KR20080036583A - 인간 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 결정 구조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 solAC 촉매 도메인의 결정 구조를 제공한다. 이 구조는 표 1 내지 5에 기재된다. 이 구조는 제약 화합물과 같은 리간드와 이러한 단백질의 상호작용을 모델링하는데, 그리고 관련된 아데닐레이트 사이클라제 분자의 구조를 결정하는데 사용될 수 있다.

가용성 아데닐레이트 사이클라제(solAC), solAC 촉매 도메인, 아데닐레이트 사이클라제 리간드, 결정 구조

Description

인간 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 결정 구조{CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN SOLUBLE ADENYLATE CYCLASE}

본 발명은 인간 가용성 아데닐레이트 사이클라제 (solAC)의 촉매 도메인, 이의 결정화 방법, solAC의 결정 및 이의 3-차원 구조, 리간드의 존재 하에서의 solAC의 결정, 및 이의 용도에 관한 것이다.

아데닐레이트 사이클라제

고리형 아데노신 3',5'-모노포스페이트 (cAMP)는 유전자 발현, 세포 성장, 심장 기능, 염색체 분리 및 세포 대사를 포함하는 다수의 필수적인 생리학적 프로세스를 조절하는 편재성 2차 메신져이다 ([Robison, G.A. Butcher, R.W. and Sutherland, E.W. (1968) Annu. Rev. Biochem., 37, 149-174]; [Rodbeli, M. (1980) Nature, 284, 17-22]). 이는 6가지 상이한 족의 효소에 의해 ATP로부터 합성되고, 이러한 효소 중 하나가 아데닐레이트 또는 아데닐릴 사이클라제 (AC)이다. 이러한 족들이 cAMP를 ATP로부터 생성시키는 능력을 공유하지만, 이들은 서로 서열 유사성을 나타내지 않는다. 클래스 I은 장 박테리아에 존재하고 이화 억제를 조절하는 반면, 클래스 II는 병원체 예컨대 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 보르데텔라 페르투시 스(Bordetella pertusis)에 존재한다. 클래스 IV, V 및 VI는 아에로모나스 히드로힐라(Aeromonas hydrohila), 프레보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola) 및 리조비움 에틀리(Rhizobium etli)에 각각 존재한다. 유니버설 클래스(Universal Class)로 또한 공지된 클래스 III 사이클라제는 진핵생물에서 발견된 유일한 클래스이고, 또한 박테리아 및 고세균에 존재한다. 포유류 세포는 2가지 상이한 유형의 이러한 효소를 발현한다; 잘 특성화된 막통과 아데닐레이트 사이클라제 (tmAC) 및 최근에 발견된 가용성 아데닐레이트 사이클라제 (solAC) ([Shenoy, A. V. and Visweswariah, S.S (2004) FEBS Lett. 561, 11-21]).

tmAC는 형질막에 결합된 단백질이다. 모두 9가지의 확인된 tmAC 이소형 (I-IX)이 호르몬 및 신경전달물질에 의해 자극되고, G_s 단백질의 α-서브유닛에 의해 활성화되고, 유형 IX를 제외하고, 디테르펜 포르스콜린에 의해 자극된다. 이들은 G_i, G_o 및 G_z α-서브유닛, 뿐만 아니라 G_β,γ 서브유닛, PKC 및 Ca^{2 +}/칼모둘린에 대한 이의 다양한 응답에 의해 구별될 수 있다. 이러한 조절 다양성은 상이한 tmAC가 정확한 세포 관계로 세포전달물질 및 호르몬으로부터의 세포간 신호에 응답하도록 한다. TmAC는 6개의 막통과 나선으로 종종 모델링(modelling)되는 소수성 영역의 일련 반복이 이어지는 짧은 세포질 N-말단, 및 세포질 영역으로 구성된 공통적인 양식을 공유한다. 각각 C₁ 및 C₂로 명명된 2개의 세포질 도메인은 서로들 간에 (~50％ 동일성), 뿐만 아니라 tmAC 족의 9가지 상이한 구성원에 걸쳐 (~50-90％ 동 일성) 커다란 정도의 상동성을 나타낸다. 효소 활성은 C₁ 및 C₂가 회합하여 상보적인 이종이량체를 형성하는 것을 필요로 한다. 이러한 효소들의 메커니즘 및 조절의 생화학적인 특성화는 활성 단백질을 정제하는 것에서의 어려움으로 인해 오랫동안 저지되었다. 세포질 도메인의 절편들이 가용성 재조합 단백질로 독립적으로 발현된 가용성 tmAC 시스템의 개발로부터 상당한 약진이 나타났다. C₁ 및 C₂ 모두 시험관 내에서 머리-꼬리 계면에서 자가-회합하여 불활성 (C₁) 및 불량하게 활성인 (C₂) 동종이량체가 생산되는 경향이 있지만, 혼합된 경우 조절 성질이 유지된 완전하게 활성인 이종이량체가 생산되었다. 따라서 C₂ 동종이량체 및 C₁C₂ 이종이량체는 포르스콜린 자극에 응답하는 반면, C₁ 동종이량체는 여전히 불활성이다.

가용성 tmAC 시스템은 효소의 X-선 결정 연구를 가능하게 하여, 래트 유형 II C2 동종이량체 및 소 G_sα와 복합체를 형성한 개 V 유형 C₁/래트 유형 II C₂ 이종이량체의 구조가 해석되었다 ([Zhang, G., Liu, Y., Ruoho, A.E. and Hurley, J.H. (1997) Nature, 386, 247-253]; [Tesmer, J.J.G, Sunahara, R.K., Gilman, A.G. and Sprang, S.R. (1997) Science 278, 1907-1916]; [Tesmer, J.J.G, Sunahara, R.K., Johnson, R.A, Gosselin, G., Gilman, A.G. and Sprang, S.R (1999) Science, 285, 756-760]).

이같은 시스템의 구축은 계속 어려웠고, 주요 난점 중의 하나는 C₁ 및 C₂ 구축물에 대한 시작점을 결정하는 것이다. 족에 걸쳐 상당한 서열 상동성이 존재하 고, 오직 서열 상동성에 대한 구축물 디자인이 유용한 시작점임에도 불구하고, 단백질용해적으로 안정적이고, 가용성이며, 기능성인 단백질을 수득하는 것은 결코 일상적이지 않다 ([Beeler, J.A. and Tang, W-J. (2004) Methods in Mol. Biol, 237, 39-53]).

가용성 아데닐레이트 사이클라제: 기능, 특성화 및 정제

새로운 가용성 형태의 아데닐레이트 사이클라제 ("solAC")의 존재는 래트 고환으로부터 유래된 세포질 분획에서 1975년에 최초로 보고되었다. tmAC와는 달리, 이는 Mn^{2 +} 이온을 특이적으로 필요로 하는 것을 나타냈고, 이의 활성은 황체형성 호르몬 (LH) 또는 난포 자극 호르몬 (FSH)에 의해 자극되지 않았다 ([Braun, T. and Dods, R.F. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1097-1101]). 효소를 활성화시키는 Mn^{2 +} 이온의 능력 및 효소가 G 단백질 조절에 대해 나타내는 무감응은 Buck 및 동료들이 1999년에 효소를 생화학적 및 크로마토그래피적으로 특성화할 수 있도록 하였다. 이들은 분자량이 48 kDa인 가용성 단백질을 확인하였지만, PCR에 의해 단리된 solAC의 전장(全長) 유전자는 187 KDa의 훨씬 더 큰 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 나타냈다. 48 kD의 효소적으로 활성인 종은 전장 단백질의 N-말단 부분에 존재하는 것으로 나타났고, 이는 이러한 종이 단백질의 단백질용해성 단편을 나타낼 수 있다는 것을 시사하였다. 설치류 배선(胚線)에서 2가지의 별법적인 스플라이스(splice) 전사물에 의해 짧은 효소 및 전장 효소가 생성된다는 것에 대한 증거가 PCR 및 RNA분해효소 보호 분석법에 의해 나타났다 ([Jaiswal, B.S. and Conti, M. (2001) J. Biol. Chem., 276, 31698-31708]). solAC 오픈 리딩 프레임과 기타 서열의 비교는 48 KDa 종이 다양한 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인에 대해 상당한 아미노산 상동성을 나타내는 2개의 영역을 함유하였음을 나타냈고, 가장 밀접하게 관련된 서열은 남조류 (아나바에나 스피루렌시스(Anabaena spirulensis) cyaB1, cyaB2 및 cyaA, 및 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis) cyaC)) 및 점액균 (스티그마텔라 아루란티아카(Stigmatella aurantiaca), cyaA 및 cyaA)로부터의 것들이었다 ([Buck, J., Sinclair, M.L. Schapal, L., Cann, M.J. and Levin, L.R. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 79-84]). 추가적인 분석은 solAC의 촉매 도메인이 tmAC의 촉매 도메인 C₁ 및 C₂와 오직 15 내지 25％의 서열 동일성을 공유하였음을 나타냈다.

solAC의 발현이 안구 모세관 프로세스, 각막 내피, 맥락막총, 신장 및 부고환을 포함하여 시험된 대부분의 조직에서 역방향 PCR에 의해 증명되었다 ([Mittag, T.W., Guo, W-B and Kobayashi (1993) Am. J. Physiol 264, F1060-F1064]; [Zippin, J.H Levin, L.R. and Buck (2001) Trends Endocrinol Metab, 12 366-370]). 그러나, 노던(Northern) 블롯(blot) 분석 및 원위치(in situ) 혼성화는 고도의 발현이 수컷 생식 세포에만 존재한다는 것을 가리켰다 ([Sinclair, M.L., Wang, X-Y, Matia, M., Conti, M. Buck, J., Wolgemuth, D.J. and Levin, L.R. (2000) Mol. Reprod. Dev. 56, 6-11]). solAC이 단지 가용성 효소이지 않고, 미토콘드리아, 중심소체, 유사분열방추, 중간체 및 핵이 포함되는 세포내 소기관에 특 이적으로 표적화되어, 이를 cAMP 신호전달의 이펙터들에 아주 근접하게 배치시킨다는 것이 증명되었다 ([Zippin, J.H., Chen, Y. Nahirney, P., Kamenetsky, M., Wuttke, M.S., Fishman, D.A., Levin, L.R and Buck, J. (2003) Faseb Journal, 17, 82-84]; [Litvin, T.N., Kamenetsky. M., Zarifyan.A., Buck.J. and Levin L.R. (2003) J. Biol. Chem. 278, 15922- 15926]).

가용성 AC는 Ca^{2 +} 및 HCO₃ ^-에 의해 조절되어, 이러한 세포내 신호전달 분자에 의한 조정이 solAC가 cAMP 의존적 응답을 내인성 세포 이벤트로 매개하도록 야기한다는 것을 시사한다. 포유동물에서 바이카르보네이트/이산화탄소 화학센서(chemosensor)로 현재까지 확인된 유일한 효소이기 때문에, solAC는 정자 수정능획득, 과잉활성화된 운동 및 첨단체 반응에서뿐만 아니라 또한 신장에서의 유체 재흡수, 섬모체 및 맥락막총에서의 유체 분비, 및 영양 신호에 응답한 대사 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다 ([Litvin, T.N., Kamenetsky. M, Zarifyan. A., Buck, J. and Levin L.R. (2003) J. Biol. Chem. 278, 15922-15926]).

단백질 구조의 설명은 결정 생성을 허용하는 충분한 양의 정제된 단백질의 공급원을 필요로 한다. 다수의 단백질이, 재조합 생산 시스템에서 발현되는 경우에도, 단백질이 가용성이고 활성이며 응집되지 않은 형태로 정제되기 어려운 것으로 판명된다.

다수의 여러 박테리아 아데닐레이트 사이클라제가 대장균에서 가용성 형태로 발현되었다. 특히, 박테리아 아데닐레이트 사이클라제 아나바에나(Anabaena) cyaB, 미코박테리움(Mycobacterium) Rv1264 및 스티그마텔라(Stigmatella) cyaB가 가용성 형태로 대장균에서 발현되었다 ([Cann et al. (2003), J. Biol. Chem; 278, 35033-35038]; [Kanacher et. Al. (2002) EMBO J. 21, 3672-3680]; [Under et al. (2002) J. Biol. Chem, 277, 15271-15276]).

대장균은 봉입체 형태로 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) 아데닐레이트 사이클라제를 발현하는데 또한 사용되었다 ([Bieger, B. and Essen, L-O. (2000) Acta Cryst. D56, 359-362]').

대장균은 N-말단에 His 태그(tag)가 부착된 래트 막통과 아데닐레이트 사이클라제의 C2 도메인을 발현하는데 또한 사용되었다. 단백질은 가용성 형태로 발현되었다 ([Yan, S-Z et al. (1996) J. Biol. Chem, 271, 10941-10945]).

아데닐레이트 사이클라제의 개 유형 V C1 도메인이 N-말단에 His 태그가 부착된 융합물로서 또한 발현되었다 ([Sunahara, R.K et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 22265-22271]).

solAC의 메커니즘 및 생화학의 설명은 충분히 높은 순도의 재료를 충분히 수득하는 것에서의 어려움으로 인해 제한되었다. 상기 언급된 다른 형태의 아데닐레이트 사이클라제의 발현 및 회수를 위한 조건은 모두 다르고, 상이한 형태의 아데닐레이트 사이클라제는 실질적인 양의 단백질의 생산을 달성하는데 정확하고 상이한 조건을 필요로 한다는 것을 가리켰다.

재조합 발현 전에, solAC의 정제를 위한 한 접근법은 효소 성질을 연구하는데 충분한 단백질 (~3 ㎍)을 수득하기 위하여 수백개의 래트 고환 (950)의 프로세 싱을 필요로 하였다 ([Buck, J., Sinclair, M. L. and Levin, L.R. (2003) Methods in Enzymol. 345, 95-105]). 정제 절차에는 20 mM 트리스(Tris)-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제를 포함하는 세포 용해물로부터 시작하는 다중 단계가 수반되었다. 6가지의 상이한 컬럼 정제 후에, 효소의 농축된 분획을 HPLC 컬럼에 적용하고, 20 mM 트리스-HCl (pH 6.8), 1 mM DTT로 용출하고, 0 - 0.1 M NaCl의 구배로 용출시켰다. 이러한 단계에서 최초로 이루어진 pH에서의 감소가 활성에서의 현저한 강화 (약 60배) 증가를 설명하는 것으로 여겨졌다. 회수된 solAC 단백질의 최종 수율은 약 3 ㎍이었지만, 이는 62 KDa의 관련되지 않은 오염 단백질을 포함하였고, 따라서 규모가 증진되었더라도 제조가 결정의 생산에 적절할 것 같지 않았다.

재조합 전장 및 촉매 도메인 래트 solAC가 HEK293 세포에서 또한 발현되었다. 이러한 구축물은 2개의 별법적인 전사물에 의해 코딩되는 효소의 성질, 뿐만 아니라 서로 및 조직 유래 등가물에 대한 관련 활성을 결정하는데 사용되었다. 재조합 세포 용해물은 원심분리에 의해 정화되고, 이어서 세파크릴(Sephacryl) S-200 컬럼에 적용되었다. 수율이 보고되지는 않았지만, 이는 재조합 종이 활성, 크기 및 면역반응성에서 고환에서 발현된 2가지 solAC 종에 상응하였음을 확인하는데 충분하였다 ([Jaiswal, B.S. and Conti, M. (2001) J. Biol. Chem., 276, 31698-31708]).

발현에 대한 재조합 접근법은 단백질이 회수를 촉진하기 위하여 태그가 부착되어 발현되도록 하였다. [Litvin et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 15922- 15926]에는 배큘로바이러스 Hi 5 세포에서의 GST 태그가 부착된 재조합 인간 solAC 촉매 도메인의 생산이 기술되어 있다. 단백질을 생산하는 세포를 PBS (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일에 용해시켰다. 용해물을 글루타티온 세파로스 4B 컬럼에 적용하고, 50 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 10 mM 환원 글루타티온, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌 및 10 ㎍/㎖ 류펩틴으로 용출시켰다. 용출물을 수퍼덱스(Superdex) 200 HR 10/30 컬럼에 적용하고, 샘플을 50 ％ 글리세롤에서 보관하였다. 최종 샘플은 추가적인 GST 밴드를 함유하였고, 당해 단백질은 태그로부터 절단되지 않았다. 저자는 수율을 언급하지 않았지만, 효소학적 연구에 충분하였지만 매우 낮은 것으로 보인다.

별법적인 태그는 solAC 촉매 도메인 (아미노산 1 내지 469)을 발현하기 위해 [Chen et al., (2000) Science 289, 625-628]에서 사용된 헥사히스티딘 태그이다. 태그가 C-말단에 융합되었다. Bac-to-Bac™ 배큘로바이러스 발현 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 곤충 HiFive 세포에서 단백질이 이종형으로 발현되었고, Ni2+-NTA 세파로스 수지 (Qiagen) 상에서의 크로마토그래피에 의해 단백질이 정제되었다. 단백질의 상태 및 수율은 개시되지 않았지만, 충분한 양이 재조합 효소 활성에 대한 바이카르보네이트의 효과가 pH 효과로 인한 것이 아니라는 것을 결정하는데 충분하였다. 또한, 바이술파이트 이온이 solAC 바이카르보네이트의 자극을 모방할 수 있는 반면, 클로라이드 또는 술페이트 또는 포스페이트는 그렇지 않았음을 나타냈다.

solAC로의 이러한 기존의 연구에도 불구하고, 순수한 재조합 포유류 단백질 의 최종 수율은 여전히 낮았고, 따라서 구조 연구가 착수되는 것을 방지하였다.

SolAC 상동성 구조물

HCO₃ ^-의 존재 또는 부재 하에 ATP 유사물, Mg^{2 +} 또는 Ca^{2 +}와 복합체를 형성한 스피룰리나 플라텐시스로부터의 solAC 상동체 CyaC의 일련의 구조물이 보고되었다. 이들은 칼슘 이온이 제1 금속 결합 부위를 차지하고 활성 부위의 개방 입체구조에서 뉴클레오티드의 결합을 매개하는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 바이카르보네이트의 존재는 제2 금속 이온을 또한 고용하면서 활성 부위가 닫히도록 한다. 기질 유사체의 포스페이트 기는 활성 부위 내에서 입체구조를 재배열시켜, 아미도 생성물 형성 및 방출을 촉진할 것이다. 효소의 아포(apo) 형태는 해석되지 않았기 때문에, 효소의 추가적인 입체구조가 존재하는 것 및 관찰된 것들이 반응 경로를 따라 포획된 종을 나타내는 것이 가능하다 ([Steegborn, C, Litvin, T., Levin, L. R. Buck, J. and Wu, H. (2005) Nat. Struc. And Mol. Biol., 12, 32-37, Tesmer, J.J.G. (2005) Nat. Struc. And Mol. Biol., 12, 7-8]).

SolAC 및 수컷 농도

세포 cAMP 농도에서의 변화가 정충에 의한 수정 프로세스, 특히 성숙, 수정능획득, 운동성 및 생식자와의 융합의 조절과 관련되었다. 이러한 이벤트들의 관련성에도 불구하고, 기초를 이루는 메커니즘은 불충분하게 이해된다. 이러한 프로세스의 조정에서의 여러 아데닐레이트 사이클라제의 구체적인 역할을 결정하기 위한 정충 연구는 solAC가 핵심 역할은 아니지만 주요 역할을 한다는 것을 시사하였 다 ([de Lamirande, E., LeClerc. P. and Gagnon, C. (1997) Mol. Hum. Reprod., 3, 175-194]; [Jaiswal, B.J. and Conti. M. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10676-10681]; [Xie, F. and Conti, M. (2004) Developmental Biol. 265, 196-206]; [Chen, Y., Cann, M.J., Litvin, T.N., lourgenko, V., Sinclair, M. L., Levin, L.R. and Buck, J. (2000) Science 289, 625-628]). 수정에서의 solAC의 역할에 대한 결정적인 증거는 정자 운동성에서 심각한 손상을 야기하여 마우스를 불임이게 하는 마우스에서의 solAC 유전자의 파괴로부터 나타났다. solAC 결핍 수컷에서 정상적인 고환 및 정소상체(epididymides)가 발달되었고, solAC를 발현하는 것으로 공지된 다른 기관에서 명백한 이상을 나타내지 않는다. 암컷 solAC 결핍 마우스는 표현형을 나타내지 않고, 야생형 또는 이종접합 마우스와 함께 정상적인 크기의 새끼를 낳는다. solAC 결핍 마우스는 정상적으로 교미하였지만, 정자의 전방 운동 결여로 인해 번식에 실패하였다. 돌연변이 정자로의 시험관내 연구는 cAMP의 로딩에 의해 정상적인 운동성이 회복될 수 있지만, 돌연변이 정자가 여전히 난모세포를 수정시킬 수 없다는 것을 나타냈다 ([Esposito, G., Jaiswal, B.S., Xie, F., Krajnc-Franken, M.A.M., Robben, T.J.A.A, Strik, A.M., Kuil, C, Philipsen, R.L.A., van Duin, M., Conti, M. and Gossen, J.A. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2993-2998]).

수정에서의 solAC의 핵심 역할에도 불구하고, 여러 tmAC가 또한 프로세스에 수반될 수 있다는 증거가 존재한다. 무손상 마우스 정충의 면역국소화(immunolocalisation)는 tmAC II, III 및 VIII가 첨단체 및 편모 영역에 풍부하 게 존재하는 반면 tmAC I 및 IV는 더 적은 정도로 중편 및 첨단체 모자에 존재한다는 것을 나타냈다. IVF 배지의 일부 성분이 G-단백질 연관 수용체를 통해 작용하는 것으로 공지된 바와 같이, 이들의 효과가 tmAC를 통해 조정될 것이다 ([Baxendale, R. W. and Fraser, L (2003) Mol. Reprod. and Dev. 66, 181-189]).

solAC , 종양학, 염증 및 기타 프로세스

cAMP는 세포 증식, 세포 분화 및 세포자멸사에 영향을 미치는 신호 전달 경로에 수반된다. 이러한 경로에서의 탈선은 병리학적 용태 예컨대 암에 이르는 것으로 공지되어 있다. 언급될 수 있는 다양한 암에는 하기 본원에서의 섹션 G(vii)에 기재된 것들이 포함된다. 따라서, solAC의 증가 또는 감소된 활성에 의한 cAMP 농도의 조정은 치료적 또는 예방적 방편으로 간주될 수 있다.

최근의 연구는 구아노신 트리포스파타제 Rap-1의 cAMP 의존적 조정을 통한 solAC TNF-유도 중성구 활성화 및 NGF-매개 신경돌기생성(neuritogenesis)을 나타냈다 ([Han, H., Stessin, A.M., Roberts, J., Hess, K. C., Gautam, N., Kamenetsky, M., Lou, O., Hyde, E., Nathan, N., Muller, W.A., Buck, J., Levin, L.R., and Nathan, C. (2005) J. Exp. Med., 202, 353-361]; [Stessin, A.M., Zippin, J.H., Kamenetsky, M., Hess, K.C., Buck, J., and Levin, L.R. (2006). J. Biol. Chem., 10, 1074]). 따라서, solAC의 활성화 또는 억제에 의한 이러한 프로세스의 하류 조절이 치료적으로 유용할 수 있다.

과도한 또는 조절되지 않은 TNF 생산이 류머티스 관절염 ([Maini et al., APMIS, 105(4): 257-263]), 류머티스양 척추염, 골관절염, 통풍 관절염 및 기타 관 절염성 용태; 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소성 쇼크, 그람 음성 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 성인성 호흡 곤란 증후군, 뇌 말라리아, 만성 폐 염증성 질환, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 천식, 폐 섬유증 및 세균성 폐렴 규폐증, 폐 사르코이드증, 골 흡수 질환, 재관류 손상, 이식편 대 숙주 반응, 동종이식 거부, 인플루엔자, 헤르페스 단순 바이러스 유형-1 (HSV-1), HSV-2, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 수두 대상포진 바이러스 (VZV), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV), 인간 헤르페스 바이러스-6 (HHV-6), HHV-7, HHV-8과 같은 감염으로 인한 열 및 근육통, 가성광견병, 비기관염 및 감염 또는 악성종양에 2차적인 악액질, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)에 2차적인 악액질, AIDS, ARC (AIDS 관련 증후군), 켈로이드 형성, 흉터 조직 형성, 크론병, 궤양성 결장염, 또는 가슴쓰림이 포함되는 다수의 염증성 질환 및 용태를 매개하거나 악화시키는데 관련되었다. TNF 생산에 의해 야기되는 효과의 억제로 인해, solAC 억제제가 상기 열거된 질환의 치료에 유용할 것으로 파악된다.

또한 cAMP는 방수(房水) 형성 (녹내장) 및 이자섬 세포로부터의 인슐린 분비 (당뇨병)을 자극하는 것으로 공지되어 있다. 양쪽 모두의 프로세스는 바이카르보네이트 농도에 의해 조절되고, 따라서 solAC에 직접적으로 연관된다.

단백질 결정화

단백질을 결정화시키는 것은 어떠한 명확한 성공 예상도 없는 불확실하고 어려운 공정이라는 것이 단백질 화학 분야에 주지되어 있다. 단백질 결정화가 단백질 구조 결정에서의 주된 장애물이라는 것이 현재 명백하다. 이러한 이유로, 단백 질 결정화가 그 자체로 스스로 연구 주제가 되어 왔고, 단백질 결정학자의 실험의 단순한 연장이 아니다. 성장하는 단백질 결정과 관련된 어려움이 기술된 다수의 참조문헌이 존재한다 ([Kierzek AM. and Zielenkiewicz P. (2001) Biophysical Chemistry, 91, 1-20 Models of protein crystal growth]; [Wiencek JM (1999) Annu Rev Biomed Eng., 1, 505-534 New Strategies for crystal growth]; [Service, R., Science (2002) Nov 1;298, 948-50 Structural genomics. Tapping DNA for structures produces a trickle]; [Chayen N., J Struct Funct Genomics (2003) 4 (2-3) 115-20 Protein crystallization for genomics: throughput versus output]).

Wiencek은 단백질 구조 결정에 적절한 고품질의 단일한 단백질 결정을 생산하기 위한 합리적인 방법론 및 프로토콜에 대한 요구를 강조하였고, 구조 결정에서 일반적으로 속도-제한 단계인 단백질 결정화에 대한 기초적인 접근법의 결여를 언급하였다. 합리적인 접근법에 대한 요구와 함께, 단백질 용해도에 대한 온도, 압력, pH, 전해질, 반용매(antisolvent) 및 가용성 합성 중합체의 효과를 포함하여, 단백질 용해도, 핵형성 및 결정 성장에 영향을 미치는 변수가 논의되었다. 다양한 생리화학적 기술 (레이저 광 산란, X-선 산란, X-선 회절 및 원자힘 현미경 포함), 및 결정 성장 및 핵형성 속도를 연구하는데 있어서 이의 용도가 기술되었고, 다양한 결정 성장 기술, 예컨대 증기 확산, 자유 계면 확산, 투석, 뱃치(batch) 성장 및 시딩(seeding) 기술이 기술되었다. 단백질 결정 품질의 측정 및 이에 영향을 미치는 변수가 또한 논의되었다. Wiencek은 단백질 결정화에서의 많은 부분이 여 전히 불명확하고, 구조 생물학의 많은 부분이 단백질 분자를 결정화시키는 능력에 달려있기 때문에 단백질 결정화의 이해에서의 기초적인 진보가 단백질 결정학 자체 너머의 용도에서 상당한 효과를 가질 것으로 결론지었다.

유사하게, Kierzek 등은 단백질 결정화의 물리화학적 양상이 이해되지 않았기 때문에 X-선 결정학에 의한 단백질 구조 결정에서의 주요 장애물이 잘 정돈된 대형 단백질 결정에 여전히 남아있다는 것을 인정하였다. 단백질 결정 성장에 대해 현재까지 수집된 실험 데이타를 해석하기 위한 모델의 형성에 대한 노력이 재고되었지만, 단백질의 거대한 복잡성 때문에 단백질 결정화의 만족스러운 모델이 없다고 언급되었다: 결정화 프로세스는 시간 및 크기 규모 모두에 대해 대규모로 걸쳐지고, 이는 대부분의 컴퓨터 모의실험 접근법에 대해 금지적이다. Kierzek 등은 실험적 및 이론적 방법 모두의 추가적인 발전이 결정 성장 분야에서 현재 테스트되는 광범위한 접근법의 약간의 통합에 필요할 것이라고 결론지었다.

Service (동일 문헌)는 단백질의 결정화 및 구조 결정과 관련된 문제점들을 논의하였다. 주어진 예는 단백질을 결정화시키는데 수반되는 수많은 단계를 자동화함으로써 구조 결정 프로세스의 속도를 증진시키기 위하여 시작된 US 파일럿 프로젝트이다. 이러한 프로젝트는 프로세스의 각 단계에서 어려움에 마주친 것으로 기술되었다: 구조 결정을 위해 확인된 1870개의 단백질 표적 중에서, 23개만의 완결된 단백질 구조가 생성되었다. Service는 또다른 프로젝트에서 유사한 결과가 산출되었음을 언급하였고, 따라서 전세계적으로 다양한 구조 유전자학(genomics) 프로젝트에 의해 표적화된 약 18,000개의 단백질 중에서, 약 200개의 단백질의 구 조만이 입수가능하였다. 문헌에서 구조 결정 프로세스에서의 여러 상이한 지점이 제시되었고, 모두 문제를 야기하였다. 출발점, 즉 대장균 및 기타 숙주 세포가 적절한 단백질을 발현하도록 하고 단백질을 가용성 형태로 수득하는 것이 가장 큰 문제점들 중 하나로 언급되었다. 그 후, 단백질이 X-선 연구에 적절한 결정을 형성하도록 하는 것과 관련된 이어지는 문제가 논의되었다: 결정화 및 이어지는 결정의 최적화가 프로세스에서 주요 난점인 것으로 언급되었다. 실제로, 각 단계에서 마멸이 심각한 것으로 문헌에서 언급되었다. 결정이 수득될 수 있더라도, 결정의 구조가 해석되어야 하고, 이는 일상적인 프로세스가 아니거나 성공이 예상 또는 예측될 수 있는 것이 아니다. 이는 NISGC 협회에 의해 문헌에 설명되었다. 결정화 및 구조 결정에 대해 확인된 표적 단백질의 수와 비교하여, 실제로 클로닝된 후 가용성 단백질로 발현된 수는 낮다. 이어서 추가적인 정제가 항상 가능하지 않고, 정제 후에도, 정제된 단백질의 오직 적은 분획만이 결정화되었다. 그후에도, 이러한 단백질의 일부만이 X-선 결정학에 의한 단백질 구조 결정에 적절한 고품질의 단일한 단백질 결정이 생산되도록 결정화되었다. 5187개의 표적 단백질 중에서, 협회 구성원은 이들 중 1675개를 클로닝하였고, 1295개가 단백질로 발현되었으며, 이중 773개만 가용성이었다. 이들 중에서, 719개의 단백질을 정제하였지만, 94개만이 결정화되었다. 현재까지, 50개의 구조가 결정되었고, 이들 중 22개만이 X-선 분석에 의해 결정되었다.

유사한 양상이 Chayen (동일 문헌)의 도 1에 제시되었다. Chayen은 구조 유전자학에서 수반되는 많은 단계들 중 결정화 단계에 초점을 맞추었고, X-선 결정학 에 의한 구조 결정에 적절한 고품질의 단백질 결정을 생산하는 것의 어려움을 논의하였다. 이러한 어려움은 생산된 단백질 중 적은 백분율만이 현재 구조 결정되었다는 사실을 대부분 설명한다.

용액으로부터의 단백질 분자의 결정화가 단백질 구조를 결정하는 프로세스에서 장애물인 것으로 통상적으로 생각되는 이유는 다수이다; 단백질은 복합적인 분자이고, 용액 내의 다른 단백질 분자 및 소형 분자와의 특이적 및 비-특이적 상호작용이 수반되는 미묘한 균형이 예측하기 어렵다.

각각의 단백질은 독특한 셋트의 조건 하에 결정화되고, 이는 미리 예측될 수 없다. 단순히 단백질을 과포화시켜 용액에서 꺼내는 것은 잘 되지 않을 것이고, 대부분의 경우에 결과는 비결정질의 침전물일 것이다. 다수의 침전제가 사용되었고, 통상적인 것은 여러 염, 및 폴리에틸렌 글리콜이지만, 또다른 것들도 공지되어 있다. 또한, 용액 내에서의 단백질의 거동을 조정하기 위해 첨가물 예컨대 금속 및 세제가 첨가될 수 있다. 다수의 키트가 입수가능하고 (예를 들어, Hampton Research로부터 입수가능), 이는 결정화 공간에서의 가능한 한 많은 파라메터를 포함하도록 시도되었지만, 다수의 경우에 회절 분석에 적절하지 않은 결정질 침전물 및 결정을 최적화하기 위한 출발점만이 존재하였다. 용해도, 정확한 폴딩(folding) 또는 활성을 위한 금속 이온에 대한 의존, 다른 분자와의 상호작용 및 입수가능한 임의의 기타 정보의 관점에서의 단백질 거동의 인식이 성공적인 결정화에 도움이 되었다. 그렇다 하더라도, 단백질 결정화는 시간-소비 프로세스로 종종 간주됨으로써, 이어지는 실험은 과거의 시도의 관찰을 토대로 한다.

단백질 결정이 수득된 경우, 이는 회절 분석에 반드시 항상 적절하지는 않다; 이는 해상도에서 제한될 수 있고, 이어서 분석에 필요한 해상도로 회절될 포인트로 이를 개선시키는 것이 어려울 수 있다. 결정에서의 제한된 해상도는 여러 요인으로 인한 것일 수 있다. 이는 결정 내의 단백질의 본질적인 운동성으로 인한 것일 수 있다; 이는, 다른 결정 형태로도, 극복하기 어려울 수 있다. 이는 결과적으로 약한 산란이 초래되는 결정 내의 높은 용매 함량으로 인한 것일 수 있다. 별법적으로, 이는 결정 격자 내의 결함으로 인한 것일 수 있고, 이는 회절된 x-선이 격자 내에서 유닛에서 유닛으로 완전하게 상 형태에 있지 않을 것임을 의미한다. 이들 중 임의의 것 또는 이들의 조합이 결정이 구조 결정에 적절하지 않다는 것을 의미할 수 있다.

일부 단백질은 결코 결정화되지 않고, 합리적인 시도 후에 단백질 자체를 시험하고 개별적인 도메인, 여러 N 또는 C-말단 절단, 또는 점 돌연변이를 만드는 것이 가능한지 여부를 고려할 필요가 있다. 어떻게 단백질이 결정성을 개선시키는 것과 같은 방식으로 재조작될 수 있는지를 예측하는 것은 종종 어렵다. 때때로 결정화 혼합물 내에 리간드를 포함시키는 것이 적절한 결정의 생산에 필수적이다. 결정화 메커니즘의 본 발명가들의 이해는 여전히 불완전하고, 결정화에 수반되는 단백질 구조의 인자는 주지되어 있지 않다.

발명의 개요

본 발명은 인간 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 결정 구조에 관한 것이고, 이는 효소에서의 기질 및 보조인자의 결합 위치가 조사 및 결정되 도록 한다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 표 1에 기재된 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 3차원 아포 (즉 리간드가 없는) 구조, 및 이의 용도를 제공한다.

두번째 양상에서, 본 발명은 표 2 및 또한 표 3, 4 및 5에 기재된, 리간드 존재 하에서의 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 3차원 구조를 제공한다.

일반적인 양상에서, 본 발명은 solAC 구조의 제공, 및 리간드, 예를 들어 잠재적 및 기존의 제약 화합물 또는 기타 분자 구조, 전구약물, solAC 조정인자 또는 기질, 또는 이같은 화합물, 조정인자 또는 기질의 단편과 이러한 solAC 구조와의 상호작용을 모델링하는 것에서의 이의 용도의 제공에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 및 또다른 양상 및 실시양태가 하기에 논의된다.

본 발명의 상기 양상들은, 단독적으로 및 조합되어, 유리한 본 발명의 특색에 모두 기여한다.

도 1은 solAC에 결합된 3가지 화합물을 나타낸다. 도면은 표 3-5에서 사용된 원자 번호매김 시스템을 나타낸다.

도 2는 solAC의 잔기 중 3개에 대한 바이카르보네이트의 결합 상호작용을 나타낸다.

표의 간단한 설명

표 1은 solAC의 구조의 좌표 데이타를 제시한다.

표 2는 AMPCPP와 복합체를 형성한 solAC의 구조의 좌표 데이타를 제시한다.

표 3은 바이카르보네이트와 복합체를 형성한 solAC의 구조의 좌표 데이타를 제시한다.

표 4는 5-페닐-2H-[1,2,4]트리아졸-3-티올 (화합물 1)과 복합체를 형성한 solAC의 구조의 좌표 데이타를 제시한다.

표 5는 N-(3-페녹시-페닐)-옥살람산과 복합체를 형성한 solAC의 구조의 좌표 데이타를 제시한다.

표 6: solAC의 활성 부위 잔기.

표 7: 아데노신 모이어티(moiety)와 상호작용하는 solAC의 활성 부위 잔기

표 8: solAC의 바이카르보네이트 결합 부위.

표 9: solAC의 채널 결합 부위.

표 10: solAC의의 서브-포켓(sub-pocket) 결합 부위.

표 11 : solAC의 별법적인 결합 부위 잔기.

표 12: 포유류 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 전체 서열 간의 백분율 동일성.

표 13: 포유류 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인 간의 백분율 동일성.

표 14: solAC 발현 구축물.

표 15: solAC 용해 완충제.

표 16: solAC 구조를 해석하는데 사용된 중원자(重原子) 유도체.

정의

선택된 좌표

본원에 기술된 본 발명의 다양한 양상 (예를 들어 리간드의 피팅(fitting), 상동성 모델링 및 구조 해석, 데이타 저장 수단, 좌표의 컴퓨터 보조 조작 등)은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에 기재되었거나, 또는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5로부터 유도되거나, 또는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표를 참조하여 수득된 좌표를 사용한다. 본 발명의 모든 이같은 양상에서, 당업자는 본 발명의 다수의 용도에서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 모든 좌표를 사용할 필요가 없고, 단지 이들의 일부, 예를 들어 특정 사용과 관련하여 특별히 흥미로운 원자를 나타내는 좌표의 셋트가 필요하다는 것을 이해할 것이다. 이같은 일부 좌표가 본원에서 "선택된 좌표"로 지칭된다.

본 발명에 따른 선택된 좌표가 언급되는 경우, 이는 예를 들어 solAC 구조의 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상, 더욱 더 바람직하게는 100개 이상, 예를 들어 500개 이상 또는 1000개 이상의 단백질 원자를 의미한다. 바람직하게는, 선택된 좌표는 30개 이상의 상이한 아미노산 잔기 (즉, 30개의 상이한 잔기로부터의 1개 이상의 원자가 존재할 수 있다), 더욱 바람직하게는 60개 이상의 잔기, 더욱 더 바람직하게는 100개 또는 150개 이상의 잔기에 관련된다. 임의로, 선택된 좌표는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에 기재된 1개 이상의 리간드 또는 물 분자 원자를 포함한다.

아데닐레이트 사이클라제는 일반적으로 2-도메인 구조를 갖고, 2개의 도메인은 서로 상당한 구조 상동성을 갖고, 유사(pseudo)-이량체와 닮았다. 가용성 아데닐레이트 사이클라제는 대칭형 동종이량체로서 기능하는 남조류 클래스 III 아데닐레이트 사이클라제와 가장 밀접하게 관련된다. 동종이량체 내의 2개의 단량체, 또는 유사-이량체 내의 2개의 도메인은 이들의 활성 부위의 내용물에 따라 서로에 대해 상이한 정위를 가질 수 있다. 따라서, 선택된 좌표는 N-말단 도메인 (잔기 1-246)만의 것 또는 C-말단 도메인 (잔기 247-468)만의 것일 수 있다.

또다른 양상에서, 선택된 좌표는 하기 기술되는 바와 같이 solAC의 활성 부위에 주쇄 또는 부쇄 원자를 기증하는 것으로 본 발명가들이 확인한 1개 이상의 아미노산 잔기, 특히 표 6의 것들 (더욱 특히 표 7의 것들 중 어느 하나)의 원자를 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 선택된 좌표가 표 6에서 확인되는 잔기의 기, 더욱 바람직하게는 표 7에서 확인되는 잔기의 기로부터의 1개 이상의 원자를 포함하는 경우, 선택된 좌표는 이러한 바람직한 기의 아미노산 중 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상, 더욱 더 바람직하게는 5개 이상, 가장 바람직하게는 모두를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 선택된 좌표는 잔기의 이러한 기로부터의 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 25개, 더욱 바람직하게는 50개의 원자를 포함하고, 이때 1개 이상의 원자는 기의 각각의 구성원으로부터의 것이다.

또다른 양상에서, 선택된 좌표는 표 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나의 1개 이상의 아미노산 잔기의 원자를 포함하거나, 이것으로 구성된다. 또다른 실시양태에서, 선택된 좌표가 표 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나에서 확인된 잔기의 기로부터의 1개 이상의 원자를 포함하는 경우, 선택된 좌표는 각각의 표의 아미노산 중 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상, 더욱 더 바람직하게는 5개 이상, 가장 바람직하게는 모두를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 선택된 좌표는 잔기의 이러한 기로부터의 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 25개, 더욱 바람직하게는 50개의 원자를 포함하고, 이때 1개 이상의 원자는 이러한 표들 중 어느 하나에 기재된 기의 각각의 구성원으로부터의 것이다.

별법적으로, 선택된 좌표는 표 6 내지 11 중 어느 하나 또는 모두로부터의 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 25개, 더욱 바람직하게는 50개의 원자 예컨대 적어도 100개의 원자를 포함할 수 있다.

한 양상에서, 선택된 좌표는 표 6으로부터 선택된 아미노산 잔기 (예를 들어 표 7의 잔기)의 1개 이상의 좌표와 함께 표 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기의 1개 이상의 좌표를 포함할 수 있다. 한 양상에서, 선택된 좌표는 적어도 표 6 (바람직하게는 표 7)과 표 8로부터의 것이다. 선택된 좌표의 이같은 기는 ATP 및 바이카르보네이트 결합 부위를 차지하는 리간드의 디자인, 개발 및 분석에 특히 유리할 수 있다.

또다른 양상에서, 표 8의 잔기의 바람직한 부분집합은 Lys95, Val 67 및 Arg176이다. 표 8 잔기의 아미노산의 좌표의 사용과 관련된 본원에 기재된 본 발명의 양상에서, 잔기의 이러한 부분집합으로부터의 좌표의 사용이 또한 구현된다. 추가적으로, 특이적 리간드 상호작용을 갖는 것으로 확인된 원자 (표 1의 원자 1525, 2585, 2600, 2729; 표 2의 1525, 2588, 2603 및 2732; 표 3의 937, 1505, 1508 및 1578; 표 4의 1516, 2678, 2692 및 2821; 표 5의 1516, 2670, 2684 및 2813)의 좌표의 사용이 구현된다.

또다른 양상에서, 표 9의 잔기의 바람직한 부분집합은 His164, Phe165 및 Val335이다. 표 9 잔기의 아미노산의 좌표의 사용과 관련된 본원에 기재된 본 발명의 양상에서, 잔기의 이러한 부분집합으로부터의 좌표의 사용이 또한 구현된다. 추가적으로, 특이적 리간드 상호작용을 갖는 것으로 확인된 원자 (표 1의 원자 2536, 2546, 2565 및 5295; 표 2의 2539, 2549, 2568 및 5298; 표 3의 원자 1482, 1486, 1489, 및 2866; 표 4의 원자 2628, 2639, 2657, 및 5413; 표 5의 원자 2620, 2631, 2649, 및 5392)의 좌표의 사용이 구현된다.

추가적인 양상에서, 선택된 좌표는 tmAC와 비교하여 solAC에 독특한 것으로 나타난 solAC의 추가적인, 부분적으로 나선형인 도메인의 1개 이상의 아미노산 잔기의 원자를 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. 따라서 선택된 좌표는 잔기 Met1 내지 Tyr26 또는 Lys219 내지 Gly284의 1개 이상의 원자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 선택된 좌표는 잔기 Ile13 내지 His19, Phe226 내지 Phe236, Asp258 내지 Tyr268 또는 Glu271 내지 Ile277의 1개 이상의 원자를 포함한다. 이같은 경우, 더욱 바람직하게는, 선택된 좌표는 이러한 바람직한 좌표의 아미노산 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상, 더욱 더 바람직하게는 5개 이상, 예컨대 10개 이상, 가장 바람직하게는 모두로부터의 1개 이상의 원자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 선택된 좌표는 잔기의 이러한 기로부터의 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 25개, 더욱 바람직하게는 50개의 원자를 포함하고, 이때 상기 원자는 여러 아미노산의 전술된 바람직한 값으로부터의 것이다.

선택된 좌표는 바람직하게는 약 5％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 10％ 이상의 C-알파 원자를 포함한다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 선택된 좌표는 질소, C-알파, C-말단 및 카르보닐 산소 원자의 임의의 조합으로부터 선택된 골격 원자를 약 10％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 20％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 30％ 이상 포함한다.

따라서, 하기의 본원에서의 "선택된 좌표"에 대한 모든 언급은 명확하게 다른 방식으로 한정되지 않는 한 상기 정의된 바와 같이 파악되어야 한다.

제곱 평균 제곱근 편차 (rmsd).

단백질 구조 유사성은 제곱 평균 제곱근 편차 (rmsd)에 의해 일상적으로 표현 및 측정되고, 이는 두 셋트의 원자 사이의 공간에서 위치시키는 것에서의 차이를 측정한다. rmsd는 등가 원자들의 최적의 중첩 후 이들 간의 거리를 측정한다. rmsd는 전체 원자, 잔기 골격 원자 (즉 단백질 아미노산 잔기의 질소-탄소-탄소 골격 원자), 오직 주쇄 원자 (즉 단백질 아미노산 잔기의 질소-탄소-산소-탄소 골격 원자), 오직 부쇄 원자에 걸쳐서, 또는 더욱 일반적으로는 오직 C-알파 원자에 걸쳐서 계산될 수 있다.

단백질 구조를 비교하는 방법이 [Methods of Enzymology, vol 115, pg 397-420]에 논의되어 있다. rmsd를 계산하기 위한 필요한 최소-제곱 대수학은 [Rossman and Argos, J. Biol. Chem., vol 250, pp7525 (1975)]에서 제공되었지만, 더욱 신속한 방법이 [Kabsch, Acta Crystallogr., Section A, A92, 922 (1976)]; [Acta Cryst. A34, 827-828 (1978)], [Hendhckson, Acta Crystallogr., Section A, A35, 158 (1979)]; [McLachan, J. Mol. Biol., vol 128, pp49 (1979)] 및 [Kearsley, Acta Crystallogr., Section A, A45, 208 (1989)]에 기술되었다. 일부 알고리즘은, [Ferro and Hermans, Acta Crystallographic, A33, 345-347 (1977)]에 기술된 것과 같이, 한 분자가 다른 분자에 대해 이동되는 반복 절차를 사용한다. 또다른 방법, 예를 들어 Kabsch의 알고리즘은 베스트 핏(best fit)을 직접 밝혀낸다.

rmsd를 결정하기 위한 프로그램에는 MNYFIT (COMPOSER로 칭해지는 프로그램 컬렉션의 일부분, [Sutcliffe, M.J., Haneef, I., Carney, D. and Blundell, T.L. (1987) Protein Engineering, 1, 377-384]), MAPS ([Lu, G. An Approach for Multiple Alignment of Protein Structures (1998, 원고 및 http://bioinfo1.mbfys.lu.se/TOP/maps.html)])가 포함된다.

현저하게 상이한 셋트의 좌표를 비교하는 경우, 오직 C-알파 원자에 대해서만 rmsd 값을 계산하는 것이 더욱 일반적이다. 그러나, 측쇄 이동을 분석하는 경우, 모든 원자에 대한 rmsd를 또한 계산할 수 있다.

프로그램 예컨대 LSQKAB ([Collaborative Computational Project 4. The CCP4 Suite: Programs for Proten Crystallography, Acta Crystallographica, D50, (1994), 760-763]), QUANTA ([Jones et al., Acta Crystallography A47 (1991), 110-119], Accelrys (San Diego, CA)로부터 시판됨), Insight (Accelrys (San Diego, CA)로부터 시판됨), Sybyl® (Tripos, Inc. (St Louis)로부터 시판됨), O ([Jones et al., Acta Crystallographica, A47, (1991), 110-119]), 및 기타 좌표 핏팅 프로그램을 사용하여 rmsd 값을 계산할 수 있다.

예를 들어 프로그램 LSQKAB 및 O에서, 사용자는 계산 목적으로 짝지워지는 2개의 단백질 내의 잔기를 정의할 수 있다. 별법적으로, 잔기 짝지움은 두 단백질의 서열 정렬을 생성시킴으로써 결정될 수 있고, 서열 정렬을 위한 프로그램은 섹션 D에 더욱 상세하게 논의되어 있다. 그 후, 이러한 정렬에 따라 원자 좌표를 중첩시키고, rmsd 값을 계산한다. 프로그램 Sequoia ([CM. Bruns, I. Hubatsch, M. Ridderstrom, B. Mannervik, and J.A. Tainer (1999) Human Glutathione Transferase A4-4 Crystal Structures and Mutagenesis Reveal the Basis of High Catalytic Efficiency with Toxic Lipid Peroxidation Products, Journal of Molecular Biology 288(3): 427-439])는 상동성 단백질 서열의 정렬, 및 상동성 단백질 원자 좌표의 중첩을 수행한다. 일단 정렬되면, 상기 상술된 프로그램을 사용하여 rmsd를 계산할 수 있다. 동일한 또는 고도로 동일한 서열에 대해, 단백질의 구조 정렬은 상기 개요된 바와 같이 수동으로 또는 자동으로 이루어질 수 있다. 또다른 접근법은 서열을 고려하지 않고 단백질 원자 좌표의 중첩을 생성시키는 것일 것이다.

본원에 기술된 본 발명의 다양한 양상에서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 모든 또는 선택된 좌표의 사용이 기술된다. 유사하게, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 모든 또는 선택된 좌표의 사용에 의해 수득가능한, 또는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 모든 또는 선택된 좌표로부터 유도되는 구조 및 이의 사용이 기술된다. 이같은 양상에서, 표의 좌표는 1.5 Å 이하, 바람직하게는 1.4 Å 이하, 더욱 바람직하게는 1.2 Å 이하, 더욱 바람직하게는 1.0 Å 이하, 예를 들어 바람직하게는 0.7 Å 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 Å 이하, 더욱 바람직하게는 0.2 Å 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.1 Å 이하의 rmsd 내에서 변할 수 있다.

따라서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표에 대한 본원에서의 모든 언급은, 반대로 상술되지 않는 한, 1.5 Å 이하의 rmsd 변화를 포함하는 것으로 파악되고, 바람직한 변화량 값은 전술된 단락에 기재된 바와 같다. 유사하게, 1.5 Å 이하보다 작은 값의 rmsd 변화량은 마찬가지로 전술된 문장에 기재된 바람직한 더 좁은 한계를 포함하는 것으로 파악된다. 불확실함을 피하기 위해, 상기의 1.5 Å 이하보다 작은 특정값의 Å 미만의 rmsd 값에 대한 본원에서의 언급은 특정값 이하의 상기 기재된 바람직한 더 좁은 한계를 포함하는 것으로 이해된다.

바람직하게는, rmsd는 C-알파 원자를 기준으로 계산되고, 단 선택된 좌표가 사용되는 경우, 이는 이같은 원자의 약 5％ 이상, 바람직하게는 약 10％ 이상을 포함한다. 선택된 좌표가 상기 약 5％ 이상을 포함하지 않는 경우, rmsd는 모든 4개의 골격 원자를 참조하여 계산될 수 있고, 단 이는 선택된 좌표의 약 10％ 이상, 바람직하게는 약 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 30％ 이상을 포함한다. 선택된 좌표가 90％ 이상의 측쇄 원자를 포함하는 경우, rmsd는 모든 선택된 좌표를 참조하여 계산될 수 있다.

리간드.

본원에서 사용된 리간드는 본 발명의 solAC 구조에 결합하거나 이와 상호작용하는 잠재력을 갖는, 1개 이상의 원자를 포함하는 가상 또는 물리적 구조물이다. 이같은 원자는 유기 분자에서 발견되는 것들 예컨대 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황, 뿐만 아니라 생물학적 시스템에서 통상적으로 발견되는 금속 이온 예컨대 철, 칼슘, 마그네슘, 망간, 셀레늄 등을 포함한다.

본 발명에서 사용하기 위한 리간드는 3차원 구조가 당업계에서, 예를 들어 250,000개를 초과하는 분자의 구조를 함유하는 Cambridge Structural Database (www.ccdc.cam.ac.uk)로부터 입수가능한 소형 화학 분자일 수 있거나, 또는 특정 구조 또는 기타 기준을 기초로 구조가 디자인 또는 선택된 리간드일 수 있다. 이러한 구조 및 기타 구조는 solAC의 기능을 조정, 예를 들어 활성화 또는 억제하도록 solAC와 상호작용하는 신규 화합물의 개발에서 리간드를 스크리닝하는 것에 관한 본 발명의 양상에서 예를 들어 사용될 수 있다. 가상 분자 형태의 리간드가 본 발명의 solAC 구조의 1개 이상의 단백질 원자와 상호작용하도록 만들어질 수 있지만, 이같은 상호작용은 물리적 화합물 자체와 solAC 간에서 발생하지 않을 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

solAC의 촉매 도메인의 1개 이상의 원자에 결합하는 또는 이와 상호작용하는 리간드가 특히 흥미롭다. 리간드는 효소의 조정인자 (예를 들어 활성화제 또는 억제제), 또는 효소의 기질일 수 있다. 한 이같은 기질은 아데닐레이트 사이클라제의 작용에 의해 활성 약물로 전환되는 전구약물일 수 있다. 리간드 결합은, 배타적이지는 않지만, 일반적으로 비-공유결합 상호작용, 예컨대 수소 결합 등을 통한 것이다.

컴퓨터-기반 분석 방법 등의 방법의 문맥에서 리간드에 대한 언급은 가상 분자 구조를 지칭하는 것일 반면, 다른 문맥 (예를 들어 solAC의 결정의 침투(soaking) 등)에서는 리간드가 화학 화합물일 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 일부 양상에서, 리간드는 컴퓨터 모델링 기술에 의해 확인되고, 이어서 추가적인 분석을 위해 화학 화합물의 형태로 제공될 것이다. 종종 화합물의 분석, 예를 들어 침투 또는 공동-결정화 실험에서의 분석으로 추가적인 리간드가 생산될 것이고, 그후 이는 본 발명의 컴퓨터-기반 방법에 의해 분석될 것이다.

침투 또는 공동-결정화에 사용될 수 있는 후보 리간드는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 아데닐레이트 사이클라제 억제제로서 개발 중인 화합물이 화합물과 solAC의 상호작용을 확인하고 따라서 리간드를 이의 활성을 증강 또는 다른 방식으로 조정하기 위한 방식으로 변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 이같은 리간드는 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 아데닌 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.

별법적으로, 다수의 합성 화합물 라이브러리(library)가 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.), 및 Microsource (New Milford, Conn.)가 포함되는 다양한 회사로부터 시판되고, 희귀 화학물질 라이브러리가 Aldrich (Milwaukee, Wis.)로부터 입수가능하다. 조합 라이브러리가 입수가능하고, 제조될 수 있다. 별법적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가, 예를 들어, Pan Laboratories (Bothell, Wash.) 또는 MycoSearch (N.C)로부터 입수가능하거나, 또는 당업계에 주지된 방법에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 천연 공급원, 예컨대 동물, 박테리아, 진균, 식물 공급원 (잎 및 나무껍질 포함), 및 해양 샘플로부터 단리된 화합물을 잠재적으로 유용한 제약 작용제의 존재에 대한 후보물질로서 분석할 수 있다는 것이 제안된다. 스크리닝될 제약 작용제가 화학 조성물 또는 인간에 의해 제조된 화합물로부터 또한 유도 또는 합성될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

특히 흥미로운 리간드는 제약 용도용으로 개발 중인 화합물일 것이다. 일반적으로, 이같은 리간드는 유기 분자일 수 있고, 이는 분자량이 전형적으로 약 100 내지 2000 Da, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 1000 Da이다. 이같은 리간드에는 펩티드 및 이의 유도체, 스테로이드, 항-염증 약물, 항암제, 항진균 또는 항바이러스제, 신경 작용제 등이 포함된다. 원칙적으로, 약학 분야에서 개발 중인 임의의 화합물이 이의 개발을 촉진하기 위하여 또는 추가적인 합리적인 약물 디자인이 이의 성질을 개선시키도록 하기 위하여 본 발명에서 사용될 수 있다.

기타 흥미로운 리간드는 아데닌 뉴클레오티드 및 이의 유사체이다. 아데닌 뉴클레오티드는 아데노신의 포스페이트 에스테르 중 임의의 것, 즉 아데노신 5' 모노포스페이트 (AMP), ADP 및 ATP 중 임의의 것이다.

아데닌 뉴클레오티드의 유사체는 아데닌 뉴클레오티드의 특징적인 구조가 유지된 임의의 화합물, 예컨대 solAC의 ATP-결합 포켓에 결합할 수 있는 뉴클레오티드 단편 또는 뉴클레오티드의 분자 변이체이다. 특징적인 구조는 유사체가 1개 이상의 퓨린 염기 구조, 당 잔기, 및 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트 에스테르 구조 또는 이의 유사체를 포함할 것이라는 것을 의미한다.

아데닌 뉴클레오티드의 단편은 아데노신의 포스페이트 에스테르 중 임의의 것의 임의의 분자 단편을 포함하고, 이러한 단편은 solAC의 ATP-결합 포켓에 결합할 수 있다. 따라서, 아데닌 뉴클레오티드의 예는 아데닌 (염기), 아데노신 (뉴클레오시드), 리보스 (당), 및 리보스의 포스페이트 에스테르 중 임의의 것 (예를 들어 리보스 5' 모노포스페이트, 리보스 5' 디포스페이트 및 리보스 5' 트리포스페이트 중 임의의 것)이다.

아데닌 뉴클레오티드의 분자 변이체에서, 퓨린 염기 구조는 아데닌 유도체, 예컨대 위치 8에서 치환되었거나 (예를 들어 8-브로모 ATP 또는 8-브로모 AMP가 제공되도록 할로겐 원자로 치환되거나, 또는 알킬 기로 치환됨), 또는 고리가 헤테로원자를 함유하거나, 또는 ZMP (AICA 리보시드 모노포스페이트)에서와 같이 염기가 개방-고리 유사체인 아데닌일 수 있다. 추가적으로 또는 별법적으로, 당 잔기 구조는, 예를 들어, 2' 또는 3' 히드록실 기의 변형, 예를 들어 다른 기로의 치환 또는 기의 고리화를 포함할 수 있다. 또한, 유사체의 포스페이트 에스테르 부분은 예를 들어 γ와 β 포스페이트 간에 (예를 들어 아데노신-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트, AMPPNP) 또는 β와 a 포스페이트 간에 (예를 들어 아데노신-5'-[(α,β)-메틸에노]트리포스페이트, AMPCPP) 비-가수분해성 기를 제공하도록 변형될 수 있다. 매우 광범위한 유사체가 광범위한 시판원, 예를 들어 Jena Bioscience GmbH (Jena, Germany)로부터 입수가능하다.

또한, 광범위한, 아데닌 뉴클레오시드 유사체가 또한 임상적으로, 특히 항바이러스 분야에서 사용된다. 예를 들어 비다라빈 (아데닌 아라비노시드, 또는 ara-A로 또한 공지됨)은 바이러스 중합효소를 표적화함으로써 헤르페스 바이러스를 치료하기 위해 사용되는 아데닌 뉴클레오시드 유사체이고, 9-(3-히드록시-2-포스포닐-메톡시프로필)-아데닌 (HPMPA로 또한 공지됨)은 항-HIV 활성이 있는 아데닌 유도체이다 ([Pauwels, R.; Balzarini, J.; Schols, D.; Baba, M.; Desmyter, J.; Rosenberg, I.; Holy, A.; De Clercq, E., Phosphonylmethoxyethyl Purine Derivatives, A New Class Of Anti-Human Immunodeficiency Virus Agents. Antimicrob Agents Chemother 32(7): 1025-1030 (1988)]). 이들 중 일부는 생체내에서 트리포스페이트로 인산화된다.

아데닌 뉴클레오티드 및 이의 유사체는 solAC와의 상호작용이 증가 또는 감소되도록 추가로 변형될 수 있는 리간드로서, 예를 들어 신규 제약 화합물의 개발에서 사용될 수 있다.

또한 리간드는, 모이어티가 바이카르보네이트 결합에서 수반되는 1개 이상의 solAC 원자와 배위되는 능력을 갖도록, 바이카르보네이트 또는 바이술피드 유사체 모이어티인 모이어티가 있는 화합물일 수 있다.

A. 단백질 결정

본 발명은 인간 가용성 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인의 결정을 제공한다.

추가적인 양상에서, 본 발명은 서열 3의 잔기 1 내지 468을 포함하는 가용성 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인 또는 1 내지 10개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 있는 이의 변이체의 결정을 제공한다. 이같은 결정은 임의로 His6 태그가 제거된 (즉 서열 3의 1 내지 469), 또는 His6 태그가 4 내지 20개의 아미노산을 갖는 태그로 대체된 서열 3의 서열을 가질 수 있다. 이같은 태그는 더 적거나 더 많은 수의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있고, 예를 들어 His4, His5, His 7 또는 His6 태그일 수 있다. 결정은 본원에 설명된 조건 하에 결정을 형성하는 능력이 유지된 서열 3의 잔기 1-468의 대립유전자 또는 변이체를 포함할 수 있다. 이같은 변이체는 다수의 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산의 등가 또는 더 적은 갯수의 아미노산에 의한 치환이 있는 것들을 포함한다. 돌연변이체를 포함하여 변이체의 추가적인 예가 하기에서 본원에서 추가로 논의된다.

한 실시양태에서, 상기 기술된 본 발명의 결정은 스페이스 군 P6₃을 갖고, 단위(unit) 셀(cell) 치수가 a = b = 99.5 Å, c = 97.4 Å, 및 α = β = 90.00°, γ = 120.00°이다. 단위 셀 치수에 5％의 가변성이 적용될 수 있다. 따라서, 특정 예는 a = b = 99.51 Å, c = 97.13 Å; a = b = 99.424 Å, c = 97.390 Å (표 1에 제시된 바와 같음); a = b = 99.651 Å, c = 96.522 (표 2에 제시된 바와 같음); a = b = 99.673 Å, c = 96.824 (표 3에 제시된 바와 같음); a = b = 99.569 Å, c = 98.470 (표 4에 제시된 바와 같음); a = b = 99.291 Å, c = 97.753 (표 5에 제시된 바와 같음)이다.

더욱 일반적으로, 단위 셀 결정 치수는 104.475 Å > a = b > 94.525 Å, 102.27 Å > c > 92.53 Å 범위 내일 수 있다.

이같은 결정은 첨부된 실시예에 기술된 방법을 사용하여 수득할 수 있다.

본 발명은 임의의 활성 부위 결합 리간드의 부재 하에 성장된 solAC 촉매 도메인의 결정을 제공한다. 따라서 본 발명은 solAC 촉매 도메인의 아포 결정을 포함한다.

본원에 설명된 solAC 결정 또는 공동-결정을 제공하기 위해 사용된 방법은 일반적으로 약 3.5 Å 이상의 해상도에서 해상가능한 solAC 촉매 도메인 결정 또는 공동-결정을 제공하도록 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 해상도가 3.5 Å 이상인 solAC 촉매 도메인 결정 또는 공동-결정을 추가로 제공한다.

추가적인 양상에서, 본 발명은 부유 방울 증기 확산에 의해 결정을 성장시키는 것을 포함하는, solAC 촉매 도메인 단백질 결정, 특히 solAC의 촉매 도메인의 서열을 포함하는 solAC 단백질 또는 이의 변이체의 것을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상은 내부에 리간드가 침투된 solAC 촉매 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명은 solAC 촉매 도메인의 결정을 제조하고 이의 내부에 리간드를 침투시키는 것을 포함하는 solAC 촉매 도메인과 리간드의 복합체의 결정을 제조하는 방법을 제공한다.

(i) 돌연변이체

돌연변이체는 야생형 solAC로부터의 1개 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 특징으로 하는 solAC 촉매 도메인 단백질이다. 이같은 돌연변이체는 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 또는 천연 또는 비천연 아미노산의 혼입에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 "돌연변이체"가 구현되고, 이때 "돌연변이체"는 천연 또는 합성 solAC 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 치환함으로써 및/또는 천연 폴리펩티드 내의 solAC에 상응하는 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기를 부가 및/또는 결실시킴으로써 수득되고, 자신이 유래된 solAC와 실질적으로 동일한 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 실질적으로 동일한 3차원 구조를 갖는다는 것은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표로부터의 제곱 평균 제곱근 편차 (rmsd)가 약 1.5 Å 미만인 원자 구조 좌표의 셋트를 갖는 것을 의미한다.

돌연변이체는 효소 또는 촉매 활성을 가질 수 있지만, 반드시 가질 필요는 없다.

상동체 또는 돌연변이체를 생산하기 위해, 상기 단백질 내에 존재하는 아미노산을 유사한 성질, 예를 들어, 소수성, 소수성 모멘트, 항원성, α-나선형 또는 β-시트 구조를 형성하거나 파괴하는 성향 등을 갖는 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있다. 단백질의 치환 변이체는 단백질 서열 내의 1개 이상의 아미노산이 제거되고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것이다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이지만, 기능적 속박에 따라, 예를 들어 결정 접촉에서 군집될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환을 포함할 것이다. 삽입 아미노산 변이체는 1개 이상의 아미노산이 도입된 것이다. 이는 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합, 뿐만 아니라 서열내 삽입일 수 있다. 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합의 예는 친화력 태그 (예를 들어 MBP 또는 GST 태그), 또는 에피토프 태그이다

solAC의 3차원 구조를 현저하게 방해하지 않는 아미노산 치환, 결실 및 부가는, 부분적으로, 치환, 부가 또는 결실이 발생하는 solAC의 영역에 좌우될 것이다. 분자의 고도로 가변성인 영역에서, 비-보존성 치환, 뿐만 아니라 보존성 치환이 분자의 3차원 구조를 현저하게 파괴하지 않으면서 허용될 수 있다. 고도로 보존된 영역, 또는 중요한 2차 구조를 함유하는 영역에서는, 보존성 아미노산 치환이 선호된다.

보존성 아미노산 치환은 당업계에 주지되어 있고, 수반되는 아미노산 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 성질에서의 유사성을 기초로 이루어진 치환을 포함한다. 예를 들어, 음성 전하를 띠는 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고; 양성 전하를 띠는 아미노산에는 라이신 및 아르기닌이 포함되고; 유사한 친수성 값을 갖는 전하를 띠지 않는 극성 머리 기가 있는 아미노산에는 류신, 이소류신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 페닐알라닌, 타이로신이 포함된다. 기타 보존성 아미노산 치환은 당업계에 주지되어 있다.

일부 예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 내의 편리한 클로닝 부위의 제공, 폴리펩티드 정제의 보조 등을 위해 아미노산 잔기를 치환, 결실 및/또는 부가시키는 것이 특히 유리하거나 편리할 수 있다. solAC의 3차원 구조를 실질적으로 변화시키지 않는 이같은 치환, 결실 및/또는 부가는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 본원에서 구현된 돌연변이체는 효소 활성을 나타낼 필요가 없다. 실제로, solAC의 촉매 활성을 방해하지만 촉매 영역의 3차원 구조를 현저하게 변화시키지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 본 발명에서 특히 구현된다. 이같은 결정질 폴리펩티드, 또는 이로부터 수득되는 원자 구조 좌표를 사용하여 단백질에 결합하는 리간드를 확인할 수 있다.

돌연변이를 위한 잔기는 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있고, 이러한 돌연변이는 Stratagene QuikChange™ 부위-지정 돌연변이유발 키트를 예를 들어 사용하여 부위-지정 돌연변이유발 또는 카세트 돌연변이유발 방법에 의해 도입될 수 있다 (예를 들어 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York], 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)] 참조).

( ii ) 대립유전자

본 발명에서 "대립유전자"가 구현되고, 이때 대립유전자는 멘델 유전에서 서로 대립되는 문자에 대해 1902년 Bateson 및 Saunders가 만들어낸 용어이다. 현재 용어 대립유전자는 상이한 유전자 산물 및 따라서 상이한 표현형이 초래되는 2개 이상의 택일적인 형태의 유전자에 대해 사용된다. 대립유전자는 전사, 스플라이싱, 번역, 전사후 또는 번역후 개질에 영향을 미치거나 1개 이상의 아미노산 변화를 초래하는 것으로 나타난 뉴클레오티드 변화를 함유한다. 전형적으로, solAC의 대립유전자 변이체는 상응하는 특정하게 예시된 solAC 단백질과의 서열 동일성이 적어도 75％ (더욱 바람직하게는 적어도 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 서열 동일성)일 것이고, 이때 서열 동일성은 중첩 및 동일성이 최대화되면서 서열 갭(gap)은 최소화되도록 정렬되었을 때 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 결정된다. 더욱 일반적으로, 대립유전자 형태는 야생형 단백질로부터의 1-10개의 아미노산 변화, 특히 1개 또는 2개의 아미노산 변화, 또는 DNA 서열에서의 1-30개의 뉴클레오티드 변화를 포함한다.

본 발명이 solAC-리간드 복합체 및 solAC의 돌연변이체, 상동체, 유사체, 대립유전자 형태, 종 변이체 단백질에 관련된다는 점에서, 이같은 단백질의 결정이 형성될 수 있다. 당업자는 solAC의 결정화를 위해 본원에서 제공된 조건이 이같은 결정을 형성시키는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 별법적으로, 당업자는 이러한 조건을 결정을 형성시키기 위한 변형 조건을 확인하기 위한 기초로 사용할 것이다.

따라서, solAC의 결정에 관한 본 발명의 양상은 상동체, 대립유전자 형태 및종 변이체가 초래되는 solAC의 돌연변이체의 결정으로 확장될 수 있다.

( iii ) solAC 의 정제

결정화를 위한 충분한 양의 단백질을 수득하기 위해, solAC의 고수준의 발현 및 회수를 위한 프로토콜을 개발하는 것이 필요하였다. 한 실시양태에서, 본 발명은

solAC를 진핵생물 세포 배양물에서 발현시키는 단계;

배양물 내의 세포를 10 - 100 mM 트리스 (pH 7.4 - 8.0) (4℃), 0.3 - 0.5 M NaCl, 0 - 20％ (v/v) 글리세롤 및 2-5 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 완충액에서 용해시키는 단계; 및

solAC를 배양물로부터 회수하는 단계

를 포함하는 solAC (예를 들어 서열 3의 잔기 1-469를 포함하는 solAC 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체)의 생산 방법을 제공하고, 이때 임의로 solAC는 C-말단 또는 N-말단 태그에 융합된다.

더욱 바람직하게는, 상기 방법은

배양물 내의 세포를 40-60 mM 트리스 (pH 7.4 - 7.6) (4℃), 0.3 - 0.4 M NaCl, 5 - 15％ (v/v) 글리세롤 및 2-5 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 완충액에서 용해시키는 단계; 및

solAC를 배양물로부터 회수하는 단계

를 포함한다.

더욱 바람직하게는, 상기 세포 배양물에서의 발현에 이어서, 상기 방법은

배양물 내의 세포를 50 mM 트리스 (pH 7.5) (4℃), 0.3 M NaCl, 10％ (v/v) 글리세롤 및 2-5 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 완충액에서 용해시키는 단계; 및

solAC를 배양물로부터 회수하는 단계

를 포함한다.

이러한 상기 언급된 방법들에서, 진핵생물 세포 배양물은 포유류 또는 곤충 세포 배양물, 특히 곤충 세포 배양물일 수 있다.

한 실시양태에서, solAC는 히스티딘 태그 (예를 들어, 약 4개 내지 10개, 예컨대 약 6개의 히스티딘을 포함하는 태그) 잔기를 포함하고, solAC의 회수는 solAC를 태그가 컬럼에 결합되도록 하는 조건 하에 킬레이트 컬럼에 결합시킨 후, 컬럼으로부터 단백질을 용출시키는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, solAC는 GST 태그를 포함할 수 있다.

본 발명은 50 mM 트리스 (pH 7.5) (4℃), 330 mM NaCl, 10％ (v/v) 글리세롤 및 1 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 완충액 내에 solAC, 특히 서열 3의 solAC 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 바람직한 실시양태에서, solAC의 농도는 10 내지 40 ㎎/㎖, 예컨대 20 내지 40 ㎎/㎖이다. 바람직하게는, solAC는 이러한 바람직한 조건에서 단량체성 형태로 유지된다.

( iv ) solAC 의 결정화

solAC 촉매 도메인 단백질의 결정을 생산하기 위해, 최종 단백질을 시판되는 농축 장치를 사용하여 50 mM 트리스 (pH 7.5), 330 mM 염화나트륨, 1 mM 베타-메르캅토에탄올 및 10％ 글리세롤을 예를 들어 포함하는 완충제에서 약 8-15 ㎎/㎖로 농축시킨다.

단백질의 결정화는 부유 또는 시팅(sitting) 방울 방법에 의해 설정되고, 단백질은 광범위한 증기 확산 완충제 조성물에 대한 4℃에서의 증기 확산에 의해 결정화된다. 마이크로시딩(microseeding)이 사용될 수 있다. 부유 또는 시팅 방울에서 1:1 비율의 단백질 용액 및 증기 확산 완충제를 사용하는 것이 통상적이고, 달리 언급되지 않는 한 본원에서 이러한 비율이 사용되었다. 부유 또는 시팅 방울은 전형적으로 부피가 약 0.5 내지 2 ㎕, 예컨대 약 1 내지 2 ㎕, 바람직하게는 1 ㎕이다. 결정화는 마이크로뱃치(microbatch) 방법에 의해 또한 수행될 수 있다.

전형적으로, 증기 확산 완충제는 100 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8), 200 mM 시트르산삼나트륨, 14-17％ PEG4000, 10％ 글리세롤 및 3 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함한다.

결정화를 위한 시험용 조건을 Hampton Research Screening 키트, 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG)/이온 스크린, PEG 그리드, 황산암모늄 그리드, PEG/황산암모늄 그리드 등을 사용하여 제조할 수 있다.

결정화에 영향을 미치는 것으로 확인된 첨가제를 결정화 조건에 첨가할 수 있다. 첨가제의 존재가 샘플의 결정화를 보조할 수 있고 첨가제가 결정의 품질을 개선시킬 수 있는 예비 결정화 조건의 최적화 동안 첨가제 스크린, 예를 들어, 글리세롤, 폴리올 및 단백질 결정화에서의 기타 단백질 안정화제 ([R. Sousa. Acta. Cryst. (1995) D51, 271-277]) 또는 2가 양이온 ([Trakhanov, S. and Quiocho, F.A. Protein Science (1995) 4,9, 1914-1919])을 사용하는 Hampton Research 첨가제 스크린이 사용된다.

또한, 결정화 거동을 개선시키기 위해 세제, 예를 들어, Hampton Research 세제 스크린에서 발견된 이온성, 비-이온성 또는 쯔비터이온성 세제가 결정화 조건에 첨가될 수 있다 ([McPherson, A., et al., The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins, J. Crystal Growth (1986) 76, 547-553]).

또한, 시딩 방법을 사용함으로써 결정 품질이 개선될 수 있다. 여기에는 마이크로시딩, 스트릭(streak) 시딩 및 마크로시딩(macroseeding)이 포함된다. 시판되는 시드 제조 키트, 예컨대 Hampton Research에서 판대되는 것들을 사용할 수 있다.

B. 결정 좌표.

추가적인 양상에서, 본 발명은 표 1의 3차원 원자 좌표를 갖는 가용성 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인의 결정을 또한 제공한다.

표 1은 원자 1 내지 7273을 포함하는 분자 A로 확인된, 비대칭 단위 내에 존재하는 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인에 대한 원자 좌표 데이타를 제공한다. 이러한 표의 행에서, 두번째 열은 원자 번호를 나타내고, 세번째 열은 원자를 나타내고, 네번째 열은 잔기 유형이며, 다섯번째 열은 사슬 식별 (A 또는 B)이고, 여섯번째 열은 잔기 번호이고, 일곱번째, 여덟번째 및 아홉번째 열은 각각 당해 원자의 X, Y, Z 좌표이며, 열번째 열은 원자의 점유율이고, 열한번째 열은 원자의 온도 인자이고, 열두번째 열은 원자 유형이다.

표의 나머지 원자 (7274-8726)는 물이고, 원자들은 상기와 동일한 포맷으로 확인된다.

표 1의 원자 좌표에 의해 정의되는 구조의 유리한 특색은 이들이 약 1.7 Å의 해상도를 갖는다는 것이다. 표 2의 원자 좌표에 의해 정의되는 구조의 유리한 특색은 이들이 약 1.9 Å의 해상도를 갖는다는 것이다. 표 3 및 표 4의 원자 좌표에 의해 정의되는 구조의 유리한 특색은 이들이 약 2.0 Å의 해상도를 갖는다는 것이다. 표 5의 원자 좌표에 의해 정의되는 구조의 유리한 특색은 이들이 약 2.05 Å의 해상도를 갖는다는 것이다.

표 1의 원자좌표에 의해 정의되는 바와 같은 구조의 특별한 장점은 이들이 리간드가 차지하지 않은 활성 부위를 갖는 구조를 묘사한다는 것이다.

추가적인 양상에서, 본 발명은 표 2에 기재된 3차원 구조를 갖는, 분자 AMPCPP와 복합체를 형성한 가용성 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인의 결정을 또한 제공한다.

표 2는 solAC와 AMPCPP의 복합체에 대한 원자 좌표를 제공하고, 이때 분자 A로 확인된 단백질은 1-7289로 번호매겨진 원자를 포함하고, AMPCPP 분자는 7291-7339로 번호매겨진 원자를 포함하며, 칼슘 이온은 7340으로 번호매겨지고, 나머지 원자는 7341-8307로 번호매겨지고 물 분자이다. 이러한 표의 행에서, 두번째 열은 원자 번호를 나타내고, 세번째 열은 원자를 나타내고, 네번째 열은 잔기 유형이며, 다섯번째 열은 사슬 식별 (A 또는 B)이고, 여섯번째 열은 잔기 번호이고, 일곱번째, 여덟번째 및 아홉번째 열은 각각 당해 원자의 X, Y, Z 좌표이며, 열번째 열은 원자의 점유율이고, 열한번째 열은 원자의 온도 인자이고, 열두번째 열은 원자 유형이다.

표 3은 solAC와 바이카르보네이트의 복합체에 대한 원자 좌표 데이타를 제공한다. 분자 A로 확인된 단백질은 171 내지 3909로 번호매겨진 원자를 포함한다. 표에서 물 분자 (1-87 및 92-170) 및 바이카르보네이트의 원자 (88-91)가 선행된다.

표 4는 solAC와 5-페닐-2H-[1,2,4]-트리아졸-3-티올 (화합물 1)의 복합체에 대한 원자 좌표 데이타를 제공하고, 이때 분자 A로 확인된 단백질은 1-7499로 번호매겨진 원자를 포함하고, 화합물 1 분자는 원자 7516-7534이며, 이후의 분자는 물이다. 글리세롤 분자가 원자 7502 내지 7514로 또한 구조 내에 존재한다.

표 5는 solAC와 N-(3-페녹시-페닐)-옥살람산 (화합물 2)의 복합체에 대한 원자 좌표 데이타를 제공하고, 이때 분자 A로 확인된 단백질은 1-7478로 번호매겨진 원자를 포함하고, 화합물 2 분자는 원자 7495-7523이며, 이후의 분자는 물이다. 글리세롤 분자가 원자 7481 내지 7493으로 또한 구조 내에 존재한다.

표 3-5의 행의 순서는 solAC 단백질 구조와 관련하여 표 2에 대한 것과 같다.

표 1, 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5는 모두 내부적으로 일관된 포맷으로 기재된다. 예를 들어, 표 1, 2, 4 및 5에서, 각각의 아미노산 잔기의 원자의 좌표는 먼저 골격 질소 원자, 이어서 C-알파 골격 탄소 원자 (CA로 칭해짐), 이어서 측쇄 잔기 원자 (한 표준 협정에 따라 칭해짐), 마지막으로 단백질 골격의 탄소 및 산소이도록 열거된다. 표 3에서, 단백질 골격의 탄소 및 산소가 측쇄 잔기에 선행된다. 표 3은 solAC 구조에 대한 연속적인 원자 번호매김을 또한 함유하지만, 다른 표에서의 번호매김은 단백질 분자의 수소 원자를 세는 협정을 사용한다. 이러한 원자들의 상이한 순서매김, 또는 측쇄 잔기, 리간드 분자 원자의 상이한 호칭을 포함할 수 있는 별법적인 파일 포맷을 당업자가 사용하거나 선호할 수 있다. 그러나, 표의 좌표를 나타내거나 조작하기 위해 상이한 파일 포맷을 사용하는 것은 본 발명의 범주 내라는 것이 명백할 것이다.

표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표는 소수점 3자리까지 주어진, 옹스트롬 단위의 원자 위치의 치수를 제공한다. 좌표는 3차원 형상을 정의하는 위치들의 상대적인 셋트이지만, 당업자는 상이한 원점 및/또는 축을 갖는 전체적으로 상이한 셋트의 좌표가 유사 또는 동일한 형상을 정의할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 상기의 "정의" 섹션에 기재된 바와 같이, 제곱 평균 제곱근 편차가 1.5 Å 미만이도록 구조의 원자의 상대적인 원자 위치를 변화시키는 것은 구조적 특성 및 리간드와의 solAC-상호활성의 구조-기반 분석에 대한 유용성 모두의 관점에서 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 구조와 실질적으로 동일한 구조를 일반적으로 초래할 것이라는 것을 이해할 것이다.

마찬가지로, 당업자는 표의 물 분자 및/또는 리간드 분자의 수 및/또는 위치를 변화시키는 것이 solAC-상호작용 리간드의 구조-기반 분석에 대한 구조의 유용성에 일반적으로 영향을 미치지 않을 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 양상인 것으로 본원에 기술된 목적을 위해, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표가 상이한 원점 및/또는 축으로 전치되고/되거나; 구조의 원자의 상대적인 원자 위치 또는 이의 선택된 좌표가 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에 제공된 좌표에 중첩되었을 때 생성된 변화된 구조의 제곱 평균 제곱근 편차가 1.5 Å 미만이도록 변화되고/되거나; 물 분자 및/또는 리간드 분자의 수 및/또는 위치가 변화되는 것은 본 발명의 범주 내이다.

상기 언급된 바와 같이, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 구조의 바람직한 선택된 좌표는 본원의 하기에서 기술되는 바와 같이 solAC의 활성 부위에 주쇄 또는 측쇄 원자를 기증하는 것으로 본 발명가들이 확인한 1개 이상의 아미노산 잔기의 원자일 수 있다. 이같은 원자는 표 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 예컨대 표 6, 7 또는 11 중 어느 하나에 기재된 아미노산에 존재하는 하나 이상의 원자를 포함한다. 각각의 표의 바람직한 선택된 좌표, 또는 2개 이상의 표로부터의 좌표의 조합은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다.

가용성 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 구조가 표 1 또는 표 2의 좌표에 의해 기술된다. 잔기 Met1이 전자 밀도에서 첫번째 관찰가능한 잔기이고, Lys468이 마지막 잔기이다. Met1의 주쇄 질소에 인접한 전자 밀도 피크는 아세틸화로 인한 것일 수 있고, 모델링되지 않았다. 표 1에서 해석가능한 주쇄 밀도가 없는 잔기는 Trp135, Glu136, Glu137, Gly138, Leu139, Asp140, Phe350, Pro351, Gly352, Glu353, Lys354, Val355 및 Pro356이다. 잔기 Val469 및 C-말단 His 태그는 전자 밀도에서 가시적이지 않다. 134에서의 첫번째 단절에 인접한 주쇄는 불량하게 정의되고, 잔기 132-134는 일정하지 않은(patchy) 주쇄 전자 밀도를 갖는다. 잔기 304-306 및 451-455는 전자 밀도에 의해 불량하게 정의된다. 또한, 모델의 주변부 상의 여러 잔기는 이들에 대한 해석가능한 밀도가 없기 때문에 이들의 측쇄가 임의로 배치되었다. Phe350는 표 2에서 가시적이다.

가용성 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 추가적인 구조가 해석되었고, 여러 이러한 구조가 표 1의 해상되지 않은 잔기에 대한 해석가능한 밀도를 가져, 표 3, 표 4 또는 표 5의 더욱 완전한 좌표 데이타가 수득되도록 하였다.

해석된 포유류 가용성 아데닐레이트 사이클라제 구조를 기존에 공개된 박테리아 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 구조와 비교하기 위해, 가용성 아데닐레이트 사이클라제와 스피룰리나 플라텐시스 아데닐레이트 사이클라제 (PDB 코드 1wc1) ([Steegborn, C, Litvin, T., Levin, L.R. Buck, J. and Wu, H. (2005) Nat. Struc. And Mol. Biol.,12, 32-37]) 구조 간의 rmsd를 계산하였다. 구조를 중첩시키기 위해 Comparer ([Sali and Blundell (1990) J Mol Biol. 212, 403-428])를, 중첩을 정련시키고 rmsd를 계산하기 위해 MNYFIT ([Sutcliffe et al. 1987])를 사용하여 계산을 수행하였다. 오직 Cα 원자만의 위치를 사용하여 rmsd를 계산하였다. 중첩을 수행하기 위해 각각의 구조를 이의 구성 도메인으로 분할하였다. 이는 도메인 이동이 구조들 간의 rmsd에서의 커다란 차이의 원인이 되는 문제를 무효로 한다. 따라서 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 첫번째 도메인 (잔기 36-216)이 스피룰리나 플라텐시스 구조의 B 사슬 상에 중첩되었고, 두번째 도메인 (잔기 287-465)이 C 사슬 상에 중첩되었다. 2.5 Å의 차단(cut-off)을 사용하여 등가를 정의하였다 (중첩된 구조의 Cα 원자의 2.5 Å 이내인 한 구조의 Cα 원자는 등가이다). 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 첫번째 도메인에 대해, 181개의 잔기 중 116개가 1.2 Å의 rmsd로 스피룰리나 플라텐시스 구조 내의 잔기에 대해 등가인 것으로 정의되었다. 두번째 도메인에 대해, 179개의 잔기 중 127개가 1.4 Å의 rmsd로 스피룰리나 플라텐시스 구조 내의 잔기에 대해 등가인 것으로 정의되었다. 이러한 rmsd 값 및 2.5 Å 차단에서 확인된 등가 잔기의 낮은 개수는 2차 구조 요소를 연결하는 서열의 다수의 영역의 길이 및 정위에서의 차이의 결과이다. 중첩 조사는 포유류 사이클라제에서 몇개의 잔기가 더 짧은 나선 α3의 길이에서의 차이를 또한 나타냈고, 분자의 코어(core) β-시트 부분은 잘 중첩되는 반면, 나선 α2 및 α3는 덜 잘 중첩되었다. 따라서, 본 발명의 solAC 구조의 전체적인 2개의 도메인은 스피룰리나 플라텐시스 구조 1wc1로부터 1.5 Å를 상당히 초과하는 전체 Cα 원자의 rmsd 값을 갖는다.

효소들 간의 2차 구조에서의 약간의 차이가 존재하고, 예를 들어 인간 가용성 아데닐레이트 사이클라제는 tmAC 또는 스피룰리나 플라텐시스 효소보다 짧은 베타1 가닥 및 더 긴 알파1 나선을 갖는다.

solAC와 tmAC 및 스피룰리나 플라텐시스 solAC 간의 주요 차이는 유사이량체의 N-말단 도메인의 염기에 대해 놓인 추가적인 부분적 나선형 도메인의 존재이다. 이는 N-말단 잔기 1-26으로 구성되고, 잔기 1-12는 펼쳐진 입체구조를 갖고, 13-19는 나선형 입체구조를 채택하며, 나머지 잔기 20-26은 펼쳐지면서, 25-27이 1회전의 나선을 형성한다. 도메인의 나머지 부분은 잔기 219-284에 의해 형성된다. 이는 N-말단 도메인 내의 베타8, C-말단 도메인 내의 베타1, 및 C-말단 도메인 내의 알파1을 형성할 잔기들을 포함한다. 잔기 219-284 내에서, 잔기 226-236, 258-268 및 271-277은 3개의 나선을 형성한다.

본 발명가들은 리간드에 결합하는 solAC 내의 여러 영역을 확인하였다. 또한 본 발명가들은 이러한 영역들이 2개 이상의 이러한 영역 내에서 결합하는 리간드에 대한 확장된 결합 부위를 형성하는 잠재력을 갖는다는 것을 발견하였다.

본 발명가들이 확인한 영역은 (a) ATP 결합 부위, (b) 바이카르보네이트 결합 부위, (c) 채널 결합 부위 및 (d) 서브-포켓 결합 부위이다. 추가적으로, 본 발명가들은 (e) 별법적인, 잠재적으로 알로스테릭(allosteric)한 부위를 또한 확인하였다. 이러한 부위들의 더욱 상세한 설명이 첨부된 실시예에서 제공된다.

(A) ATP 결합 부위.

solAC의 활성 부위로 더욱 일반적으로 지칭되는 이러한 부위는 활성 부위 잔기에 의해 라이닝(lining)된다. 본 발명에 의해 확인된 solAC의 활성 부위 잔기가 하기의 표 6 및 7에서 단일 문자 코드로 기재된다.

(B) 바이카르보네이트 결합 부위

본 발명의 solAC 구조 분석은 바이카르보네이트 결합 영역을 나타냈다. solAC의 3개의 잔기, 즉 Lys95, Val167 및 Arg176이 바이카르보네이트 이온과 상호작용한다. HCO₃ ^- 이온에 대해 거의 동일한 위치에 놓인 음성 전하를 띠는 황 원자가 있는 화합물 (5-페닐-2H-[1,2,4]-트리아졸-3-티올; "화합물 1")을 사용하여, 본 발명가들은 ATP 결합 부위에 접촉된, 대형 포켓을 형성하는 확장된 바이카르보네이트 결합 부위를 확인하였다.

이러한 확장된 HCO₃ ^- 결합 부위는 solAC 억제제 또는 활성화제의 디자인에서 활용될 수 있는 solAC 구조의 영역을 강조한다.

확장된 부위의 잔기가 표 8에 기재된다.

이러한 잔기에서, 본 발명가들은 하기를 발견하였다:

1) Lys95의 NZ가 HCO₃ ^-의 O1과 염 다리를 형성함;

2) Val167의 골격 NH가 HCO₃ ^-의 O1과 전하를 띠는 수소 결합을 형성함;

3) Val 167의 골격 카르보닐이 HCO₃ ^-의 OH와 수소 결합을 형성함;

4) Arg176의 측쇄 NH2가 HCO₃ ^-의 O3와 염 다리를 형성함; 및

5) Arg176의 측쇄 NH2가 HCO₃ ^-의 OH와 전하를 띠는 수소 결합을 형성함.

펼쳐진 바이카르보네이트 부위 내에서, 5-페닐-2H-[1,2,4]-트리아졸-3-티올의 황 원자는 포켓의 하부에 위치하고, Lys95의 NZ와 염 다리를 형성하고, Val167의 골격 NH 및 Phe336의 골격 NH와 전하를 띤 수소 결합을 형성한다. 트리아졸의 N6 또한 포켓의 하부에서 Met337의 골격 카르보닐과 수소 결합을 형성한다. 또한, 트리아졸의 N5는 Arg176의 NH2와 전하를 띤 수소 결합을 형성한다. 화합물 1의 페닐 기는 Phe45, Lys95, Ala97, Ala100, Leu102 및 Phe336의 측쇄에 의해 형성된 화합물 포켓의 주로 친지성인 영역 내로 연장된다. 화합물의 페닐 기 너머로, 포켓은 ATP 결합 부위 내로 개방되기 전에 약간씩 좁아진다. 확장된 HCO₃ ^- 결합 부위의 형상 및 화합물:solAC 복합체에서 관찰된 상호작용의 성질은 이러한 부위가 다양한 리간드에 대해 수정될 수 있을 것임을 시사한다.

(C) 채널 결합 부위

solAC에 결합된 N-(3-페녹시-페닐)-옥살람산 ("화합물 2")의 결정 구조로 약물 디자인에서 활용될 수 있는 solAC 구조의 영역이 추가로 밝혀졌다. 화합물 2에 대한 결합부위는 화합물 2의 페녹시 기가 화합물 1의 페닐 기에 대한 매우 유사한 위치를 차지하도록 화합물 1에 대해 기술된 확장된 HCO₃ ^- 포켓과 겹쳐진다. 그러나, 화합물 2는 HCO₃ ^- 결합 부위의 하부에 놓인 Lys95의 커다란 측쇄 이동을 유도한다. 이러한 Lys95 이동은 HCO₃ ^- 결합 포켓을 개방시켜, ATP 결합 부위에 반대되는 지점에서 단백질 표면 상에 개방되기 전에 커다란 물이 채워진 공동과 합병되는 채널을 형성한다. 하기의 잔기 (표 9)가 이러한 새롭게 노출된 채널에 라이닝된다:

화합물 2의 옥살람산 기가 이러한 채널 내로 가장 멀리 돌출되어, 단백질과의 여러 상호작용을 형성한다:

1) 화합물 2 O3가 His164의 ND와 전하를 띠는 수소 결합을 형성함;

2) 화합물 2 O1이 Phe165의 골격 NH와 전하를 띠는 수소 결합을 형성함;

3) 화합물 2 O5가 Val335의 골격 NH에 수소 결합됨; 및

4) 화합물 2의 아미드 N6가 Phe165의 골격 카르보닐에 수소 결합됨.

Lys95, Phe165, Leu166, Val167 및 Phe336의 측쇄는 화합물 2의 중앙 아닐리노 방향족 고리 주변에 친지성 환경을 형성한다. 화합물 2의 말단 페녹시 기는 화합물 1에 대해 기술된 동일한 친지성 포켓 내에 결합하지만, 이러한 포켓의 환경은 Met337, Phe338, Asp339, Lys340 및 Gly341을 포함하는 루프의 화합물 2에 의해 유도된 이동을 통해 약간 변화된다. 이러한 루프 이동은 Phe338을 ATP 부위로부터 화합물 2의 말단 페녹시 기의 반데르발스 거리 내로 끌어당긴다. Phe338의 이러한 이동은 아포 solAC, AMP-PNP가 결합된 solAC 및 화합물 1이 결합된 solAC의 구조에서는 관찰되지 않는다.

(D) 서브-포켓 결합 부위

AMP-PNP 복합체 구조의 추가적인 분석으로 Phe338이 AMP-PNP 리보스의 히드록실 기에 인접하게 놓인 ATP 부위의 한쪽 끝을 형성한다는 것이 밝혀졌다. Phe338의 위치전환으로 ATP 결합 부위에 이웃한 새로운 서브-포켓이 생성되었다. 이러한 새로운 서브-포켓은 하기의 잔기 (표 10)에 의해 라이닝된다.

(E) solAC 상의 별법적인 결합 부위

solAC 분자의 표면 상의 소수성 클레프트(cleft)가 대칭성 관련 분자의 N-말단에 대한 결합 부위를 형성한다. N-말단 메티오닌의 측쇄가 Phe89, Phe230 및 Phe226의 측쇄에 의해 형성된 소수성 포켓 내로 슬롯팅(slotting)된다. 그후, 잔기 1-4의 주쇄가 한편으로는 나선 2의 말단에서의 잔기에 의해, 다른 한편으로는 잔기 번호 Lys246, Asn247, Leu248 및 Leu249를 포함하는 루프로부터의 잔기에 의해 형성된 홈 내로 슬롯팅되고, 이는 스피룰리나 플라텐시스 아데닐레이트 사이클라제에 비해 solAC의 여분 도메인 내에 놓인다. 임의의 특정한 이론에 한정되지 않고, 표 11에 기재된 이러한 잔기는 알로스테릭 부위를 형성할 수 있고, 따라서 이는 solAC에 대한 리간드를 위한 추가적인 표적일 수 있다.

복합체 구조

AMPCPP가 침투된 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 구조는 단백질의 뉴클레오티드 결합 포켓, 특히 뉴클레오티드의 아데노신 모이어티의 것에 대한 정보를 제공한다. 그후 이러한 구조를 사용하여, 더욱 강력한 조정인자, 예를 들어 억제제 또는 활성화제를 디자인하기 위한 목적으로, 유사한 구조와 solAC의 상호작용을 모델링할 수 있다. 더욱 일반적으로, 기타 리간드가 침투된 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 구조는 이러한 단백질의 기타 결합 포켓에 대한 구조 정보를 제공한다.

solAC 잔기의 확인 및 용도.

solAC에 대한 결정 구조는 ATP 결합 포켓 영역 내의 효소의 결합 부위에 라이닝된 모든 잔기 (표 6)를 정확하게 확인하도록 하였다.

따라서, 본 발명의 방법에서의 선택된 좌표의 용도가 본 발명에서 구현되는 본 발명의 바람직한 양상에서, 이같은 선택된 좌표는 표 6으로부터 선택된 아미노산 잔기의 1개 이상의 좌표, 바람직하게는 1개 이상의 측쇄 좌표를 포함할 것이다. 더욱 바람직하게는, 선택된 좌표는 표 7로부터 선택된 아미노산 잔기의 1개 이상의 좌표, 바람직하게는 1개 이상의 측쇄 좌표를 포함할 것이다. 표 6에서 확인된 잔기는 소형 분자 리간드 디자인에 특히 유용하다.

특정 아미노산의 모든 또는 오직 일부 원자만이 선택되었는지 여부와 상관없이, 5개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상의 선택된 좌표가 상응하는 갯수의 상이한 아미노산 잔기로부터의 측쇄 잔기의 것인 것이 또한 바람직하다. 이들은 표 6, 7 또는 11로부터 배타적으로 선택될 수 있다.

본 발명의 방법에서의 선택된 좌표의 용도가 본 발명에서 구현되는 또다른 실시양태에서, 이같은 선택된 좌표는 표 6, 7 또는 11 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 잔기의 1개 이상의 좌표, 바람직하게는 1개 이상의 측쇄 좌표를 포함할 것이다.

C. 키메라 .

원하는 성질을 달성하기 위한 키메라 단백질의 사용은 현재 과학 문헌에서 통상적이다. 따라서, solAC의 변이체는 키메라일 수 있다.

구조 정보를 수득하기 위한 대리 시스템을 제공하도록 활성 부위가 변형된 경우에 특히 관련된다. 예를 들어, [lkuta et al., J Biol Chem (2001) 276, 27548-27554]에서는 구조 데이타를 수득할 수 있는 cdk2의 활성 부위가 현재 X-선 구조를 입수할 수 없는 cdk4의 활성 부위를 닮도록 변형되었다. 이러한 방식으로, 키메라 단백질로부터 단백질/리간드 구조를 수득할 수 있었고, 이는 cdk4 억제제 디자인에 유용하였다. 유사한 방식으로, 관련된 solAC 이소형의 일차 서열의 비교를 기초로, 본 발명의 solAC의 결합 부위를 이의 이소형과 닮도록 변형시킬 수 있다. 키메라 단백질의 단백질/리간드 구조의 단백질 구조를 관련된 solAC 이소형의 리간드인 화합물의 구조-기반 선별에 사용할 수 있다.

본원에 기술된 solAC와 다른 이소형 간의 아미노산 서열 동일성의 백분율이 20 내지 80％를 차지하는 경우에도, solAC 단백질의 전체적인 폴딩은, 구조 요소의 동일한 공간 분포와 함께, 매우 유사할 것으로 예상된다.

D. 상동성 모델링 .

본 발명은 다른 단백질 (하기에서 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질로 지칭됨)의 상동성 모델링을 위한 수단을 또한 제공한다. "상동성 모델링"은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5 또는 이의 선택된 좌표로부터 유도가능한 좌표 데이타의 조작을 기초로, 구조의 컴퓨터-보조 신생(de novo) 예측을 사용하여 관련된 아데닐레이트 사이클라제 구조를 예측하는 것을 의미한다.

"상동성 모델링"은 첨부된 실시예에서 구조가 결정된 solAC 단백질의 유사체 또는 상동체인 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질로 확장된다. 이는 solAC 단백질 자체의 단백질 돌연변이체로 또한 확장된다.

용어 "상동성 영역"은 동일하거나 또는 유사한 (예를 들어 지방족, 방향족, 극성, 음성 전하를 띠는, 또는 양성 전하를 띠는) 측쇄 화학 기를 갖는 2개의 서열 내의 아미노산 잔기를 기술한다. 상동성 영역 내의 동일한 및 유사한 잔기는 때때로 각각 "불변인" 및 "보존된" 것으로 당업자에 의해 기술된다.

일반적으로, 이러한 방법은 아미노산 서열을 정렬함으로써 solAC 단백질의 아미노산 서열을 표적 단백질과 비교하는 것을 수반한다. 그후, 서열 내의 아미노산을 비교하고, 상동성인 아미노산 군 (편리하게 "상응하는 영역"으로 지칭됨)을 함께 군집시킨다. 이러한 방법은 폴리펩티드의 보존된 영역을 검출하고, 아미노산 삽입 또는 결실을 설명한다.

아미노산 서열 간의 상동성은 시판되는 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 프로그램 BLAST, 갭드(gapped) BLAST, BLASTN, PSI-BLAST, BLAST 2 및 WU- BLAST (National Center for Biotechnology Information 제공)가 이러한 목적을 위해 당업계에서 광범위하게 사용되고, 2개 이상의 아미노산 서열의 상동성 영역을 정렬시킬 수 있다. 이들은 solAC와 모델링될 다른 표적 단백질의 아미노산 서열 간의 상동성 정도를 결정하기 위한 디폴트 파라메터와 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 바람직한 것은 WU-BLAST (Washington University BLAST) 버젼 2.0 소프트웨어이다. 여러 UNIX 플랫폼에 대한 WU-BLAST 버젼 2.0의 실행가능 프로그램을 ftp://blast.wustl.edu/blast/executables에서 다운로드할 수 있다. 이러한 프로그램은 WU-BLAST 버젼 1.4를 기초로 하고, 차례로 이는 공공 도메인 NCBI-BLAST 버젼 1.4를 기초로 한다 ([Altschul and Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480]; [Altschul et al., 1990, Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215: 403-410]; [Gish and States, 1993, Identification of protein coding regions by database similarity search, Nature Genetics 3:266-272]; [Karlin and Altschul, 1993, Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]; 이들 모두는 거명에 의해 본원에 포함됨).

스위트 내의 모든 조사 프로그램에서, 갭드 정렬 루틴(routine)은 데이타베이스 조사 자체에 대한 적분이다. 원한다면 갭핑(gapping)을 끌 수 있다. 길이 1의 갭에 대한 디폴트 페널티 (Q)는 단백질 및 BLASTP에 대해 Q=9, 및 BLASTN에 대해 Q=10이지만, 임의의 정수로 변화될 수 있다. 갭을 확장시키는 것에 대한 디폴트 잔기 당 페널티 (R)은 단백질 및 BLASTP에 대해 R=2, 및 BLASTN에 대해 R=10이지만, 임의의 정수로 변화될 수 있다. 중첩 및 일치가 최대화되면서 서열 갭이 최소화되도록 서열을 정렬하기 위해 Q 및 R에 대한 값의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 디폴트 아미노산 비교 매트릭스는 BLOSUM62이지만, 다른 아미노산 비교 매트릭스 예컨대 PAM을 사용할 수 있다.

유사체는 서열 수준에서의 공통적인 선조의 증거가 거의 없으면서 유사한 3차원 구조 및/또는 기능을 갖는 단백질로 정의된다.

상동체는 공통적인 선조의 증거가 있는 단백질이고, 즉 진화적인 분산의 결과일 수 있고, 서열 동일성의 정도 (일반적으로 백분율로 표시됨)를 기초로 원거리, 중거리 또는 근거리 하부분류(sub-division)으로 분류된다.

상동체는 인간 solAC에 대한 동일성이 약 20％ 이상, 예를 들어 25％ 이상, 30％ 이상, 35％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 더욱 바람직하게는 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상인 단백질로서 본원에서 정의된다. 이는 solAC의 다형성 형태 및 종 형태 (하기 표 12 및 13에서 언급된 종들 포함)을 포함한다.

표 12 및 13는 포유류 가용성 아데닐레이트 사이클라제들 간의 백분율 동일성을 나타낸다.

2가지 유형의 상동체가 있다; 오르토로그(orthologue) 및 파라로그(paralogue). 오르토로그는 상이한 생물들 내의 상동성 유전자로서 정의되고, 즉 유전자들이 이들을 생성시킨 종분화 이벤트와 일치하는 공통적인 선조를 공유한다. 파라로그는 유전자/염색체/게놈 중복, 즉 마지막 종분화 이벤트 이후에 발생한 유전자의 공통적인 선조로부터 유래된 동일한 생물 내의 상동성 유전자로 정의된다.

상동체는 solAC의 다형성 형태, 예컨대 섹션 (A)에서 기술된 바와 같은 대립유전자 또는 돌연변이체, 또는 섹션 (D)에서 기술된 바와 같은 키메라일 수 있다.

일단 공지된 구조 및 미지 구조의 폴리펩티드의 아미노산 서열이 정렬되면, 공지된 구조의 폴리펩티드의 컴퓨터 화상을 미지 구조의 폴리펩티드의 상응하는 아미노산으로 전사시킨다. 예를 들어, 공지된 구조의 아미노산 서열 내의 타이로신이 미지 구조의 아미노산 서열 내의 상응하는 상동성 아미노산인 페닐알라닌으로 치환될 수 있다.

보존되지 않은 영역 내의 아미노산의 구조는 수동으로 표준 펩티드 기하학을 사용함으로써 또는 분자 자극 기술, 예컨대 분자 역학에 의해 할당할 수 있다. 방법의 최종 단계는 분자 역학 및/또는 에너지 최소화를 사용하여 전체 구조를 정련함으로써 달성된다.

이와 같은 상동성 모델링은 당업자에게 주지된 기술이다 (예를 들어 [Greer, Science, Vol. 228, (1985), 1055], 및 [Blundell et al., Eur. J. Biochem, Vol. 172, (1988), 513] 참조). 당업계에서 일반적으로 입수가능한, 이러한 참고문헌에 기술된 기술, 뿐만 아니라 기타 상동성 모델링 기술을 본 발명을 수행하는데 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은

(a) 미지의 3차원 구조의 표적 solAC 단백질의 아미노산 서열의 화상을 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC, 또는 이의 선택된 좌표의 아미노산 서열과 정렬시켜, 아미노산 서열의 상동성 영역을 매칭(matching)시키는 단계;

(b) 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에 정의된 바와 같은 solAC 구조, 또는 이의 선택된 좌표의 상응하는 영역 상에서 미지 구조의 상기 표적 solAC의 매칭된 상동성 영역의 구조를 모델링하는 단계; 및

(c) 상기 매칭된 상동성 영역의 구조가 실질적으로 보존된 미지 구조의 상기 표적 solAC의 입체구조를 결정하는 단계

를 포함하는 상동성 모델링 방법을 제공한다.

미지 구조의 상기 표적 solAC에 대한 입체구조는, 예를 들어, 미지 구조의 표적 아데닐레이트 사이클라제 내에 및/또는 낮은 에너지 입체구조가 형성되도록 유리한 상호작용이 형성된 것일 것이다.

바람직하게는, 단계 (a) 내지 (c) 중 하나 또는 모두가 컴퓨터 모델링에 의해 수행된다.

표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표는 또다른 아데닐레이트 사이클라제의 상동성 모델링에 특히 유리할 것이다.

인 실리코(in silico)에서 solAC 구조를 이용하는 본원에 기술된 본 발명의 양상은 본 발명의 상기 양상에 의해 수득된 아데닐레이트 사이클라제의 상동체 모델에 동등하게 응용될 수 있고, 이러한 응용은 본 발명의 추가적인 양상을 형성한다. 따라서, 상기 기술된 방법에 의해 아데닐레이트 사이클라제의 입체구조가 결정되면, 이같은 입체구조를 본원에 기술된 바와 같은 컴퓨터 기반의 합리적인 약물 디자인 방법에서 사용할 수 있다.

E. 구조 해석

solAC의 원자 좌표 데이타는 solAC, 돌연변이체, solAC의 공동-복합체를 포함하여 다른 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 결정 구조를 해석하는데 또한 사용될 수 있고, 이때 이러한 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 X-선 회절 데이타 또는 NMR 분광학 데이타가 생성되었고, 구조를 제공하기 위해 해석이 필요하다.

solAC의 경우, 이러한 단백질은 1가지를 초과하는 결정 형태로 결정화될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타, 또는 이의 선택된 좌표는 solAC의 이러한 다른 결정 형태의 구조를 해석하는데 특히 유용하다. 이는 solAC 돌연변이체, solAC 공동-복합체, 또는 solAC의 임의의 기능성 도메인에 대한 아미노산 서열 상동성이 상당한 임의의 다른 단백질의 결정질 형태의 구조를 해석하는데 또한 사용될 수 있다.

기타 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질, 특히 상동성 포유류 가용성 아데닐레이트 사이클라제 예컨대 표 12 및 13에서 언급된 종으로부터의 것들의 경우, 본 발명은 미처리 X-선 회절 데이타가 생성되었을 때 이같은 표적의 구조가 더욱 용이하게 수득되도록 한다.

따라서, X-선 결정학 또는 NMR 분광학 데이타가 미지 3차 구조의 표적 단백질 아데닐레이트 사이클라제 또는 solAC에 대해 제공되었을 때, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에서 유래된 원자 좌표 데이타를 이러한 데이타를 해석하는데 사용하여, 당업계에 주지된 기술, 예를 들어 X-선 결정학의 경우 상조정(phasing) 및NMR 스펙트럼의 경우 피크 할당에 의해 다른 아데닐레이트 사이클라제에 대한 유사한 구조를 제공할 수 있다.

이러한 목적으로 사용될 수 있는 한 방법은 분자 치환이다. 이러한 방법에서, 미지의 결정 구조를, solAC, solAC 돌연변이체, solAC 키메라 또는 solAC 공동-복합체의 또다른 결정 형태, 또는 solAC의 임의의 기능성 도메인에 대한 아미노산 서열 상동성이 있는 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 결정인지 여부와 상관 없이, 본 발명의 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5 전체 또는 이의 일부분의 solAC 구조 좌표를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 방법은 미지의 결정에 대한 정확한 구조 형태를 이같은 정보를 처음부터 결정하려고 시도하는 것보다 더욱 신속하고 효율적으로 제공할 것이다.

분자 치환을 수행하기 위해 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램의 예는 CNX ([Brunger A.T.; Adams P.D.; Rice L.M., Current Opinion in Structural Biology, Volume 8, Issue 5, October 1998, Pages 606-611] (Accelrys (San Diego, CA)에서 또한 시판됨), MOLREP ([A.Vagin, A.Teplyakov, MOLREP: an automated program for molecular replacement, J. Appl. Cryst. (1997) 30, 1022-1025], CCP4 스위트의 일부) 또는 AMoRe ([Navaza, J. (1994). AMoRe: an automated package for molecular replacement. Acta Cryst. A50, 157-163])이다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양상에서,

임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표, 또는 이의 선택된 좌표를 제공하는 단계, 및

(a) 단백질의 구조가 제공되도록 단백질의 결정 단위 셀 내에 상기 좌표를 위치시키거나, 또는 (b) 상기 좌표를 조작함으로써 단백질의 NMR 스펙트럼 피크를 할당하는 단계

를 포함하는, 단백질의 구조를 결정하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 또는 이의 선택된 좌표는 표 6 내지 11 중 어느 하나, 예컨대 표 6, 7 또는 11에 기재된 아미노산 잔기의 원자의 좌표를 포함한다. 각각의 표의 바람직한 선택된 좌표, 또는 2개 이상의 표로부터의 좌표의 조합은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다.

본 발명은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타를 조작함으로써 이같은 단백질의 NMR 스펙트럼의 피크를 할당하는데 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양상에서, 표적 아데닐레이트 사이클라제, 특히 solAC의 상동체, 예를 들어 또다른 아데닐레이트 사이클라제, 특히 상이한 종으로부터의 solAC의 이소형의 구조를 해석하는데 좌표가 사용된다.

F. 컴퓨터 시스템.

또다른 양상에서, 본 발명은

(a) solAC 촉매 도메인의 3차원 구조를 정의하는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표;

(b) 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 데이타를 기초로 하는 표적의 상동성 모델링에 의해 생성된 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 원자 좌표 데이타;

(c) 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 데이타를 참조하여 X-선 결정학 데이타 또는 NMR 데이타를 해석함으로써 생성된 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 원자 좌표 데이타;

(d) (b) 또는 (c)의 원자 좌표 데이타로부터 유도가능한 구조 인자 데이타; 및

(e) 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표

중 1개 이상을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이타를 함유하는, solAC, solAC 상동체 또는 유사체와 상호작용하는 리간드, solAC와 리간드의 복합체, 또는 solAC 상동체 또는 유사체와 리간드의 복합체의 구조를 생성시키고/시키거나 이의 최적화를 수행하도록 의도된 시스템, 특히 컴퓨터 시스템을 제공한다.

예를 들어 컴퓨터 시스템은 (i) 컴퓨터-판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이타 저장 매체; (ii) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타의 프로세싱을 위한 명령어를 저장하기 위한 작업 메모리; 및 (iii) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타를 프로세싱함으로써 구조를 생성시키고/시키거나 합리적인 약물 디자인을 수행하기 위한, 상기 작업 메모리 및 상기 컴퓨터-판독가능 데이타 저장 매체에 커플링된 중앙-프로세싱 유닛을 포함할 수 있다.

본 발명은 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 원자 좌표 데이타를 함유하고, 이같은 데이타가 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타 또는 이의 선택된 좌표에서 제공된 출발 데이타를 기초로 본원에 기술된 본 발명의 방법에 따라 생성된 이같은 시스템을 또한 제공한다.

이같은 데이타는 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 작용 메커니즘을 분석하고/하거나 solAC와 상호작용하는 리간드, 예컨대 아데닐레이트 사이클라제에 의해 대사되는 화합물의 합리적인 약물 디자인을 수행하기 위한 구조 생성을 포함하여 다수의 목적에 유용하다.

또다른 양상에서, 본 발명은 컴퓨터 판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하고, 데이타가 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5 또는 이의 선택된 좌표의 solAC 단백질, 또는 solAC의 상동체의 구조 좌표에 의해 정의되며, 상기 상동체는 상기 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5 또는 이의 선택된 좌표의 골격 원자로부터의 제곱 평균 제곱근 편차가 1.5 Å 미만인 골격 원자를 포함하는 컴퓨터-판독가능 저장 매체를 제공한다.

추가적인 양상에서, 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 구조에 의해 정의되는 solAC 단백질에 대한 구조 좌표 또는 이의 선택된 좌표의 적어도 일부분의 푸리에(Fourier) 변형체를 포함하는 제1셋트의 컴퓨터-판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하고;

상기 데이타가, 상기 제1셋트의 데이타 및 상기 제2셋트의 데이타를 사용하기 위한 명령어로 프로그래밍된 기계를 사용하여, 미지 구조의 분자 또는 분자 복합체의 X-선 회절 패턴을 포함하는 제2셋트의 기계 판독가능 데이타와 조합되었을 때, 제2셋트의 기계 판독가능 데이타에 상응하는 구조 좌표의 적어도 일부분을 결정할 수 있는,

컴퓨터-판독가능 저장 매체가 제공된다.

본원에서 사용된 "컴퓨터 판독가능 매체"는 컴퓨터에 의해 직접적으로 판독 및 액세스(access)될 수 있는 임의의 매체를 지칭한다. 이같은 매체에는 자기 저장 매체 예컨대 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프; 광학 저장 매체 예컨대 광학 디스크 또는 CD-ROM; 전기 저장 매체 예컨대 RAM 및 ROM; 및 이러한 카테고리의 하이브리드(hybrid) 예컨대 자기/광학 저장 매체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

이같은 컴퓨터 판독가능 매체를 제공함으로써, 본 발명의 원자 좌표 데이타를 일상적으로 액세스하여 아데닐레이트 사이클라제 또는 이의 선택된 좌표를 모델링할 수 있다. 예를 들어, RASMOL ([Sayle et al., TIBS, Vol. 20, (1995), 374])은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 패키지이고, 이는 구조 결정 및/또는 합리적인 약물 디자인을 위한 원자 좌표 데이타의 액세스 및 분석을 허용한다.

본원에서 사용된 "컴퓨터 시스템"은 본 발명의 원자 좌표 데이타를 분석하기 위해 사용된 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단 및 데이타 저장 수단을 지칭한다. 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템의 최소 하드웨어는 중앙 프로세싱 유닛 (CPU), 입력 수단, 출력 수단 및 데이타 저장 수단을 포함한다. 바람직하게는, 모니터가 제공되어 구조 데이타가 가시화된다. 데이타 저장 수단은 RAM 또는 본 발명의 컴퓨터 판독가능 매체를 위한 수단일 수 있다. 이같은 시스템의 예는 Unix 기반, Windows XP 또는 IBM OS/2 연산 시스템을 실행하는 Silicon Graphics Incorporated 및 Sun Microsystems으로부터 입수가능한 마이크로컴퓨터 워크스테이션이다.

본 발명은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 좌표 또는 이의 선택된 좌표를 포함하는 제1셋트의 컴퓨터-판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하고; 상기 데이타가, 상기 제1셋트의 데이타 및 상기 제2셋트의 데이타를 사용하기 위한 명령어로 프로그래밍된 기계를 사용하여, 미지 구조의 분자 또는 분자 복합체의 X-선 회절 패턴을 포함하는 제2셋트의 기계 판독가능 데이타와 조합되었을 때, 제2셋트의 기계 판독가능 데이타에 상응하는 전자 밀도의 적어도 일부분을 결정할 수 있는, 컴퓨터-판독가능 저장 매체를 또한 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상은

(i) (a) solAC 촉매 도메인의 3차원 구조, 또는 이의 선택된 좌표를 정의하는, 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이타;

(b) 데이타 (a)를 기초로 하는 표적의 상동성 모델링에 의해 생성된 표적 아데닐레이트 사이클라제 상동체 또는 유사체의 원자 좌표 데이타;

(c) 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타를 참조하여 X-선 결정학 데이타 또는 NMR 데이타를 해석함으로써 생성된 단백질의 원자 좌표 데이타; 및

(d) (a) 또는 (c)의 원자 좌표 데이타로부터 유도가능한 구조 인자 데이타

를 함유하는 원격 장치가 있는 통신을 설립하는 단계; 및

(ii) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타를 상기 원격 장치로부터 수신하는 단계

를 포함하는, solAC, solAC 상동체 또는 유사체와 상호작용하는 리간드, solAC와 리간드의 복합체, 또는 solAC 상동체 또는 유사체와 리간드의 복합체의 구조를 생성시키고/시키거나 이의 최적화를 수행하기 위한 데이타를 제공하는 방법을 제공한다.

추가적인 양상에서, 본 발명은

(i) 기계-판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하고, 상기 데이타가 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 구조, 또는 이의 선택된 좌표를 포함하는 기계-판독가능 데이타 저장 매체;

(ii) 상기 기계-판독가능 데이타를 상기 3차원 화상으로 프로세싱하기 위한 명령어

를 포함하는, solAC 구조가 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5, 또는 이의 선택된 좌표의 것인 solAC 구조 또는 solAC-리간드 복합체의 3차원 화상을 생산하기 위한 컴퓨터의 용도를 제공한다.

컴퓨터는 상기 3차원 화상을 디스플레이하기 위한 디스플레이를 추가로 포함할 수 있다.

상기 원격 장치로부터 수신된 컴퓨터-판독가능 데이타는, 특히 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표의 형태인 경우, 예를 들어 리간드 구조를 solAC 구조와 함께 연구하기 위해, 본원에 기술된 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

따라서 원격 장치는 예를 들어 본 발명의 이전의 양상들 중 하나의 컴퓨터 시스템 또는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함할 수 있다. 원격 장치는 컴퓨터-판독가능 데이타가 수신되는 곳과 상이한 국가 또는 관할구 내에 있을 수 있다.

통신은 유선을 통해 또는 무선 수단에 의해 예컨대 지상 라디오 또는 위성에 의해 전송되는 인터넷, 인트라넷, 전자 우편 등을 통해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 통신은 사실상 전자 통신일 것이지만, 일부 또는 모든 통신 경로는 예를 들어 광섬유를 통한 광학 통신일 수 있다.

G. 본 발명의 구조의 용도.

본 발명에 따라 수득된 결정 구조, 뿐만 아니라 본원에 기술된 방법에 따라 수득된 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 구조는 여러가지 방식으로 약물 디자인에 사용될 수 있다. 예를 들어, solAC, 예컨대 solAC의 뉴클레오티드 결합 영역에 선택적인 리간드의 디자인이 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 데이타 또는 이의 선택된 좌표를 참조로 착수될 수 있다. 한 양상에서, 비-고리형성성 뉴클레오티드 유사체 AMPCPP는 다수의 상이한 아데닐레이트 사이클라제의 뉴클레오티드 결합 포켓에 결합할 수 있다. 본 발명의 solAC 촉매 도메인의 구조의 사용은 다른 아데닐레이트 사이클라제에 비해 solAC에 대한 특이성이 더 높은 구조가 디자인되도록 한다.

더욱 일반적으로, 본 발명의 구조는 solAC의 조정인자의 제공, 디자인, 변형 또는 분석에 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 solAC의 "조정인자"에 대한 언급은 solAC 단백질의 생물학적 활성 수준에서 변화 (즉, 조정)를 야기하는 리간드를 지칭하도록 의도된다. 따라서, 조정은 solAC 활성에서의 증가 또는 감소를 초래하는 생리학적 변화를 포함한다. 전자의 경우에, 조정은 활성화로 기술될 수 있고; 후자의 경우에는 억제로 기술될 수 있다. 조정은 직접적으로 solAC의 ATP 결합 부위에 결합하는 리간드의 결과로서, 또는 간접적으로, 예를 들어 solAC의 활성 또는 다른 단백질과의 이의 상호작용이 영향을 받도록 solAC의 임의의 부위에 결합하는 리간드에 의해 일어날 수 있다. 이같은 상호작용은 solAC 효소를 특정 세포소기관 (예를 들어 미토콘드리아, 중심소체, 유사분열방추, 핵)에 배치시키거나 또는 solAC와 이펙터 분자 (예를 들어 PKA) 간의 또는 효소 활성의 수준 (예를 들어 알로스테릭 메커니즘, 경쟁적 억제, 활성-부위 불활성화, 피드백 억제성 경로의 교란 등에 의해)에서의 상호작용을 일으키는 다른 유전자 산물 또는 단백질과의 상호작용을 포함할 수 있다. 따라서, 조정은 이같은 메커니즘에 의해 일어난 solAC의 과발현 또는 저발현, 뿐만 아니라 ATP 결합 부위, 또는 바이카르보네이트 결합 부위, 또는 본원에서 확인된 기타 부위 중 임의의 것에서 결합하는 리간드로 인한 과잉활성 (또는 과소활성)을 포함할 수 있다. solAC와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "조정인자", "조정" 및 "조정하다"는 이에 따라 해석된다.

예를 들어, 결합 포켓에서의 리간드의 결합 정위에 대한 정보를 공동-결정화, 리간드의 침투 또는 리간드의 컴퓨터 도킹(docking)에 의해 결정할 수 있다. 이는 리간드와 단백질의 상호작용을 매개 또는 제어하기 위해 디자인된 화학 구조에 대한 특이적 변형을 안내할 것이다. 이같은 변형은 리간드와 solAC의 상호작용을 변형시키고 따라서 이의 치료 작용을 개선시키기 위한 목적으로 디자인될 수 있다.

따라서, solAC의 3차원 구조의 결정은 solAC와 상호작용하는 신규 리간드, 예를 들어 화학 화합물의 디자인을 위한 기초를 제공한다. 예를 들어, solAC의 3차원 구조를 알면, 컴퓨터 모델링 프로그램을 사용하여, 가능한 또는 확정된 활성 부위, 예컨대 solAC의 결합 부위 또는 기타 구조적 또는 기능적 특색과 상호작용할 것으로 예상되는 다른 분자를 디자인할 수 있다.

(i) 결정 복합체의 수득 및 분석.

한 접근법에서, solAC에 결합된 리간드의 구조를 실험에 의해 결정할 수 있다. 이는 solAC에 결합된 리간드의 분석에서 출발점을 제공할 것이고, 따라서 어떻게 이러한 특정 리간드가 solAC와 상호작용하는지 및 리간드가, 예를 들어, 결합 포켓에 대해 ATP와 경쟁하는 메커니즘에 대한 상세한 통찰력을 당업자에게 제공할 것이다.

상기 기술된 구조-기반 약물 디자인에 작용된 다수의 기술 및 접근법은 리간드-단백질 복합체에서의 리간드의 결합 위치를 확인하기 위해 일부 단계에서 X-선 분석에 의존한다. 이를 수행하는 통상적인 방법은 복합체 상에서 X-선 결정학을 수행하고, 차이 푸리에 전자 밀도 지도를 만들고, 전자 밀도의 특정 패턴을 리간드와 관련시키는 것이다. 그러나, 지도를 만들기 위하여 (예를 들어 [Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, New York, London and San Francisco, (1976)]에 설명된 바와 같이), 먼저 단백질 3D 구조 (또는 적어도 단백질 결정에 대한 구조 인자의 셋트)를 아는 것이 필요하다. 따라서, solAC 구조의 결정은 solAC-리간드 복합체의 차이 푸리에 전자 밀도 지도가 만들어지도록 하고, 약물의 결합 위치가 결정되도록 하며, 따라서 합리적인 약물 디자인 방법을 크게 보조할 수 있다.

따라서, 본 발명은

solAC 단백질의 결정을 제공하는 단계;

결정에 리간드를 침투시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및

임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 사용함으로써 복합체의 구조를 결정하는 단계

를 포함하는, solAC에 결합된 리간드의 구조를 결정하는 방법을 제공한다.

별법적으로, solAC 및 촉매 도메인 및 리간드가 공동-결정화될 수 있다. 정제된 단백질 샘플을 일정 기간의 시간 (일반적으로 1시간 초과) 동안 잠재적인 리간드와 함께 인큐베이션한다. 그후, 단백질 리간드 복합체를 결정화 조건에 대해 스크리닝한다. 별법적으로, 1개의 리간드를 함유하는 단백질 결정을 결정을 리간드가 존재하지 않는 안정화 용액 내에 놓음으로써 역-침투시켜 이러한 리간드를 제거할 수 있다. 그후, 생성된 결정을 상이한 리간드를 함유하는 제2용액 내로 옮길 수 있다.

따라서, 본 발명은

solAC 단백질을 리간드와 혼합하는 단계;

solAC 단백질-리간드 복합체를 결정화시키는 단계; 및

임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 사용함으로써 복합체의 구조를 결정하는 단계

를 포함하는, solAC에 결합된 리간드의 구조를 결정하는 방법을 제공한다.

화합물들의 혼합물에 결정을 침투시키거나 결정과 공동-결정화시킬 수 있고, 이때 오직 1개 또는 약간의 화합물만이 solAC에 결합할 것으로 예상될 수 있다. 화합물들의 혼합물은 solAC에 결합하는 것으로 공지된 리간드를 포함할 수 있다. 복합체의 구조뿐만 아니라, 복합체화 화합물(들)의 신원이 그후 결정된다.

상기 방법은 (a) 상기 후보 리간드를 수득 또는 합성하는 단계; (b) solAC와 상기 후보 리간드의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 복합체를 X-선 결정학 또는 NMR 분광학에 의해 분석하여 solAC와 상호작용하는 상기 후보 리간드의 능력을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이같은 구조의 분석은 (i) 복합체로부터의 X-선 결정학 회절 데이타 및 (ii) solAC의 3차원 구조, 또는 적어도 이의 선택된 좌표를 사용하여, 복합체의 차이 푸리에 전자 밀도 지도를 생성시킬 수 있고, 이때 3차원 구조는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 원자 좌표 데이타 또는 이의 선택된 좌표에 의해 정의된다. 그후, 차이 푸리에 전자 밀도 지도가 분석될 수 있다.

따라서, X-선 회절 방법을 사용하여, 예를 들어 [Greer et al., J of Medicinal Chemistry, Vol. 37, (1994), 1035-1054]에 기술된 접근법에 따라, 이같은 복합체가 결정화되어 분석될 수 있고, 침투된 또는 공동-결정화된 solAC의 X-선 회절 패턴 및 복합체화되지 않은 solAC의 해석된 구조를 기초로 차이 푸리에 전자 밀도 지도가 계산될 수 있다. 그후 이러한 지도를 분석하여, 예를 들어, 특정 리간드가 solAC에 결합하는지 여부 및 결합하는 곳 및/또는 특정 리간드가 solAC의 입체구조를 변화시키는지 여부 및 변화시키는 곳을 결정할 수 있다.

전자 밀도 지도는 CCP4 컴퓨팅 패키지로부터의 것들과 같은 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다 ([Collaborative Computational Project 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, Acta Crystallographica, D50, (1994), 760-763]). 지도 가시화 및 모델 구축을 위해 "O" ([Jones et al., Acta Crystallographica, A47, (1991), 110-119])와 같은 프로그램을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라, solAC 돌연변이체가 공지된 solAC 리간드 또는 신규 리간드와의 공동-복합체에서 결정화될 수 있다. 그후, 일련의 이같은 복합체의 결정 구조를 분자 치환에 의해 해석하고, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 구조 또는 이의 선택된 좌표의 것과 비교할 수 있다. 따라서 효소의 다양한 결합 부위 내에서의 변형을 위한 잠재적인 부위를 확인할 수 있다. 이러한 정보는 solAC와 리간드 간의 가장 효율적인 결합 상호작용, 예를 들어, 증가된 소수성 상호작용을 결정하는 추가적인 도구를 제공한다.

상기 언급된 모든 복합체를 주지된 X-선 회절 기술을 사용하여 연구할 수 있고, CNX ([Brunger et al., Current Opinion in Structural Biology, Vol. 8, Issue 5, October 1998, 606-611], Accelrys (San Diego, CA)에서 시판됨)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 그리고 [Blundell et al, (1976)] 및 [Methods in Enzymology, vol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press (1985)]에 기술된 바와 같이, 1.5 내지 3.5 Å 해상도의 X-선 데이타에 대해 약0.30 이하의 R 값으로 정련시킬 수 있다.

따라서 이러한 정보를 사용하여 공지된 부류의 solAC 리간드를 최적화시킬 수 있고, 더욱 중요하게는, 신규 부류의 solAC 리간드, 특히 억제제 또는 활성화제를 디자인 및 합성할 수 있고, solAC 상호작용이 변형된 약물을 디자인할 수 있다.

(ii) 인 실리코 분석 및 디자인

본 발명이 solAC 촉매 도메인 및 solAC 촉매 도메인과 상호작용하는 리간드를 포함하는 실제 결정 구조의 결정을 용이하게 할 것이지만, 현재의 컴퓨터 기술은 이같은 결정을 생성시키고 회절 데이타를 생성시키고 분석하는 요구에 대한 강력한 별법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 양상은 본 발명의 solAC 구조와 상호작용하는 리간드의 분석 및 개발에 관한 컴퓨터 기반 ("인 실리코") 방법에 관한 것이다.

solAC 촉매 도메인의 3차원 구조의 결정은, 특히 유사한 효소와의 비교가 이루어졌을 때, solAC의 결합 부위에 관한 중요한 정보를 제공한다. 그후, 예를 들어 결합 부위에 대한 가능한 결합 리간드가 확인되는 컴퓨터 기술에 의해, 약물 디자인에 대한 연결-단편 접근법을 가능하게 함으로써, 그리고 X-선 결정학 분석을 사용하여 결합된 리간드의 확인 및 위치결정을 가능하게 함으로써, 이러한 정보를 solAC 리간드의 합리적인 디자인 및 변형에 사용할 수 있다. 이러한 기술들은 하기에 더욱 상세하게 논의된다.

따라서 solAC 3차원 구조가 결정된 결과, 합리적인 약물 디자인을 위한 더욱 순수한 컴퓨터 기술을 또한 사용하여 solAC와의 상호작용이 더욱 양호하게 이해되는 구조를 디자인할 수 있다 (이러한 기술의 개관을 위해, 예를 들어 [Walters et al., Drug Discovery Today, Vol.3, No.4, (1998), 160-178]; [Abagyan, R.; Totrov, M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 375-382] 참조). 예를 들어, 표적 수용체의 원자 좌표에 대한 정확한 정보를 필요로 하는 자동화된 리간드-수용체 도킹 프로그램 (예를 들어 [Jones et al. Current Opinion in Biotechnology, Vol.6, (1995), 652-656] 및 [Halperin, I.; Ma, B.; Wolfson, H.; Nussinov, R. Proteins 2002, 47, 409-443]에 논의됨)을 사용할 수 있다.

인 실리코에서 solAC 구조를 사용하는 본원에 기술된 본 발명의 양상은 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 구조 또는 이의 선택된 좌표 및 본 발명의 또다른 양상에 의해 수득된 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 모델 모두에 에 동등하게 응용될 수 있다. 따라서, 상기 기술된 방법에 의해 solAC의 입체구조가 결정되면, 이같은 입체구조를 본원에 기술된 바와 같은 컴퓨터 기반의 합리적인 약물 디자인 방법에서 사용할 수 있다. 또한, solAC 구조의 입수가능성은 실제 라이브러리 스크리닝 또는 리간드 디자인을 위한 고도로 예측성인 약물작용발생단 모델이 생성되도록 할 것이다.

따라서, 본 발명은

임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 것인 solAC 구조, 또는 이의 선택된 좌표를 제공하는 단계;

상기 solAC 구조 또는 이의 선택된 좌표에 피팅되도록 리간드를 제공하는 단계; 및

리간드를 상기 solAC 구조에 피팅시키는 단계

를 포함하는, 리간드와 solAC 구조의 상호작용 분석 방법을 제공한다

본 발명의 이러한 방법은 solAC의 공지된 리간드의 개발 또는 발견, 예를 들어 리간드의 1가지 이상의 성질을 개선 또는 변형시키기 위한 solAC의 리간드의 변형 등에 일반적으로 적용가능하다.

본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 구조, 또는 이의 선택된 좌표는 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 컴퓨터 모델에서 표현될 수 있다. 당업자는 이같은 방법에서 단백질의 3차원 화상을 제공하는 수단에 익숙할 것이다. 적절한 모델에는 (a) 와이어-프레임(wire-frame) 모델; (b) 치킨-와이어(chicken-wire) 모델; (c) 볼-앤-스틱(ball-and-stick) 모델; (d) 스페이스-필링(space-filling) 모델; (e) 스틱(stick)-모델; (f) 리본(ribbon) 모델; (g) 스네이크(snake 모델); (h) 화살표 및 실린더(cylinder) 모델; (i) 전자 밀도 지도; 또는 (j) 분자 표면 모델이 포함된다.

선택된 좌표는 표 6 내지 11 중 어느 하나, 예컨대 표 6, 7 또는 11에 열거된 아미노산의 일부 또는 모두로부터의 1개 이상의 측쇄 또는 주쇄 원자로부터의 것일 수 있고, 이같은 좌표의 바람직한 갯수 및 조합은 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같다.

별법적인 양상에서, 본 발명의 방법은 구조물이 결합하는 포켓을 모델링하기 위해, 추정 리간드 구조와 인접한, 예를 들어 촉매 영역의 10-25 Å 이내 또는 결합된 리간드의 5-10 Å 이내인 solAC 리간드 결합 영역의 당해 원자의 좌표를 사용할 수 있다. 이러한 좌표를 사용하여 공간을 정의할 수 있고, 이어서 상기 기술된 바와 같이 공간이 인 실리코로 분석된다.

실제로, 결합 포켓을 나타내는, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 또는 이의 선택된 좌표에 의해 정의되는 바와 같은 solAC의 충분한 갯수의 원자, 예를 들어, 표 6 내지 11 중 어느 하나, 예컨대 표 6, 7 또는 11에서 확인된 잔기의 원자를 모델링하는 것이 바람직할 것이다. 각각의 표의 바람직한 선택된 좌표, 또는 2개 이상의 표로부터의 좌표의 조합은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다. 결합 포켓 및 solAC와 리간드의 상호작용의 기타 특색이 첨부된 실시예에 기술된다.

solAC에 의해 결합된 모든 리간드가 단백질의 결합 포켓의 상이한 부분과 상호작용할 수 있지만, 이러한 solAC의 구조는 solAC와 약물 후보물의 많은 상호작용에서 수반될 것 같은 다수의 특정 부위가 확인되도록 한다. 잔기가 표 6 내지 11, 예컨대 표 6, 7, 또는 11에 기재된다. 따라서 본 발명의 이러한 양상에서, 선택된 좌표는 이러한 잔기의 일부 또는 모두의 좌표를 포함할 수 있다. 각각의 표의 바람직한 선택된 좌표, 또는 2개 이상의 표로부터의 좌표의 조합은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다.

본 발명의 solAC 구조에 피팅되는 리간드의 3차원 구조를 제공하기 위해, 이러한 목적을 위한 시판되는 소프트웨어를 사용하여 3차원으로 리간드 구조를 모델링할 수 있거나, 또는 이의 결정 구조가 입수가능하다면, 구조의 좌표를 사용하여 본 발명의 solAC 구조에 피팅시키기 위한 리간드의 화상을 제공할 수 있다.

새롭게 디자인된 리간드 구조를 합성할 수 있고, 이와 solAC의 상호작용을 어떻게 새롭게 디자인된 구조가 상기 solAC 구조에 결합되는지에 관하여 결정 또는 예측할 수 있다. 이러한 방법은 이와 solAC 간의 상호작용을 추가로 변경시키기 위하여 반복될 수 있다.

"피팅"은 자동 수단 또는 반자동 수단에 의해 후보 분자의 1개 이상의 원자와 본 발명의 solAC 구조의 1개 이상의 원자 간의 상호작용을 결정하고, 이같은 상호작용이 안정적인 정도를 계산하는 것을 의미한다. 상호작용은 전하, 입체적, 친지성 고려사항 등에 의해 초래되는 인력 및 척력을 포함한다. 이러한 유형의 전하 및 입체적 상호작용은 컴퓨터에 의해 모델링될 수 있다. 이같은 컴퓨터조작의 예는 부분적인 전하를 단백질 및 리간드 상의 원자에 할당하고 쿨롱(Coulomb) 포텐셜을 사용하여 단백질과 리간드 원자 간의 정전기적 상호작용 에너지를 평가하는 Amber ([Cornell et al., A Second Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules, Journal of American Chemical Society, (1995), 117(19), 5179-97])와 같은 역장에 의한 것이다. Amber 역장은 또한 두 원자 간의 인력 및 척력 입체 상호작용을 평가하기 위해 반데르발스 에너지 조항을 할당할 것이다. 친지성 상호작용은 다양한 수단을 사용하여 모델링할 수 있다. 예를 들어 ChemScore 함수 ([Eldridge M D; Murray C W; Auton T R; Paolini G V; Mee R P Empirical scoring functions: I. The development of a fast empirical scoring function to estimate the binding affinity of ligands in receptor complexes, Journal of computer-aided molecular design (1997 Sep), 11 (5), 425-45])는 단백질 및 리간드 원자를 소수성 또는 극성으로 할당하고, 두 소수성 원자 간의 상호작용에 대해 유리한 에너지 조항을 지정한다. 리간드 결합에 대한 소수성 고려사항을 평가하는 또다른 방법이 입수가능하고, 이들은 당업자에게 공지되어 있다. 상호작용을 평가하는 또다른 방법이 입수가능하고, 분자 디자인 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 피팅을 위한 다양한 컴퓨터-기반 방법이 본원에서 추가로 기술된다.

더욱 구체적으로, 리간드와 본 발명의 solAC 구조의 상호작용을 도킹 프로그램 예컨대 GOLD ([Jones et al., J. Mol. Biol., 245, 43-53 (1995)], [Jones et al., J. Mol. Biol., 267, 727-748 (1997)]), GRAMM ([Vakser, I.A., Proteins, Suppl., 1 :226-230 (1997)]), DOCK ([Kuntz et al, (1982) J.Mol.Biol., 161, 269-288]; [Makino et al, (1997) J.Comput.Chem., 18, 1812-1825]), AUTODOCK ([Goodsell et al, (1990) Proteins, 8, 195-202], [Morris et al, (1998) J.Comput.Chem., 19, 1639- 1662]), FlexX ([Rarey et al, (1996) J.Mol.Biol., 261, 470-489]) 또는 ICM ([Abagyan et al, (1994) J.Comput.Chem., 15, 488-506])을 사용하는 컴퓨터 모델링을 사용하여 시험할 수 있다. 이러한 절차는 리간드의 형상 및 화학 구조가 얼마나 잘 solAC에 결합하는지를 확인하기 위한 solAC에 대한 리간드의 컴퓨터 피팅을 포함할 수 있다.

solAC의 활성 부위 구조의 컴퓨터-보조 수동 시험이 또한 수행될 수 있다. 다양한 관능기를 갖는 분자와 효소 표면 간의 가능한 상호작용 부위를 결정하는 프로그램인 GRID ([Goodford, (1985) J. Med. Chem., 28, 849-857])와 같은 프로그램을 또한 사용하여, 리간드의 대사 속도를 변경시킬 변형 유형을 예를 들어 예측하기 위해 활성 부위를 분석할 수 있다.

컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 결합 파트너 (즉 solAC 구조 및 리간드)의 인력, 척력 및 입체적 장애를 추정할 수 있다.

1개를 초과하는 solAC 활성 부위 포켓이 특성화되고 다수의 개별적인 더 작은 리간드가 디자인 또는 선택되는 경우, 각각의 작은 리간드를 더 큰 리간드로 연결시킴으로써 리간드가 형성될 수 있고, 이는 활성 부위에서의 개별적인 리간드의 상대적인 위치 및 정위를 유지한다. 더 큰 리간드는 실제 분자로서 또는 컴퓨터 모델링에 의해 형성될 수 있다.

그후 solAC에 대한 리간드의 결합에 대해 상세한 구조 정보를 수득할 수 있고, 이러한 정보의 견지에서, 리간드의 구조 또는 기능성에 대해, 예를 들어 solAC와의 상호작용을 변경시키기 위해, 조정이 이루어질 수 있다. 필요하다면 상기 단계들을 반복 및 재반복할 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 3차원 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 사용하여, 1개 이상의 solAC 결합 부위, 바람직하게는 복수 개의 solAC 결합 부위를 특성화하는 단계; (b) 후보 리간드의 구조를 제공하는 단계; (c) 후보 리간드를 결합 부위(들)에 피팅시키는 단계; 및 (d) 부위(들)에 피팅되는 후보 리간드를 선택하는 단계를 포함하는, solAC의 활성을 조정하기 위한 리간드를 확인하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 복수개의 후보 리간드가 결합 부위와의 상호작용에 대해 스크리닝 또는 문의된다. 한 예에서, 단계 (b)는 후보 리간드의 구조를 제공하는 것을 수반하고, 이어서 각각의 후보 리간드는 단계 (c)에서 피팅되어 결합 부위와의 상호작용에 대해 화합물의 데이타베이스 (예컨대 Cambridge Structural Database)가 컴퓨터에 의해 스크리닝되고, 즉 후보 리간드가 결합 부위와의 상호작용에 대해 리간드의 데이타베이스를 컴퓨터로 스크리닝함으로써 선택될 수 있다 ([Martin, J. Med. Chem., vol 35, 2145-2154 (1992)] 참조). 또다른 예에서, 리간드에 대한 3-D 기술어가 유도되고, 이 기술어는 결합 공동(들)의 구조 및 화학적 성질로부터 유도된 기하학적 및 기능적 구속을 예를 들어 포함한다. 그후, 기술어를 사용하여 화합물 데이타베이스가 문의될 수 있고, 확인된 리간드는 기술어의 특색과 매치되는 화합물이다. 실제로, 기술어는 실제 약물작용발생단의 유형이다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 solAC 구조에 피팅될 수 있는 리간드는 잠재적인 제약 작용제로서 개발 중인 화합물을 포함한다. solAC의 작용이 어떻게 작용제를 변형시키는지를 결정하고, 예를 들어 ATP와 경쟁하여 solAC에 결합하는 후보 리간드를 모델링하기 위한 기초를 제공하기 위해 작용제가 피팅될 수 있다.

본 발명에 따라 리간드 화합물이 수득 및 특성화되면, 본 발명은 (a) 리간드의 부재 하에 solAC가 ATP에 결합할 수 있는 조건 하에 solAC를 제공하는 단계; (b) 리간드 화합물을 제공하는 단계; 및 (c) ATP에 결합하는 solAC의 능력이 상기 화합물의 존재에 의해, 예를 들어 경쟁에 의해 변경되는 정도를 결정하는 단계를 포함하는, solAC의 활성을 조정하는 방법을 추가로 제공한다.

( iii ) 리간드의 분석 및 변형

리간드가 solAC의 작용을 조정하는 것으로 공지되었거나 조정할 것으로 예상되는 경우, 리간드와 상호작용하는 solAC의 잔기를 더욱 잘 결정하기 위해 리간드의 구조를 모델링할 수 있다. 본 발명은

리간드를 solAC 촉매 도메인의 3차원 구조, 또는 이의 선택된 좌표에 피팅시키고, 이때 3차원 구조는 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표, 또는 이의 선택된 좌표에 의해 정의되는 단계;

상기 리간드가 어떻게 상기 촉매 도메인과 상호작용하는지를 결정 또는 예측하는 단계; 및

리간드와 촉매 도메인의 상호작용이 증가 또는 감소되도록 리간드 구조를 변형시는 단계

를 포함하는, solAC 리간드로 작용하는 추가적인 리간드를 예측하는 방법을 또한 제공한다.

전형적으로, 리간드는 출발 리간드보다 더욱 효과적인 리간드를 생산하거나 또는 더욱 제약상 허용가능한 리간드를 생산하기 위한 목적으로 변형될 것이다.

구조 변형은 일반적으로 인 실리코로 발생하여, 변형된 구조가 어떻게 solAC와 상호작용하는지에 관한 예측이 이루어지도록 할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다.

[Greer et al., (1994), J. of Medicinal Chemistry, 37, 1035-1054]에는 반복된 순서의 컴퓨터 모델링, 단백질-리간드 복합체 형성 및 X-선 결정학적 또는 NMR 분광학적 분석을 기초로 하는 리간드 디자인에 대한 반복 접근법이 기술되어 있다. 따라서, 신규 티미딜레이트 합성효소 억제제 시리즈가 Greer 등에 의해 신생으로 디자인되었고, solAC 리간드가 또한 이러한 방식으로 디자인 또는 변형될 수 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어 solAC의 해석된 구조에 대해 GRID를 사용하여, solAC 결합 부위의 기능성을 보완하는 solAC에 대한 리간드를 디자인할 수 있다. 별법적으로, solAC에 대한 리간드를 이것이 solAC 결합 부위의 기능성을 더 또는 덜 잘 보완하도록 변형시킬 수 있다. 그후, 리간드를 합성하고, solAC와의 복합체로 형성시킨 후, 복합체를 X-선 결정학에 의해 분석하여, 결합된 리간드의 실제 위치를 확인할 수 있다. 그후, 필요하다면, X-선 분석의 결과의 관점에서 리간드의 구조 및/또는 관능기를 조정하고, 합성 및 분석 순서를 최적화된 리간드가 수득될 때까지 반복할 수 있다. 구조-기반 약물 디자인에 대한 반복된 접근법은 [Bohacek et al. (1996) Medicinal Research Reviews, 16, 3-50]에 또한 논의되어 있다. 구조 기반 약물 디자인을 사용하여 별법적인 solAC 성질을 갖는 리간드를 디자인하는 것은 제2의 표적 단백질에 대한 높은 친화력에 대한 요구를 또한 고려할 수 있다. [Gschwend et al. (1999) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9, 307-312] 및 [Bayley et al. (1997) Proteins: Structure, Function and Genetics, 29, 29-67]에는 구조 기반 약물 디자인을 사용하여 표적 단백질에 대한 친화력을 유지시키면서 한 단백질의 친화력을 감소시키는 접근법이 기술되어 있다.

변형은 숙련된 의약 화학자에게 공지된 업계에 통상적인 것들일 것이고, 예를 들어, 본 발명의 solAC 구조의 아미노산 측쇄 기와 상호작용하는 잔기를 함유하는 기의 치환 또는 제거를 포함할 것이다. 예를 들어, 치환은 테스트 화합물 내의 기의 전하를 감소 또는 증가시키기 위한 기의 부가 또는 제거, 테스트 화합물 내의 기의 크기를 증가 또는 감소시키기 위한 치환, 전하를 띤 기의 반대 전하의 기로의 치환, 또는 소수성 기의 친수성 기로의 치환 또는 거꾸로의 치환을 포함할 수 있다. 이들은 신규 제약 화합물의 개발에서 의약 화학자에 의해 고려되는 치환 유형의 단지 예일 뿐이고, 출발 화합물의 성질 및 이의 활성에 따라 다른 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

출발 리간드를 본 발명의 solAC 구조에 피팅시키고 이로부터 변형된 리간드를 예측함으로써 잠재적인 변형된 리간드가 개발된 경우, 본 발명은 변형된 리간드를 합성하는 단계 및 solAC에 대한 리간드로서의 이의 활성 및/또는 이의 유효성을 결정하기 위해 이를 생체내 또는 시험관내 생물학적 시스템에서 테스트하는 단계를 추가로 포함한다.

상기 기술된 본 발명의 방법들은 변형된 리간드 자체가 추가적인 리간드 디자인의 기초일 수 있다는 점에서 반복될 수 있다. 상기 기술된 방법들을 solAC 결합 포켓 내에서 제2리간드와 상호작용하는 리간드를 변형시키기 위해 또한 사용할 수 있다.

( iv ) 결합 포켓 영역 내의 리간드의 분석

한 실시양태에서, 본 발명은

리간드를 solAC 촉매 도메인의 3차원 구조, 또는 이의 선택된 좌표에 피팅시키고, 이때 3차원 구조는 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표, 또는 이의 선택된 좌표에 의해 정의되는 단계; 및

리간드와 촉매 도메인의 상호작용이 증가 또는 감소되도록 리간드 구조를 변형시는 단계

를 포함하고, 상기 피팅은 표 6 내지 11 중 어느 하나, 예컨대 표 6, 7, 또는 11에 기재된 아미노산 잔기의 1개 이상의 좌표를 포함하는 것으로 정의된 리간드-결합 영역에 관한 것인, 리간드의 구조를 변형시키는 방법을 제공한다. 각각의 표의 바람직한 선택된 좌표, 또는 2개 이상의 표로부터의 좌표의 조합은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다. 전형적으로, 리간드는 이의 억제 유효성, 또는 이의 제약상 허용가능성을 개선시키려는 목적으로 변형될 것이다.

불확실함을 피하기 위해, 용어 "변형"은 선행 서브섹션에서 정의된 바와 같이 사용되고, 일단 이같은 리간드가 개발되면, 또한 상기 기술된 바와 같이 이를 합성 및 테스트할 수 있다.

( vi ) 단편 연결 및 성장.

본 발명의 결정 구조의 제공은 단편 연결 또는 단편 성장 접근법을 기초로 solAC 촉매 도메인의 결합 포켓 영역과 상호작용하는 리간드 (예를 들어 solAC의 리간드, 특히 억제제 또는 활성화제로서 작용)가 또한 개발되도록 하였다.

예를 들어, 1개 이상의 리간드 단편의 결합을 X-선 결정학에 의해 단백질 결합 포켓에서 결정할 수 있다. 전형적으로 리간드 단편은 분자량이 100 내지 200 Da인 화합물이다 ([Carr et al, (2002) Drug Discov Today. May 1;7(9):522-7)]. 그후 이들은 구조-기반 접근법을 사용하여 상호작용을 최적화시키기 위해 의약 화학에 출발점을 제공할 수 있다. 단편들을 주형 상에서 조합시키거나, 또는 단백질의 또다른 포켓 내로 리간드를 "성장"시키기 위한 출발점으로 사용할 수 있다 ([Blundell et al; Nat Rev Drug Discov. (2002) Jan;1(1):45-54]). 단편들을 solAC의 결합 포켓에 위치시킨 후, 이용가능한 공간을 채우도록 "성장"시켜, 분자 인식에서 수반되는 정전기, 반데르발스 또는 수소-결합 상호작용을 조사할 수 있다. 따라서 원래의 약하게 결합하는 단편의 효능을 반복적인 구조-기반 화학 합성을 사용하여 신속하게 개선시킬 수 있다.

단편 성장 접근법의 1가지 이상의 단계에서, 리간드를 합성하여 이의 활성에 대해 생물학적 시스템에서 테스트할 수 있다. 이를 사용하여 단편의 추가적인 성장을 안내할 수 있다.

2개의 단편-결합 영역이 확인된 경우, 연결된 단편 접근법은 2개의 단편을 직접적으로 연결시키려고 시도하는 것, 또는 원하는 성질을 가질 수 있는 더 커다란 연결된 구조를 수득하기 위해 단편 중 1개 또는 양쪽 모두를 상기 기술된 방식으로 성장시키는 것을 기초로 할 수 있다.

연결된 단편 접근법은, 예를 들어, ATP 결합 부위 및 바이카르보네이트 결합 부위를 차지하는 리간드를 디자인하는데 사용될 수 있다. 양쪽 부위의 적어도 일부를 차지하는 이같은 리간드는 ATP 결합 부위만을 차지하는 리간드보다 solAC에 대한 선택성이 양호할 수 있다.

2개 이상의 리간드의 결합 부위가 결정되는 경우, 이들을 연결하여 잠재적인 선도(lead) 화합물을 형성시킬 수 있고, Greer 등의 반복 기술을 예를 들어 사용하여 이를 추가로 정련할 수 있다. 가상의 연결된 단편 접근법에 대해서는, [Verlinde et al. (1992) J. of Computer-Aided Molecular Design, 6, 131-147]을, NMR 및 X-선 접근법에 대해서는 [Shuker et al. (1996) Science, 274, 1531-1534] 및 [Stout et al. (1998) Structure, 6, 839-848] 참조. solAC 리간드를 디자인하기 위해 이러한 접근법을 사용하는 것은 solAC 구조의 결정에 의해 가능해졌다.

( vii ) 본 발명의 화합물.

본 발명의 solAC 촉매 도메인 구조에 대한 잠재적인 리간드가 본 발명의 방법에 따라 결정된 경우, 본 발명은 확인된 리간드를 합성하는 단계 및 이의 활성 및/또는 이의 유효성을 결정하기 위해 이를 생체내 또는 시험관내 생물학적 시스템에서 테스트하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 이러한 양상은

리간드를 수득 또는 합성하는 단계; 및

후보 리간드를 solAC와 접촉시켜, solAC와 상호작용하는 후보 리간드의 능력을 결정하는 단계

를 추가로 포함한다.

예를 들어, 상기의 접촉 단계에서, 후보 리간드가 기질, 일반적으로 ATP, 및 전형적으로 완충제의 존재 하에 solAC와 접촉되어, solAC에 결합하는, 예를 들어 이를 억제하는 후보 리간드의 능력이 결정된다. 한 이같은 방법은 solAC에 의해 생산된 cAMP 및 XL-665-표지 cAMP가 유-크립테이트(Eu-cryptate)가 표지된 항-cAMP 항체에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 HTRF 기반 면역분석법이다 (http://www.htrf-assays.com; [Gabriel D, Vernier M, Pfeifer MJ, Dasen B, Tenaillon L, Bouhelal R. (2003) Assay & Drug Dev. Technol.; 2:291-303]). 따라서, 예를 들어, 후보 리간드, 기질 및 완충제를 포함하는 solAC에 대한 분석 혼합물이 생산될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 후자의 단계에서, 후보 리간드는 이의 기능을 결정하기 위한 조건 하에 solAC와 접촉된다.

별법적으로, 또는 추가적으로, 상기 방법은

리간드를 수득 또는 합성하는 단계;

solAC 단백질 또는 이의 촉매 도메인과 상기 리간드의 복합체를 형성시키는 단계; 및

상기 복합체를 X-선 결정학에 의해 분석하여, solAC 또는 이의 촉매 도메인과 상호작용하는 상기 리간드의 능력을 결정하는 단계

를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 단계들은 추가적인 리간드의 디자인에 이르는 반복적인 방법에서 본 발명의 구조에 피팅될 수 있는 리간드를 확인하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 상기의 접촉 단계에서, 후보 리간드가 기질 및 전형적으로 완충제의 존재 하에 solAC와 접촉되어, solAC에 결합하는, 예를 들어 이를 억제하는 상기 후보 리간드의 능력이 결정된다. 따라서, 예를 들어, 후보 리간드, 기질 및 완충제를 포함하는 solAC에 대한 분석 혼합물이 생산될 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 방법에 의해 확인된 solAC 리간드인 화합물을 포함한다.

이같은 화합물의 확인 후, 이를 의약, 제약 조성물 또는 약물과 같은 조성물의 제조, 즉 제작 또는 제형에서 제작 및/또는 사용할 수 있다. 이들을 개체에게 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다양한 양상으로 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 화합물뿐만 아니라, 이같은 화합물을 포함하는 제약 조성물, 의약, 약물 또는 기타 조성물로 다양한 양상으로 확장된다. 조성물은 암, 염증, 골다공증, 당뇨병, 녹내장 또는 불임증과 같은 질환의 치료 (예방적 치료를 포함할 수 있음)에 사용될 수 있다. 조성물은 피임 방법에서, 예를 들어 정자 운동 또는 수정을 억제하는데 사용될 수 있다.

질환 또는 용태를 치료하는 문맥에서 본원에서 사용된 용어 "치료"는 원하는 치료 효과, 예를 들어, 용태 진행의 억제가 달성되는 인간 또는 동물 (예를 들어 수의학 용도)의 치료 및 요법에 일반적으로 관련되고, 진행 속도에서의 감소, 진행 속도에서의 정지, 용태의 완화, 및 질환 또는 용태의 치유를 포함한다. 예방 수단으로서의 치료 (즉, 예방)가 또한 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 바람직한 치료 요법에 따라 투여되었을 때, 합리적인 이익/위험 비율이 적합한, 원하는 치료 효과를 일으키는데 효과적인 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투약 제형의 양에 관한 것이다..

용어 "치료"는 2가지 이상의 치료 또는 요법이, 예를 들어, 연속적으로 또는 동시에 조합되는 조합 치료 및 요법을 포함한다.

본 발명의 화합물 또는 본 발명에 따라 수득된 화합물은 solAC 활성의 억제제인 화합물을 포함한다. 따라서, 이들은 정자 운동 및 과잉운동, 수정능획득 및 첨단체 반응을 예방하고/하거나 가능하게 하는 수단을 제공하는데 유용할 것으로 예상된다. 따라서, 화합물이 일부 형태의 남성 불임증을 치료하고/하거나 난모세포의 수정 및 결과적인 임신을 예방하는데 유용한 것으로 입증될 것으로 기대된다.

치료될 수 있는 암의 예로는 암종, 예를 들어, 방광의 암종, 유방의 암종, 결장의 암종 (예를 들어 결장직장 암종 예컨대 결장 선암종 및 결장 선종), 신장의 암종, 표피의 암종, 간의 암종, 폐의 암종, 예를 들어 선암종, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암종, 식도의 암종, 담낭의 암종, 난소의 암종, 췌장의 암종, 예를 들어 외분비 췌장 암종, 위의 암종, 자궁경부의 암종, 갑상선의 암종, 전립선의 암종, 또는 피부의 암종, 예를 들어 편평세포 암종; 림프구 계통의 조혈 종양, 예를 들어 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종, 또는 버킷 림프종; 골수 계통의 조혈 종양, 예를 들어 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 또는 전골수구성 백혈병; 다발성 경화증; 갑상선 여포암; 중간엽 기원의 종양, 예를 들어 섬유육종 또는 횡문근육종; 중추 또는 말초 신경계의 종양, 예를 들어 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종 또는 신경초종; 흑색종; 정상피종; 기형암종; 골육종; 색소성 건피증; 각화극세포종; 또는 카포시 육종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

solAC의 억제에 의해 완화되는 염증성 질환 또는 용태의 예로는 류머티스 관절염, 골관절염, 류머티스양 척추염, 통풍 관절염, 외상성 관절염, 풍진성 관절염, 건선성 관절염, 및 기타 관절염성 용태; 알츠하이머병; 독성 쇼크 증후군, 내독소에 의해 유도된 염증성 반응 또는 염증성 장 질환; 결핵, 죽상경화증, 근육 퇴행, 라이터 증후군, 통풍, 급성 윤활막염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소성 쇼크, 그람 음성 패혈증, 성인성 호흡 곤란 증후군, 뇌 말라리아, 만성 폐 염증성 질환, 규폐증, 폐 사르코이드증, 골 흡수 질환, 재관류 손상, 이식편 대 숙주 반응, 동종이식 거부, 인플루엔자와 같은 감염으로 인한 열 및 근육통, 악액질, 특히 감염 또는 악성종양에 2차적인 악액질, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)에 2차적인 악액질, AIDS, ARC (AIDS 관련 증후군), 켈로이드 형성, 흉터 조직 형성, 크론병, 궤양성 결장염, 가슴쓰림, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 천식, 폐 섬유증 및 세균성 폐렴이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

염증성 질환 및 용태, 류머티스 관절염 및 골관절염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 화합물이 특히 흥미롭다.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따라 수득된 화합물을 포함하는 조성물을 예를 들어 질환의 치료를 위해 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있는, 상기 언급된 용태의 치료; 예를 들어 질환의 치료를 위해 투여하기 위한 조성물의 제조에서의 화합물, 예를 들어 solAC의 억제제의 용도; 및 이같은 화합물을 제약상 허용가능한 부형제, 비히클 또는 담체, 및 임의로 기타 성분과 부가혼합하는 것을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 추가적인 양상은 (a) 본원에 개시된 본 발명의 여러 양상 중 어느 한 방법에 의해 화합물을 확인 또는 변형시키는 단계; (b) 화합물의 구조를 최적화시키는 단계; 및 (c) 최적화된 화합물을 함유하는 의약, 제약 조성물 또는 약물을 제조하는 단계를 포함하는 의약, 제약 조성물 또는 약물의 제조 방법을 제공한다.

상기 기술된 본 발명의 방법은 변형된 화합물 자체가 추가적인 화합물 디자인의 기초가 될 수 있다는 점에서 반복될 수 있다.

"구조를 최적화시킴"은, 리간드 분자의 원래의 조정 기능은 유지 또는 증강되면서 리간드 분자의 화학 구조가 변화되도록, 분자 발판(scaffolding)을 부가하는 것, 관능기를 부가하거나 변화시키는 것, 또는 분자를 다른 분자에 연결시키는 것 (예를 들어, 단편 연결 접근법 사용)을 예를 들어 의미한다. 이같은 최적화는 예를 들어 선도 화합물의 효능 증강, 약리학적 허용가능성 촉진, 화학적 안정성 증가 등을 위해 약물 개발 프로그램 동안 정규적으로 기도된다.

변형은 숙련된 의약 화학자에게 공지된 업계에 통상적인 것들일 것이고, 예를 들어, 본 발명의 solAC 구조의 아미노산 측쇄 기와 상호작용하는 잔기를 함유하는 기의 치환 또는 제거를 포함할 것이다. 예를 들어, 치환은 테스트 화합물 내의 기의 전하를 감소 또는 증가시키기 위한 기의 부가 또는 제거, 전하를 띤 기의 반대 전하의 기로의 치환, 또는 소수성 기의 친수성 기로의 치환 또는 거꾸로의 치환을 포함할 수 있다. 이들은 신규 제약 화합물의 개발에서 의약 화학자에 의해 고려되는 치환 유형의 단지 예일 뿐이고, 출발 화합물의 성질 및 이의 활성에 따라 다른 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

조성물은 임의의 적절한 경로 및 투여 수단에 의해 제형될 수 있다. 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제에는 경구, 직장, 비강, 국소 (협측 및 설하 포함), 질 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 경막내 및 경막외 포함) 투여에 적절한 제형에서 사용되는 것들이 포함된다. 제형은 단위 투약 제형으로 편리하게 제시될 수 있고, 약학 분야에 주지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

고체 조성물에 대해, 통상적인 비-독성 담체, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 활석, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등이 사용될 수 있다. 제약상 투여가능한 액체 조성물은, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물 및 임의의 제약 보조제의 담체, 예컨대 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에의 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 원한다면, 투여되는 제약 조성물은 미량의 비-독성 보조 물질 예컨대 습윤화 또는 유화제, pH 완충제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 또한 함유할 수 있다. 이같은 투약 제형의 실제 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 당업자에게 명백할 것이다; 예를 들어, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins] 참조.

본 발명이 하기의 실시예에 의해 설명된다.

solAC의 3차원 (3차) 구조의 결정에 사용될 수 있는 폴리펩티드 (또는 단백질)을 수득하기 위해, solAC를 코딩하는 DNA를 전체 유전자 합성에 의해 또는 클로닝에 의해 수득할 수 있다. 그후 이러한 DNA를 적절한 발현 시스템에서 발현시켜 폴리펩티드를 수득하고, 이를 이의 3차원 구조를 결정하기 위한 기술에 적용할 수 있다.

solAC 의 클로닝 , 발현 및 정제의 요약.

구조 연구를 위한 solAC의 발현 및 정제를 수득하기 위해, 대장균 및 곤충 세포 모두에서의 발현을 위해 다수의 상이한 구축물을 제조하였다. 하기의 상세한 예에서, 바람직한 구축물인 2056의 발현이 기술된다. 수많은 구축물 및 발현 및 정제 조건의 광범위한 연구 후에 이러한 구축물의 발현 및 회수를 위한 조건에 도달하였다.

구축물은 잔기 1 내지 469 사이의 solAC 단백질의 일부분 또는 전체, 뿐만 아니라 N-말단 또는 C-말단 태그를 포함하였다. C-말단 태그는 담배 식각 바이러스 (Tobacco Etch Virus: TEV) 프로테아제-절단성-GST 또는 TEV-절단성-His6 태그였다. His6 태그는 일부 구축물에서 C-말단에서 또한 사용되었다. 분석된 구축물이 하기 표 14에 기재된다.

구축물 1-8은 배큘로바이러스 발현 시스템에서의 발현을 위한 것이고, 9-15는 대장균에서의 발현을 위한 것이었다.

대장균 구축물

온도를 30℃ 내지 37℃ 사이로 유지했을 때 모든 구축물이 봉입체로서 발현되었다. 유도 시 온도를 15℃로 저하시킴으로써 가용성 발현을 달성하기 위한 시도로 약간의 가용성 발현이 초래되었지만, 모든 구축물의 심각한 단백질용해적 분해가 항-SAC 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰되었다. 출발점으로 Bieger의 트리파노소마 브루세이(T. brucei) AC 프로토콜 ([Bieger, B. and Essen, L-O. (2000) Acta Cryst. D56, 359-362])을 사용하여 구축물 2033의 봉입체 제조가 수행되었다.

간략하게, 세포 (주로 구축물 2033)를 현탁시키고, 초음파처리에 의해 용해시키고, 원심분리에 의해 정화시켰다. 봉입체 펠렛을 재현탁시키고, 광범위하게 세정한 후, 6M GuHCl 또는 8M 요소에 재용해시켰다. 사용된 완충제는 주로 트리스 HCl (pH 8.0), 헤페스(Hepes) (pH 8.0) 또는 PBS (pH 7.6)이었다. 일부 세정에 사용된 세제는 트리톤(Triton) 100이었다. Ni-NTA형 및 비-니켈형의 고정 금속 친화력 크로마토그래피 (IMAC) 수지 TALON™ (Clontech, Mountain View, CA) 컬럼을 변성 조건 하에 사용하여 당해 단백질을 포획하였다. 변성된 용해된 단백질을 10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7.6), 0.3 M NaCl, 0.4 M 아르기닌, 10％ 글리세롤에 대해 2시간 동안 투석하여, 대부분의 오염물은 용액 내에 유지되고, 당해 단백질은 용액으로부터 나오도록 하였다. 재용해된 solAC 단백질을 8×96 조건의 리폴딩 스크린(refolding screen)에서 사용하였다. 리폴딩된 활성 단백질이 초래된 한 셋트의 조건이 확인되었다; 예를 들어: 50 mM 헤페스 (pH 7.2), 0.5 M 아르기닌, 0.3 M NaCl, 5 mM BME 및 10％ 글리세롤. 이러한 조건으로 폴딩된 활성 단백질이 산출되었고, 그 후 이를 추가적인 정제를 위해 Ni-NTA 컬럼에 적용하였다. 단백질 수율은 낮았고, 추가적인 연구는 곤충 세포 발현에 초점이 맞춰졌다.

배큘로바이러스 구축물

작업은 문헌에 기술된 구축물들에 주로 초점이 맞추어졌는데, 이들이 분석법에서 활성이고 수용성인 것으로 나타났기 때문이었다. 그러나, 공개된 낮은 발현 수율 및 정제 전례의 결여와 관련된 상당한 우려가 있었다. solAC 구축물의 발현이 Sf9 및 High Five™ 세포에서 테스트되었고, 후자에서 더 양호한 것으로 나타났다.

N-말단에 GST 태그가 달린 solAC 구축물 (2022)은 GST와 solAC 도메인 사이에 조작된 TEV 절단 부위를 포함한다. 먼저 세포를 PBS, 10％ 글리세롤, 2 mM BME에 현탁시키고, 얼음 상에서의 초음파처리에 의해 용해시키고, 원심분리에 의해 정화시켰다. 튜브를 풀링(pooling)하자 곧 반투명/불투명해졌기 때문에 상청액을 원심분리에 의해 재-정화시켰다. 펠렛의 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯은 무손상 sAC 및 단백질용해적으로 절단된 sAC가 침전물의 상당한 부분을 구성하였음을 나타냈다. 용해물을 안정화시키기 위한 전략을 4℃ 및 실온 (약 20℃)의 2가지 온도에서 광범위한 완충제를 시험함으로써 조사하였다. 이러한 완충제들이 하기 표 15에 기재된다.

모든 완충제에 대해, 약 2 g의 세포를 5 ㎖의 각각의 완충제에 현탁시키고, 동결-해동 사이클을 실행하여 이들을 열리도록 터뜨렸다. '혼탁'해지거나 침전되는 현탁액의 경향을 주지하였다. pH가 7.5 내지 8.5 사이이고, 온도가 40℃로 유지되며, 0.3 M 또는 0.5 M NaCl가 존재할 때 최상의 결과가 수득되었다. 세제는 해로운 효과를 갖는 것으로 보였다. PBS로의 별도의 실험은 이러한 완충제와의 안정성 문제를 시사하였다.

최적의 조건은 50 mM 트리스 (pH 7.5) (4℃에서 측정됨); 0.3M NaCl 10％ 글리세롤; 및 2-5 mM BME인 것으로 발견되었다.

구축물 2056은 단백질을 포획하기 위해 Ni-NTA 수지를 사용하도록 하는 C-말단 헥사히스티딘 태그를 갖는다. TALON™ 컬럼의 사용은 포획을 개선시키지 않았다. 완충제의 선택이 용해물의 안정화에 상당히 도움이 되었지만, 수지와의 충분한 접촉 시간을 허용하는 느린 유동 속도에 대한 요구가 여전히 난점을 야기하였고, 이는 DEAE 컬럼에 의한 예비-청소 단계의 실행에 이른다. 이를 위해, 세포를 초저염 완충제에 현탁시키고, 용해시키고, 정화시키고, DEAE 컬럼에 적용하였다. 표적 단백질이 매트릭스에 약하게 결합하였기 때문에, 용해물의 전도율을 매우 낮게 유지하였다. 이의 실패로 불량한 포획이 야기되었다. 2단계 구배로 용출을 수행하였고, 구축물 2022 및 2056 모두 첫번째 단계에서 용출되었다. 쉽게 침전되는 대부분의 오염물은 이러한 컬럼에 결합하는데 실패하였다. 분획들을 풀링하고, NaCl 농도를 300 mM로 조정한 후, Ni-NTA 컬럼 또는 글루타티온 세파로스 4b 컬럼에 적용하였다. 이러한 단계의 추가로 후속 단계에서 느린 유동 속도가 가능해졌고, 이는 더 높은 효소 회수에 이르렀다. 나중에, 또한 본 발명가들은 세포를 고염 완충제에 용해시켜, 정화 후에 직접적으로 Ni-NTA 급속 유동 수지에 뱃치 결합시킬 수 있었다.

solAC-2056 함유 분획으로부터의 이미다졸의 제거가 단백질 회수의 성공에 대해 중요한 요소였다. 일단 Ni-NTA 용출의 재현성이 설립되면, 리소스(resource) Q 컬럼에 적용하기 위하여 단백질 풀의 완충제를 50 mM 트리스 (pH 7.5) (4°C), 30 mM NaCl, 10％ 글리세롤 및 1 mM BME로 교환하였다. 50％까지의 단백질이 손실되면서 단백질 수율에서의 가장 높은 손실이 이러한 단계에서 경험되기 때문에 저염에서의 단백질의 체류 시간은 최소로 유지하였다. 리소스 Q 단계가 이러한 단계에서의 완충제의 전도율 및 pH가 극도로 중요한 것으로 발견되었음에도 불구하고 잘 진행되었다. 이러한 파라메터 중 하나가 변경되면, 단백질이 결합하는데 실패하거나 젤 상에서의 정제 프로파일이 개선을 나타내지 않았다. 최종 정제 단계는 본 발명가들이 발견한 가장 안정적인 완충제 내에 단백질을 놓는 것이었다: 50 mM 트리스 (pH 7.5) (4°C), 330 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 1 mM BME.

단백질을 어떠한 응집 증거도 없이 40 ㎎/㎖ 너머로 농축시킬 수 있었지만, 10 ㎎/㎖에서 결정화가 설정되었다.

놀랍게도, 2022 및 2056 구축물의 유사성에도 불구하고 (TEV 절단 뒷부분의 2022는 N-말단에서의 수개의 아미노산 잔기 및 C-말단에서의 His6 태그의 부재만이 상이함), 2022는 5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 올리고머화된 반면, 2056은 40 ㎎/㎖까지 단량체로 유지되었다.

solAC -2056의 클로닝 , 발현 및 정제

전장 solAC를 코딩하는 발현 벡터 pCDNA3.1 (Nucleotide NM 018417 SwissProt)을 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다.

solAC -2056의 클로닝

구축물 M1-V469를 PCR을 사용하여 증폭시켰다.

5' 프라이머:

(서열 1)

는 attB1 인식 서열, 및 염기 1-11에 상응하는 서열을 갖는다.

3' 프라이머:

(서열 2)

는 염기 463-469, 6 his c-말단 태그, 종결 코돈 및 attB2 인식 부위를 도입한다.

PCR 반응 시약: 10 ㎕ Thermopol 완충제 10×, 2 ㎕ dNTP 믹스, 1 ㎕ DNA 주형, 1 ㎕ 5' 프라이머, 1 ㎕ 3' 프라이머, 1 ㎕ 벤트(Vent). 반응물을 H₂O로 100 ㎕로 만들었다.

PCR 사이클: 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 3분의 사이클 25회, 이어서 72℃에서 10분의 신장.

1407-bp 단편을 게이트웨이(Gateway) 클로닝 기술의 BP 반응을 사용하여 도입 벡터 pDONR 내로 재조합시켰다.

분취량의 생성물을 DH5α 수용성 세포 내로 형질전환시켰다. 카나마이신 선별성 플레이트 상에서 성장된 박테리아로부터 플라스미드를 추출하였다. 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 클론을 게이트웨이 클로닝 기술의 LR 반응을 통해 목적 벡터 pDEST8로 옮겼다. 분취량의 생성물을 DH5α 수용성 세포 내로 형질전환시켰다. 카르베니실린 선별성 플레이트 상에서 성장된 박테리아로부터 플라스미드를 추출하였다. 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 단백질의 발현을 시작하였다.

solAC-2056의 단백질 서열은 하기와 같다:

(서열 3)

6 His 태그는 이러한 구축물에서 절단성이지 않다.

solAC-2056의 단백질 생산

solAC-2056의 재조합 바이러스 생산을 하기 방식으로 수행하였다. 간략하게, 관련된 유전자를 코딩하는 pDEST8 벡터를 배큘로바이러스 게놈 (백미드(Bacmid) DNA)를 함유하는 대장균 DH10BAC 세포 내로 형질전환시켰다. 세포에서의 형질전환 이벤트를 통해, 배큘로바이러스 폴리헤드론 프로모터를 포함하는 유전자 및 젠타마이신 저항성 유전자를 함유하는 pDEST8 벡터의 영역이 백미드 DNA 내로 직접적으로 전위되었다. 젠타마이신, 카나마이신, 테트라사이클린 및 Bluo-gal 상에서의 선별에 의해, 생성된 백색 콜로니는 관련 유전자를 코딩하는 재조합 백미드 DNA를 함유하여야 한다. 백미드 DNA를 백색 DH10BAC 세포의 배양물로부터 추출하고, SF900 II 무혈청 배지에서 성장된 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9 세포 내로 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시켰다. 바이러스 입자를 감염 72시간 후에 수확하였다. 수확된 바이러스 입자의 1 ㎖ 분취량을 사용하여 100 ㎖의 sf9 세포 (1×10⁶ 개의 세포/㎖ 함유)를 감염시켰다. 세포 배양 배지를 감염 72시간 후에 수확하였다.

Hi 5 곤충 세포를 EX-Cell 405 (JRH) 무혈청 배지에서 1×10⁶ 개의 세포/㎖의 밀도로 배양하였다. 바이러스 모액의 5 ㎖ 분취량을 각각 1 ℓ의 Hi 5 세포에 첨가하였다. 배양물을 27℃에서 48-72시간 동안 인큐베이션하였다. 4000 rpm에서 8분 동안의 원심분리에 의해 세포를 수확하였다. 펠렛을 -80℃로 동결시켰다.

solAC-2056의 단백질 정제

모든 절차를 달리 언급되지 않는 한 4℃에서 수행하였다. 세포 펠렛을 얼음 상에서 해동시키고, 용해 완충제 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 2 mM BME, 프로테아제 억제제 칵테일 (Calbiochem))에 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고, 용해물을 DNA분해효소 1과 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 14,000 또는 25,000 rpm에서 1시간 동안의 원심분리에 의해 용해물을 정화시켰다. 정화된 용해물을 기존 단계에서와 같은 원심분리에 의해 추가로 정화시킨 후, 0.45 ㎛ 필터에 통과시키고 나서, 뱃치 결합 방식으로 Ni²⁺가 예비-충전된 금속 킬레이트화 매트릭스 (GE Healthcare)에 적용하였다. 수지 또는 매트릭스를 컬럼 내로 붓고, 250 mM 이미다졸을 함유하는 용해 완충제의 첨가에 의해 solAC 단백질을 용출시켰다. 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하고, solAC 단백질을 함유하는 것들을 풀링하였다. 풀링된 단백질의 완충제를 50 mM 트리스 (pH 7.5), 30 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 5 mM BME에서 평형화된 G25-탈염 컬럼에 적용함으로써 저염으로 교환시켰다. 그후 완충제가 교환된 solAC 단백질을 6 ㎖ 리소스 Q 양이온 교환 (GE Healthcare) 컬럼에 적용하고, 20 컬럼 부피에 걸쳐 0-30％ 1 M NaCl의 구배를 사용하여 용출시켰다. 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하고, solAC 단백질을 함유하는 것들을 풀링하여, 50 mM 트리스 (pH 7.5), 330 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 5 mM BME에서 예비-평형화된 26/60 수퍼덱스-75 젤 여과 컬럼에 적용하였다. 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하였다. solAC 분획을 풀링하고, 비바스핀 2 원심분리 농축기 (HY)를 사용하여 약 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 농축하였다.

solAC -2056의 별법적인 정제

모든 절차를 달리 언급되지 않는 한 4℃에서 수행하였다. 세포 펠렛을 얼음 상에서 해동시키고, 용해 완충제 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 10％ 글리세롤, 2 mM BME, 프로테아제 억제제 칵테일 (Calbiochem))에 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고, 용해물을 DNA분해효소 1과 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 14,000 또는 25,000 rpm에서 1시간 동안의 원심분리에 의해 용해물을 정화시켰다. 정화된 용해물을 기존 단계에서와 같은 원심분리에 의해 추가로 정화시킨 후, 0.45 ㎛ 필터에 통과시키고 나서, DEAE 양이온 교환 수지에 적용하였다. 단백질을 1 M NaCl의 15 및 30％ 단계 구배를 통해 용출시켰다. 15％ 피크를 풀링하고, 풀링된 단백질의 NaCl 농도를 300 mM으로 상승시킨 후, Ni²⁺가 예비충전되고 50 mM 트리스 (pH 7.5), 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 2 mM BME에서 평형화된 금속 킬레이트화 컬럼, 일반적으로 5 ㎖ Hi-trap 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. solAC 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 평형 완충제의 첨가에 의해 용출시켰다. 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하고, solAC 단백질을 함유하는 것들을 풀링하였다. 풀링된 단백질의 완충제를 50 mM 트리스 (pH 7.5), 30 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 5 mM BME에서 평형화된 G25-탈염 컬럼에 적용함으로써 저염으로 교환시켰다. 그후 완충제가 교환된 solAC 단백질을 6 ㎖ 리소스 Q 양이온 교환 (GE Healthcare) 컬럼에 적용하고, 20 컬럼 부피에 걸쳐 0-30％ 1 M NaCl의 구배를 사용하여 용출시켰다. 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하고, solAC 단백질을 함유하는 것들을 풀링하여, 50 mM 트리스 (pH 7.5), 330 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 5 mM BME에서 예비-평형화된 26/60 수퍼덱스-75 젤 여과 컬럼에 적용하였다. 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하였다. solAC 분획을 풀링하고, 비바스핀 2 원심분리 농축기 (HY)를 사용하여 약 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 농축하였다.

가용성 아데닐레이트 사이클라제의 단백질 결정화

시팅 또는 부유 방울 증기 확산 방법을 사용하여 인간 solAC의 결정을 성장시키기 위해 시판되는 마이크로뱃치 결정화 스크린을 사용하였다. 광범위한 조건에 대해, 결정이 200 mM 시트레이트 염 (예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄) 및 20％ PEG3350으로부터 성장하였다는 것이 발견되었다. 이러한 결정은 형상이 매우 청키(chunky)하였지만, 매우 작았다. 이러한 결정으로부터의 회절은 불량하였고, 6.0 옹스트롬의 최대 해상도에 도달하였다. 따라서, 상당한 크기 및 허용가능한 회절 해상도의 결정이 만들어질 수 있는 상이한 조건을 발견하는 것이 필요하였다.

최초의 스크린에서 수득된 결정은 완충되지 않은 용액으로부터 성장하였다. 추가 라운드의 스크리닝에서, 부유 방울 증기 확산 방법을 사용하여, pH 4.6-5.2의 완충제를 사용하는 것이 결정 성장을 개선시켰다는 것이 발견되었다.

결정이 이에 대해 평형화되는 용액의 최종 pH는 pH 6.0-6.4였다. 추가적인 라운드의 스크리닝에서, 시트레이트 농도를 0.2 M 시트르산삼나트륨에서 일정하게 유지시키면서, PEG의 농도 및 분자량을 변화시켰다. 10-20％ 사이에서 변하는 농도의 PEG 4000를 사용하는 것이 결정화를 개선시켰다는 것이 발견되었다.

최상의 결정은 16％ PEG4K에서 나타났지만, 이의 품질이 일관되지 않았고, 이의 크기가 최장 치수에서 0.05 mM 내지 0.2 mM로 변하였다. 최상의 이러한 결정은 2.3 옹스트롬의 해상도로 회절되었다.

따라서 추가적인 최적화가 요구되었다. 단백질을 50 mM 트리스/HCl (pH 7.5), 330 mM NaCl, 2 mM 베타 메르캅토에탄올 및 10％ 글리세롤에서 약 10 ㎎/㎖로 농축하였다. 단백질 용액을 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 16-18％ PEG4K 및 10％ 글리세롤의 저장 용액과 1:1 부피비로 혼합하였다. 결정이 4℃에서 부유 방울 증기 확산 방법에 의해 성장되었다.

3-6일 후 결정이 방울로 나타났고, 14일 후 0.5×0.1×0.1 ㎜의 최대 크기에 도달하였다. 마이크로시딩 방법을 사용하여 결정 크기 및 품질의 일관성이 추가로 개선되었다. solAC 결정을 0.1M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 14％ PEG4K, 2 mM 베타 메르캅토에탄올 및 10％ 글리세롤의 용액에서 분쇄함으로써 시드 모액을 제조하였다. 시험용 결정화 가동을 수행함으로써 시드 모액의 최적의 희석에 도달하였고, 이때 1/100, 1/10000, 1/100,000 및 1/1000,000 희석의 시드 모액을 사용하여 트레이(tray)가 설비되었다.

동일한 부피 (일반적으로 1 ㎕ + 1 ㎕)의 단백질 용액 및 시드 모액을 커버 슬립(cover slip) 상에서 혼합함으로써 결정화 트레이가 설비되었다. 이를 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 14％ PEG4K 및 10％ 글리세롤을 함유하는 웰 상에 놓았다. 필요한 희석은 단백질의 뱃치마다 달랐다.

결정이 스페이스 군 P6₃에서 성장하였고, 셀 치수는 a=b=99.15 Å, c=97.51 Å이었다.

저온에서의 데이타 수집 동안 결정을 보존하기 위해, solAC의 결정을 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 30％ PEG4K 및 10％ 글리세롤을 함유하는 냉동완충제(cryobuffer) 용액으로 잠시 옮겼다. 이러한 용액으로부터, 결정이 액체 질소 내로 플런징(plunging)되었고, 후속 데이타 수집을 위해 보관되었다.

데이타 수집 및 프로세싱

solAC의 구조를 해석하기 위해 사용된 회절 데이타를 Jupiter CCD 검출기 또는 RAXIS HTC 이미지 플레이트 검출기를 사용하여 사내에서(in house) 수집하였다. 양쪽 검출기 모두 Rigaku 회전형 애노드(anode) 생성기 상에 마운팅(mounting)되었다. 1.7 Å에서 solAC 구조를 정련하기 위해 사용된 고해상도 데이타를 0.934Å의 파장으로 ADSC Quantum4 CCD 검출기를 사용하여 ESRF (European Synchrotron Radiation facility)에서 Beamline ID29-1 상에서 수집하고, MOSFLM ([Leslie, A. G. W. (1992) Joint CCP4 and EESF-EACMB Newsletter on Protein Crystallography, vol. 26, Warrington, Daresbury Laboratory])를 사용하여 프로세싱하였다. 데이타셋트를 SCALA ([CCP4 - Collaborative Computational Project 4. (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallographica D50, 760-763])를 사용하여 축척화시키고, 프로그램의 CCP4 스위트 ([CCP4 - Collaborative Computational Project 4. (1994) The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Crystallographica D50, 760-763])로부터 TRUNCATE ([Evans, P. R. (1997). Scaling of MAD data. Recent Advances in Phasing (ed. K. S. Wilson, G. Davies, A. W. Ashton and S. Bailey), pp. 97- 102. Council for the Central Laboratory of the Research Councils Daresbury Laboratory, Daresbury, UK])로 강도를 구조 인자 진폭으로 전환시켰다.

구조 결정 및 정련

가용성 아데닐레이트 사이클라제의 구조를 다중 동형 치환(multiple isomorphous replacement)을 사용하여 해석하였다. 중금속을 함유하는 화합물을 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 16％ PEG4K 및 10％ 글리세롤로 구성된 용액에 용해시킴으로써 광범위한 중금속 용액을 제조하였다. 그후, solAC의 결정을 용액 내에 놓고, 다양한 길이의 시간 (2분 내지 5일) 동안 평형화시켰다. 다수의 이러한 용액들은 결정에 손상을 야기하여, 회절의 완전한 손실에서 원래의 결정과 침투된 결정의 동형의 결여까지의 효과에 이르렀다.

다수의 침투물 (>100) 중에서, 31개의 결정이 사용가능한 데이타셋트를 제공하였고, 이들 중 5개가 중원자 위치 및 점유에 대해 분석 및 해석될 수 있는 유도체를 제공하였다. 차이 패터슨(Difference Patterson) 방법을 사용하여, 중원자에 대한 최초의 위치를 수득하였고, 이들을 MLPHARE (프로그램의 CCP4 스위트)로의 예비 상조정에 사용하였으며, 차이 푸리에 지도를 사용하여 추가적인 부위를 위치시켰다. 이를 5개의 사용가능한 유도체에 대해 반복하였고, 그후 이를 차이 푸리에를 사용하여 검증하여, 중원자에 대한 모든 용액이 동일한 기원에 대한 것이었음을 확실히 하였다.

따라서, 5개의 유도체를 사용하여 상 (표 16에 제시됨)을 수득하였고, 그후 용매 평평화 (Solomon) 및 ARP/WARP의 사이클을 사용하여 이를 개선시켰다. 그후 가용성 아데닐레이트 사이클라제의 서열을 생성된 전자 밀도 지도 내로 건설하였다. 초기에는 사내 데이타를 사용하여 2.3 Å에서, 마지막으로는 싱크로트론 데이타를 사용하여 1.7 Å에서, 여러 라운드의 재건설 및 재정련 후 (QUANTA, REFMAC 및 CNX 사용), 최종 가용성 아데닐레이트 사이클라제 모델이 2개의 갭 (잔기 135-140 및 350-356)이 있는 잔기 1-468로 구성되었다. 생성된 구조가 표 1에 제시된다.

아포 가용성 아데닐레이트 사이클라제 구조의 기술

가용성 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 구조가 표 1의 좌표에 의해 기술된다. 잔기 Met1이 전자 밀도에서 관찰가능한 첫번째 잔기이고, Lys468이 마지막 잔기이다. Met1의 주쇄 질소에 인접한 전자 밀도 피크는 아세틸화로 인한 것일 수 있고, 모델링되지 않았다. 해석가능한 주쇄 밀도가 없는 잔기는 Trp135, Glu136, Glu137, Gly138, Leu139, Asp140, Phe350, Pro351, Gly352, Glu353, Lys354, Val355 및 Pro356이다. 잔기 Val469 및 C-말단 His₆ 태그는 전자 밀도에서 가시적이지 않다. 134에서의 첫번째 단절에 인접한 주쇄는 불량하게 정의되고, 잔기 132-134는 일정하지 않은 주쇄 전자 밀도를 갖는다. 잔기 304-306 및 451-455는 전자 밀도에 의해 불량하게 정의된다. 또한, 모델의 주변부 상의 여러 잔기는 이들에 대한 해석가능한 밀도가 없기 때문에 이들의 측쇄가 임의로 배치되었다.

solAC 의 활성 부위

solAC와 스피룰리나 플라텐시스로부터의 효소의 비교는 solAC가 오직 1개의 활성 부위를 갖는다는 것을 강력하게 시사하고, 이는 스피룰리나 플라텐시스에서의 B 단량체로부터 A-사슬 잔기 1140, B-사슬 잔기 1061을 함유하는 루프 및 나선 α1을 형성하는 잔기에 의해 형성된 부위에 상응한다. 나선 α1은 스피룰리나 플라텐시스에서의 A 단량체에 상응할 두번째 부위에 대해 존재하지 않는다. A 단량체에서의 2 및 3에 상응하는 베타-가닥이 solAC에 대해 더 길고, 아데노신 결합 부위를 부분적으로 가려서, 아데노신 결합 부위가 대칭 관련된 상응하는 부위보다 훨씬 덜 개방된다. 표 6은 기질과 상호작용하는 것으로 제안되는 활성 부위 영역 내의 잔기를 기술한다.

리간드와 복합체를 이룬 solAC 의 결정의 제조

200 mM α-β-메틸렌 아데노신 5'-트리포스페이트, 40 mM CaCl₂ 및 40 mM MnCl₂의 용액을 침투 용액에서 제조하였다. 침투 용액은 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 16％ PEG4K, 및 10％ 글리세롤로 구성되었다. solAC 촉매 도메인의 앞서 성장된 결정을 20 ㎕의 리간드 침투 용액 내에 놓고, 3일 동안 평형화시켰다. 그후 결정을 동결방지제의 용액으로 옮기고, 데이타 수집용 제제에서 액체 질소에서 동결시켰다.

리간드 복합체를 위한 데이타 수집, 구조 해석 및 정련

사내 X-선 공급원 상에 마운팅된 RAXIS HTC를 사용하여 solAC 촉매 도메인/리간드 복합체에 대해 회절 데이타를 수집하였다. 앞서 해석된 solAC 촉매 도메인의 구조를 정련을 위한 출발 모델로 사용하였다. 강체 및 구속 정련을 수행하고, 차이 지도를 계산하였다. 리간드 분자인 α-β-메틸렌 아데노신 5'-트리포스페이트를 차이 밀도 내로 건설하고, 후속 라운드의 정련을 수행하였다.

solAC 리간드 복합체의 기술

solAC와 복합체를 이룬 α,β 메틸렌 ATP의 구조는 스피룰리나 플라텐시스에 대해 기술된 것과 매우 유사하다. 대다수의 상호작용은 포스페이트 기, 금속 이온 및 단백질 간의 것이다. 아데닌 기는 Val406의 주쇄 카르보닐 기와 N6 아미노 기 사이에 수소 결합을 형성하고, 물에 의해 매개되는 상호작용이 Asn412의 OD1과 N7 사이에 형성된다. 리보스 기는 단백질과 수소 결합을 형성하지 않는다. 대다수의 상호작용은 포스페이트 기, 제안된 금속 결합 부위 및 단백질 간의 것이다. 잔기Asp99, Asp47의 측쇄, Ile48의 카르보닐 기, 베타 및 감마 포스페이트의 산소 원자 및 물 분자가 금속 이온과 상호작용한다. Arg416은 알파 포스페이트로부터의 산소 원자와 상호작용한다. 감마 포스페이트로부터의 산소 원자는 Thr52의 OG, 및 Thr52 및 Phe51의 주쇄 질소 원자와 상호작용한다.

리간드의 결합 시, 약간의 재배열이 잔기 48-58의 영역에서 보이고, 이는 나선 알파 1 및 베타 1과 알파 1을 연결하는 루프에 상응한다. 잔기 96 내지 101을 함유하는 루프는 잔기 99의 C-알파가 3.5 Å 이동하도록 합의된 이동을 겪는다.

추가적인 solAC - 리간드 복합체

solAC의 HCO ₃ ^- 결합 부위

solAC는 활성이 HCO₃ ^-에 의해 직접적으로 조절되는 것으로 공지된 유일한 단백질이다. solAC 결정에 중탄산나트륨을 침투시키는 것은 HCO₃ ^- 결합 부위의 위치를 밝혀냈다. HCO₃ ^- 이온의 결합은 도 2에 제시된 바와 같은 수소 결합 및 정전기적 상호작용의 네트워크에 의해 매개된다: 1) Lys95의 NZ가 HCO₃ ^-의 O1과 염 다리를 형성하고, 2) Val167의 골격 NH가 HCO₃ ^-의 O1과 전하를 띠는 수소 결합을 형성하며, 3) Val 167의 골격 카르보닐이 HCO₃ ^-의 OH와 수소 결합을 형성하고, 4) Arg176의 측쇄 NH2가 HCO₃ ^-의 O3와 염 다리를 형성하며, 5) Arg176의 측쇄 NH2가 HCO₃ ^-의 OH와 전하를 띠는 수소 결합을 형성함. HCO₃ ^-와 배위되는 것에서 Lys95가 수반되는 것은 바이카르보네이트-응답성 아데닐레이트 사이클라제의 공개된 연구로부터 추론된 결론과 일치한다 ([Cann, M.J. et al. (2003) Journal of Biological Chemistry 278, 35033-35038]).

solAC 의 바이카르보네이트 부위에의 5- 페닐 -2H-[1,2,4]- 트리아졸 -3- 티올의 결합

solAC에 결합된 5-페닐-2H-[1,2,4]-트리아졸-3-티올 (화합물 1, Lancaster Synthesis (UK)로부터 구입)의 구조는 HCO₃ ^- 결합 부위가 또다른 소분자 리간드에 의해 접근될 수 있다는 것을 나타냈다. 화합물 1의 음성 전하를 띠는 황 원자는 HCO₃ ^- 이온과 거의 동일한 위치에 놓이지만, 화합물의 1의 페닐 연결된 트리아졸 기는 HCO₃ ^- 결합 부위를 ATP 결합 부위에 인접한 커다란 포켓 내로 개방시킨다. 이러한 확장된 HCO₃ ^- 결합 부위는 solAC 억제제 또는 활성화제의 디자인에서 탐구될 수 있는 solAC 구조의 영역을 강조한다.

화합물 1에 의해 매개된 HCO3^- 결합 부위의 확장은 HCO₃ ^- 포켓으로부터의 Arg176의 이동 및 Ala97, Gly98, Asp99 및 Ala100을 포함하는 루프의 이동에 의해 가능해진다. 또한 화합물 1 결합은 Val335-Cys343으로부터의 서열에서의 합의된 이동을 유도한다. solAC의 이러한 영역은 바이카르보네이트 결합 부위의 하부를 따라 이어지는 베타 가닥 및 루프 구조의 일부를 형성한다. 이러한 서열 내의 Phe336, Met337, 및 Phe338은 화합물 1 결합 부위의 일부를 형성한다.

화합물 1에 대한 확장된 HCO₃ ^- 결합 부위는 하기의 잔기에 의해 라이닝된다: Phe45, Leu94, Lys95, Ala97, Ala100, Leu102, Phe165, Leu166, Val167, Ile168, Val172, Arg176, Val335, Phe336, Met337, 및 Phe338. 화합물 1의 황 원자는 포켓의 하부에 놓이고, Lys95의 NZ와 염 다리를, Val167의 골격 NH 및 Phe336의 골격 NH와 전하를 띤 수소 결합을 형성한다. 또한 트리아졸의 N6는 포켓의 하부에서 Met337의 골격 카르보닐과 수소 결합을 형성한다. 또한, 트리아졸의 N5는 Arg176의 NH2와 전하를 띤 수소 결합을 형성한다. 화합물 1의 페닐 기는 Phe45, Lys95, Ala97, Ala100, Leu102 및 Phe336의 측쇄에 의해 형성된 화합물 1 포켓의 주로 친지성인 영역 내로 연장된다. 화합물 1의 페닐 기 너머로, 포켓은 ATP 결합 부위 내로 개방되기 전에 약간씩 좁아진다. 확장된 HCO₃ ^- 결합 부위의 형상 및 화합물 1:solAC 복합체에서 관찰된 상호작용의 성질은 이러한 부위가 다양한 리간드에 대해 수정될 수 있을 것임을 시사한다.

포유류 막통과 아데닐레이트 사이클라제 이소형들 간에 고수준의 서열 및 구조 유사성이 존재하지만, solAC는 HCO₃ ^-에 의해 조절되는 유일한 이러한 효소 부류의 구성원이다. 따라서, 본원에 기술된 solAC HCO₃ ^- 결합 부위에 대한 구조 정보는 tmAC에 비해 고도로 선택적인 solAC 표적 약물의 디자인에 대한 길잡이를 제공한다. 약물 디자인과 관련하여 화합물 1이 결합된 구조의 또다른 중용한 특색은 화합물 1이 HCO₃ ^- 부위에서, 그리고 solAC의 ATP 결합 부위 내로 명백한 성장 벡터 기회를 나타낸다는 것이다. 단백질의 ATP 결합 부위를 표적으로 하는 화합물은 약물 발견에서 전례가 잘 제시되어 있다. 본원에서 제시된 구조는 화합물이 solAC의 HCO₃ ^- 및 ATP 결합 부위 모두를 동시에 차지하도록 화합물이 디자인될 수 있음이 입증되었다.

추가적인 solAC 화합물 결합 부위 - N-(3- 페녹시 - 페닐 )- 옥살람산

solAC에 결합된 N-(3-페녹시-페닐)-옥살람산 (화합물 2)의 결정 구조는 약물 디자인에서 탐구될 수 있는 solAC 구조의 추가적인 영역을 드러냈다. 화합물 2에 대한 결합부위는 화합물 2의 페녹시 기가 화합물 1의 페닐 기에 대한 매우 유사한 위치를 차지하도록 화합물 1에 대해 기술된 확장된 HCO₃ ^- 포켓과 겹쳐진다. 그러나, 화합물 2는 HCO₃ ^- 결합 부위의 하부에 놓인 Lys95의 커다란 측쇄 이동을 유도한다. 이러한 Lys95 이동은 HCO₃ ^- 결합 포켓을 개방시켜, ATP 결합 부위에 반대되는 지점에서 단백질 표면 상에 개방되기 전에 커다란 물이 채워진 공동과 합병되는 채널을 형성한다. 하기의 잔기가 이러한 새롭게 노출된 채널에 라이닝된다: His164, Phe165, Tyr268, Asn333, Lys334 및 Val335. 화합물 2의 옥살람산 기가 이러한 채널 내로 가장 멀리 돌출되어, 단백질과의 여러 상호작용을 형성한다: 1) 화합물 2 O3가 His164의 ND와 전하를 띠는 수소 결합을 형성하고, 2) 화합물 2 O1이 Phe165의 골격 NH와 전하를 띠는 수소 결합을 형성하고, 3) 화합물 2 O5가 Val335의 골격 NH에 수소 결합되며, 4) 화합물 2의 아미드 N6가 Phe165의 골격 카르보닐에 수소 결합됨. Lys95, Phe165, Leu166, Val167 및 Phe336의 측쇄는 화합물 2의 중앙 아닐리노 방향족 고리 주변에 친지성 환경을 형성한다. 화합물 2의 말단 페녹시 기는 화합물 1에 대해 기술된 동일한 친지성 포켓 내에 결합하지만, 이러한 포켓의 환경은 Met337, Phe338, Asp339, Lys340 및 Gly341을 포함하는 루프의 화합물 2에 의해 유도된 이동을 통해 약간 변화된다. 이러한 루프 이동은 Phe338을 ATP 부위로부터 화합물 2의 말단 페녹시 기의 반데르발스 거리 내로 끌어당긴다. Phe338의 이러한 이동은 아포 solAC, AMP-PNP가 결합된 solAC 및 화합물 1이 결합된 solAC의 구조에서는 관찰되지 않는다. 실제로, AMP-PNP 복합체의 구조는 Phe338이 AMP-PNP 리보스의 히드록실 기에 인접하게 놓인 ATP 부위의 한쪽 끝을 형성한다는 것을 드러냈다. Phe338의 위치전환으로 ATP 결합 부위에 이웃한 새로운 서브-포켓이 생성되었다. 이러한 새로운 서브-포켓은 하기의 잔기에 의해 라이닝된다: Phe296, Met418, N298, Ser343, Phe336, Met337, Gly341, Asp339, Met419, Cys342, Ala415, Arg416, Met300, 및 Lys340.

이러한 ATP 서브-포켓의 형성을 유도하는 화합물은 solAC 활성 부위 내에 추가적인 약물 디자인 기회를 생성시킨다. 이러한 ATP 서브-포켓이 확장된 HCO₃ ^- 부위 내에서 결합하는 화합물에 의해 유도된다는 사실은 HCO₃ ^- 부위가 바이카르보네이트 응답성이 아닌 tmAC에 비해 고수준의 선택성을 갖는 약물 개발에 대해 커다란 잠재력을 갖는다는 관점을 강화시킨다.

중요하게, 본원에 기술된 4가지 결합 부위는 서로 배타적이지 않고, 기술된 확장된 ATP 및 HCO₃ ^- 포켓을 포함하는 연속적인 solAC 결합 부위를 형성할 수 있다. 이러한 전체적인 결합 부위는 소분자 solAC 약물의 개발에 대한 매력적인 표적을 제시한다.

N-(3- 페녹시 - 페닐 )- 옥살람산의 제조

테트라히드로푸란 (3 ㎖) 내의 3-페녹시아닐린 (276 ㎎, 1.4 mM) 및 트리에틸아민 (0.2 ㎖, 1.4 mM)의 용액에 클로로-옥소-아세트산 에틸 에스테르 (0.175 ㎖, 1.5 mM)를 점적식으로 첨가하였다. 생성된 용액을 주위 온도에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (1.5 ㎖) 및 수산화나트륨 (72 ㎎, 1.8 mM)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 추가로 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄과 염산 (2N) 사이에 분배시켰다. 수성 층을 디클로로메탄으로 세정하였다. 디클로로메탄 층을 합친 후, 염산 (2N) 및 물로 세정하였다. 유기물을 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 진공 증발에 의해 제거하여, N-(3-페녹시-페닐)-옥살람산이 백색 고체 (286 ㎎, 74％)로 제공되었다.

HCO ₃ ^- 와 복합체를 이룬 solAC 결정의 제조

50 mM 중탄산나트륨의 용액을 0.1 M 아세트산나트륨 (pH 4.8), 0.2 M 시트르산삼나트륨, 16％ PEG 4000, 및 10％ 글리세롤로 구성된 침투 용액에서 제조하였다. 앞서 성장된 solAC 촉매 도메인의 결정을 20 ㎕의 바이카르보네이트 침투 용액 내에 놓고, 3시간 동안 평형화시켰다. 그후 결정을 동결방지제의 용액으로 옮기고, 데이타 수집용 제제에서 액체 질소에서 동결시켰다.

화합물들과 복합체를 이룬 solAC 결정의 제조

모 침투 용액을 90％의 최종 부피로 제조하였고, 이는 200 mM NaCl, 200 mM 시트르산삼나트륨 (pH 6.4), 15％ w/v PEG 4000 및 15％ v/v 글리세롤을 포함하였다. 나머지 10％의 부피는 1) 물로 채워져서 수확 용액이 제공되거나 또는 2) 화합물 모액 (DMSO 내)으로 채워져서 최종 침투 용액이 제조되었다. 수확 용액은 solAC 결정을 부유 방울로부터 수집한 후 solAC 결정의 임시 보관에, 또한 침투 용액의 증발을 방지하기 위해 침투 동안 저장 용액으로 사용되었다. 화합물 1 및 화합물 2 모액을 DMSO에서 0.25 M로 제조하였다. 90％ 모 침투 용액의 pH를 화합물 1에 대해 이러한 화합물의 결합을 용이하게 하기 위해 pH 7.3으로 조정하였다.

36 ㎕의 "90％ 모액"을 4 ㎕의 화합물 모액과 혼합함으로써 화합물 1 및 2에 대한 최종 침투 용액을 제조하였다. 이는 25 mM의 최종 화합물 농도를 제공하였다.

화합물에 대한 침투/동결 절차

결정을 부유 방울로부터 10 ㎕의 신선한 수확 용액 내로 수집하였다. 저장소에 50-100 ㎕의 수확 용액을 또한 충전하였다. 침투 용액 (6 ㎕)을 웰 내에 놓고, 상응하는 저장소에 50 ㎕의 수확 용액을 충전하였다. 결정을 침투 용액 내로 분포시켰다 (1개의 결정/화합물). 웰을 밀봉하고, 20℃에서 화합물 1의 경우 6분, 화합물 2의 경우 4.5시간 동안 침투가 진행되도록 하였다. 밀봉을 절단하고, 결정을 마이크로마운트 상에 마운팅한 후, 액체 질소에서 동결시켰다.

화합물 번호매김

solAC:HCO₃ ^-, solAC:화합물 1 및 solAC:화합물 2 복합체의 기술에서, 채택된 원자 번호매김 계획 (첨부된 pdb 파일에서 발견됨)이 도 1에 제시된다. 화합물 1 및 화합물 2에 대해 수소 원자는 제시되지 않는다. HCO₃ ^-에 대해서는 수소 원자가 제시되는데, 이러한 수소가 solAC:HCO₃ ^- 상호작용을 정의하는데 특히 중요하기 때문이다.

Claims (41)

1. 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차(rmsd)만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 구조, 또는 이의 선택된 좌표를 제공하는 단계;

   상기 solAC 구조 또는 이의 선택된 좌표에 피팅(fitting)되도록 리간드를 제공하는 단계; 및

   리간드를 상기 solAC 구조에 피팅시키는 단계

   를 포함하는, 리간드와 solAC 구조의 상호작용 분석을 위한 컴퓨터-기반 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 선택된 좌표가 표 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나에 기재된 잔기의 1개 이상의 기로부터의 원자를 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 선택된 좌표가 기 Met1 내지 Tyr26 또는 Lys219 내지 Gly284로부터의 1개 이상의 아미노산으로부터의 원자를 포함하는 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 리간드가 상기 기의 2개 이상, 바람직하게는 5개 이상의 구성원으로부터의 1개 이상의 원자에 피팅되는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 10개 이상의 원자, 바람직하게는 100개 이상의 원자에 피팅되는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 좌표가 500개 이상, 바람직하게는 1000개 이상의 원자의 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 개의 분자 단편이 피팅되고, 상기 단편이 단일 분자로 어셈블링(asembling)되어 리간드를 형성하는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 리간드를 수득 또는 합성하는 단계; 및

   상기 리간드를 solAC 단백질과 접촉시켜 solAC와 상호작용하는 상기 리간드의 능력을 결정하는 단계

   를 추가로 포함하는 방법.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 리간드를 수득 또는 합성하는 단계;

   solAC 단백질과 상기 리간드의 복합체를 형성시키는 단계; 및

   상기 복합체를 X-선 결정학에 의해 분석하여 solAC와 상호작용하는 상기 리간드의 능력을 결정하는 단계

   를 추가로 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 리간드를 수득 또는 합성하는 단계;

    상기 리간드가 상기 solAC 구조와 상호작용하는 방식을 결정 또는 예측하는 단계; 및

    리간드와 solAC 간의 상호작용이 변경되도록 리간드를 변형시는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, solAC 구조가 임의로 0.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표의 전체 또는 일부분, 또는 이의 선택된 좌표로부터 구축된 모델인 방법.
12. 제11항에 있어서, 모델이 (a) 와이어-프레임(wire-frame) 모델; (b) 치킨-와이어(chicken-wire) 모델; (c) 볼-앤-스틱(ball-and-stick) 모델; (d) 스페이스-필링(space-filling) 모델; (e) 스틱(stick)-모델; (f) 리본(ribbon) 모델; (g) 스네이크(snake) 모델; (h) 화살표 및 실린더(cylinder) 모델; (i) 전자 밀도 지도; (j) 분자 표면 모델인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    (a) 리간드를 수득 또는 합성하는 단계; 및

    (b) 리간드를 solAC와 접촉시켜 solAC와 상호작용하는 상기 리간드의 능력을 결정하는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
14. 리간드를 수득 또는 합성하는 단계;

    solAC 단백질과 상기 리간드의 결정화된 복합체를 형성시키며, 여기서 상기 복합체는 상기 복합체의 원자 좌표의 결정을 위해 X-선을 3.5 Å보다 양호한 해상도로 회절시키는 단계; 및

    임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 사용함으로써 상기 복합체를 X-선 결정학에 의해 분석하여, solAC 단백질과 상호작용하는 상기 리간드의 능력을 결정하는 단계

    를 포함하는, solAC 단백질과 상호작용하는 리간드의 능력을 평가하는 방법.
15. 제14항에 있어서,

    solAC 단백질의 결정을 제공하는 단계;

    결정에 리간드를 침투시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및

    임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 사용함으로써 복합체의 구조를 결정하는 단계

    를 포함하는 방법.
16. 제14항에 있어서,

    solAC 단백질을 리간드와 혼합하는 단계;

    solAC 단백질-리간드 복합체를 결정화시키는 단계; 및

    임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 사용함으로써 복합체의 구조를 결정하는 단계

    를 포함하는 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 리간드의 구조를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제14항 또는 제17항에 있어서,

    리간드를 수득 또는 합성하는 단계; 및

    리간드와 solAC 간의 상호작용이 변경되도록 리간드를 변형시키는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
19. 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표, 또는 이의 선택된 좌표를 제공하는 단계, 및

    (a) 단백질의 구조가 제공되도록 단백질의 결정 단위 셀 내에 상기 좌표를 위치시키거나, 또는 (b) 상기 좌표를 조작함으로써 단백질의 NMR 스펙트럼 피크를 할당하는 단계

    를 포함하는, 단백질의 구조를 결정하는 방법.
20. 미지의 3차원 구조의 표적 solAC 단백질의 아미노산 서열의 화상을 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC의 아미노산 서열, 또는 이의 선택된 좌표와 정렬시켜, 아미노산 서열의 상동성 영역을 매칭(matching)시키는 단계;

    임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에 정의된 바와 같은 solAC 구조, 또는 이의 선택된 좌표의 상응하는 영역 상에서 미지 구조의 상기 표적 solAC의 매칭된 상동성 영역의 구조를 모델링하는 단계; 및

    상기 매칭된 상동성 영역의 구조가 실질적으로 보존된 미지 구조의 상기 표적 solAC의 입체구조를 결정하는 단계

    를 포함하는, 미지 구조의 solAC 단백질 상동체 또는 유사체의 3차원 구조를 예측하는 방법.
21. (i) (a) solAC 촉매 도메인의 3차원 구조, 또는 이의 선택된 좌표를 정의하는, 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표를 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이타;

    (b) 데이타 (a)를 기초로 표적의 상동성 모델링에 의해 생성된 표적 아데닐레이트 사이클라제 상동체 또는 유사체의 원자 좌표 데이타;

    (c) 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 데이타를 기준으로 X-선 결정학 데이타 또는 NMR 데이타를 해석함으로써 생성된 단백질의 원자 좌표 데이타; 및

    (d) (a) 또는 (c)의 원자 좌표 데이타로부터 유도가능한 구조 인자 데이타

    를 함유하는 원격 장치와 통신을 확립하는 단계; 및

    (ii) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타를 상기 원격 장치로부터 수신하는 단계

    를 포함하는, solAC, solAC 상동체 또는 유사체와 상호작용하는 리간드, solAC와 리간드의 복합체, 또는 solAC 상동체 또는 유사체와 리간드의 복합체의 구조를 생성시키고/시키거나 이의 최적화를 수행하기 위한 데이타를 제공하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 컴퓨터-판독가능 데이타가 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표이며,

    임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표에 피팅되도록 리간드를 제공하는 단계; 및

    리간드를 solAC 구조에 피팅시키는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 좌표가 5％ 이상, 바람직하게는 10％ 이상의 Cα 원자를 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 rmsd가 상기 Cα 원자를 기준으로 계산되는 방법.
25. (a) solAC 촉매 도메인의 3차원 구조를 정의하는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 solAC 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표;

    (b) 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 데이타를 기초로 표적의 상동성 모델링에 의해 생성된 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 원자 좌표 데이타;

    (c) 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표 데이타를 기준으로 X-선 결정학 데이타 또는 NMR 데이타를 해석함으로써 생성된 표적 아데닐레이트 사이클라제 단백질의 원자 좌표 데이타;

    (d) (b) 또는 (c)의 원자 좌표 데이타로부터 유도가능한 구조 인자 데이타; 및

    (e) 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 원자 좌표 데이타, 또는 이의 선택된 좌표

    중 1개 이상을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이타를 함유하는, solAC, solAC 상동체 또는 유사체와 상호작용하는 리간드, solAC와 리간드의 복합체, 또는 solAC 상동체 또는 유사체와 리간드의 복합체의 구조를 생성시키고/시키거나 이의 최적화를 수행하도록 의도된 컴퓨터 시스템.
26. 제25항에 있어서, 상기 선택된 좌표가 표 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나에 기재된 잔기의 1개 이상의 기로부터의 원자를 포함하는 컴퓨터 시스템.
27. 제26항에 있어서, 상기 선택된 좌표가 상기 기의 2개 이상, 바람직하게는 5개 이상의 구성원으로부터의 1개 이상의 원자에 대한 것인 컴퓨터 시스템.
28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 10개 이상의 원자, 바람직하게는 100개 이상의 원자에 피팅되는 컴퓨터 시스템.
29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,

    (i) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이타 저장 매체;

    (ii) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타의 프로세싱을 위한 명령어를 저장하기 위한 작업 메모리; 및

    (iii) 상기 컴퓨터-판독가능 데이타를 프로세싱함으로써 구조를 생성시키고/시키거나 합리적인 약물 디자인을 수행하기 위해서, 상기 작업 메모리 및 상기 컴 퓨터-판독가능 데이타 저장 매체에 커플링되는 중앙-프로세싱 유닛

    을 포함하는 컴퓨터 시스템.
30. 제29항에 있어서, 상기 구조를 디스플레이하기 위해, 상기 중앙-프로세싱 유닛에 커플링되는 디스플레이를 추가로 포함하는 컴퓨터 시스템.
31. (i) 기계-판독가능 데이타가 코딩된 데이타 저장 물질을 포함하며, 여기서 상기 데이타가 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 구조, 또는 이의 선택된 좌표를 포함하는 기계-판독가능 데이타 저장 매체;

    (ii) 상기 기계-판독가능 데이타를 3차원 화상으로 프로세싱하기 위한 명령어

    를 포함하는, solAC 구조가 임의로 1.5 Å 이하의 제곱 평균 제곱근 편차만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5, 또는 이의 선택된 좌표인 solAC 구조 또는 solAC-리간드 복합체의 3차원 화상을 생산하기 위한 컴퓨터의 용도.
32. 제31항에 있어서, 상기 선택된 좌표가 표 6, 7, 8, 9, 10 및 11 중 어느 하나에 기재된 1개 이상의 잔기의 원자인 용도.
33. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따라 리간드를 확인하는 단계 및 분자를 담체와 부가혼합하는 단계를 포함하는 조성물의 제조 방법.
34. (a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 따라 리간드를 확인하는 단계; 및 (b) 리간드를 함유하는 의약, 제약 조성물 또는 약물을 제조하는 단계를 포함하는, 의약, 제약 조성물 또는 약물의 제조 방법.
35. 제34항에 있어서, (a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 따라 리간드를 확인하는 단계; (b) 리간드의 구조를 최적화시키는 단계; 및 (c) 최적화된 리간드를 함유하는 의약, 제약 조성물 또는 약물을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
36. solAC 촉매 도메인의 결정.
37. solAC 촉매 도메인과 리간드의 공동-결정.
38. 스페이스 군 P6₃을 갖는 리간드와 solAC 촉매 도메인의 공동-결정.
39. 제32항 또는 제33항에 있어서, 단위 셀 치수 a = b = 99.5 Å, c = 97.4 Å, 및 α = β = 90.00, γ = 120.00이고, 모든 치수에서 단위 셀 가변성이 5％인 공 동-결정.
40. 해상도가 3.5 Å 이상인 solAC 단백질의 결정.
41. 임의로 1.5 Å 미만의 rmsd만큼 가변적인 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5의 좌표에 의해 정의되는 구조를 갖는 solAc 단백질의 결정.

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