んでなる方法を提供する。

修飾された化合物自体を他の化合物設計の基礎として、本発明の上述のプロセスを反復してもよい。

「構造を最適化する（optimising the structure）」という語は、例えば、分子の足場の追加、官能基の追加若しくは変更、又は、（例えば、断片連結アプローチを用いた）他の分子への分子の連結であって、リガンド分子の化学構造を変化する一方、その本来の調節済みの官能性を維持又は強化するようなものをいう。かかる最適化は、薬剤開発プログラムにおいては定常的に、例えばリード化合物の効力の強化、医薬的許容性の改善、化学安定性の増加等を目的として行なわれている。

修飾には、薬化学の当業者に公知の従来法を用いればよい。例としては、本発明のｓｏｌＡＣ構造のアミノ酸側鎖基と相互作用し得る残基を有する基の置換又は除去が挙げられる。置換としては、例えば、試験化合物中の基の電荷を上昇又は下降させるための基の付加又は除去、反対の電荷を有する基による荷電基の置換、或いは、親水性基による疎水性基の置換（又はその逆）が挙げられる。当然のことながら、これらは、新規の医薬化合物の開発に携わる薬化学者が考慮する置換の種類の例に過ぎず、出発化合物の性質やその活性に応じて、他の修飾を加えてもよい。

組成物の製剤は、任意の好適な投与経路及び手段に応じて行なえばよい。医薬的に許容し得る担体又は希釈剤としては、経口、直腸内、鼻腔内、局所（口腔及び舌下を含む）、膣内又は非経口（例えば皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下及び硬膜外）投与に適した製剤に使用されるものが挙げられる。製剤は単位投薬形態とすることが便宜上好ましい。かかる形態は、製薬分野で周知の方法の何れかにより調製することができる。

個体組成物の場合、従来の毒性のない個体担体としては、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロ誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、滑石、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。医薬的に投与可能な液体組成物は、例えば、上に定義した活性化合物を、任意により医薬アジュバントとともに、例えば水、食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノール等の担体中に溶解又は分散等させ、溶液又は分散液とすることにより調製される。所望であれば、投与用の医薬組成物は更に、毒性のない補助物質等を少量含有していてもよい。例としては、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン等が挙げられる。かかる投薬形態を実際に調製する方法は、本技術分野の当業者には公知であり、又は明らかである。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsを参照のこと。

本発明を以下の実施例により説明する。

ｓｏｌＡＣの三次元（３級）構造の決定に利用可能なポリペプチド（又はタンパク質）を得るためには、総遺伝子合成又はクローニングによって、ｓｏｌＡＣをコード化するＤＮＡを取得すればよい。続いて、このＤＮＡを好適な発現系で発現させ、得られたポリペプチドを、三次元構造を決定するための手法に供すればよい。

ｓｏｌＡＣのクローニング、発現及び精製の概要
構造研究用のｓｏｌＡＣの発現及び精製を行なうべく、幾つかの異なるコンストラクトを作成し、大腸菌（E. Coli）及び昆虫細胞の双方での発現に供した。以下に続く詳細な実施例では、好ましいコンストラクト（２０５６）の発現について説明する。このコンストラクトの発現及び回収のための条件は、多数のコンストラクトや発現及び精製条件を徹底的に研究した末に到達したものである。

コンストラクトは、残基１と４６９との間に、ｓｏｌＡＣタンパク質の全部又は一部を含有すると共に、Ｎ末端又はＣ末端タグを含有する。Ｃ末端タグとしては、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus：ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂性ＧＳＴ、又は、ＴＥＶ開裂性Ｈｉｓ６タグのいずれかを用いた。一部のコンストラクトについては更に、Ｃ末端にＨｉｓ６タグを用いた。分析を行なったコンストラクトを下記表１４に記す。

コンストラクト１〜８はバキュロウイルス発現系での発現に供し、９〜１５は大腸菌（E. Coli）における発現に供した。

大腸菌（E. Coli）コンストラクト
コンストラクトは何れも、温度を３０から３７℃の間に維持しながら誘導することにより、封入体として発現されたものである。可溶性発現を達成するべく、誘導時に温度を１５℃まで下げたところ、ある程度の可溶性発現が得られたが、抗ＳＡＣ抗体を用いたウエスタンブロット分析の観察によれば、全てのコンストラクトに重度のタンパク質分解がみられた。コンストラクト２０３３の封入体調製は、BiegerによるＴ・ブルーセイ（T. brucei）ＡＣプロトコル（Bieger, B. and Essen, L-O. (2000) Acta Cryst. D56, 359-362）を出発点として実施した。

要約すると、細胞（主にコンストラクト２０３３）を懸濁させ、超音波処理で溶解し、遠心分離で浄化した。封入体ペレットを再懸濁させ、よく洗浄した後に、６Ｍ ＧｕＨＣｌ又は８Ｍ 尿素に再可溶化した。使用したバッファーの主成分は、トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、又はＰＢＳ、ｐＨ７．６。洗浄の一部では、界面活性剤としてTriton 100 を使用した。（Ｎｉ−ＮＴＡ及び非ニッケル）固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂TALON^{（登録商標）}（Clontech, Mountain View, CA）カラムを変性条件下で使用し、着目するタンパク質を捕捉した。変性可溶化タンパク質を、１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄／Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ７．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍ アルギニン、１０％グリセロールを用いて２時間透析したところ、大部分の混入物質が溶液中に残存したまま、着目するタンパク質が溶液から出現した。再可溶化ｓｏｌＡＣタンパク質を条件数８×９６のリフォールディングスクリーン内で使用した。活性タンパク質をリフォールディングする一分の条件が同定された。例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、０．５Ｍ アルギニン、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＢＭＥ、及び１０％グリセロール等が挙げられる。こうして得られたリフォールディング済み活性タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに通して更に精製した。タンパク質の収率は低かったので、その後の試験は昆虫細胞での発現のみに絞った。

バキュロウイルスコンストラクト
研究は主に文献に記載されたコンストラクトに絞って行なった。これらはアッセイにおいて、活性を有し、且つコンピテントであることが示されているからである。しかしながら、文献においては発現収率が低く、精製の先例もないという点に大きな懸念があった。ｓｏｌＡＣコンストラクトをSf9及びHigh Five^{（登録商標）}細胞中で発現させたところ、後者において良好であることが示された。

Ｎ末端にＧＳＴタグを付したｓｏｌＡＣコンストラクト（２０２２）は、ＧＳＴとｓｏｌＡＣドメインとの間のリンカーに、遺伝子操作によりＴＥＶ切断部位を有する。細胞をまずＰＢＳ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＢＭＥに懸濁させ、氷上、超音波処理で溶解し、遠心分離で浄化した。上清を遠心分離で再浄化したところ、試験管に貯留後数分で半透明／不透明になった。このペレットをＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで分析したところ、無傷及びタンパク分解切断性sＡＣが沈殿のかなりの割合を占めていることが分かった。様々なバッファーを、４℃及び室温（約２０℃）という２通りの温度で調べ、溶解物を安定化させる方策を探った。これらのバッファーを下記の表１５に示す。

何れのバッファーについても、~２ｇの細胞を各々のバッファー５ｍｌに分散させ、凍結融解サイクルに供して破裂させた。この懸濁液が「濁る（cloud）」、又は沈殿する性向を有することが確認された。最も良好な結果が得られたのは、ｐＨが７．５から８．５の間であり、温度を４℃に維持し、０．３Ｍ又は０．５Ｍ ＮａＣｌが存在する場合であった。界面活性剤は悪影響を及ぼすことが分かった。ＰＢＳとの分離実験により、このバッファーには安定性に関する課題があることが示唆された。

最適条件は、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５（４℃で測定）；０．３Ｍ ＮａＣｌ １０％グリセロール；及び２〜５ｍＭ ＢＭＥであった。

コンストラクト２０５６はＣ末端にヘキサヒスチジンタグを有するため、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いれば、タンパク質を捕捉することができる。TALON^{（登録商標）}カラムを使用しても、捕捉性は向上しない。バッファーの選択によって、溶解物の安定性を顕著に向上させることができたものの、流速を低くして樹脂との十分な接触時間を確保する必要があり、これが依然として難点であったため、ＤＥＡＥカラムを用いた前洗浄（pre-cleanup）工程を実施することにした。このために、細胞を塩濃度の極めて低いバッファーに懸濁させ、溶解させ、浄化して、ＤＥＡＥカラムに通した。標的タンパク質のマトリックスへの結合が弱いために、溶解物の伝導度は極めて低い値に維持しなければならなかった。これを怠ったため、捕捉量はごく僅かであった。溶出は２段階の勾配をかけて行ない、コンストラクト２０２２及び２０５６の何れも第１の段階で溶出された。混入物質の多くは易沈殿性であり、カラムに吸着されなかった。画分をプールして、ＮａＣｌ濃度を３００ｍＭに調節した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム又はグルタチオンセファロース４ｂカラムの何れかに通した。この工程を追加することで、その後の工程を低流速で行なっても、酵素の回収率を高くすることができた。後に本発明者等は、細胞を高塩濃度バッファーで溶解させた後、浄化の直後にバッチを高流速でＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させた。

ｓｏｌＡＣ−２０５６含有画分からイミダゾールを除去することが、タンパク質回収を首尾よく行なうための鍵となる要素であった。Ｎｉ−ＮＴＡ溶出の再現性を確立した後、タンパク質プールのバッファーを５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５（４℃）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、及び１ｍＭ ＢＭＥに変更した上で、resource Q カラムに導入した。低塩濃度下でのタンパク質滞留時間は最短となるよう維持した。タンパク質の収率に最も大きな損失が生じたのがこの工程であり、最大５０％のタンパク質が損なわれたからである。resource Q 工程は良好に完了したが、この工程におけるバッファーのｐＨ及び伝導度は極めて重要であることが分かった。これらのパラメーターの何れかを変更した場合、タンパク質が結合できず、ゲルの精製プロファイルには改善が見られなかった。精製の最終工程では、タンパク質を、本発明者等が見出した最も安定なバッファー、即ち５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５（４℃）、３３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＢＭＥに移送した。

タンパク質を濃縮したところ、４０ｍｇ／ｍｌを超えても凝集の徴候は見られなかったが、１０ｍｇ／ｍｌにおいて結晶化が始まった。

驚くべきことに、コンストラクト２０２２と２０５６との類似性にもかかわらず（ＴＥＶ切断後の２０２２は、数個のアミノ酸残基をＮ末端に有する点と、Ｈｉｓ６タグがＣ末端に存在しない点のみが異なる）、２０２２は５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でオリゴマー化したのに対して、２０５６は４０ｍｇ／ｍｌまで単量体のままであった。

クローニング、ｓｏｌＡＣの発現及び精製−２０５６
全長ｓｏｌＡＣをコード化する発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（ヌクレオチドＮＭ ０１８４１７ SwissProt）を、ＰＣＲ増幅用のテンプレートとして用いた。

ｓｏｌＡＣ−２０５６のクローニング
コンストラクトＭ１−Ｖ４６９をＰＣＲにより増幅した。

５’プライマー：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧ３’（配列番号１）
attB1認識配列と、塩基１〜１１に対応する配列を有する。

３’プライマー：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣ３’（配列番号２）
塩基４６３〜４６９に対応する配列、６ｈｉｓＣ末端タグ、停止コドン、及びattB2認識部位を導入されている。

ＰＣＲ反応試薬：１０μｌ Thermopol バッファー １０×、２μｌ ｄＮＴＰ混合液、１μｌ ＤＮＡテンプレート、１μｌ ５’プライマー、１μｌ ３’プライマー、１μｌ Vent。Ｈ₂Ｏを加えて反応液を１００μｌとした。

ＰＣＲサイクリング：９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３分のサイクルを２５サイクル、その後更に７２℃で１０分。

Gateway（登録商標）cloning technique のＢＰ反応を用いて、１４０７−ｂｐ断片を、導入ベクターであるｐＤＯＮＲに組み換え導入した。

生成物のアリコットをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。カナマイシン選択プレート上で生育させた細菌からプラスミドを抽出した。配列をＤＮＡシークエンシングで確認した後、クローンを目的ベクターであるｐＤＥＳＴ８に、Gateway（登録商標）cloning technique のＬＲ反応により移送した。生成物のアリコットをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。カルベニシリン選択プレート上で生育させた細菌からプラスミドを抽出した。配列をＤＮＡシークエンシングで確認した後、タンパク質の発現を開始した。

ｓｏｌＡＣ−２０５６のタンパク質配列は以下の通りである。
ＭＮＴＰＫＥＥＦＱＤＷＰＩＶＲＩＡＡＨＬＰＤＬＩＶＹＧＨＦＳＰＥＲＰＦＭＤＹＦＤＧＶＬＭＦＶＤＩＳＧＦＴＡＭＴＥＫＦＳＳＡＭＹＭＤＲＧＡＥＱＬＶＥＩＬＮＹＨＩＳＡＩＶＥＫＶＬＩＦＧＧＤＩＬＫＦＡＧＤＡＬＬＡＬＷＲＶＥＲＫＱＬＫＮＩＩＴＶＶＩＫＣＳＬＥＩＨＧＬＦＥＴＱＥＷＥＥＧＬＤＩＲＶＫＩＧＬＡＡＧＨＩＳＭＬＶＦＧＤＥＴＨＳＨＦＬＶＩＧＱＡＶＤＤＶＲＬＡＱＮＭＡＱＭＮＤＶＩＬＳＰＮＣＷＱＬＣＤＲＳＭＩＥＩＥＳＶＰＤＱＲＡＶＫＶＮＦＬＫＰＰＰＮＦＮＦＤＥＦＦＴＫＣＴＴＦＭＨＹＹＰＳＧＥＨＫＮＬＬＲＬＡＣＴＬＫＰＤＰＥＬＥＭＳＬＱＫＹＶＭＥＳＩＬＫＱＩＤＮＫＱＬＱＧＹＬＳＥＬＲＰＶＴＩＶＦＶＮＬＭＦＥＤＱＤＫＡＥＥＩＧＰＡＩＱＤＡＹＭＨＩＴＳＶＬＫＩＦＱＧＱＩＮＫＶＦＭＦＤＫＧＣＳＦＬＣＶＦＧＦＰＧＥＫＶＰＤＥＬＴＨＡＬＥＣＡＭＤＩＦＤＦＣＳＱＶＨＫＩＱＴＶＳＩＧＶＡＳＧＩＶＦＣＧＩＶＧＨＴＶＲＨＥＹＴＶＩＧＱＫＶＮＬＡＡＲＭＭＭＹＹＰＧＩＶＴＣＤＳＶＴＹＮＧＳＮＬＰＡＹＦＦＫＥＬＰＫＫＶＭＫＧＶＡＤＳＧＰＬＹＱＹＷＧＲＴＥＫＶＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）

このコンストラクトの６’Ｈｉｓタグは開裂性ではない。

ｓｏｌＡＣ−２０５６のタンパク質産生
ｓｏｌＡＣ−２０５６の組み換えウイルスの産生は、以下の手法で行なった。要約すると、関連遺伝子をコード化するｐＤＥＳＴ８ベクターを、バキュロウイルスゲノム（Bacmid ＤＮＡ）を有する大腸菌（E. Coli）ＤＨ１０ＢＡＣ細胞に形質転換した。細胞での転位により、前記遺伝子と、バキュロウイルスポリヘドロン（polyhedron）プロモーターを含むゲンタマイシン抵抗性遺伝子とを有するｐＤＥＳＴ８ベクターの領域が、Bacmid ＤＮＡ内に直接転移された。ゲンタマイシン、カナマイシン、テトラシクリン及びBluo-Galに基づく選択を行なった。得られた白色コロニーは、関連遺伝子をコード化する組み換えbacmid ＤＮＡを有していると考えられる。白色ＤＨ１０ＢＡＣ細胞の培養物からBacmid ＤＮＡを抽出し、ＳＦ９００II無血清培地で生育させたヨウトガ（Spodoptera frugiperda）Ｓｆ９細胞に対して、メーカーの指示に従ってトランスフェクトさせた。感染後７２時間でウイルス粒子を収穫した。収穫されたウイルス粒子のアリコット１ｍｌを使用して、１×１０⁶細胞／ｍｌのｓｆ９細胞１００ｍｌに感染させた。感染後７２時間で培養培地の細胞を収穫した。

Ｈｉ５昆虫細胞をEX-Cell405（JRH）無血清培地で、密度が１x１０⁶細胞／ｍｌとなるまで培養した。Ｈｉ５細胞１リットル当たり、ウイルスストックのアリコット５ｍｌを加えた。培養物を２７℃で４８〜７２時間インキュベートした。４０００ｒｐｍで８分の遠心分離により細胞を収穫した。ペレットを−８０℃で冷凍した。

ｓｏｌＡＣ−２０５６のタンパク質精製法
別途記載した場合を除き、以下の手順は何れも４℃で実施した。細胞ペレットを氷上で解凍し、溶解バッファー（５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＢＭＥ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Calbiochem）に再懸濁させた。細胞を超音波処理で溶解し、溶解物をDNase1とともに４℃で１時間インキュベートした。溶解物を浄化するべく、１４，０００又は２５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。浄化した溶解物を更に、前記工程と同様の遠心分離によって浄化した後、０．４５μｍのフィルターに通過させてから、予めＮｉ²⁺で荷電させた金属キレート化マトリックス（GE Healthcare）に、バッチ結合モード（batch bind mode）で通過させた。樹脂又はマトリックスをカラムに注ぎ入れ、２５０ｍＭ イミダゾールを含有する溶解バッファーを加えて、ｓｏｌＡＣタンパク質を溶出させた。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分解し、ｓｏｌＡＣタンパク質含有画分をプールした。プールされたタンパク質を、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５ｍＭ ＢＭＥで平衡化したＧ２５−脱塩カラムに通過させ、低塩濃度バッファーに交換した。バッファー交換後のｓｏｌＡＣタンパク質を続いて６ｍｌのResource Q カチオン交換（GE Healthcare）カラムに通し、２０カラム容量で０〜３０％ １Ｍ ＮａＣｌの勾配をかけて溶出した。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分解し、ｓｏｌＡＣタンパク質含有画分をプールして、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、３３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５ｍＭ ＢＭＥで予め平衡化した 26/60 superdex-75 ゲル濾過カラムに通した。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分解した。ｓｏｌＡＣ画分をプールし、最終濃度~１０ｍｇ／ｍｌとなるまで、vivaspin2 遠心濃縮器（HY）を用いて濃縮した。

別のｓｏｌＡＣ−２０５６の精製法
別途記載した場合を除き、以下の手順は何れも４℃で実施した。細胞ペレットを氷上で解凍し、溶解バッファー（５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、１０％ グリセロール、２ｍＭ ＢＭＥ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Calbiochem）に再懸濁させた。細胞を超音波処理で溶解し、溶解物をDNase1とともに４℃で１時間インキュベートした。溶解物を浄化するべく、１４，０００又は２５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。浄化した溶解物を更に、前記工程と同様の遠心分離によって浄化した後、０．４５μｍのフィルターに通過させてから、ＤＥＡＥカチオン交換樹脂に通した。１Ｍ ＮａＣｌの１５及び３０％の段階勾配によってタンパク質を溶出した。１５％のピークをプールし、プールされたタンパク質のＮａＣｌ濃度を３００ｍＭまで上昇させてから、予めＮｉ²⁺で荷電させ、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、２ｍＭ ＢＭＥで平衡化した金属キレート化（通常５ｍｌ Hi-trap）カラム（GE Healthcare）に通した。２５０ｍＭ イミダゾールをが乳する平衡化バッファーを加えてｓｏｌＡＣタンパク質を溶出した。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分解し、ｓｏｌＡＣタンパク質含有画分をプールした。プールされたタンパク質を、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５ｍＭ ＢＭＥで平衡化したＧ２５−脱塩カラムに通過させ、低塩濃度バッファーに交換した。バッファー交換後のｓｏｌＡＣタンパク質を続いて６ｍｌのResource Q カチオン交換（GE Healthcare）カラムに通し、２０カラム容量で０〜３０％ １Ｍ ＮａＣｌの勾配をかけて溶出した。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分解し、ｓｏｌＡＣタンパク質含有画分をプールして、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、３３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５ｍＭ ＢＭＥで予め平衡化した 26/60 superdex-75 ゲル濾過カラムに通した。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分解した。ｓｏｌＡＣ画分をプールし、最終濃度~１０ｍｇ／ｍｌとなるまで、vivaspin2 遠心濃縮器（HY）を用いて濃縮した。

可溶性アデニル酸シクラーゼのタンパク質結晶化
市販のマイクロバッチ結晶化スクリーンを用いて、静滴又は懸滴蒸気拡散法により、ヒトｓｏｌＡＣの結晶を成長させた。一連の条件を試した上で、結晶が２００ｍＭ クエン酸塩（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム等）及び２０％ ＰＥＧ３３５０から生成することが分かった。これらの結晶は分厚い形状であったが、極めて小さかった。これらの結晶からの回折は僅かであり、最高分解度は６．０オングストロームであった。従って、ある程度の大きさと、許容し得る回折分解能とを有する結晶が形成される、異なる条件を探す必要があった。

初回スクリーンで得られた結晶は、緩衝化していない溶液から得られたものであった。懸滴蒸気拡散法を用いたその後の回のスクリーニングによれば、ｐＨ４．６〜５．２のバッファーを使用することで、結晶成長が促進されることが分かった。

結晶を生成させる溶液の最終ｐＨを、ｐＨ６．０〜６．４の範囲内で平衡化した。その後の回のスクリーニングでは、クエン酸濃度を０．２Ｍ クエン酸三ナトリウムで一定に維持する一方、ＰＥＧの濃度及び分子量を変化させた。ＰＥＧ４０００を、１０〜２０％の範囲の様々な濃度で使用することで、結晶化が促進されることが分かった。

最高の結晶が得られたのは１６％ ＰＥＧ４Ｋであったが、その質は一定ではなく、そのサイズも最長寸法が０．０５ｍＭから０．２ｍＭまでと様々であった。これらの結晶のうち最も優れたものは、分解能２．３オングストロームでの回折を示した。

よって、更なる最適化が必要であった。タンパク質を５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３３０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ベータメルカプトエタノール、及び１０％ グリセロール中で、~１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質溶液を体積比１：１で、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、１６〜１８％ ＰＥＧ４Ｋ、及び１０％ グリセロールの貯蔵溶液と混合した。懸滴蒸気拡散法により、結晶が４℃で成長した。

３〜６日後に液滴中に結晶が現れ、１４日後には最大で０．５×０．１×０．１ｍｍのサイズに達した。結晶のサイズ及び質の均一性を更に向上させるため、マイクロシーディング（microseeding）法を用いた。種晶ストック（seed stock）は、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、１４％ ＰＥＧ４Ｋ、２ｍＭ ベータメルカプトエタノール、及び１０％グリセロールの溶液中で、ｓｏｌＡＣ結晶を粉砕して調製した。種晶ストックの最適希釈率は、試験結晶化を行なって決定した。試験結晶化には、種晶ストックを１／１００、１／１００００、１／１００，０００、及び１／１０００，０００の希釈率で用いて、トレーをセットアップした。

結晶化トレーのセットアップは、タンパク質溶液及び種晶ストックをカバースリップ上で当量ずつ（通常１μｌ＋１μｌ）混合して行なった。これを０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、１４％ ＰＥＧ４Ｋ、及び１０％グリセロールを含有するウェル上に配置した。必要な希釈率はタンパク質のバッチ毎に異なる。

結晶は、格子寸法ａ＝ｂ＝９９．１５Å、ｃ＝９７．５１Åの空間群Ｐ６₃内で成長した。

低温でのデータ収集の間、結晶を保存するために、ｓｏｌＡＣの結晶を一時的に、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、３０％ ＰＥＧ４Ｋ、及び１０％グリセロールを含有する低温バッファー（cryobuffer）溶液中に移送した。この溶液から結晶を液体窒素中に即座に移送し、その後のデータ収集の間保存した。

データの収集及び処理
ｓｏｌＡＣの構造を分解するために使用される回折データは、Jupiter CCD 検出器又は RAXIS HTC イメージプレート検出器の何れかを用いて、社内で収集した。何れもリガク社製回転型陰極発生装置（rotating anode generators）に装着した。ｓｏｌＡＣ構造を精緻化するために使用した１．７Åの高分解データは、欧州シンクロトロン放射光施設（European Synchrotron Radiation facility）のBeamline ID29-1で、波長０．９３４ÅのADSC Quantum4 CCD 検出器を用いて収集し、MOSFLM（Leslie, A. G. W. (1992). In Joint CCP4 and EESF-EACMB Newsletter on Protein Crystallography, vol. 26, Warrington, Daresbury Laboratory）を用いて処理を行なった。データセットのスケーリングはSCALA（CCP4 - Collaborative Computational Project 4. (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallographica D50, 760-763）を用いて行ない、強度から構造因子振幅（structure factor amplitudes）への変換にはTRUNCATE（Evans, P. R. (1997). Scaling of MAD data. In Recent Advances in Phasing (ed. K. S. Wilson, G. Davies, A. W. Ashton and S. Bailey), pp. 97-102. Council for the Central Laboratory of the Research Councils Daresbury Laboratory, Daresbury, UK), from the CCP4 suite of programs (CCP4 - Collaborative Computational Project 4. (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallographica D50, 760-763）を用いた。

構造決定及び精緻化
可溶性アデニル酸シクラーゼの構造の解析は、多重同形置換（multiple isomorphous replacement）を用いて行なった。０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、１６％ＰＥＧ４Ｋ、及び１０％グリセロールを含有する溶液に、重金属含有化合物を溶解させることにより、様々な重金属溶液を調製した。続いて、ｓｏｌＡＣの結晶を溶液に入れ、様々な期間（２分から５日）に亘って平衡化した。これらの溶液の多くは結晶に損傷を与え、回折の完全な消失から、元の結晶と浸漬した結晶との間の同形性の消失まで、様々な影響を及ぼす。

多数（＞１００）の浸漬のうち、３１の結晶が使用可能なデータセットを有しており、更にこれらのうち５つが、重原子の位置及び占有について、分析及び解析が可能な誘導体を生じていた。差パターソン法（Difference Patterson methods）を用いて重原子の初期位置を取得し、これらを用いてMLPHARE（CCP4 プログラムパッケージ）による予備フェージング（preliminary phasing）を行ない、差フーリエマップ（difference Fourier maps）を用いて更なる部位を特定した。この操作を５つの使用可能な誘導体について繰り返し、更にこれらを差フーリエ（Difference Fouriers）を用いてクロスチェックし、全ての重原子の解が同じ起源を有することを確認した。

即ち、５つの誘導体を用いて相を取得し（表１６に示す）、それらを更に溶媒平坦化（Solomon）及びARP／WARPのサイクルにより精緻化した。続いて、得られた電子密度マップに、可溶性アデニル酸シクラーゼの配列を組み入れた。最初は社内データを用いて２．３Åで、最後はシンクロトロンデータを用いて１．７Åで、再構築及び精緻化を複数回繰り返したところ（QUANTA、REFMAC、及びCNXを使用）、最終的な可溶性アデニル酸シクラーゼモデルは、残基１〜４６８から構成され、２つのギャップ（残基１３５〜１４０及び３５０〜３５６）を含むものとなった。得られた構造を表１に示す。

アポ可溶性アデニル酸シクラーゼの構造の記述
可溶性アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインの構造を、表１の座標によって記述する。電子密度において、観察し得る最初の残基が残基Ｍｅｔ１であり、最後がＬｙｓ４６８である。Ｍｅｔ１の主鎖窒素に近接する電子密度ピークは、Ｎ末端のアセチル化によるものと考えられ、モデル化することができなかった。解釈可能な主鎖密度を有さない残基は、Ｔｒｐ１３５、Ｇｌｕ１３６、Ｇｌｕ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｌｅｕ１３９、Ａｓｐ１４０、Ｐｈｅ３５０、Ｐｒｏ３５１、Ｇｌｙ３５２、Ｇｌｕ３５３、Ｌｙｓ３５４、Ｖａｌ３５５、及びＰｒｏ３５６であった。残基Ｖａｌ４６９及びＣ末端Ｈｉｓ₆−タグは、電子密度においては見ることができなかった。１３４の第１の断点（break）に近接する主鎖は殆ど定義することができず、残基１３２〜１３４の主鎖電子密度は不完全であった。残基３０４〜３０６及び４５１〜４５５は、電子密度では殆ど定義できなかった。更に、モデルの周辺にある幾つかの残基は、解釈可能な密度が存在しないことから、その側鎖が恣意的に存在していると考えられた。

ｓｏｌＡＣの活性部位
ｓｏｌＡＣと、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）由来の酵素との比較によれば、ｓｏｌＡＣが有する活性部位は一つのみであり、これがＳ．プラテンシスにおける、Ａ−鎖の残基１１４０、Ｂ−鎖の残基１０６１を含有するループ、Ｂ単量体のヘリックスα１を形成する残基によって形成される部位と対応することが強く示唆される。Ｓ．プラテンシスのＡ単量体に対応する第２の部位のへリックスα１は存在しない。Ａ単量体の２及び３に相当するβ−ストランドはｓｏｌＡＣの方が長く、部分的に不明瞭なアデノシン結合部位であり、対称関連対応部位に比べてその開放性が遥かに少なかった。表６は、基質と相互作用すると推測される、活性部位領域の残基を示したものである。

リガンドと複合化されたｓｏｌＡＣの結晶の調製
２００ｍＭ α−β−メチレンアデノシン５’−三リン酸、４０ｍＭ ＣａＣｌ₂、及び４０ｍＭ ＭｎＣｌ₂の溶液を、浸漬溶液中で調製した。浸漬溶液は、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、１６％ ＰＥＧ４Ｋ、及び１０％ グリセロールから構成した。予め成長させたｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶を、２０Ｌのリガンド浸漬溶液に入れ、３日に亘って平衡化した。その後、結晶を冷凍保存溶液に移送し、データ収集の準備の間、液体窒素中で冷凍した。

リガンド複合体のデータ収集、構造解及び精緻化（refinement）
ｓｏｌＡＣ触媒ドメイン／リガンド複合体についての回折データは、社内のＸ線源に装着したRAXIS HTCを用いて収集した。予め解析したｓｏｌＡＣ触媒ドメインの構造を、精緻化のための出発モデルとした。剛体及び制限された精緻化を行ない、差マップを算出した。リガンド分子、α−β−メチレンアデノシン５’−三リン酸を差密度に組み込んで、更に複数回の精緻化を行なった。

ｓｏｌＡＣリガンド複合体の記述
ｓｏｌＡＣと複合化されたα−β−メチレンＡＴＰの構造は、Ｓ．プラテンシスについて記述されたものと極めて類似した様式の相互作用を示している。この相互作用の大部分は、リン酸基、金属イオン、及びタンパク質間のものである。アデニン基はＮ６アミノ基とＶａｌ４０６の主鎖カルボニル基との間に水素結合を形成し、水媒介相互作用がＡｓｎ４１２のＮ７及びＯＤ１の間に形成される。リボース基はタンパク質と水素結合を形成しない。相互作用の大部分は、リン酸基、推測される金属結合部位、及びタンパク質間のものである。残基Ａｓｐ９９、Ａｓｐ４７の側鎖、Ｉｌｅ４８のカルボニル基、β及びγホスフェートの酸素原子、及び水分子が、金属イオンと相互作用する。Ａｒｇ４１６は、αホスフェートの酸素と相互作用する。γホスフェートの酸素原子は、Ｔｈｒ５２のＯＧ、及び、Ｔｈｒ５２及びＰｈｅ５１の主鎖窒素原子と相互作用する。

リガンドの結合の際に、ヘリックスα１及びβ１とα１とを連結するループに相当する残基４８〜５８の領域に、ある程度の再編成がみられる。残基９６から１０１を含有するループが協調して移動することにより、残基９９のＣ−αが３．５Å移動する。

更なるｓｏｌＡＣ−リガンド複合体

ｓｏｌＡＣのＨＣＯ₃ ^-結合部位
ｓｏｌＡＣは、その活性がＨＣＯ₃ ^-によって直接制御されることが知られている、唯一のタンパク質である。ｓｏｌＡＣ結晶の重炭酸ナトリウムへの浸漬によって、ＨＣＯ₃ ^-結合部位の位置が明らかになった。ＨＣＯ₃ ^-イオンの結合は、図２に示すような水素結合及び静電相互作用のネットワークによって媒介される。１）Ｌｙｓ９５のＮＺは、ＨＣＯ₃ ^-のＯ１との間に塩橋を形成している。２）Ｖａｌ１６７の骨格ＮＨは、ＨＣＯ₃ ^-のＯ１との間に荷電水素結合を形成している。３）Ｖａｌ１６７の骨格カルボニルは、ＨＣＯ₃ ^-のＯＨとの間に水素結合を形成している。４）Ａｒｇ１７６の側鎖ＮＨ２は、ＨＣＯ₃ ^-のＯ３との間に塩橋を形成している。５）Ａｒｇ１７６の側鎖ＮＨ２は、ＨＣＯ₃ ^-のＯＨとの間に荷電水素結合を形成している。ＨＣＯ₃ ^-の配位におけるＬｙｓ９５の関与は、重炭酸イオン反応性アデニル酸シクラーゼに関する研究論文から導かれる結論と一致している（Cann, M.J. et al. (2003) Journal of Biological Chemistry 278, 35033-35038）。

ｓｏｌＡＣの重炭酸イオン部位への５−フェニル−２Ｈ−［１，２，４］−トリアゾール−３−チオールの結合
ｓｏｌＡＣに結合した５−フェニル−２Ｈ−［１，２，４］−トリアゾール−３−チオール（化合物１、Lancaster Synthesis, UKから購入）の構造は、ＨＣＯ₃ ^-結合部位が他の小型分子リガンドからもアクセス可能であることを明らかにしている。化合物１の負帯電硫黄原子は、ＨＣＯ₃ ^-イオンと殆ど同一の位置に存在しているが、化合物１のフェニル結合トリアゾール基は、ＨＣＯ₃ ^-結合部位から開口して、ＡＴＰ結合部位に隣接する大きなポケットを形成している。この拡張ＨＣＯ₃ ^-結合部位は、ｓｏｌＡＣ阻害剤又は活性剤の設計において利用可能なｓｏｌＡＣ構造の領域に光を当てるものである。

化合物１により媒介されるＨＣＯ₃ ^-結合部位の拡張を可能としているのは、ＨＣＯ₃ ^-ポケットからのＡｒｇ１７６の移動、及び、Ａｌａ９７、Ｇｌｙ９８、Ａｓｐ９９、及びＡｌａ１００を含んでなるループの移動である。また、化合物１の結合は、Ｖａｌ３３５〜Ｃｙｓ３４３の配列にも、協調的な移動を引き起こす。このｓｏｌＡＣの領域は、重炭酸イオン結合部位の底部に沿って存在するβストランド及びループ構造の一部を形成する。この配列のＰｈｅ３３６、Ｍｅｔ３３７、及びＰｈｅ３３８は、化合物１の結合部位の一部を形成する。

化合物１の拡張ＨＣＯ₃ ^-結合部位は、以下の残基によって裏打ちされている。Ｐｈｅ４５、Ｌｅｕ９４、Ｌｙｓ９５、Ａｌａ９７、Ａｌａ１００、Ｌｅｕ１０２、Ｐｈｅ１６５、Ｌｅｕ１６６、Ｖａｌ１６７、Ｉｌｅ１６８、Ｖａｌ１７２、Ａｒｇ１７６、Ｖａｌ３３５、Ｐｈｅ３３６、Ｍｅｔ３３７、及びＰｈｅ３３８。化合物１の硫黄原子はポケットの底部に存在し、Ｌｙｓ９５のＮＺとの間に塩橋を、Ｖａｌ１６７の骨格ＮＨ及びＰｈｅ３３６の骨格ＮＨとの間に荷電水素結合を形成している。また、トリアゾールのＮ６も、ポケットの底部におけるＭｅｔ３３７の骨格カルボニルとの間に水素結合を形成している。更に、トリアゾールのＮ５は、Ａｒｇ１７６のＮＨ２との間に荷電水素結合を形成している。化合物１のフェニル基は、化合物１のポケットの、Ｐｈｅ４５、Ｌｙｓ９５、Ａｌａ９７、Ａｌａ１００、Ｌｅｕ１０２、及びＰｈｅ３３６の側鎖によって形成される、概ね親油性の領域内に入り込んでいる。化合物１のフェニル基の先で、ポケットはわずかに狭まってから、ＡＴＰ結合部位に開口している。拡張ＨＣＯ₃ ^-結合部位の形状と、化合物１：ｓｏｌＡＣ複合体に観察される相互作用の性質から、この部位が種々のリガンドを受容し得ることが示される。

哺乳類膜貫通アデニル酸シクラーゼイソフォームとの間に高レベルの配列及び構造的類似性があるものの、ｓｏｌＡＣはこのクラスの酵素の中で、ＨＣＯ₃ ^-により制御される唯一の酵素である。従って、本明細書に記載のｓｏｌＡＣＨＣＯ₃ ^-結合部位の構造に関する情報は、ｔｍＡＣ’に対して高い選択性を示す、ｓｏｌＡＣを標的とした薬剤を設計するための指針となる。薬剤設計に関して化合物１結合構造が有するもう一つの重要な特徴は、化合物１が、ＨＣＯ₃ ^-部位からｓｏｌＡＣのＡＴＰ結合部位へと至る、明白な成長ベクトルの可能性を示すことである。タンパク質のＡＴＰ結合部位を標的とした化合物は、薬物送達においては先例が多い。本明細書に記載される構造は、ＨＣＯ₃ ^-及びｓｏｌＡＣのＡＴＰ結合部位の双方を同時に占有する化合物の設計が可能であることを立証している。

更なるｓｏｌＡＣ化合物結合部位 − Ｎ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸
ｓｏｌＡＣに結合したＮ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸（化合物２）の結晶構造は、薬剤設計に利用し得る更なる領域をｓｏｌＡＣ構造が有することを示している。化合物２の結合部位は、化合物１について記載した拡張ＨＣＯ₃ ^-ポケットと重複しており、化合物２のフェノキシ基は、化合物１のフェニル基と極めて類似した位置を占有する。しかしながら、化合物２は、ＨＣＯ₃ ^-結合部位の底部に存在する、Ｌｙｓ９５の側鎖の大きな移動を招く。このＬｙｓ９５の移動がＨＣＯ₃ ^-結合ポケットを開放して形成されるチャネルが、水で満たされた大きな空隙と連結した上で、ＡＴＰ結合部位とは反対の位置でタンパク質表面に開口している。この新たに露出されるチャネルを裏打ちしている残基は、Ｈｉｓ１６４、Ｐｈｅ１６５、Ｔｙｒ２６８、Ａｓｎ３３３、Ｌｙｓ３３４、及びＶａｌ３３５である。化合物２のオキサルアミド酸基が更に突出してこのチャネル内に侵入し、タンパク質と幾つかの相互作用を形成している。１）化合物２のＯ３が、Ｈｉｓ１６４のＮＤとの間に荷電水素結合を形成している。２）化合物２のＯ１が、Ｐｈｅ１６５の骨格ＮＨとの間に荷電水素結合を形成している。３）化合物２のＯ５が、Ｖａｌ３３５の骨格ＮＨとの間に水素結合を形成している。４）化合物２のアミドＮ６が、Ｐｈｅ１６５の骨格カルボニルとの間に水素結合を形成している。Ｌｙｓ９５、Ｐｈｅ１６５、Ｌｅｕ１６６、Ｖａｌ１６７、及びＰｈｅ３３６の側鎖が、化合物２の中央のアニリノ芳香環の周囲に、親油性環境を形成している。化合物２の末端フェノキシ基は、化合物１について説明したのと同じ親油性ポケット内で結合しているが、Ｍｅｔ３３７、Ｐｈｅ３３８、Ａｓｐ３３９、Ｌｙｓ３４０、及びＧｌｙ３４１を含んでなるループに対して化合物２が移動を生じさせることにより、このポケットの環境は僅かに変化している。このループの移動によって、Ｐｈｅ３３８がＡＴＰ部位から、化合物２の末端フェノキシ基のファン・デル・ワールス距離内に引っ張られている。このＰｈｅ３３８の移動は、アポ、ＡＭＰ−ＰＮＰ、及び化合物１結合ｓｏｌＡＣの構造には観察されない。実際に、ＡＭＰ−ＰＮＰ複合体の構造は、Ｐｈｅ３３８がＡＭＰ−ＰＮＰリボースのヒドロキシル基に隣接して存在するＡＴＰ部位の一端を形成していることを、明らかに示している。Ｐｈｅ３３８の再配置は、ＡＴＰ結合部位に隣接する新たな基質ポケットを作り出している。この新たな基質ポケットは、以下の残基によって裏打ちされている：Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ４１８、Ｎ２９８、Ｓｅｒ３４３、Ｐｈｅ３３６、Ｍｅｔ３３７、Ｇｌｙ３４１、Ａｓｐ３３９、Ｍｅｔ４１９、Ｃｙｓ３４２、Ａｌａ４１５、Ａｒｇ４１６、Ｍｅｔ３００、及びＬｙｓ３４０。

このＡＴＰ基質ポケットの形成を促す化合物は、ｓｏｌＡＣ活性部位内に、更なる薬剤設計の機会を作り出している。このＡＴＰ基質ポケットが拡張ＨＣＯ₃ ^-部位内に結合する化合物によって誘導されるという事実は、非重炭酸イオン反応性ｔｍＡＣに対して高レベルの選択性を有する薬剤の開発において、ＨＣＯ₃ ^-部位が大きな可能性を有しているという見方を補強するものである。

重要なのは、本明細書に記載の４つの結合部位は相互に排他的ではなく、説明したような拡張ＡＴＰ及びＨＣＯ₃ ^-ポケットを誘導する、連続的なｓｏｌＡＣ結合部位を形成し得るという点である。この全体としての結合部位は、小型分子ｓｏｌＡＣ薬物の開発にとって、魅力的な標的となり得る。

Ｎ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸の調製
３−フェノキシアニリン（２７６ｍｇ、１．４ｍモル）及びトリエチルアミン（０．２ｍｌ、１．４ｍモル）のテトラヒドロフラン（３ｍｌ）中溶液に、クロロオキソ酢酸エチルエステル（０．１７５ｍｌ、１．５ｍモル）を滴下によって加えた。得られた溶液を環境温度で４０分攪拌した。この反応混合物に対して、水（１．５ｍｌ）及び塩化ナトリウム（７２ｍｇ、１．８ｍモル）を加えた。この反応混合物を環境温度で更に２４時間攪拌した。この反応混合物をジクロロメタンと塩酸（２Ｎ）とで分配した。水層をジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタン層を合わせて塩酸（２Ｎ）及び水で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、溶媒を真空下で蒸散させて除去することにより、Ｎ−（３−フェノキシ−フェニル）−オキサルアミド酸を白色固体（２８６ｍｇ、７４％）として得た。

ＨＣＯ₃ ^-と複合化したｓｏｌＡＣ結晶の調製
０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、０．２Ｍ クエン酸三ナトリウム、１６％ ＰＥＧ４０００、及び１０％グリセロールを含有する浸漬溶液中、５０ｍＭ 重炭酸ナトリウム溶液を調製した。予め成長させたｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶を、２０μｌの重炭酸塩浸漬溶液中に入れ、３時間平衡化させた。続いて、結晶を冷凍保存溶液に移送し、データ収集の準備の間、液体窒素中で冷凍した。

化合物と複合化したｓｏｌＡＣ結晶の調製
保存浸漬溶液は、最終体積の９０％とし、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ クエン酸三ナトリウム（ｐＨ６．４）、１５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、及び１５％ ｖ／ｖ グリセロールから構成した。残りの１０％分の体積のとして、１）水を加えて収穫用溶液とするか、或いは２）化合物保存溶液（ＤＭＳＯ中）を加えて最終浸漬溶液とした。収穫用溶液は、懸滴から収集されたｓｏｌＡＣ結晶の一時保存に使用するとともに、浸漬中に浸漬溶液の蒸散を避けるための保存溶液としても使用した。化合物１及び化合物２の保存溶液はＤＭＳＯ中０．２５Ｍの濃度で調製した。保存９０％浸漬溶液のｐＨは、化合物１については、この化合物の結合を促進するため、ｐＨ７．３に調製した。

３６μｌの「９０％保存溶液」を、４μｌの化合物保存溶液と混合することにより、化合物１及び２の最終浸漬溶液を調製した。これにより、最終的な化合物濃度は、２５ｍＭ となった。

化合物の浸漬／冷凍手順
新たに調製した１０μｌの収穫用溶液に、結晶を懸滴から収穫した。また、容器に５０〜１００μｌの収穫用溶液を入れた。浸漬溶液（６μｌ）をウェル内に入れ、対応する容器に５０μｌの収穫用溶液を入れた。結晶を浸漬溶液内に分配した（１結晶／化合物）。ウェルを密閉し、化合物１については６分間、化合物２については４．５時間、２０℃で浸漬させた。密閉を切開し、結晶を顕微標本（micromounts）上に載せ、液体窒素中で冷凍した。

化合物番号付与
ｓｏｌＡＣ：ＨＣＯ₃ ^-、ｓｏｌＡＣ：化合物１及びｓｏｌＡＣ：化合物２複合体の記述において使用した原子番号付与手順（添付のｐｄｂファイルに表記）を図１に示す。化合物１及び化合物２については、水素原子は示していない。ＨＣＯ₃ ^-の水素原子は、ｓｏｌＡＣ：ＨＣＯ₃ ^-相互作用を定義する上で特に重要であるため、表示している。

図１は、ｓｏｌＡＣに結合させた３種の化合物である。この図では、表３〜５で使用した原子番号付与系を示している。 図２は、重炭酸イオンと、ｓｏｌＡＣの３つの残基との間の結合相互作用を示している。

Claims (41)

1. リガンドとｓｏｌＡＣ構造との相互作用をコンピュータにより分析する方法であって：
   二乗平均平方根偏差（root mean square deviation）１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標を用意する工程；
   当該ｓｏｌＡＣ構造に適合させるべきリガンド、或いはその選択座標を用意する工程；及び、
   前記リガンドを当該ｓｏｌＡＣ構造に適合させる工程を含んでなる方法。
2. 当該選択座標が、表６、７、８、９、１０又は１１のうち何れかに記載された残基からなる群のうち、１又は２以上に由来する原子を含む、請求項１記載の方法。
3. 当該選択座標が、Ｍｅｔ１からＴｙｒ２６まで、又はＬｙｓ２１９からＧｌｙ２８４までのアミノ酸からなる群のうち、１又は２以上に由来する原子を含む、請求項１記載の方法。
4. 当該リガンドを、当該群のうち少なくとも２つ、好ましくは５つの要素に由来する原子に対して適合させる、請求項２又は３に記載の方法。
5. 当該リガンドを少なくとも１０の原子、好ましくは少なくとも１００の原子に対して適合させる、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記選択座標が、少なくとも５００の原子、好ましくは少なくとも１０００の原子のものである、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
7. 複数の分子断片を適合させると共に、当該断片を単一分子に組み立てることにより、リガンドが形成される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
8. 当該リガンドを取得又は合成する工程；及び
   当該リガンドが前記ｓｏｌＡＣと相互作用する能力を決定するべく、当該リガンドをｓｏｌＡＣタンパク質と接触させる工程を更に含んでなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
9. 当該リガンドを取得又は合成する工程；
   ｓｏｌＡＣタンパク質と当該リガンドとの複合体を形成する工程；及び
   当該リガンドが前記ｓｏｌＡＣと相互作用する能力を決定するべく、当該複合体をＸ線結晶学により分析する工程を更に含んでなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
10. 当該リガンドを取得又は合成する工程；
    当該リガンドが当該ｓｏｌＡＣ構造とどのように相互作用するかを決定又は予測する工程；及び
    前記リガンドと前記ｓｏｌＡＣとの相互作用が変化するように、前記リガンドを修正する工程を更に含んでなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
11. 前記ｓｏｌＡＣ構造が、二乗平均平方根偏差０．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の座標の全部又は一部、或いはその選択座標から構築されたモデルである、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
12. 前記モデルが：
    （ａ）ワイヤー・フレーム（wire-frame）モデル；
    （ｂ）チキン・ワイヤー（chicken-wire）モデル；
    （ｃ）ボール・アンド・スティック（ball-and-stick）モデル；
    （ｄ）スペース・フィリング（space-filling）モデル；
    （ｅ）スティック（stick）モデル；
    （ｆ）リボン（ribbon）モデル；
    （ｇ）スネーク（snake）モデル；
    （ｈ）アロー・アンド・シリンダー（arrow and cylinder）モデル；
    （ｉ）電子密度マップ（electron density map）；
    （ｊ）分子表面モデル（molecular surface model）
    である、請求項１１記載の方法。
13. （ａ）前記リガンドを取得又は合成する工程；及び
    （ｂ）当該リガンドがｓｏｌＡＣと相互作用する能力を決定すべく、前記リガンドをｓｏｌＡＣと接触させる工程を更に含んでなる、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
14. リガンドがｓｏｌＡＣタンパク質と相互作用する能力を評価する方法であって：
    当該リガンドを取得又は合成する工程；
    ｓｏｌＡＣタンパク質と当該リガンドとの結晶化複合体を形成する工程であって、当該複合体の原子座標の決定の際に、当該複合体が３．５Åよりも優れた分解能でＸ線を回折するものである工程；及び、
    当該リガンドが前記ｓｏｌＡＣタンパク質と相互作用する能力を決定するべく、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標を用いて、Ｘ線結晶学により当該複合体を分析する工程を含んでなる方法。
15. 前記ｓｏｌＡＣタンパク質の結晶を用意する工程；
    前記結晶に前記リガンドを含浸させて複合体を形成する工程；及び、
    二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標を用いて、前記複合体の構造を決定する工程を含んでなる、請求項１４記載の方法。
16. 前記ｓｏｌＡＣタンパク質を前記リガンドと混合する工程；
    ｓｏｌＡＣタンパク質−リガンド複合体を結晶化させる工程；及び
    二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のデータ、或いはその選択座標を用いて、前記複合体の構造を決定する工程を含んでなる、請求項１４記載の方法。
17. 当該リガンドの構造を決定する工程を更に含んでなる、請求項１４記載の方法。
18. 前記リガンドを取得又は合成する工程；及び、
    前記リガンドと前記ｓｏｌＡＣとの相互作用が変化するように、前記リガンドを修正する工程を更に含んでなる、請求項１４又は請求項１７に記載の方法。
19. タンパク質の構造を決定する方法であって；
    二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の座標、或いはその選択座標を用意する工程；及び、
    （ａ）当該タンパク質の構造を構成するべく、当該座標を当該タンパク質の結晶単位格子内に配置するか、或いは、（ｂ）当該座標を操作して、当該タンパク質のＮＭＲスペクトルピークを割り当てる工程を含んでなる方法。
20. 未知の構造を有するｓｏｌＡＣタンパク質の相同体又は類似体の三次元構造を予測する方法であって：
    未知の３次元構造を有する標的ｓｏｌＡＣタンパク質のアミノ酸配列表現を、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣのアミノ酸配列、或いはその選択座標とアラインメントし、前記アミノ酸配列の相同領域同士をマッチングさせる工程；
    未知の構造を有する当該標的ｓｏｌＡＣのマッチングさせた相同領域の構造を、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５に規定されるｓｏｌＡＣ構造、或いはその選択座標の対応する領域上にモデリングする工程；及び
    当該マッチングさせた相同領域の構造が実質的に保存された、未知の構造を有する当該標的ｓｏｌＡＣの立体構造を決定する工程を含んでなる方法。
21. ｓｏｌＡＣ、ｓｏｌＡＣ相同体又は類似体、ｓｏｌＡＣとリガンドとの複合体、又はｓｏｌＡＣ相同体又は類似体とリガンドとの複合体と相互作用するリガンドの構造を生成し、及び／又は、最適化を行なうためのデータを提供する方法であって：
    （ｉ）（ａ）ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の原子座標、或いはその選択座標のデータであって、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造、或いはその選択座標を規定するデータを含んでなる、コンピュータ読取可能なデータ；
    （ｂ）（ａ）のデータに基づく前記標的の相同性モデリングにより生成された、標的アデニル酸シクラーゼ相同体又は類似体の分子座標データ；
    （ｃ）表１、表２、表３、表４又は表５のデータを基準として、Ｘ線結晶学的データ又はＮＭＲデータを解釈することにより生成された、タンパク質の分子座標データ；及び
    （ｄ）（ａ）又は（ｃ）の原子座標データから誘導される構造因子データ
    を有する遠隔装置と、通信を確立する工程；並びに、
    （ii）当該遠隔装置から、当該コンピュータ読取可能なデータを受信する工程を含んでなる方法。
22. 当該コンピュータ読取可能なデータが、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ原子座標データ、或いはその選択座標であるとともに：
    二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ原子座標データ、或いはその選択座標に適合させるべきリガンドを用意する工程；及び
    前記リガンドを前記ｓｏｌＡＣ構造に適合させる工程を更に含んでなる、請求項２１記載の方法。
23. 当該選択座標が少なくとも５％の、好ましくは少なくとも１０％のＣα原子を含有する、請求項１〜２２の何れか一項に記載の方法。
24. 当該ｒｍｓｄが当該Ｃα原子を基準として計算される、請求項２３記載の方法。
25. ｓｏｌＡＣ、ｓｏｌＡＣ相同体又は類似体、ｓｏｌＡＣとリガンドとの複合体、又はｓｏｌＡＣ相同体又は類似体とリガンドとの複合体と、相互作用するリガンドの構造を生成し、及び／又は、最適化を行なうためのコンピュータシステムであって、前記システムがコンピュータ読取可能なデータとして：
    （ａ）表１、表２、表３、表４又は表５のｓｏｌＡＣ座標データであって、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの３次元構造を規定するデータ、或いはその選択座標；
    （ｂ）表１、表２、表３、表４又は表５の座標データに基づく前記標的の相同性モデリングにより生成された、標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の分子座標データ；
    （ｃ）表１、表２、表３、表４又は表５の座標データを基準として、Ｘ線結晶学的データ又はＮＭＲデータを解釈することにより生成された、標的アデニル酸シクラーゼタンパク質の分子座標データ；
    （ｄ）（ｂ）又は（ｃ）の原子座標データから誘導される構造因子データ；及び、
    （ｅ）ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の分子座標データ、或いはその選択座標
    のうち１又は２以上を有する、コンピュータシステム。
26. 当該選択座標が、表６、７、８、９、１０又は１１のうち何れかに記載された残基からなる群のうち、１又は２以上に由来する原子を含む、請求項２５記載のコンピュータシステム。
27. 当該選択座標が、当該群のうち少なくとも２つ、好ましくは５つの要素に由来する、少なくとも一の原子に対応するものである、請求項２６記載のコンピュータシステム。
28. 当該リガンドを少なくとも１０原子、好ましくは少なくとも１００原子に対して適合させる、請求項２５〜２７の何れか一項に記載のコンピュータシステム。
29. （ｉ）当該コンピュータ読取可能なデータがコード化されたデータ記憶物質を含んでなる、コンピュータ読取可能なデータ記憶媒体；
    （ii）当該コンピュータ読取可能なデータを処理するための命令を記憶するための作業メモリ；及び、
    （iii）当該作業メモリ及び当該コンピュータ読取可能なデータ記憶媒体に連結され、当該コンピュータ読取可能なデータを処理することにより、構造を生成し、及び／又は、合理的薬物設計を行なうための中央処理装置（central-processing unit）
    を含んでなる、請求項２５〜２８の何れか一項に記載のコンピュータシステム。
30. 当該中央処理装置（central-processing unit）に連結された、当該構造を表示するためのディスプレイを更に含んでなる、請求項２９記載のコンピュータシステム。
31. ｓｏｌＡＣ構造又はｓｏｌＡＣ−リガンド複合体の３次元表現を作成するためのコンピュータの使用であって、前記ｓｏｌＡＣ構造が、二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の構造、或いはその選択座標であるとともに、当該コンピュータが：
    （ｉ）二乗平均平方根偏差１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の構造、或いはその選択座標を含んでなる、機械読取可能なデータがコード化されたデータ記憶物質を含んでなる、機械読取可能なデータ記憶媒体；及び
    （ii）当該機械読取可能なデータを当該３次元表現に加工するための命令を含んでなる、使用。
32. 当該選択座標が、表６、７、８、９、１０又は１１のうち何れかに記載された残基のうち、１又は２以上の原子である、請求項３１記載の使用。
33. 組成物を調製する方法であって、請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法に従ってリガンドを特定する工程と、前記分子を担体と混和する工程とを含んでなる方法。
34. 医薬品、医薬組成物又は薬物を製造する方法であって：（ａ）請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法に従ってリガンドを特定する工程；及び（ｂ）前記リガンドを含有する医薬品、医薬組成物又は薬物を調製する工程を含んでなる方法。
35. （ａ）請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法に従ってリガンドを特定する工程；（ｂ）前記リガンドの構造を最適化する工程；及び（ｃ）前記最適化されたリガンドを含有する医薬品、医薬組成物又は薬物を調製する工程を含んでなる、請求項３４記載の方法。
36. ｓｏｌＡＣ触媒ドメインの結晶。
37. ｓｏｌＡＣ触媒ドメインとリガンドとの共結晶。
38. 空間群Ｐ６₃を有する、ｓｏｌＡＣ触媒ドメインとリガンドとの共結晶。
39. 単位格子次元ａ＝ｂ＝９９．５Å、ｃ＝９７．４Å、及び、α＝β＝９０．００、γ＝１２０．００であり、単位格子変動性が全ての次元で５％である、請求項３２又は３３に記載の共結晶。
40. 分解能が３．５Åであるか、又はより優れている、ｓｏｌＡＣタンパク質の結晶。
41. ｒｍｓｄ１．５Å未満の差異を有していてもよい、表１、表２、表３、表４又は表５の座標により規定される構造を有する、ｓｏｌＡＣタンパク質の結晶。

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